Научный руководитель:

кандидат химических наук, старший научный Рубина Алла Юрьевна сотрудник Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, Нечипуренко Юрий Дмитриевич старший научный сотрудник ИМБ РАН доктор биологических наук, профессор, заведующий Лабораторией молекулярной Деев Сергей Михайлович иммунологии ИБХ РАН ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Ведущая организация:

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Защита состоится л 22 ноября 2006 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (государственном университете) по адресу: 141700, Московская область, г. Долгопрудный, Институтский переулок, 9., тел.: (495) 408Ц57Ц00, 408Ц56Ц27.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического института (государственного университета).

Автореферат разослан л_ октября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета К 212.156.03 к.ф.-м.н., доцент Брагин В.Е.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Злокачественные опухоли являются одними из самых распространенных заболеваний с летальным исходом. Рак предстательной железы (РПЖ) занимает второе место по смертности от онкологических заболеваний у мужчин. Своевременное распознавание злокачественного процесса является ключевым этапом при лечении рака, поскольку оно определяет прогноз заболевания и терапию. Поэтому разработка и внедрение в практику быстрых, чувствительных и недорогих методов анализа приобретает все большее значение.

Для диагностики злокачественных новообразований и контроля за лечением в настоящее время широко используются опухолеассоциированные антигены (онкомаркеры), определяемые в сыворотке крови с помощью специфических моноклональных антител. Их уровень в крови, как правило, коррелирует с размером опухоли или стадией заболевания.

Количественный анализ онкомаркеров проводится иммунохимическими методами (ИФА) в основном на плашках (стрипах). Традиционные иммунологические методы позволяют выявлять содержание только одного маркера в одном клиническом образце, в то время как для постановки точного диагноза требуется анализ на содержание в крови нескольких онкомаркеров.

Эта проблема решается при помощи метода, представленного в данной диссертационной работе, позволяющего количественно анализировать содержание нескольких антигенов в образце с использованием трехмерных гидрогелевых микрочипов.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью исследования является разработка метода одновременного количественного анализа общей и свободной форм простата-специфического антигена (ПСА) в сыворотке крови на биологическом микрочипе.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Разработать условия ковалентной иммобилизации белков в гелях с максимальным сохранением биологической активности.

2. Оптимизировать проведение иммуноанализа с использованием микрочипов на основе гидрогелей. Выбрать оптимальный состав геля.

3. Создать микрочип с ковалентно иммобилизованными антителами к ПСА. Ввести в состав биочипа внутреннюю калибровочную кривую (гелевые ячейки с иммобилизованным ПСА), позволяющую проводить количественное определение двух форм ПСА на одном микрочипе.

4. Оценить параметры количественного иммуноанализа ПСА на микрочипе.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ В диссертационной работе предложен оригинальный метод количественного анализа двух форм ПСА на биологическом микрочипе в формате лодин образец - один микрочип.

Данный метод не требует дополнительного построения калибровочных кривых при каждом проведении анализа.

Создан микрочип, содержащий иммобилизованные антитела против общей и свободной форм ПСА и внутреннюю калибровочную кривую, представляющую собой гелевые ячейки с иммобилизованным в различных концентрациях ПСА. Подобраны оптимальные условия иммобилизации белков в гелевых элементах микрочипа с максимальным сохранением исходной активности белков.

Показано, что разработанный метод одновременного количественного анализа двух форм простата-специфического антигена на биологическом микрочипе позволяет с достаточной чувствительностью, воспроизводимостью и точностью проводить определение содержания двух форм данного онкомаркера в растворах и сыворотках крови.

Созданный метод может служить основой для разработки тест-системы для ранней и дифференциальной диагностики рака предстательной железы.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Результаты работы докладывались на XIV зимней молодежной научной школе Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии (9-12 февраля, 2004, Москва). Отдельные фрагменты диссертационной работы многократно докладывались на научных семинарах Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН.

ПУБЛИКАЦИИ По результатам диссертации опубликовано две научные статьи, опубликованы два тезиса докладов. Ссылки на работы даны в конце автореферата.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация состоит из следующих глав: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение; выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит рисунков и таблиц.

