На правах рукописи

Болотина Наталья Александровна

ОПУХОЛЬ-ПРОМОТОРНЫЙ ЭФФЕКТ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ (ПАУ).

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва-2008

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию и в НИИ Канцерогенеза Государственного учреждения Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Дубовая Татьяна Клеониковна

Доктор биологических наук, профессор Кобляков Валерий Александрович

Официальные оппоненты:

Кандидат медицинских наук,

доктор биологических наук, профессор Кондратенко Вадим Григорьевич

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН РФ

Доктор медицинских наук, профессор Ивков Николай Николаевич

ГОУ ВПО РГМУ Росздрава

Ведущее учреждение:

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН РФ

Защита состоится л8 декабря 2008 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.04 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан л29 октября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор А.И.Щеголев

Список используемых сокращений:

АФК - активные формы кислорода

БП - бензо/а/пирен

БеП - бензо/е/пирен

ДМБА - 7,12-диметилбенз/а/антрацен

МЩК - межклеточные щелевые коммуникации

3-МХ - 3-метилхолантрен,

-НФ - -нафтофлавон

ПАУ - полициклические ароматические углеводороды

АР-1 - аctivator protein-1

NF-kB - ядерный транскрипционный комплекс kB

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы.

В настоящее время для решения целого ряда проблем цитологии, клеточной биологи и биологии развития используются самые разные модели. Это обусловлено поразительным множеством и сходством морфофункциональных, молекулярно-генетических и биохимических изменений, лежащих в основе жизнедеятельности клеток в различных условиях функционирования в норме и при развитии патологических процессов. С этих позиций довольно часто в экспериментальных исследованиях используется модель канцерогенеза. Очевидно, что работы в этой области важны и для биологи, и для практической медицины. Причины возникновения злокачественных опухолей многообразны. К ним следует отнести ультрафиолетовое излучение, ионизирующую радиацию, инфекционные агенты, генетические факторы и др. Лидирующие позиции в этом списке занимают химические канцерогены (Канцерогенез, 2004; Trosko, 2000; Loeb et all., 2008).

Среди химических канцерогенов имеются, так называемые, непрямые и прямые. Непрямые канцерогены (проканцерогены) исходно биологически инертные вещества и для их превращения в активный канцероген требуется метаболическая трансформация в клетке. Прямые канцерогены в исходной форме реализуют свой канцерогенный потенциал. Кроме того, среди химических канцерогенов выделяют полные и неполные. Полные канцерогены способны индуцировать развитие опухоли без дополнительных воздействий. Неполные - индуцируют или стадию инициации (инициаторы), или стадию промоции (промоторы).

Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), используемые в нашей работе, являются полными непрямыми канцерогенами.

Именно ПАУ - наиболее распространенные загрязнители окружающей среды. Эти соединения находятся в выхлопных газах двигателей внутреннего сгорания, в табачном дыме, их выявляют в продуктах питания, подвергшихся термической обработке и пр. Как известно, в течении химического канцерогенеза принято выделять три стадии: инициация, промоция и прогрессия. Что касается ПАУ, то в первую очередь следует обратить внимание на то, что до настоящего времени исследования по механизму их канцерогенного действия были направлены на изучение инициации, поскольку считалось, что именно эта стадия является определяющей в развитии опухоли при действии непрямых канцерогенов (Boutwell et al., 1982; Trosko et al., 1996). Попытки применения и разработка новых препаратов, ингибирующих стадию инициации (в первую очередь антиоксиданты, ингибиторы свободно - радикальных процессов) успеха не принесли. Исследования последнего времени дали основания считать, что стадией, определяющей канцерогенность ПАУ, является стадия промоции (Thilly W.2003). Поэтому изучение механизмов промоции при действии непрямых канцерогенов является важной и актуальной задачей, дающей в перспективе возможность создания профилактических и лечебных препаратов, препятствующих (или замедляющих) развитию опухолевого процесса.

Цель исследования - изучение механизмов опухоль-промоторного действия полных канцерогенов на примере ПАУ на модели культуры клеток гепатом.

Задачи исследования:

1. провести сравнительное изучение действия канцерогенных ПАУ и их неканцерогенного аналога на функциональную активность межклеточных щелевых коммуникаций (МЩК) в культуре клеток гепатом, экспрессирующих и неэкспрессирующих ферменты метаболизма и Ah-рецептор.

