На правах рукописи

ЭКСПРЕССИЯ НАТИВНОГО И МОДИФИЦИРОВАННОГО ГЕНОВ ИММУННОГО ИНТЕРФЕРОНА БЫКА В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE И PICHIA PASTORIS 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2010

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете в лаборатории биохимической генетики кафедры генетики и селекции 2

Научный консультант: доктор биологических наук Падкина Марина Владимировна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, академик РАСХН, профессор, директор Всероссийского НИИ сельхозмикробиологии Тихонович Игорь Анатольевич;

доктор биологических наук, доцент, ведущий научный сотрудник отдела молекулярной генетики НИИЭМ СЗО РАМН Мандельштам Михаил Юрьевич Ведущее учреждение: Институт цитологии РАН

Защита состоится л _ 2010 г. в часов на заседании совета Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб 7/9, СПбГУ, биологопочвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан л _ 20 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. За последнее десятилетие иммунология претерпела глубокие изменения в связи с доказательством того, что иммунная система регулируется пептидными гормонами - цитокинами, 3 действия которых подчиняются тем же закономерностям, что и процессы с участием классических гормонов и их рецепторов (Завьялов, 1993). На данный момент известна первичная структура нескольких десятков цитокинов, обеспечивающих дистанционное взаимодействие иммунокомпетентных клеток между собой. Изучение цитокинов имеет не только теоретическое, но и прикладное значение (Кетлинский, 1992).

Наиболее широкое применение в клинической практике получили интерфероны (ИНФ), представляющие собой естественную систему противовирусной защиты организма, а также оказывающие иммуностимулирующее, противовоспалительное, противоопухолевое и антимитотическое действие (Ершов и др., 1996). ИФН-, иммунный, синтезируется Т-лимфоцитами после стимуляции их митогенами, антителами, интерлейкином-2.

Иммунные интерфероны млекопитающих повышают бактерицидную и фунгицидную активность макрофагов и являются эффективными препаратами для лечения и профилактики различных заболеваний животных. Использование интерферонов в качестве лекарственного средства имеет существенные преимущества по сравнению с антибиотиками и химиотерапевтическими препаратами за счет широкого спектра действия, обусловленного активацией иммунной системы, и из-за отсутствия побочных эффектов.

С разработкой методов работы с ДНК in vitro появилась возможность клонировать и экспрессировать чужеродные гены в различных прокариотических и эукариотических клетках-хозяевах и получать рекомбинантные белки в значительных количествах. Впервые препараты рекомбинантных цитокинов были получены из бактерий Escherichia coli (Дебабов, 1985). Однако E.coli являются условно патогенными микроорганизмами, и получаемый белок не удается полностью очистить от продуктов жизнедеятельности бактерий, поэтому препарат в той или иной степени является токсичным, что ограничивает применение его в медицине (Primrose, 1986). Использование непатогенных микроорганизмов (дрожжей), не содержащих токсических и пирогенных факторов, в качестве продуцентов рекомбинантных цитокинов млекопитающих позволяет использовать эти белки в ветеринарии.

Используя системы экспрессии различных видов дрожжей, а также подбирая условия культивирования, можно добиться достаточно высокого уровня выхода рекомбинантного белка. Однако следует отметить, что целью подобных экспериментов является, в основном, повышение продукции гетерологичных белков. При этом мало внимания уделяется самим продуцентам и процессам, происходящим в клетках микроорганизмов во время синтеза чужеродных белков. Очевидно, что такие исследования необходимы для успешного решения основной задачи биотехнологии - увеличения выхода целевого продукта.

Целью данной работы являлось получение штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris - продуцентов биологически активного ИФН- быка и изучение особенностей продукции гетерологичного белка клетками двух видов дрожжей.

В задачи исследования входило:

- получение вектора экспрессии, обеспечивающего синтез нативного и модифицированного -интерферона быка в клетках дрожжей P.

pastoris;

- получение штаммов-продуцентов биологически активного ИФН быка на основе дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris;

- изучение протеолитической стабильности нативного и модифицированного белков;

- сравнение эффективности дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris в качестве систем экспрессии гетерологичных генов;

- изучение влияния экспрессии гетерологичного гена bIFNG на клетку-хозяина.