Библиография включает наименования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ В соответствии с целями и задачами данного исследования на первом этапе разработки метода количественного анализа онкомаркеров необходимо было подобрать условия для создания белковых микрочипов, содержащих иммобилизованные антитела к двум формам ПСА и разработать процедуру проведения иммуноанализа на микрочипе. На сконструированном микрочипе была проведена оценка надежности результатов количественного иммуноанализа, воспроизводимости измерений и чувствительности метода. На втором этапе работы, для определения концентраций двух форм ПСА на одном микрочипе без предварительного построения калибровочных кривых в ходе каждого анализа, в структуру биочипа были введены дополнительные элементы (ячейки с иммобилизованным в различных концентрациях ПСА), выполняющие функцию внутренней калибровочной кривой. Проведено сравнение результатов измерений двух форм ПСА, полученных на биочипах с помощью внутренней калибровочной кривой, и стандартными иммунохимическими методами.

1. Простата-специфический антиген (ПСА) ПСА продуцируется клетками предстательной железы и представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 32 кДа. С точки зрения биохимических свойств, ПСА является ферментом - сериновой протеазой с субстратным сродством к химотрипсину и, в меньшей степени, к трипсину. При поступлении в кровь ПСА связывается с ингибиторами протеаз, в результате чего в сыворотке крови он обнаруживается как в свободной форме, так и в различных связанных молекулярных формах, не обладающих специфической ферментативной активностью:

преимущественно в комплексе с антихимотрипсином (АХТ) Ч ПСА-АХТ и макроглобулином (МГ) Ч ПСА-МГ. Установлено, что доминирующей связанной формой в сыворотке крови (до 90%) является комплекс ПСА-АХТ, тогда как на долю комплекса ПСА-МГ приходится менее 1%. В сыворотке крови также всегда циркулирует не связанная с ингибиторами (свободная) форма антигена. Большая часть простатаспецифического антигена, доступная для иммунологического определения, находится в комплексе с антихимотрипсином. Незначительная часть ПСА, связанная с макроглобулином, недоступна для определения обычными иммунными методами, так как молекула ПСА экранирована комплексом. Для исследования концентрации этой фракции требуются специальные методы лабораторной диагностики. Под определением двух форм ПСА имеется в виду определение концентрации свободного ПСА (ПСАсвоб), и общего ПСА (ПСАобщ). Общей формой ПСА называют сумму концентраций свободного ПСА и ПСА, связанного в комплекс с антихимотрипсином.

Измерение концентрации общего и свободного ПСА в сыворотке крови больного, а также соотношения этих двух форм, позволяет различать злокачественные и доброкачественные заболевания предстательной железы. В норме у здорового мужчины и при доброкачественных заболеваниях соотношение [ПСАсвоб]/[ПСА общ] в сыворотке крови более 0.25, а при РПЖ - менее 0.1. Принимая во внимание высокую клиническую значимость ПСА как диагностического маркера, было решено создать специальный микрочип для одновременного количественного определения двух форм ПСА, который может найти применение для ранней дифференциальной диагностики рака предстательной железы, включая массовое обследование населения.

2. Белковые микрочипы В лаборатории биологических микрочипов Института молекулярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта разрабатываются микрочипы на основе трехмерных гидрогелей.

Технология гидрогелевых микрочипов достаточно универсальна и может быть применена для изготовления чипов, содержащих различные по своей природе иммобилизованные зонды: ДНК, РНК, белки, пептиды и пр. Олигонуклеотидные микрочипы уже используются для диагностики целого ряда инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний.

Биочип представляет собой подложку (пластик, стекло и др.), на которую нанесены полусферические гелевые элементы (ячейки). Каждый гелевый элемент микрочипа содержит иммобилизованный индивидуальный зонд.

Носителем для иммобилизации гидрогелей являются стеклянные пластинки, обработанные специальным агентом (Bind Silane) для создания непредельной метакрильной группы на поверхности стекла. Далее на активированное таким образом стекло роботом с пиновой технологией нанесения наносится полимеризационная смесь в виде микрокапель, содержащая иммобилизуемые зонды и гелеобразующие мономеры.

Ячейки находятся на гидрофобной поверхности подложки с определенным периодом;

число ячеек на микрочипе и их размер определяются задачей и условиями предполагаемого эксперимента.

