Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения Российский научно-исследовательский противочумный институт УМикробФ (ФГУЗ РосНИПЧИ УМикробФ)

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ

член-корр. РАМН,

доктор медицинских наук, профессор

Кутырев Владимир Викторович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Ананьева Юлия Васильевна

доктор медицинских наук, профессор

Богомолова Нина Викторовна

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник

Малецкая Ольга Викторовна

Ведущая организация - ФГУ л48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации, г. Киров.

Защита состоится л ___________ 2009 г. в л часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 при ФГУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт Микроб по адресу: 410005 г. Саратов, ул. Университетская, д.46.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт Микроб

Автореферат разослан л _____________ 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник А.А. Слудский

Актуальность проблемы. Ежегодно в мире инфекционные болезни, и в их числе особо опасные инфекции, регистрируются более чем у двух миллиардов человек [WER, 2007; ЕИКЗР, 2007]. В результате роста и развития экономической деятельности, открытия границ, миграции населения, увеличения объемов международных сообщений и торговли тенденция к глобализации инфекционных болезней будет сохраняться. Реальная потребность создания современных, надежных средств профилактики и лечения особо опасных инфекционных болезней обусловливает интерес исследователей к всестороннему рассмотрению проблемы взаимодействия микро- и макроорганизма [Smith H., 2000; Бухарин О.В. и др., 2002; Туйгунов М.М. и др., 2003; Железникова Г.Ф., 2006].

Молекулярно-биологический анализ возбудителей холеры, чумы и туляремии, являющийся основой для получения новых знаний о ключевых факторах их патогенности и вирулентности, значительно опережает исследования в области изучения различных сторон взаимодействия патогенных бактерий с макроорганизмом [Farugue S.M. et al., 2004; Zhou D. et al., 2006; Смирнова Н.И., Кутырев В.В., 2006]. Но для адекватного решения вопросов, связанных с разработкой новых и совершенствованием уже имеющихся средств и методов эффективной борьбы с особо опасными инфекционными болезнями, этого недостаточно.

Инфекционный процесс, рассматриваемый как результат взаимодействия микро- и макроорганизма, отражает состояние нарушенного баланса между уровнями экспрессии детерминант вирулентности первого и адекватностью функционирования защитных барьеров второго [Бондаренко В.М., 1999; Атауллаханов Р.И., Гинцбург А.Л., 2005; Portnoy D., 2005; Bradley C. et al., 2005]. В этом аспекте представляют интерес исследования особенностей взаимодействия организма биомоделей с возбудителем инфекции, основанные на выяснении роли молекулярных механизмов патогенности микроорганизма, приводящих к разбалансировке функционирования систем реагирования и контроля макроорганизма.

Для решения этой задачи необходимо расширение методической базы традиционного экспериментального исследования инфекционного и вакцинного процессов при работе с возбудителями особо опасных инфекционных болезней за счет внедрения морфофункционального и морфометрического анализа адаптационно-компенсаторных реакций макроорганизма на патоген. Так, для объективного суждения о состоянии функциональных систем макроорганизма при моделировании экспериментального инфекционного процесса в количественной оценке нуждаются: выраженность воспалительных и иммунных реакций, интенсивность регенеративных и некротических процессов, особенности и интенсивность гистохимических и иммуногистохимических характеристик клеток нейроэндокринной системы (НЭК), элементов мукозального гомеостаза и ряд других параметров.

Эксперименты на лабораторных животных являются важным этапом при доклиническом испытании вакцин. При этом научные основы оценки качества вакцин, несмотря на большой фактический материал, накопленный в этой области, только начинают формироваться. В то же время имеющиеся вакцины против особо опасных инфекционных болезней не лишены недостатков [Медуницын Н.В., 2004; Kabir S., 2005], а поиск диагностических и прогностических критериев их безопасности является актуальной научной проблемой, требующей всестороннего изучения.

