На правах рукописи

Дворжак Антон Юрьевич

Возбуждающая ГАМК-эргическая синаптическая передача в неокортексе мышей в ранний постнатальный период

03.00.13 - физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего

профессионального образования Российский государственный медицинский

университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному

развитию.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Андрей Глебович Камкин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Виктор Михайлович Смирнов

кандидат биологических наук Александр Евгеньевич Гайдуков

Ведущая организация:

Институт Высшей Нервной Деятельности и Нейрофизиологии РАН

Защита состоится л23 ноября 2009 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

Автореферат разослан л25 сентября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук, доцент Т. Е. Кузнецова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Процессы кортикогенеза и механизмы его регуляции нельзя сегодня считать изученными. Тем не менее любое нарушение этого процесса может приводить к тяжелым последствиям. Так, частой причиной эпилепсии и других неврологических расстройств являются кортикальные мальформации, возникающие вследствие нарушения клеточной миграции и синаптогенеза в кортикальной пластинке. Со стороны мягкой мозговой оболочки и со стороны желудочков процесс созревания кортикальной пластинки контролируется двумя временными популяциями клеток, расположенными в маргинальной зоне и в подпластинке, соответственно. Эти наиболее филогенетически древние зоны неокортекса содержат дифференцированные нейроны, которые играют роль подмостков для развивающейся коры и исчезают в первый месяц постнатального развития. На молекулярном уровне основным регулятором кортикогенеза является белок экстраклеточного матрикса рилин. У людей гомозиготных по рилин-дефицитному гену наблюдается полное нарушение структуры коры, приводящее к сильному отставанию в развитии, генерализованным эпилептическим припадкам, двигательным нарушениям и др. Основным источником рилина в коре являются рано созревающие нейроны маргинальной зоны - клетки Кахаля-Ретциуса. Помимо продукции рилина эти клетки экспрессируют разнообразные каналы и рецепторы для разных нейротрансмиттеров, включая ГАМКА-рецепторы (ГАМК - гамма-аминомасляная кислота). Эти клетки получают возбуждающие ГАМК-эргические входы и образуют плотные горизонтально ориентированные сплетения аксонов, формирующие контакты с поверхностными клетками кортикальной пластинки и образующие глубокие нисходящие проекции в подпластинку. Таким образом, клетки Кахаля-Ретциуса (клетки-КР) принимают участие в работе нейронных сетей развивающегося неокортекса, однако, детальных данных об источниках и свойствах входов на клетки-КР в настоящее время нет.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилось изучение возбуждающей ГАМК-эргической синаптической передачи на клетки-КР в неокортексе у мышей в ранний постнатальный период. Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить постсинаптические токи в клетках Кахаля-Ретциуса.
2. Определить количество ГАМК-эргических входов на клетках Кахаля-Ретциуса и попытаться выявить их возможный (е) источник(и).
3. Дать фармакологическую характеристику постсинаптических ГАМКА рецепнторов и оценить их насыщенность.
4. Исследовать особенности пресинаптической терминали синапсов на клетках Кахаля-Ретциуса. Дать количественную оценку следующим параметрам: квантовому выбросу и размеру пула везикул, готовых к высвобождению, а также рассчитать вероятности высвобождения медиатора.
5. Изучить влияние внеклеточной ГАМК на ГАМК-эргическую синаптическую передачу в синапсах на клетках Кахаля-Ретциуса.
6. Оценить эффективность синаптической передачи (процент стимулов, приводящих к генерации потенциалов действия на постсинаптической мембране) на клетки Кахаля-Ретциуса при разных частотах стимуляции.

Научная новизна работы

В данной работе впервые было показано наличие двух типов ГАМК-эргических синапсов на клетках-КР, образованных разными аксональными проекциями и генерирующих постсинаптические токи с разной кинетикой нарастания. Нами было показано, что эти синапсы различаются постсинаптическими рецепторами и их насыщенностью, а также квантовым выбросом медиатора, вероятностью высвобождения нейротрансмиттера из синаптической везикулы и размером везикулярного пула, готового к высвобождению. В этой работе мы обнаружили, что разные синапсы обладают разной чувствительностью к внеклеточной ГАМК, а также по-разному пропускают сигналы, приходящие с разными частотами.

