На правах рукописи

ЧУМАКОВА АННА СЕРГЕЕВНА

ВОЗРАСТНЫЕ И ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ И БЕЛКОВ ПРИ ОСТРОМ СТРЕССЕ И ВВЕДЕНИИ -ТОКОФЕРОЛА НА РАЗНЫХ ЭТАПАХ ПОСТНАТАЛЬНОГО ОНТОГЕНЕЗА

Специальность 03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата

биологических наук

Астрахань - 2009

Работа выполнена на кафедре физиологии и морфологии человека и животных Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Астраханский государственный университет, г. Астрахань

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент

Нестеров Юрий Викторович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Клаучек Сергей Всеволодович

доктор биологических наук, профессор Сердюков Василий Гаврилович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Волгоградский государственный университет

Защита состоится л 26 июня 2009 года в 12-00 часов на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном университете по адресу 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного университета по адресу 414056, г.Астрахань, ул.Татищева, 20а.

Автореферат разослан л __________ 2009 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук Нестеров Ю.В.

Список условных сокращений

АФК - активные формы кислорода

ОМ - окислительная модификация

ОМБ Ц окислительная модификация белков

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПОБ - перекисное окисление белков

СРО - свободнорадикальное окисление

АКМ - активные кислородные метаболиты

СР - свободные радикалы

СОД - супер оксид дисмутаза

АОС - антиокислительная система

МДА - малоновый диальдегид

ОС Ц окислительный стресс

ПОС Ц прооксидантная система

ПОЗ Ц прооксидантная защита

АОЗ Ц антиоксидантная защита

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время по-прежнему актуальной для современной биологии и медицины остается проблема стресса и его влияния на различные функциональные системы организма. Стресс рассматривается как способ достижения резистентности организма к действию экстремальных факторов различного генеза (Тигранян Р.А., 1988; Судаков К.В., 1996; Ерохин И.А., 1993). Вместе с тем, стресс может стать фактором, оказывающим повреждающее действие на органы и системы, ведущим к развитию заболеваний (Судаков К.В., 1996; Тигранян Р.А., 1988; Теплый Д.Л., 2008).

Важным проявлением стресс-реакции и адапционной перестройки является совершенствование деятельности регуляторных механизмов, участвующих в поддержании оптимального уровня интенсивности обменных процессов на уровне целостного организма (Федоров Б.М., 1991). При этом, несомненно, должны существовать органоспецифические особенности в осуществлении мобилизации различных механизмов при стрессе и проблема реализации стресс-реакции на уровне отдельных органов и тканей остается актуальной. В частности, малоизученным остается вопрос об изменениях метаболических процессов при развитии стресс-реакции.

Как известно, одним из ведущих повреждающих факторов при стрессе, детерминирующих развитие вторичных изменений органов и тканей, является интенсификация свободнорадикального окисления, которая наряду с этим рассматривается как один из универсальных физиологических процессов - окисление биологических субстратов при действии АФК (Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г., 1988; Барабой В.А., 1991; Ланкин В.З., 2001; Дубинина Е.Е., 2003). Анализ современной научной литературы позволяет прийти к заключению о том, что значительное количество работ посвящено перекисному окислению липидов (ПОЛ), в том числе стресс-индуцированному, при этом окислительной деструкции белков клеток и тканей уделяется меньшее внимание.

Механизмы и последствия стресс-реакции в организме зависят не только от метаболических возможностей различных тканей, но и от возраста индивидуума. В то же время, возрастной аспект исследования свободнорадикальной деструкции белковых и липидных компонентов тканей, незначительно представленный в литературе, должен дополнить известные к настоящему времени закономерности стресс-реакции на разных этапах онтогенеза и позволит существенно углубить представления о возрастных особенностях механизмов адаптации к экстремальным, стресс-индуцирующим воздействиям.

Цель исследования состояла в изучении возрастных и тканеспецифических особенностей перекисного окисления белков и липидов у крыс разных возрастных групп при остром стрессе и введении природного антиоксиданта альфа-токоферола.

