На правах рукописи

МИШЕНИНА ИРИНА ИВАНОВНА

РАЗРАБОТКА БИОЛОГИЧЕСКОГО СПОСОБА УТИЛИЗАЦИИ НЕПРИГОДНЫХ К МЕДИЦИНСКОМУ ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ, ПРОИЗВОДНЫХ ФЕНОЛА

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Пермь - 2008

Работа выполнена в ГОУ ВПО Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию и в лаборатории алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь

Защита диссертационной работы состоится 22 апреля 2008 г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при ГОУ ВПО Пермская государственная фармацевтическая академия по адресу: 614990, ГСП-277, г. Пермь, ул. Ленина, 48. Тел.: (342) 212-90-06.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Пермской государственной фармацевтической академии по адресу: 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Автореферат разослан л20 марта 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук, доцент Метелева Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время в Российской Федерации остро обозначилась проблема утилизации непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств - фальсифицированных, забракованных, с истекшим сроком годности или потерявших свои потребительские свойства по тем или иным причинам.

Все некачественные лекарства признаются фармацевтическими отходами и подлежат обязательному уничтожению. Анализ случаев уничтожения таких лекарственных средств на территории Российской Федерации в период с 1997 по 2005 показал отсутствие единой системы проведения этой процедуры и централизованных мест их хранения.

Научно обоснованные методики утилизации лекарственных средств, за исключением наркотических и психотропных, пока не разработаны. Используемыми на практике способами уничтожения являются слив в промышленную канализацию, сжигание на открытом воздухе или захоронение на свалках, при этом часто не учитываются физико-химические, токсические свойства лекарственных веществ и протекающие в процессе уничтожения химические процессы. Поэтому исследования по совершенствованию существующих и поиску новых путей утилизации непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств является актуальным.

Анализ исследований в области промышленной технологии показывает, что большое внимание, особенно за рубежом, уделяется биологическим методам, за которыми признается несомненный приоритет по показателям эффективности и безопасности. Природные микроорганизмы используют для обезвреживания химических отходов, в первую очередь, нефтепродуктов, тяжелых металлов, полихлорированных фенолов, фосфорорганических и других химических соединений. Ведутся активные поиски новых микроорганизмов, адаптированных к развитию в присутствии чужеродных веществ и вызывающих их биотрансформацию.

В качестве эффективных биодеструкторов ксенобиотиков могут быть использованы актинобактерии рода Rhodococcus, которые являются обычными компонентами техногенно-загрязненных сред обитания. Родококки способны усваивать многие труднодоступные для других микроорганизмов органические вещества, в том числе предельные и ароматические углеводороды, фенолы, гетероциклические соединения, что делает использование этой группы микроорганизмов перспективными при разработке биологического способа утилизации непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств. Помимо поиска микроорганизмов-деструкторов токсических веществ, необходимо также изучение влияния на человека и окружающую среду промежуточных и конечных продуктов их трансформации.

Цель и задачи исследования. Оценка возможности использования актинобактерий для биодеструкции непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств, производных фенола.

Для реализации поставленной цели необходимо решение следующих задач:

1. Провести скрининг активных штаммов актинобактерий рода Rhodococcus-биодеструкторов веществ, производных фенола, и выбрать среди исследуемых лекарственных средств модельное соединение.
2. Разработать способы идентификации и количественного определения продуктов его биодеструкции.
3. Установить оптимальные условия процесса биотрансформации.
4. На примере модельного соединения изучить динамику процесса биодеструкции.
5. Изучить свойства конечных продуктов биодеструкции (шлама).
6. На основе полученных результатов разработать технологические схемы и лабораторный регламент процесса утилизации непригодных к медицинскому применению лекарственных средств.

Научная новизна. На примере парацетамола показана возможность биологического способа биодеструкции непригодных к медицинскому применению лекарственных веществ (ЛВ) и их препаратов.

Путем скрининга 82 бактериальных штаммов в качестве деструкторов выбраны 2 штамма актинобактерий рода Rhodococcus. Установлены оптимальные условия процесса: состав среды культивирования; влияние вспомогательных веществ, входящих в состав таблеток парацетамола, на скорость его деструкции; адаптация родококков к фенолу, что расширяет перспективу их использования для биодеструкции других ЛВ, производных фенола. Получены биокатализаторы на основе иммобилизованных в полимерном криогеле поливинилового спирта клеток микроорганизмов, с участием которых идет значительное ускорение процесса биотрансформации парацетамола.

Разработаны методики анализа в культуральных средах: парацетамола методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и его основного метаболита п-аминофенола спектрофотометрическим методом, позволяющие контролировать динамику процесса.

Предложена схема трансформации парацетамола в процессе биодеструкции. Методом тонкослойной хроматографии доказано наличие в культуральных средах п-аминофенола, пирокатехина, гидрохинона, бензохинона и трех неидентифицированных веществ.

Изучены физико-химические свойства, токсичность и фитотоксичность конечных продуктов биодеструкции парацетамола (шлама).

Работа поддержана грантом РФФИ № 04-04-96057.

Практическая значимость. По результатам выполненных исследований разработан лабораторный регламент и представлены технологические схемы утилизации парацетамола. Процесс утилизации парацетамола с положительным результатом апробирован в ОАО Пермфармация с использованием ферментационной установки Фермус - 3 с загрузкой, в 30 раз превышающей загрузку при выполнении эксперимента (акт от 20.11.07 г.).

