На правах рукописи

Пауль Галина Александровна

КОЛИЧЕСТВЕННАЯ И КАЧЕСТВЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ МОЧИ

ПРИ МУКОПОЛИСАХАРИДОЗАХ И САХАРНОМ ДИАБЕТЕ

03.00.04 - биохимия

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Новосибирск - 2007

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте физиологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Короленко Татьяна Александровна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Усынин Иван Федорович

доктор медицинских наук Ким Лена Борисовна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава

Защита состоится _____________2007 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 при Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (630117, г. Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2; тел.: 8-3832-33-54-81).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения научно-исследовательского института биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (630117, г. Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2).

Автореферат разослан ________________2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Г.С. Русских

Общая характеристика работы

Актуальность исследования. В последнее десятилетие существенно пересмотрены структурные и функциональные характеристики внеклеточного матрикса. Протеогликаны внеклеточного матрикса играют важную роль в межклеточных взаимодействиях (Iozzo, 1998; Roseman, 2001), участвуют в регуляции дифференцировки, созревании и росте клеток специализированных тканей (Hegewald et al., 2004; Schulthz et al., 2004; Stern et al., 2006), в защите сосудистой стенки и регуляции проницаемости базальных мембран (Nigro et al., 2005). Протеогликаны регулируют фибриллогенез коллагена, вовлечены в процессы роста и инвазии опухолевых клеток (Кабак и соавт., 1990; Kuo et al., 1991; Stern et al., 2004), участвуют в восстановительных процессах, выполняя компенсаторно-приспособительные функции (Raman et al., 2005; Taylor et al., 2006).

Нарушения функционирования компонентов внеклеточного матрикса наблюдаются при многих заболеваниях человека, поскольку протеогликаны вовлечены в основные типовые патологические процессы (воспаление, склероз, ишемия, старение и др.). Гликозаминогликаны (ГАГ) являются важным компонентом протеогликанов (Taylor et al., 2006).

При наследственных лизосомных заболеваниях мукополисахаридозах описаны генетические дефекты лизосомных ферментов, отвечающих за деградацию ГАГ (Neufeld et al., 1970, 1975). Эти данные стимулировали изучение патогенеза, диагностики, лечения больных мукополисахаридозами, особенно при заместительной ферментной терапии и трансплатации костного мозга. Накопление ГАГ в тканях и повышенное выделение их с мочой, как результат значительного снижения активности лизосомных гидролаз в клетках, подтверждает предполагаемый клинический диагноз у больных мукополисахаридозами и позволяет проведение первого этапа диагностики лизосомных болезней накопления (Видершайн, 1980; Краснопольская, 2005). Для количественного определения ГАГ мочи предложено несколько методов, которые нуждаются в совершенствовании.

Изменения экскреции и качественного состава ГАГ мочи изучаются при ряде заболеваниий: диабетической нефропатии (De Muro et al., 2002); аутоиммунных заболеваниях - системной красной волчанке (Bicer et al., 2003), ревматоидном артрите (Ueta et al., 1994), аутоиммунном тиреоидите (Winsz-Szczotka et al., 2006); амилоидозе (Linker et al., 1987; Magnus et al., 1992); нефролитиазе (Tsujihata et al., 2006). Изменения состава ГАГ мочи наравне с микроальбуминурией рассматриваются как показатель кардиоваскулярного риска (Russo et al., 2004; Ballinger et al., 2004).

Многолетний опыт биохимического селективного скрининга сульфатированных ГАГ у пациентов, направленных на медико-генетическое консультирование с целью выявления наследственных болезней обмена, обнаружил большой контингент больных с повышенной экскрецией сульфатированных ГАГ, не связанных с наличием мукополисахаридозов. Дальнейшие исследования показали, что среди пациентов с повышенной экскрецией сульфатированных ГАГ выделяется значительная группа больных с нарушением углеводного обмена (сахарного диабета I и II типа). В связи с этим возникла необходимость проведения дифференциальной диагностики выведения ГАГ с мочой при разных механизмах нарушения обмена протеогликанов.

В этой ситуации изучение роли одного из основных компонента внеклеточного матрикса - ГАГ в патогенезе генетически обусловленных мукополисахаридозов и диабетической нефропатии чрезвычайно актуально. Известно, что у 40-45 % больных сахарного диабета как типа 1, так и типа 2 развивается диабетическая нефропатия, которая является основной причиной смертности больных (Дедов, Шестакова, 2000).

Цель работы. Изучить особенности экскреции и качественного состава сульфатированных гликозаминогликанов мочи при мукополисахаридозах и сахарном диабете, как клинических моделях нарушения протеогликанов и углеводного обмена.

Задачи исследования:

1. Выявить частоту гиперэкскреции и изменений качественного состава сульфатированных гликозаминогликанов мочи при проведении биохимического скрининга наследственнных болезней обмена человека.

2. Изучить экскрецию и качественный состав сульфатированных гликозаминогликанов мочи, активность лизосомных ферментов в лейкоцитах и плазме крови, активность хитотриозидазы в плазме крови у больных мукополисахаридозами и болезнью Гоше.

3. Оценить количество и качественный состав сульфатированных гликозаминогликанов мочи у больных сахарным диабетом с разной степенью выраженности диабетической нефропатиии.