Важное место в перечне методов доклинической оценки вакцин занимает морфологический анализ [РД 42-28-8-89; РД 42-28-10-90; СП 3.3.2.561-96; МУ 3.3.1.1113Ц02; МУ 3.3.1.2075-06; МУ 3.3.1.2161-07]. Оценка степени выраженности изменений в органах и тканях биомоделей при экспериментальном вакцинном процессе, базирующаяся на применении тезиса Уоптимального морфофункционального соотношенияФ элементов системы для ее эффективной работы [Бородин Ю.И. и др., 1992; Труфакин В.А., Шурлыгина А.В., 2002], подразумевает широкое использование методов морфометрического анализа. Но многие структурные и функциональные взаимосвязи в работе системы реагирования, контроля и защиты макроорганизма (нейроэндокринной, иммунной) при вакцинном процессе, обусловленном препаратами для специфической профилактики холеры, чумы и туляремии, остаются мало изученными

В связи с этим комплексное исследование влияния возбудителей Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Francisella tularensis с определенным набором детерминант вирулентности и иммуногенности на адаптационно-компенсаторные реакции макроорганизма особенно актуально для расширения представлений о патогенезе этих заболеваний. Разработка алгоритма проведения патоморфологического исследования экспериментального инфекционного и вакцинного процессов направлена на формирование научно-методической основы для решения важной проблемы, связанной с информативной и объективной оценкой качества вакцинных препаратов против холеры, чумы и туляремии на этапах их разработки и доклинического испытания.

Цель исследования. Совершенствование научно-методической основы оценки качества вакцинирующих препаратов против особо опасных инфекций, базирующейся на комплексном исследовании влияния возбудителей холеры, чумы и туляремии с различным набором детерминант вирулентности и иммуногенности на адаптационно-компенсаторные реакции макроорганизма.

Задачи исследования:

1. Осуществить подбор штаммов возбудителей V.cholerae, Y. pestis, F. tularensis с различной генетической характеристикой для воспроизведения экспериментального инфекционного процесса и изучить их влияние на адаптационно-компенсаторные реакции макроорганизма, определяемые по ряду морфометрических параметров.

2. Разработать алгоритм патоморфологической оценки тяжести течения экспериментального инфекционного процесса при холере, чуме и туляремии. Определить возможность его применения при использовании аппаратно-программных компьютерных комплексов.

3. Предложить морфометрические критерии для отбора штаммов V.cholerae, используемых в качестве контрольных в морфологических и иммунологических исследованиях.

4. Выявить особенности влияния холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп на клетки APUD-системы кишечника и другие элементы кишечного барьера биомоделей.

5. Охарактеризовать течение инфекционного процесса в организме биомоделей, используя штаммы чумного и туляремийного микробов с различной вирулентностью. Сопоставить данные морфологического и морфометрического анализа изменений во внутренних органах подопытных животных с генетическими особенностями этих штаммов.

6. Провести морфофункциональный и морфометрический анализ адаптационно-компенсаторных реакций макроорганизма при моделировании вакцинного процесса с использованием коммерческих вакцин и экспериментальных препаратов.

7. Оценить реакцию барьерных структур (желудочно-кишечного тракта, лимфоидных органов, дыхательной системы) макроорганизма при введении живых коммерческих вакцин, аттенуированных и рекомбинантных штаммов возбудителей холеры, чумы и туляремии.

8. Изучить реакцию апудоцитов функционально значимых систем организма, клеток мукозального эпителия, образований эффекторной зоны иммунной системы желудочно-кишечного тракта и легких, лимфоидной системы при моделировании инфекционного процесса на фоне предварительной иммунизации биомоделей коммерческими и экспериментальными препаратами для специфической профилактики холеры, чумы и туляремии.