Теоретическая и практическая значимость результатов исследования

Теоретическое значение работы заключается в том, что впервые были подробно описаны два различных типа входов на клетки-КР. Это, в свою очередь, является качественно новым шагом в понимании того, как организованы нейронные сети на ранних этапах постнатального развития, когда кортикальные нейроны ещё не способны выполнять свои функции. Полученные данные также указывают на наличие дистантно расположенных потенциальных регуляторов кортикогенеза и раскрывают механизмы, через которые осуществляется контроль и координация процессов миграции и синаптогенеза в развивающейся коре.

Практическая значимость результатов заключается в том, что на базе понлученных данных можно осуществлять целенаправленный поиск фармакологических препаратов для изучения регуляции кортикогенеза с целью лечения и профилакнтики неврологических заболеваний. Полученные данные также могут быть использованы для поиска новых методов ранней диагностики таких заболеваний, как аутизм, шизофрения, эпилепсия и др.

Апробация работы

Основные положения работы были опубликованы в двух западных журнналах (Dvorzhak A. и др. 2008; Kirmse K. и др. 2007) и в одном отечественном журннале (Дворжак А.Ю. и др, 2009). Результаты данных исследований также докладынвались на научных конференциях сотрудников Института нейрофизиологии Бернлинского университета (Германия, 20.02.2007 и 19.02.2008) и на международном форуме европейского общества нейронаук (6th FENS, Женева, Швейцария, 07.2008).

Диссертация апробирована на Совместной научной конференции кафедры фундаментальной и прикладной физиологии МБФ РГМУ и кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. Ломоносова (Москва, 2009).

Внедрение результатов исследования

Результаты диссертации используются в научно-исследовательской работе и учебном процессе на кафедре фундаментальной и прикладной физиологии МБФ

ГОУ ВПО РГМУ.

Публикации

Материалы диссертации изложены в 4 научных публикациях в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе 2 статьи - в научных журналах, рекомендованных

ВАК РФ.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из 5 глав: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты, их обсуждение и список использованной литературы.

Работа изложена на 152 страницах машинописного текста, включая 42 рисунков и список литературы из 177 источников.

Материалы и методы исследования

Работу выполняли на потомстве мышей линии C57BL/6J, взятых в постнатальный период с 1ого по 7ой дни (день родов - 0), в соответствии с Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) от 6.04.1973 № 1045-73. Для экспериментов использовали сагиттальные переживающие срезы мозга толщиной 200 мкм. В экспериментальной работе применяли следующие растворы. Раствор для препарирования содержал (в мМ): 125 NaCl, 4 KCl, 10 глюкозы, 1,25 NaH2PO4, 25 NaHCO3, 0,5 CaCl2 и 2,5 MgCl2 - и постоянно аэрировался карбогеном (газовая смесь 5% CO2 и 95% O2), pH раствора доводился до 7,3 c применением одномолярных растворов HCl и NaOH. Инкубационный раствор содержал (в мМ): 125 NaCl, 4 KCl, 10 глюкозы, 1,25 NaH2PO4, 25 NaHCO3, 2 CaCl2 и 1 MgCl2 - и постоянно аэрировался карбогеном, pH - 7,3, осмолярность 330 мОсмоль/л. Внутрипипеточный раствор для заполнения patch-пипеток, содержал (в мМ): 100 калий-глюконата, 50 KCl, 5 NaCl, 0,5 СaCl2, 5 ЭГТА, 25 Hepes, 2 MgАТФ и 0,3 ГТФ. Перед использованием pH раствора доводился до 7,2 с помощью КОН, осмолярность 320 мОсмоль/л.

Метод приготовления переживающих срезов мозга.

После быстрой декапитации животного под эфирной анестезией, из черепа изымали мозг и перемещали его в чашку Петри, заполненную УледянымФ раствором для препарирования. Далее, используя вибратом, делали сагиттальные срезы мозга толщиной 200 мкм. Срезы инкубировали в инкубационном растворе при комнатной температуре (23-30 0С) не менее 1 ч и затем перемещали в регистрационную камеру (объёмом 0,4 мл) установки для электрофизиологических исследований, где срезы постоянно омывали потоком (2 мл/мин) инкубационного раствора при комнатной температуре.

Идентификация клеток Кахаля-Ретциуса

Идентификацию клеток-КР осуществляли визуально на основании следующих морфологических критериев: 1) локализация в маргинальной зоне коры (1-ый слой); 2) горизонтальная ориентация; 3) большая овоидная сома; 4) наличие одного толстого дендритного ствола, направленного параллельно поверхности мягкой оболочки мозга. Для экспериментов использовали клетки, локализованные в 17 и 18 полях зрительной коры. Правильность выбора клетки контролировали следующими электрофизиологическими критериями: 1) относительно деполяризованный мембранный потенциал -40 ~ -50 мВ; 2) наличие токов, активируемых гиперполяризацией (Ih-токов); 3) низкая частота генерации потенциалов действия (ПД) при деполяризации (обычно не более 1 ПД); 4) наличие спонтанных ГАМК-эргических постсинаптических токов.