Научная новизна исследования. Впервые получен штамм дрожжей P.

pastoris - продуцент модифицированного ИФН- быка, обладающего повышенной протеолитической стабильностью. Впервые показано, что продукция рекомбинантного ИФН- быка приводит к повышению количества карбонилированных белков в клетках дрожжей и вызывает изменения, подобные оксидативному стрессу. Установлено, что дрожжи P.

pastoris являются более устойчивыми к различным стрессорным факторам.

Показано, что в клетках дрожжей P. pastoris синтезированный белок находится в растворимом виде в цитоплазме, тогда как в случае S. cerevisiae он образует так называемые тельца включения. Впервые показано, что сигнал ядерной локализации ИФН- млекопитающих обеспечивает транспорт гетерологичного белка в ядро дрожжевой клетки, что свидетельствует об эволюционной консервативности этого процесса.

Практическая значимость. Штаммы дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris, синтезирующие и аккумулирующие рекомбинантный ИФН- быка внутри клеток, могут быть использованы в качестве иммунопробиотической кормовой добавки для профилактики различных заболеваний животных.

Штамм - продуцент модифицированного ИФН- может быть использован для получения рекомбинантного белка и создания на его основе лекарственного препарата, аналоги которого в настоящее время в России отсутствуют.

Положения, выносимые на защиту:

1. Продукция рекомбинантного ИФН- быка оказывает на клетки дрожжей негативное влияние, подобное оксидативному стрессу. Различная устойчивость дрожжей S. cerevisiae и P.

pastoris к негативному воздействию продукции чужеродного белка обусловлена особенностями метаболизма.

2. Делеция десяти аминокислот на С-конце молекулы ИФН- быка повышает устойчивость белка к протеолитической деградации, не оказывая влияния на его биологическую активность.

3. В молекуле ИФН- быка имеется сигнал ядерной локализации, который выполняет свою функцию в клетках дрожжей.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III Московском международном конгрессе Биотехнология - состояние и перспективы развития (Москва, 2005), на XXII международной конференции по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Словакия, Братислава, 2005), в работе Школы-конференции Генетика микроорганизмов и биотехнология (Москва, Пущино, 2006), на Седьмой международной научно-практической конференции Исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности (Санкт-Петербург, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 1 статья, патента и 4 тезисных сообщения.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на машинописной странице, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 194 наименования, и приложения.

Работа содержит 3 таблицы и 29 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Штаммы. В работе использованы следующие штаммы дрожжей S. cerevisiae: 1-GRF18 (MAT his3-11,15 leu2-31,11 pho3-1); 2P4-GRF(MAT his3-11,15 leu2-31,11 pep4); D576 (85-D600X62-D563: MAT leu2 arg4 HIS3 pho3Х MATа leu2 ARG4 his3 pho3) из коллекции лаборатории биохимической генетики, а также штамм дрожжей P.

pastoris GS115 (his4) (Invitrogen).

Плазмиду pYGIB, содержащую ген bIFNG под контролем промотора и терминатора гена РНО5 дрожжей S. cerevisiae (Мясников и др., 1989), использовали для создания штаммов дрожжейсахаромицетов - продуцентов ИФН- быка.. В данной работе были получены плазмиды pBIG, pPIC9/BIGd10, pBIG/GFP и pBIGd10/GFP которые содержали нативный (bIFNG) или модифицированный (bIFNG30) структурные гены ИФН- быка, или эти гены, сшитые с геном GFP, под контролем промотора и терминатора гена АОХдрожжей P. pastoris. (рис.1).

bIFNG bIFNGРис.1. Схема плазмид pYGIB, pBIG, pBIGd10, pBIG(pBIGd10)/GFP.

Плазмиды pBIG, pBIGd10 были использованы для получения штаммов метилотрофных дрожжей - продуцентов рекомбинантных белков. Плазмиды pBIG/GFP и pBIGd10/GFP использовали при изучении локализации рекомбинантного белка в дрожжевой клетке.

Методы. Выделение плазмидной ДНК из бактерий и хромосомной ДНК из дрожжей, рестрикционный анализ, электрофорез в агарозном геле, выделение фрагментов ДНК из геля, лигирование, ПЦР, трансформацию бактерий и дрожжей проводили в соответствии со стандартными методиками (Birnboim a Doli, 1979; Маниатис и др., 1984; Fujimura, 1997).

Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд (Bradford, 1992).

Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970). Иммунобллотинг проводили по стандартному методу (Bidwai, 1992).