Научная новизна. Впервые при изучении влияния на макроорганизм штаммов возбудителей V. cholerae, Y. рestis и F. tularensis c различной генетической характеристикой разработан алгоритм проведения патоморфологических исследований экспериментального инфекционного и вакцинного процессов и определены морфометрические параметры, объективно характеризующие тяжесть течения патологического процесса у биомоделей. Впервые оценена реакция нейроэндокринных клеток (НЭК) лимфоидных органов, лимфатических структур в легких и кишечнике при особо опасных инфекциях и вакцинации против них. Подобраны морфометрические параметры для характеристики адаптационно-компенсаторных реакций макроорганизма при моделировании инфекционного процесса на фоне предварительной иммунизации против холеры, чумы и туляремии. Обоснована необходимость проведения комплексных исследований при оценке безвредности, реактогенности и иммунологической эффективности вакцин против холеры, чумы и туляремии и показаны возможности применения для этого аппаратно-программных компьютерных комплексов с целью получения стандартизированных объективных результатов. Усовершенствована научно-методическая основа оценки экспериментальных препаратов для специфической профилактики холеры, чумы и туляремии.

Впервые показана возможность применения морфометрических характеристик состояния апудоцитов кишечника, клеток эффекторной зоны иммунной системы и слизеобразующих элементов мукозального эпителия желудочно-кишечного тракта для оценки качества противохолерных вакцин и степени выраженности холерного инфекционного процесса (патент на изобретение № 2301075 Способ оценки качества вакцинных препаратов против холеры). Впервые предложены морфометрические критерии для отбора штаммов холерного вибриона, используемых в качестве контрольных в морфологических и иммунологических исследованиях (патент на изобретение № 2254371 Авирулентный тест-штамм бактерий Vibrio Cholerae биовара eltor серовара Ogawa (ctxA-, tcpA-, toxR-, zot-), используемый в иммунологических, генетических исследованиях и учебном процессе).

Практическая значимость и внедрение. Предложенный алгоритм патоморфологического исследования был применен при проведении Государственных доклинических испытаний рекомбинантного штамма V. cholerae eltor КМ 184 - кандидата в живые противохолерные вакцины (Протокол № 5 от 15.01.2001 г.)

Результаты исследований использованы в следующих документах:

- Методические указания МУ 3.3.1.2075-06 Основные требования к вакцинным штаммам холерного вибриона, утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко и введенные в действие с 11.07.06 г. взамен методических указаний Основные критерии оценки вакцинных штаммов холерного вибриона, утвержденных Госкомсанэпиднадзором России от 17.10.1994 г. № 01-19/48-11;

- Методические указания МУ 3.3.1.2161-07 Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба, утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко и введенные в действие впервые с 01.04.07 г.;

- Методическое пособие Моделирование холерной инфекции методом RITARD, одобренное Ученым советом (протокол № 1 от 01.02.02 г.) и утвержденное директором РосНИПЧИ Микроб (05.02.02 г.);

- Методические рекомендации Оценка эффективности противохолерных вакцин по ряду морфофункциональных показателей адаптационно-приспособительной реакции биомодели к холерной инфекции, одобренные Ученым советом (протокол № 5 от 11.05.06 г.) и утвержденные директором РосНИПЧИ Микроб (12.05.06 г.);

- Методические рекомендации Техника и прядок забора гистологического материала для морфометрических исследований от биомоделей, зараженных возбудителями I-II групп патогенности, одобренные Ученым советом (протокол № 3 от 17.06.08 г.) и утвержденные директором РосНИПЧИ Микроб (18.06.08 г.).

Научные и практически значимые результаты работы используются в лекционном курсе первичной специализации и усовершенствования врачей и биологов по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ Микроб.

Опубликованные материалы исследования явились основой для написания монографий:

- APUD-система кишечника животных при холерной инфекции, интоксикации и вакцинальном процессе.- Деп. ВИНИТИ, 2000;

- Патоморфологические подходы к доклинической оценке холерных вакцин.- Деп. ВИНИТИ, 2002.

- Патоморфологические аспекты доклинических испытаний вакцин против чумы, сибирской язвы и холеры.- Саратов: ЗАОП - ИППОЛиТ-99, 2004.