Электрофизиологические исследования в переживающих срезах мозга

Электрофизиологические исследования на клетках-КР проводили с помощью стандартной микроэлектродной техники фиксации потенциала на целой клетке (patch-clamp метод в конфигурации whole-cell). Для этого использовали стеклянные микропипетки, заполненные внутриклеточным раствором (сопротивление 3-5 Мом). Регистрируемый сигнал фильтровали на 3 кГц, оцифровывали на частоте 10 кГц и записывали на жёсткий диск ЭВМ. Контактную разность потенциалов (< 5 мВ) не компенсировали. В режиме фиксации потенциала (voltage-clamp), потенциал удерживали на - 70 мВ. Сопротивление доступа контролировали гиперполяризационной ступенькой в 10 мВ. Компенсация последовательного сопротивления не применялась. Клетки, имевшие последовательное сопротивление более 40 МОм, либо показавшие изменение последовательного сопротивления более чем на 20% в течение всего эксперимента, не включали в анализ.

Метод регистрации миниатюрных постсинаптических токов

Для оценки квантового выброса, то есть постсинаптических токов (ПСТ), вызываемых выбросом медиатора из отдельной везикулы, регистрировали миниатюрные ПСТ (минПСТ), используя тетродотоксин (0,5 мкМ), блокатор потенциал-упраляемых Na+-токов. Спонтанные минПСТ в клетках-КР отличаются очень низкой частотой возникновения (порядка 0,01 Гц), что не позволяет провести полноценный статистический анализ. Для решения этой проблемы использовали 10-минутную преинкубацию срезов с 50 мкМ N-этилмалеимида (NEM). Это сульфгидрил-алкилирующий агент, который отсоединяет Gi/0 белки, чувствительные к коклюшному токсину, от своих рецепторов. Тем самым он блокирует работу тонически активированных внутриклеточных путей подавления спонтанного экзоцитоза нейротрансмиттера в пресинаптических терминалях. NEM на несколько порядков увеличивает частоту спонтанных минПСТ, но при этом не изменяет их амплитуду и кинетику (Kirmse K & Kirischuk S, 2006).

Нестационарный дисперсионный анализ шума

Для анализа проводимости постсинаптических лиганд-управляемых ионных каналов мы использовали нестационарный дисперсионный анализ шума (nonstationary variance analysis) миниатюрных ПСТ на фазе спада. Для этого мы использовали программу, написанную C. Henneberger (Институт нейрофизиологии, Берлин, ФРГ). Подробное описание анализа можно найти в статье: Traynelis S.F. и др.; Neuron, 1993, № 11(2), P.279-10.

Метод электрической стимуляции клеток Кахаля-Ретциуса

Для характеристики свойств синапсов на клетках-КР мы регистрировали вызванные ПСТ (вПСТ), используя фокальную электрическую стимуляцию нервных волокон в маргинальной зоне неокортекса с помощью униполярного электрода. Стимуляцию осуществляли прямоугольными электрическими импульсами тока с длительностью 0,5 мс. Силу тока стимуляции подбирали так, что бы она была минимальной (т.е. стимулировался один отдельный аксон). Стимуляция считалась минимальной при выполнении следующих условий: 1) латентность вПСТ должна оставаться стабильной (флуктуации не более 20%); 2) стимуляция с амплитудой на 20% меньше исходной должна быть не способна вызывать вПСТ; 3) увеличение силы стимуляции на 20 % не должно изменять ни средней амплитуды, ни формы вПСТ. Обычно сила стимулирующего тока при минимальной стимуляции варьировала от 1 до 2 мкА.

Метод парной стимуляции

Для оценки синаптической пластичности входов использовали минимальную электрическую стимуляцию парами импульсов с интервалом между парами 10 с и интервалом между стимулами в паре 50 мс (рис.3 А). В процессе обработки записи усредняли и определяли средние амплитуды ответов на первый (вПСТ1) и второй (вПСТ2) стимулы. Согласно квантовой модели синаптической передачи, средняя амплитуда вПСТ1 пропорциональна квантовой амплитуде (Q), размеру везикулярного пула, готового к высвобождению (readily releasable pool - RRP) и вероятности высвобождения медиатора (Pr): вПСТ1=Q*RRP*Pr.