Задачи исследования:

1.Провести сравнительное изучение интенсивности перекисного окисления белков и липидов интактных животных разных возрастных групп и выявить его тканеспецифические особенности в условиях фоновой активности.

2.На модели острого эмоционально-болевого стресса исследовать уровень липидной и белковой пероксидации в мозговой ткани и органах висцеральной системы у неполовозрелых, взрослых и старых крыс.

3.Провести сравнительный анализ выраженности возрастных и стресс-индуцированных изменений свободнорадикального окисления липидов и перекисной деструкции белков.

4.Изучить влияние природного антиоксиданта витамина Е на свободнорадикальное окисление липидных и белковых компонентов различных тканей в условиях фоновой активности, острого стресса и на разных этапах постнатального онтогенеза.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Свободнорадикальные процессы в условиях фоновой активности и стресса имеют тканевую специфичность, которая заключается в различной выраженности и направленности перекисного окисления белков и липидов в мозге, печени, легких и миокарде экспериментальных животных.

2. Процессы окислительной модификации белковых и пероксидного окисления липидных компонентов тканей не находятся в тесной зависимости друг от друга.

3. Реакция организма на однократное стрессорное воздействие зависит от возраста животного и отличается динамикой накопления продуктов перекисного окисления белков и липидов.

4. Антиоксидантное и (или) прооксидантное действие природного антиоксиданта -токоферола зависит от ткани и возраста животного.

Научная новизна. Впервые исследованы и сопоставлены процессы белковой и липидной пероксидации в различных тканях на разных этапах постнатального онтогенеза. В эксперименте выявлены возрастные особенности стрессорной динамики показателей ПОЛ и ПОБ в мозге, печени, легочной ткани и миокарде. Показано, что процессы СРО в этих органах не всегда изменяются однонаправлено у крыс разного возраста в норме и после стрессирования животных.

Получены ранее не известные данные о достаточно высокой силе влияния возрастного фактора на фоновую активность процессов белковой и липидной пероксидации в мозге, легких и миокарде, а также на стрессорную динамику изучаемых параметров. В частности, показано сильное влияние возраста на стрессорный уровень МДА в конечном мозге и легких и ПОБ в миокарде, мозге и печени. В ходе исследования показано также, что предварительное введение -токоферола приводит к его выраженному антиоксидантному действию в большинстве, но не во всех органах у молодых и половозрелых животных.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследования демонстрируют наличие возрастных и тканеспецифических различий свободнорадикальных процессов при остром стрессорном воздействии и расширяют представления о механизмах ранней реакции антиоксидантной системы на стресс-индуцирующие воздействия.

Онтогенетические различия в динамике накопления продуктов свободнорадикального окисления липидных и белковых компонентов тканей служат основанием для анализа результатов повреждающего действия эмоционально-болевого стресса в эксперименте и клинической практике. Выявленные эффекты природного антиоксиданта -токоферола открывают дальнейшие перспективы для его более широкого практического использования в медицине и ветеринарии при профилактике и лечении стрессорных повреждений органов. Материалы диссертационного исследования могут быть включены в курсы лекций по физиологии, экологической физиологии для студентов биологических специальностей университетов.

Апробация работы. Результаты исследования доложены и обсуждены на Международной конференции УСтруктурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза и при воздействии антропогенных факторов. Экология и здоровье населения. Актуальные проблемы биологии и медициныФ (Астрахань, 2000), ХХ международном симпозиуме УЭколого-физиологические проблемы адаптацииФ (Москва, Российский Университет Дружбы Народов, 2001), ХХI международном симпозиуме УЭколого-физиологические проблемы адаптацииФ(Москва, Российский Университет Дружбы Народов, 2003), Международной научной конференции Свободные радикалы, антиоксиданты и старение (Астрахань, 2006), VIII Международной научно-практической конференции Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря (Медико-биологические исследования) (Астрахань, 2007), на итоговых научных конференциях студентов, аспирантов и преподавателей Астраханского государственного университета (2005-2008),.