Биологическую активность рекомбинантного ИФН определяли по подавлению цитопатической активности вируса везикулярного стоматита в культуре фибробластов трахеи эмбрионов коров (FBT) в соответствии с фармакологической статьей ФС 42-3433-97.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Создание штамма дрожжей S. cerevisiae - продуцента ИФН- быка Для создания штамма дрожжей S. cerevisiae - продуцента рекомбинантного ИФН- быка плазмидой pYGIB (Мясников и др., 1989) трансформировали гаплоидные штаммы 1-GRF18, 2P4-GRF18 и диплоидный штамм D576, в которых экспрессия генов, клонированных под контролем промотора гена РНО5, регулируется неорганическим фосфатом. На необходимость такой регуляции указывали ранее полученные данные о том, что продукция чужеродных белков негативно влияет на клетки дрожжей, снижая выход биомассы и, следовательно, значительно снижает количество полученного белка. Использование регулируемой экспрессии позволило уменьшить отрицательное воздействие ИФН- на рост дрожжей продуцентов, но не повлияло на митотическую стабильность рекомбинантной плазмиды.

Штамм-продуцент на основе диплоидного штамма накапливал больше биомассы, но сравнение профилей элюции внутриклеточных белков диплоидного и гаплоидного штаммов при хроматографии на сефакриле S-показало наличие у диплоида большого количества примесных белков в области предполагаемого выхода ИФН-, что существенно осложнило бы очистку рекомбинантного белка.

Уровень продукции ИФН- быка был низким и не превышал 10 мг/л клеточной культуры даже у штамма 2P4-GRF18/pYGIB, у которого отсутствовала вакуолярная аспартилпротеаза А, принимающая участие в расщеплении гетерологичных белков (Woolford et al., 1986). Эти результаты позволили предполагать, что ИФН- является токсичным для дрожжей S.

cerevisiae.

Одним из путей снижения отрицательного воздействия чужеродного белка на жизнедеятельность клетки-хозяина является его секреция. Однако, ИФН- является гликопротеином, а структура углеводных компонентов секретируемых белков дрожжей S. cerevisiae и млекопитающих различна (Schultz et al., 1987), что не позволяет использовать данный вид дрожжей для создания секреторного продуцента ИФН-.

Особенности метаболизма дрожжей S. cerevisiae также создают неудобства использования их в качестве продуцентов рекомбинантных белков. В качестве конечного продукта усвоения углеводов образуется этанол, который ингибирует рост культуры, что также приводит к снижению продукции гетерологичного белка.

Как альтернативный организм-продуцент ИФН- быка нами были выбраны дрожжи P. pastoris, которые успешно используются для гетерологичного синтеза различных белков. Дрожжи P. pastoris способны использовать метанол в качестве единственного источника углерода.

Сильный промотор гена АОХ1, кодирующего структуру алкогольоксидазы - первого фермента утилизации метанола, регулируется источником углерода.

(Cereghino а. Cregg, 2000).

2. Создание штамма дрожжей P. pastoris - продуцента рекомбинантного ИФН- быка. Возможность получения штамма дрожжей P.

pastoris, обеспечивающего продукцию рекомбинантного ИФН- быка и секрецию синтезированного белка в культуральную жидкость была продемонстрирована ранее (Николаев и др., 2002). Было показано, что скорость роста штаммаЦпродуцента не отличалась от исходного штамма, что говорило об отсутствии негативного влияния продукции рекомбинантного белка. Такие результаты могли быть связаны со снижением токсичности белка за счет секреции, или могли быть обусловлены особенностями самого штамма-продуцента.

Для выяснения этого вопроса получили штамм дрожжей P. pastoris, обеспечивающий внутриклеточное накопление ИФН- быка. Ген bIFNG клонировали в векторе экспрессии pPIC9, предварительно удалив из него сигнальную область альфа-фактора дрожжей S. cerevisiae ( MF ), отвечающую за секрецию рекомбинантного белка в культуральную среду.

Полученной плазмидой pBIG трансформировали штамм дрожжей P. pastoris GS115. При сравнении скорости роста исходного штамма и штаммапродуцента в условиях индукции обнаружили, что синтез чужеродного белка не подавляет рост дрожжей P. pastoris, в отличие от S. cerevisiae. При этом уровень продукции составлял около 20 мг/л.

Полученные данные позволяют говорить о том, что гетерологичный ИФН- оказывает негативное влияние на жизнедеятельность дрожжей S.