2. исследовать образование активных форм кислорода (АФК) в клеточных культурах при действии канцерогенных и неканцерогенных ПАУ;

3. сравнить экспрессию белков-супрессоров р21 и р27 в культуре клеток при действии ряда ПАУ.

4. исследовать влияние ПАУ на активацию транскрипционных факторов АР-1 (activated protein 1) и NF-kB (ядерный транскрипционный комплекс kВ).

Научная новизна работы.

В нашей работе впервые использована в качестве сравнительной модели для изучения опухолевой промоции уникальная культура клеток гепатомы Г-27, в которой отсутствует экспрессия цитохрома Р450 и Ah-рецептора.

Проведенное сравнительное исследование показало, что наблюдаемые нами эффекты ПАУ, ассоциированные с промоторной стадией канцерогенеза (подавление функциональной активности МЩК, активация транскрипционного фактора NF-kB) обусловлены действием исходной химически инертной молекулой вещества.

Мы показали, что эффекты канцерогенных ПАУ, ассоциированные с промоторной стадией канцерогенеза, в культуре клеток реализуются по нескольким механизмам в зависимости от экспрессии Ah-рецептора и изоформ цитохрома Р450 в клетках-мишенях.

Впервые продемонстрировано существование ранее неизвестного механизма опухоль-промоторного действия канцерогенных ПАУ.

Практическая значимость работы.

Известно, что в химическом канцерогенезе выделяют 3 стадии: инициация, промоция и прогрессия. Стадия инициации химического канцерогенеза для ПАУ достаточно хорошо изучена, однако в представлениях о стадии промоции, необходимой для дальнейшего выживания инициированной клетки, остается много невыясненных вопросов. Полученные нами данные позволяют ответить на некоторые из них. В частности, нами установлено, что нарушение функционирования МЩК, активация некоторых белков, регулирующих клеточную пролиферацию и апоптоз на стадии опухолевой промоции, вызываются исходной биологически инертной молекулой ПАУ, по ранее неизвестному механизму.

Полученные данные углубляют существующие представления о механизмах действия ПАУ, реализующихся на стадии опухолевой промоции.

Полученные результаты важны для экспериментальной онкологии, гистологии, биохимии и молекулярной биологии, кроме того, их целесообразно учитывать при разработке новых способов лечения и профилактики онкологических заболеваний.

Внедрение в практику Полученные диссертантом данные внедрены в лекционные курсы на кафедрах гистологии и эмбриологии лечебного факультета и биохимии РГМУ.

Основные положения выносимые на защиту:

1. Стадия промоции является определяющей в развитии опухоли при действии ПАУ. Эффект канцерогенных ПАУ реализуется в зависимости от наличия или отсутствия экспрессии Ah-рецептора и изоформ цитохрома Р450 в клетках-мишенях.

2. Выявление новых аспектов механизма канцерогенного действия ПАУ на стадии промоции опухолевого роста было возможно в связи с:

- сравнительным изучением действия ПАУ на модели культуры клеток гепатом с экспрессией Ah-рецептора и цитохрома Р450 (HepG2) и без таковой (Г-27) как наиболее перспективной для изучения механизмов опухоль-промоторного эффекта ПАУ

- использованием комплексного методического подхода для оценки состояния клеток с применением морфологических, биохимических, биофизических, иммунологических, молекулярно-биологических методов

3. Канцерогенные ПАУ оказывают воздействие на ключевые функции клеток: подавляют функциональную активность МЩК, влияют на пролиферативную активность клеток и апоптоз.

4. Полученные результаты позволяют высказать предположение о существовании (кроме Ah-рецептора и цитохрома Р450) в клетках неизвестного ранее фактора, взаимодействие с которым канцерогенных ПАУ нарушает гомеостаз, приводящий к промоции.

Апробация работы. Материалы исследования доложены и обсуждены на совместной научной конференции кафедр гистологии лечебного и педиатрического факультетов РГМУ и морфологии медико-биологического факультета РГМУ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, 7 из них - в центральной печати.

Структура и объем диссертации

Материал диссертации изложен на 100 страницах машинописного текста и состоит из введения и глав: Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение и выводов. Работа проиллюстрирована - 21 рисунком, 2 таблицами. Библиографический материал включает в себя ссылки на 160 источников литературы, в том числе 20 отечественных и 140 иностранных.

Содержание работы

Материалы и методы исследований.

В экспериментах использовались клеточные культуры 2-х типов гепатом.

