Научный руководитель:

кандидат химических наук, старший научный Рубина Алла Юрьевна сотрудник Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, Лившиц Михаил Аронович заведующий лабораторией физики TH биополимеров ИМБ РАН.

HT доктор химических наук, профессор, Несмеянов Владимир Андреевич заведующий лабораторией иммунохимии ИБХ РАН ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Ведущая организация:

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Защита состоится л 22 марта 2007 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (государственном университете) по адресу: 141700, Московская область, г. Долгопрудный, Институтский переулок, 9., тел.: (495) 408Ц57Ц00, 408Ц56Ц27.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического института (государственного университета).

Автореферат разослан л_ февраля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета К 212.156.03 к.ф.-м.н., доцент Брагин В.Е.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ В настоящее время белковые микрочипы становятся эффективным аналитическим инструментом для фундаментальных и прикладных молекулярно-биологических исследований. Для закрепления белков на матрице (микрочипе) используются различные носители, такие как стекло, пластик, различные мембраны, золото, гидрогели и др.

Трехмерные гидрогелевые микрочипы, разрабатываемые в Институте молекулярной биологии РАН, обладают существенными преимуществами по сравнению с микрочипами на основе двумерных поверхностей, в особенности для иммобилизации белков.

Использование трехмерного геля в качестве носителя при иммобилизации позволяет увеличить количество иммобилизуемого зонда и достичь его равномерного распределения в объеме ячеек. Известно также, что иммобилизация белков в гидрогеле способствует их стабилизации, это справедливо и в отношении гидрогелевых микрочипов.

В данной работе предложен новый метод получения трехмерных гидрогелевых белковых микрочипов на основе полимеризационной иммобилизации, позволяющий значительно упростить технологическую процедуру изготовления микрочипов. В результате проведенных исследований показано, что микрочипы, полученные с помощью предлагаемого метода, обеспечивают оптимальное функционирование иммобилизованных в гелевых ячейках белков и сохранение ими исходной биологической активности.

Белковые микрочипы, изготовленные методом полимеризационной иммобилизации, позволяют проводить многопараметрический анализ образца и могут найти применение как в клинической практике, так и в области научных исследований.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью исследования является разработка метода получения трехмерных гидрогелевых белковых микрочипов на основе полимеризационной иммобилизации и применение разработанных микрочипов для количественного анализа белков.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Разработать способ иммобилизации белковых молекул в гидрогеле, не приводящий к потере ими биологической активности.

2. Упростить процедуру изготовления микрочипов за счет объединения полимеризации гидрогеля и иммобилизации белков в одну стадию.

3. Показать возможность проведения различных вариантов количественного анализа белков на гидрогелевых микрочипах.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ В представленной работе показана возможность получения трехмерных гидрогелевых белковых микрочипов на основе метода полимеризационной иммобилизации. На примере белка барназы исследовано влияние введения непредельных групп в молекулу белка на сохранение им биологической активности. Проведено исследование взаимодействия белков с различными гелеобразующими мономерами.

Подобраны состав компонентов полимеризационной смеси и условия проведения полимеризации, позволяющие проводить иммобилизацию белков без предварительной модификации. На примере барназы методом MALDI TOF масс-спектрального анализа показано, что иммобилизованный в гидрогеле белок сохраняет ферментативную активность и субстратную специфичность.

На примере взаимодействия барназы с её природным ингибитором барстаром продемонстрирована возможность проведения прямого масс-спектрального полуколичественного анализа белков на гидрогелевых микрочипах. Данный тип анализа может быть полезен для проведения исследований в области протеомики.

Разработанный метод иммобилизации белков позволил создать микрочипы с иммобилизованными антителами. На полученных микрочипах была показана возможность проведения количественного иммуноанализа на примере ракового эмбрионального антигена (РЭА). Для уменьшения времени проведения и увеличения чувствительности анализа были проведены исследования кинетики образования бинарных и тройных белковых комплексов, и разработана система ускорения анализа с помощью механического перемешивания образца на микрочипе. В результате проведенных исследований были подобраны условия проведения одностадийного сэндвичиммуноанализа РЭА, позволяющего с высокой чувствительностью и специфичностью определять содержание данного маркера в растворах и сыворотках крови.