Ковалентная иммобилизация зондов происходит при облучении микрочипа ультрафиолетовым светом. Иммобилизация протекает одновременно с полимеризацией геля, т.е. происходит ковалентное связывание зонда с компонентами растущей полимерной цепи в ходе фотоиндуцируемой полимеризации.

Рисунок 1. Получение ячеек гидрогеля, содержащих молекулярный зонд, методом фотоиндуцированной сополимеризации.

Для того чтобы участвовать в реакции фотоиндуцируемой полимеризации, биологические соединения должны содержать активные группы, способные вступать в реакции замещения или присоединения с бифункциональными гелеобразующими мономерами (кросс-линкерами). В качестве таких активных групп могут выступать амино- и сульфгидрильные группы. Биологические соединения, такие как белки, не нуждаются в дополнительной модификации, а олигонуклеотиды, ДНК и сахара перед проведением иммобилизации необходимо модифицировать введением в их структуру амино- либо сульфгидрильных групп. В качестве гелеобразующих соединений в нашей работе использовали производные метакриламида и N,N-метиленбисакриламид.

2.1. Регистрация сигналов гелевых ячеек микрочипа Регистрацию результатов анализа осуществляли флуориметрически или хемилюминометрически непосредственно с гелевых элементов микрочипа. Белки, используемые для детекции, содержали флуоресцентную метку (Су5) или являлись ферментами, способными участвовать в реакциях, приводящих к излучению света (хемилюминесценция). Флуоресцентные измерения проводили на анализаторе биочипов (ИМБ РАН) с использованием фильтров 650/670 нм (возбуждение/регистрация). Расчет интенсивности флуоресцентного сигнала производили с помощью программного обеспечения ImaGelAssay (ИМБ РАН). Хемилюминесцентные сигналы, полученные во время реакции окисления люминола перекисью водорода, катализируемой пероксидазой, в присутствии усилителей хемилюминесценции, регистрировали CCD-камерой флуоресцентного микроскопа с выключенным источником света.

2.2. Подбор условий иммобилизации белков В процессе образования полимерного геля белок подвергается различным денатурирующим воздействиям, в результате чего может происходить его инактивация, вплоть до полной потери каталитической или биологической активности. Причиной искажения структуры белка могут быть неспецифические взаимодействия (электростатические, гидрофобные, водородные связи) между белком и носителем;

инактивация может происходить под действием свободных радикалов, образующихся при радикальной полимеризации; также денатурацию белка могут вызывать компоненты реакционной смеси, в первую очередь, мономер.

Важной задачей являлся подбор условий иммобилизации белков с сохранением ими биологической активности. Для решения этой задачи для иммобилизации на чипах были выбраны ферменты, как белки чувствительные к различным видам модификаций и позволяющие детектировать не только степень их иммобилизации на чипе, но и сохранение ферментативной активности. В качестве объектов были выбраны широко используемые в аналитической биохимии и иммунохимии пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза.

В первых экспериментах для изготовления белковых микрочипов использовали стандартные условия изготовления микрочипов, содержащих ДНК и олигонуклеотиды (время полимеризации 90 мин, ультрафиолетовое излучение с максимумом при длине волны 312 нм). При проведении полимеризации в этих условиях, сигналы от ячеек, содержащих иммобилизованную пероксидазу, в концентрации 1мг/мл были всего на 10% выше фона. Предположили, что данные условия получения микрочипов могут приводить к инактивации белков. Было проверено действие ультрафиолетового излучения на активность пероксидазы и щелочной фосфатазы в растворе. Через определенные промежутки времени облучения отбирали аликвоты растворов и спектрофотометрически определяли активность ферментов по скорости взаимодействия с субстратами [реакция окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии пероксидазы (460нм) и реакция гидролиза п-нитрофенилфосфата в присутствии щелочной фосфатазы (405нм)].

Активность измеряли по тангенсу угла наклона прямолинейного начального участка кинетической кривой.

Рисунок 2. Инактивация пероксидазы (1) и щелочной фосфатазы (2) под действием ультрафиолетового излучения в течение времени. Раствор пероксидазы и фосфатазы (1мг/мл) облучали УФ-светом с максимумом излучения 312() и 350() нм.