Результаты работы используются в учебном процессе Пермской государственной фармацевтической академии: в лекционном курсе и на лабораторных занятиях слушателей ФДПО, интернов и студентов на кафедрах фармацевтической технологии и фармацевтической химии ФДПО и ФЗО (акты от 05.04.05 г. и 01.11.07 г.), включены в лаборатор-ный практикум студентов очного отделения биологического факультета Пермского государственного университета (акт от 20.12.07 г.).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию. Номер государственной регистрации 01.9.50 007417.

Апробация работы. Результаты и основные положения диссертационной работы доложены на XI Российском национальном конгрессе Человек и лекарство, Москва, 2004; 69-й научно-практической конференции Медико-биологические проблемы Центрального Черноземья, Курск, 2004; V Международной научно-практической конференции Здоровье и образование в XXI веке, Москва, 2004; IX Международной экологической студенческой конференции Экология России и сопредельных территорий. Экологический катализ, Новосибирск, 2004; XII Российском национальном конгрессе Человек и лекарство, Москва, 2005; II Международной конференции Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биопотенциал, Пермь-Казань, 2005; II Всероссийской научно-практической конференции Техническая химия. Достижения и перспективы, Пермь, 2006; XIII Российском национальном конгрессе Человек и лекарство, Москва, 2006; XIV Российском национальном конгрессе Человек и лекарство, Москва, 2007; Научно-практической конференции, посвященной 70-летию Пермской государственной фармацевтической академии, Пермь, 2007.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, из них 6 статей (3 - в изданиях, рекомендованных ВАК).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Обоснование условий биологического способа деструкции ЛВ, производных фенола, на примере парацетамола как модельного соединения.

2. Способы оптимизации процесса деструкции парацетамола.

3. Методики анализа парацетамола и продуктов его биодеструкции в культуральных средах.

4. Результаты изучения свойств конечных продуктов деструкции парацетамола.

5. Технологические схемы и лабораторный регламент процесса биодеструкции парацетамола.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 156 страницах компьютерного текста, содержит 44 таблицы, 24 рисунка, 4 схемы, 4 фотографии, включает введение, обзор литературы (глава 1), экспериментальную часть (главы 2-5), список литературы, содержащий 181 библиографический источник, из которых 46 на иностранных языках, и Приложение.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, определены научная и практическая значимость работы.

В первой главе представлен обзор литературы, в котором рассмотрены способы утилизации непригодных к медицинскому применению лекарственных средств, перспективы использования для этой цели различных штаммов микроорганизмов, способы анализа парацетамола и п-аминофенола.

Во второй главе описаны объекты, материалы и методы исследования.

Третья глава посвящена разработке методик количественного определения парацетамола и п-аминофенола в культуральных средах; использованию метода ТСХ для исследования динамики процесса биодеструкции парацетамола.

В четвертой главе изложены исследования по оптимизации условий биодеструкции парацетамола, разработке технологической документации и её апробации.

Пятая глава посвящена изучению свойств шлама, образующегося в процессе биодеструкции парацетамола.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве модельных ЛВ использовали парацетамол (ацетаминофенол), ацетилсалициловую и салициловую кислоты как наиболее распространенные лекарственные средства, относящихся к производным фенола. В качестве биодеструкторов выбраны 82 штамма родококков, относящихся к 6 видам рода Rhodococcus: R. erythropolis (14 штаммов), R. fascians (14 штаммов), R.,,longusТТ(14 штаммов), R. opacus (12 штаммов), R. rhodochrous (14 штаммов), R. ruber (14 штаммов), представленные Институтом экологии и генетики микроорганизмов (ИЭГМ) УрО РАН.

Условия биодеструкции. Для выбора объекта исследования и активного штамма актинобактерий использовали микролуночный метод. Культивирование клеток осуществляли в водной минеральной среде К, в которую вносили исследуемые ЛВ в виде водных растворов. Биотрансформацию парацетамола изучали в условиях периодического перемешивания родококков в колбах Эрленмейера объемом 250 мл на шейкере (160 об/мин) при 280С. В качестве посевного материала служила 48-часовая бактериальная культура родококков, предварительно выращенная на мясо-пептонном агаре, которую добавляли в концентрации 3,2 х 107клеток/мл.

Биодеструкцию парацетамола осуществляли в двух минеральных средах Киевская (К) и RS, базовый состав которых включал следующие компоненты (г/л): KNO3 1.0, KH2PО4 1.0, K2HPО4 1.0, NaC1 1.0, MgSO4 . 7H2O 0.2, CaC12 . 6H2O 0.02, FeC13 . 6H2О 0.001; среда RS дополнительно содержала (NН4)2 SO4 2.0.

Парацетамол использовали в виде субстанции и лекарственной формы - таблеток, содержащих 0,2 г парацетамола, которые вносили в водные минеральные среды.

Изучено влияние каждого из вспомогательных веществ таблеток на скорость, полноту биотрансформации, рост и жизнеспособность микроорганизмов.

Для активизации бактериальных оксигеназ и адаптации клеток штаммы родококков выращивали в жидкой минеральной среде RS, содержащей 0,1% фенола и дрожжевой экстракт. Иммобилизацию осуществляли путем внесения бактериальной взвеси клеток родококков в раствор поливинилового спирта в соотношении 1:2. Условия утилизации парацетамола актинобактериями рода Rhodococcus, установленные в ходе эксперимента, воспроизведены на укрупненной ферментационной установке Фермус-3.