По материалам диссертационного исследования опубликовано 9 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, включающего четыре подглавы, главы материал и методы исследования, двух глав, посвященных результатам исследования и их обсуждению, выводов и списка литературы. Текст иллюстрирован 8 таблицами и 25 рисунками. Библиографический список включает 321 источников, из которых 184 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводились на белых крысах-самцах в трех сериях опытов на 3-х возрастных группах животных: 1 - неполовозрелые 7 недельного возраста массой 64 г; 2 - половозрелые животные 4-х месячного возраста, средней массой 153 г.; 3 - старые животные 18-ти месячного возраста, средней массой 385 г, всего 84 животных. Животные были разделены на следующие группы: 1) интактные животные, 2) животные, подвергавшиеся эмоционально-болевому стрессу, 3) крысы, получавшие масляный раствор -токоферолацетата в течение 14 дней per os в дозе 1 мг/100 г массы тела, 4) крысы, подвергавшиеся эмоционально-болевому стрессу с предварительном введением -токоферола в той же дозе. Животные содержались в стандартных условиях вивария при естественном освещении и свободном доступе к воде и корму. По окончании опытов животных декапитировали после предварительной наркотизации крыс внутрибрюшинным введением нембутала в дозе 4 мг/100 г массы тела (Арушанян Э.Б., Толпышев Б.А., 1981). Перед экспериментом животных хендлировали (Жуков Д.А., ВиноградоваЕ.П., 1995; Виноградова Е.П., Чаадаева Е.В., 1994).

Моделью эмоционально-болевого стресса служило электрокожное раздражение, для чего использовали прямоугольную камеру с решетчатым металлическим полом, соединенным с источником переменного тока фиксированного сопротивления, получаемого с помощью лабораторного автотрансформатора. Крысу помещали в установку на 5 мин. для ознакомления с ней, а затем подавали электрический ток с напряжением 40 V на протяжении 15 мин. с интервалами 30 сек. (Буреш Я. И соавт, 1991). Животных забивали сразу после извлечения из камеры. После декапитации забирали кровь, выделяли большие полушария и гипоталамус, вскрывали грудную и брюшную полость и отпрепаровывали легкие, сердце и печень для последующей гомогенизации, экстрагирования тканей и биохимического анализа.

О развитии стресса у животных судили по изменению количества эозинофильных гранулоцитов (проба на эозинопению) и количеству адреналина в крови, а также относительной массе надпочечников (по отношению к массе тела).

Количество эозинофильных гранулоцитов в крови, забираемой из хвостовой вены, опнределяли после их окрашивания жидкостью Дунгера в камере Горяева с последующим пересчетом числа эозинофилов в 1 мм3 крови (Ронин В.С., Старобинец Г.М., 1989). Для окрашивания эозинофилов готовили основной раствор (эозин К, вода и 40% формалин) и рабочий раствор (2 части основного раснтвора, 2 части ацетона и 6 частей воды). Во флакон помещали 0,2 мл рабончего раствора, пипеткой от гемометра добавляли 0,02 мл крови, взятой из хвостовой вены, перемешивали и заполняли камеру Горяева. Подсчет пронводили через 4 минуты при увеличении по всей поверхности сетки.

Количество адреналина в крови, получаемой после декапитации животных, проводили по методу, основанном на колориметрическом определении интенсивности синего окнрашивания, возникающего при взаимодействии адреналина с реактивом Фолина (по Филиппович Ю.Б. и соавт., 1975). Для этого к 1 мл плазмы крови добавляли 4 мл свежеприготовленного 10% раствора N2СО3, 0,5 мл реакнтива Фолина и доводили объем пробы раствором N2СО3 до 10 мл. Паралнлельно готовили стандартный раствор адреналина с концентрацией 0,05 мг/1 мл. Экстинцию проб измеряли при =700. Расчет проводили по формуле: С х Eоп/Ест., где С - концентрация адреналина в стандартном растворе, Е - экстинция опытной и стандартной проб.

Уровень свободнорадикального окисления определяли по скорости перекисного окисления липидов и перекисного окисления белков (ПОБ) в гомогенатах больших полушарий, гипоталамусе, печени, легких и миокарде.