Чувствительность анализа составила 1 нг/мл. Предложенный в работе метод изготовления гидрогелевых микрочипов и разработанный на его основе микрочип для количественного иммуноанализа опухолеассоциированного антигена РЭА могут найти применение для лабораторных и клинических исследований.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Результаты работы докладывались на XIV зимней молодежной научной школе Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии (9-12 февраля, 2004, Москва). Отдельные фрагменты диссертационной работы многократно докладывались на научных семинарах Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН.

ПУБЛИКАЦИИ По теме диссертации опубликовано пять печатных работ. Ссылки на работы даны в конце автореферата.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация состоит из введения, трех глав (литературного обзора, экспериментальной части и обсуждения), вывода и списка цитированной литературы.

Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит _ рисунков и таблиц. Библиография включает _ наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Белковые микрочипы Основной задачей данного исследования являлась разработка метода изготовления гидрогелевых белковых микрочипов, обеспечивающего оптимальное функционирование иммобилизованных в гелевых ячейках белков. Для иммобилизации белковых молекул в гидрогеле был выбран метод фотоиндуцируемой сополимеризации. Данный метод подразумевает участие в реакции радикальной полимеризации модифицированного введением непредельной группы белка и гелеобразующих мономеров. В результате сополимеризации белок образует прочную ковалентную связь с образующейся полимерной сеткой гидрогеля. Было опробовано два способа получения сополимеризационных гелевых микрочипов.

На первом этапе работы были использован метод получения белковых гидрогелевых микрочипов включающий стадию предварительной модификации белка введением непредельной группы. На втором этапе работы была решена задача упрощения процесса иммобилизации белков в полимерном носителе. Предложенный метод также основан на фотоиндуцированной сополимеризации, однако модификация белка и полимеризация геля объединены в одну стадию, при этом иммобилизация осуществляется за счет взаимодействия белка с бифункциональными гелеобразующими мономерами.

При выборе объекта для проведения исследований учитывали следующие требования: используемый белок должен обладать биологической активностью, наличие которой после прохождения иммобилизации на микрочипе легко детектировать (например, ферментативной активностью); выбранный белок должен иметь относительно небольшую молекулярную массу для возможности осуществления масс-спектрального анализа при проведении различных химических модификаций. В результате, в качестве объекта исследования была выбрана внеклеточная рибонуклеозид-3Т-трансфераза барназа, состоящая из трех одинаковых субъединиц с молекулярной массой 12,3 кДа каждая.

Барназа образует прочный эквимолярный комплекс с природным ингибитором барстаром, молекулярная масса которого 10 кДа, что делает эти объекты удобными для проведения MALDI TOF MS анализа.

Изготовление гелевых микрочипов Полимеризационную смесь, содержащую гелеобразующие мономеры и белки, подлежащие иммобилизации, наносили с помощью робота (QArray, Genetix, Великобритания) в виде регулярного массива микрокапель на стеклянный слайд, стандартное предметное стекло для микроскопии, обработанный специальным реагентом (Bind Silane) для создания на поверхности непредельной группы. Гелевые ячейки (микрокапли) располагаются на гидрофобной поверхности подложки с определенным периодом; число ячеек на микрочипе и их размер определяются задачей и условиями предполагаемого эксперимента. Для флуориметрических измерений изготавливали микрочипы с диаметром ячеек 100 мкм и периодом 300 мкм; микрочипы для MALDI TOF MS анализа изготавливали на кремниевой подложке, с диаметром гелевых ячеек 0,4 мм, на расстоянии 3 мм друг от друга. Полимеризацию проводили под действием УФоблучения с максимумом при длине волны 350 нм в атмосфере инертного газа.

Регистрация сигналов гелевых ячеек микрочипа Регистрацию результатов анализа осуществляли флуориметрически или массспектрометрически. Флуоресцентные измерения проводили на анализаторе биочипов (ИМБ РАН). Этот прибор, а также специальное программное обеспечение ImaGel (ИМБ РАН) позволяет одновременно анализировать данные со всех элементов микрочипа.