Гепатома Г-27 - низкодифференцированная перевиваемая опухоль, вызванная диэтилнитрозамином (Швемберг 1970). Клетки гепатомы человека HepG2 были получены из АТСС (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA). Выбор данных клеточных культур объясняется отсутствием ферментов цитохрома Р450 и Ah-рецептора в клетках культуры Г-27 в отличие от клеток культуры HepG2. Благодаря чему, имеется возможность сравнить воздействие ПАУ на клетки в присутствии и отсутствии системы цитохрома Р450.

В экспериментах в качестве канцерогенных ПАУ использовались: бензо/а/пирен (БП), 3-метилхолантрен (3-МХ), 7,12-диметилбенз/а/антрацен (ДМБА) и неканцерогенный аналог БП - бензо/е/пирен (БеП).

В работе определялись нижеописанные параметры

Функциональная активность межклеточных щелевых контактов (МЩК).

Проницаемость МЩК определяли методом внутриклеточных инъекций флуоресцентного красителя люцифера желтого СН (Sigma США) в одну из клеток монослоя с последующей регистрацией распространения его в соседние клетки. Флуоресценция регистрировалась при помощи флуоресцентного микроскопа Axiolab (Zeiss, Германия) с фазово-контрастным освещением и 40 водно - иммерсионным объективом и видео камерой CCTV (Panasonic Япония), соединенной с компьютером. Окрашивание клеток происходило через 2 минуты после инъекции.

Определение уровня бензо/а/пирена (БП) и бензо/е/пирена (БеП) в клетках производилось методом квазилинейной люминесценции при низких температурах. Количество БП определялось при 298 возбуждения и 403флуоресценции, а для БеП при 334 возбуждения и 388флуоресценции.

Реакция связывания NF-kB (ядерный транскрипционный комплекс kВ) и

АР-1 (Асtivator protein 1) с консенсусным олигонуклеотидом (Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA). Белковый экстракт из ядер для проведения реакции получали как описано ранее (Lyakh et al., 2000). Реакцию связывания проводили следующим образом: инкубировали 10 микрограммов ядерного белка в 20 микролитрах связывающего буфера (HEPES (pH 7.5), 10 mM; KCl - 80 mM; EDTA - 1 mM; EGTA - 1 mM; глицерол - 6%, поли(dI-dC) - 0.5 мкг и консенсусного олигонуклеотида, меченого по 5Т-концу фосфором 32Р (1 x 105 - 3 x 105 cpm). Реакцию мечения проводили согласно протоколу производителя нуклеотидов (Promega Corp., Madison, США). Комплексы белок-олигонуклеотид анализировали в 6% нативном ПААГ, содержащем 0.25-кратный буфер ТБЕ. Высушенный гель экспонировали с пленкой Кодак при -80 в течение 1-7 суток.

Электрофорез и Иммуноблоттинг. Клетки на стадии формирования 80% монослоя промывали физиологическим раствором, снимали с чашек и получали клеточные экстракты как описано ранее (Красильников М.А. и др., 2004). Электорофорез образцов, содержащих по 60 мкг белка, проводили в 12,5% SDS-ПААГ геле и переносили на нитроцеллюлозные фильтры Immobilon-P (Millipore Corporation, Bedford, США) методом электропереноса.

Антитела к IкB были получены из Santa Cruz Biotechnology Inc., США и к фосфо-Ser32- IкB - из Cell Signaling Technology Inc, США и к р21Cip/Kip(Sigma) и р27Cip/Kip (Sigma). Инкубация с АТ к IкB длилась 1,5 часа при комнатной температуре, а к фосфо -Ser32- IкB - 12 ч (в буфере без молока) при 25С. Инкубация с АТ к р21 и р27 длилась в течение 12 часов при комнатной температуре. В качестве вторичных для АТ к IkB и фосфо -Ser32- IкB использовались кроличьи АТ, коньюгированные с пероксидазой (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция). В качестве вторичных для АТ к р21 ир27 использовались мышиные АТ, коньюгированные с пероксидазой (Sigma). Проявление специфического сигнала осуществлялось с помощью системы ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция).

Для оценки интенсивности иммуноблотинга с АТ к р21Cip/Kip и р27Cip/Kip использовали программу Scion Image (версия 4. 02) Scion corporation США.

Транзиторная трансфекция и определение активности гена-репортера. Для транзиторной трансфекции клеток использовалась плазмида, содержавшая ген-репортер-люциферазы под контролем промотора с NF-kB-чувствительным элементом, любезно предоставленной профессором А.В. Гаспарьяном.