Измерения для флуоресцентных красителей Texas Red и Cy5 проводили, используя фильтры 595/625 нм и 650/670 нм (возбуждение/регистрация) соответственно.

Для регистрации результатов MALDI-TOF MS анализа была разработана методика прямого MS-анализа непосредственно с гелевых ячеек микрочипа (ИМБ РАН). В работе использовали масс-спектрометр KOMPACT-4 (Kratos Analytical, США).

Введение в молекулу барназы непредельных групп Для иммобилизации барназы в полиакриламидном геле был выбран способ модификации, предполагающий участие в реакции аминогрупп белка. В белок вводили непредельную группу с помощью N-гидроксисукцинимидного эфира 6метакриламиногексановой кислоты.

O O O HN O N O Схема 1. N-гидроксисукциниммидный эфир 6-метакриламиногексановой кислоты Далее модифицированный белок и мономеры геля (такие как: акриламид, N,NТметиленбисметакриламид и др.) участвовали в реакции полимеризации гидрогеля.

Максимальное количество непредельных групп, которое может быть введено в молекулу барназы равно девяти, так как в её структуре содержится восемь лизинов (т.е. 8 аминогрупп), а также N-концевая -аминогруппа, и не содержится цистеинов (т.е. -SH групп). Варьирование условий модификации (соотношения белок/реагент, pH реакционной смеси и времени реакции) позволяет вводить в белок различное количество непредельных групп. Путём подбора условий реакции в белок вводили от 1 до метакрильных групп; количество введенных непредельных групп оценивали при помощи MALDI TOF масс-спектрометрии.

Оценка эффективности иммобилизации Эффективность иммобилизации барназы качественно проверяли с помощью гельэлектрофореза. Перед проведением фореза модифицированный белок подвергали предварительной химически индуцируемой сополимеризации с мономерами гидрогеля.

Образцы барназы с разной степенью модификации были иммобилизованы в лунках 10% акриламидного геля, в качестве контроля использовали немодифицированный белок.

Далее гель с образцами подвергали электрофорезу для удаления не иммобилизовавшегося белка из гелевых лунок. После прохождения фореза и окрашивания геля Кумасси голубой, визуально определяли эффективность сополимеризации для каждого образца.

Было обнаружено, что барназа с различным количеством метакрильных групп полностью остается в лунках, в то время как немодифицированный белок имеет хорошую электрофоретическую подвижность и практически не задерживается в лунке с гелем, т.е.

не иммобилизуется. Из картины фореза также было видно, что количество непредельных групп не влияет на эффективность иммобилизации белка в полиакриламидном геле.

Для количественной оценки эффективности иммобилизации барназы на микрочипе использовали данный белок с введенной флуоресцентной меткой. Были изготовлены микрочипы, в каждой ячейке которых была иммобилизована меченная Texas Red барназа, содержащая определенное количество метакрильных групп. С помощью флуоресцентного микроскопа получали значения интенсивности сигналов от каждой ячейки. Эти значения принимали за 100%. Затем микрочип отмывали от непрореагировавших компонентов полимеризационной смеси, в том числе белка, до постоянного значения флуоресцентных сигналов и рассчитывали эффективность иммобилизации для каждого случая. Было показано, что эффективность иммобилизации не зависит от количества введенных в белок метакрильных групп и составляет для барназы 70-75%. В качестве контроля использовали ячейки, содержащие немодифицированную барназу, эффективность иммобилизации которой в данных условиях составила менее 2-3%.

Исследование влияния введения непредельных групп в молекулу белка на сохранение им биологической активности Для изучения влияния степени модификации белка на сохранение им биологической активности использовали взаимодействие барназы с её природным белковым ингибитором барстаром, с которым она образует прочный эквимолярный -комплекс (KB =10P М).

B P асс Барназа, содержащая различные количества (от одной до девяти) непредельных групп, была иммобилизована в гелевых ячейках микрочипа. После проведения взаимодействия с флуоресцентно-меченым барстаром и отмывки от неспецифически связавшегося белка, были получены значения флуоресцентных сигналов для каждого случая модификации (рис. 1). Для увеличения точности эксперимента при расчетах использовали медианный сигнал от четырех одинаковых ячеек.