4. Изучить особенности экскреции сульфатированных гликозаминогликанов с мочой у крыс в эксперименте при воспроизведении модели мукополисахаридоза и сопоставить изменения показателей с соответствующими данными у больных мукополисахаридозами.

Научная новизна. Впервые представлены данные о частоте встречаемости синдрома гиперэкскреции сульфатированных гликозаминогликанов с мочой в сибирской популяции. Установлено, что качественный состав сульфатированных гликозаминогликанов зависит от характера заболеваний.

Проведение определения экскреции и качественного состава ГАГ мочи и оценки активности хитотриозидазы плазмы крови уже на первом этапе биохимического скрининга наследственных болезней обмена человека позволяет отдифференцировать мукополисахаридозы и болезнь Гоше.

Прогрессирование диабетической нефропатии сопровождается не только увеличением экскреции сульфатированных гликозаминогликанов, но и нарушением соотношения сульфатированных гликозаминогликанов за счет увеличения гепарансульфата.

Практическая значимость. Материалы диссертации использованы при подготовке методического пособия для врачей Наследственные болезни обмена веществ: общие принципы выявления нарушений обмена аминокислот, сахаров, гликозаминогликанов (Новосибирск, 2004). Результаты работы внедрены в практическую деятельность клинико-диагностической лаборатории Государственного Новосибирского областного клинического диагностического центра и медико-генетической консультации МУЗ Муниципального центра планирования семьи и репродукции. Диагностическое значение исследования подтверждено патентом на изобретение № 2196988 Способ диагностики мукополисахаридозов (БИПМ, №2 от 20.01.2003) и рационализаторским предложением Диагностический тест тяжести состояния и эффективности лечения больных с хронической интоксикацией №3253/2 от 28 декабря 1993г НФ НПО Гигиена и профпатология. Обнаруженные различия качественного состава сульфатированных ГАГ мочи и активности хитотриозидазы плазмы крови позволяют проводить дифференциальную диагностику между мукополисахаридозами и болезнью Гоше на I этапе биохимического селективного скрининга наследственных болезней обмена.

Положения, выносимые на защиту:

1. Синдром гиперэкскреции сульфатированных ГАГ встречается с высокой частотой (60%) при заболеваниях, которые сопровождаются нарушениями обмена протеогликанов и углеводного обмена.
2. Выраженное повышение экскреции сульфатированных гликозаминогликанов и различия качественного состава гликозаминогликанов мочи, активность хитотриозидазы в плазме крови имеют значимость для дифференциальной диагностики мукополисахаридозов и болезни Гоше, которые имеют общие фенотипические проявления.
3. Прогрессирование нефропатии у больных сахарным диабетом сопровождается гиперэкскрецией сульфатированных ГАГ, изменением соотношения хондроитинсульфата и гепарансульфата и появлением нетипичного дерматансульфата в моче, свидетельствующие о выраженности диабетической нефропатии.
4. Модель мукополисахаридоза, вызванная введением сурамина крысам Вистар, воспроизводит изменения экскреции сульфатированных гликозаминогликанов аналогичные наблюдаемым у больных мукополисахаридозами: резкое повышение количества сульфатированных гликозаминогликанов и появление нетипичных гликозаминогликанов (дерматансульфата) в моче.

Апробация работы. Материалы, изложенные в диссертации, представлены на рабочем совещании (с международным участием) Лизосомные болезни, модели, терапия (Новосибирск, 28-29 сентября, 2000); 5-ом Международном симпозуме по мукополисахаридозам (5th International Symposium on Mucopolysaccharidoses and Related Diseases, Vienna, March 18 - 21, 1999); 13-м Рабочем совещании Европейской группы по изучению лизосомных болезней (13th European Study Group on Lysosomal Diseases Workshop, Septemer 20-23, 2001, Woudschoten, The Netherlands); 2-ой межрегиональной научно-практической конференции Клинические аспекты использования молекулярно-биологической диагностики в медицине (Новосибирск, 2003); межрегиональной научно-практической конференции Молекулярная генетика нейродегенеративных заболеваний (Новосибирск, 2005); V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005); на межлабораторном семинаре ГУ НИИ физиологии СО РАМН, (Новосибирск, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 27 печатных работ, в том числе 7 статей в рекомендованных ВАК журналах.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы, включающий 216 ссылок. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста, иллюстрирована 26 рисунками, содержит 17 таблиц..

Материалы и методы исследования

Работа проводилась в подразделении биохимического селективного скрининга наследственных болезней обмена клинико-диагностической лаборатории Государственного Новосибирского областного клинического диагностического центра (главный врач к. м. н. Ю. И. Бравве) и в лаборатории клеточной биохимии и физиологии ГУ НИИ физиологии СО РАМН.

1. Характеристика клинических групп

1 группа состояла из 1523 пациентов, в возрасте от 1 месяца до 68 лет (мужчин - 49,1%, женщин - 50,9%. Исследование проводилось в течение трех лет. Все пациенты были направлены на обследование медицинскими генетиками для проведения биохимического селективного скрининга наследственных болезней обмена.

2 группа - пациенты с лизосомными болезнями накопления в возрасте от 2 до 40 лет: 8 больных мукополисахаридозами и 4 больных болезнью Гоше. Диагноз верифицирован на основании результатов клинического обследования, данных биохимического скрининга и энзимодиагностики. Характерными клиническими проявлениями мукополисахаридозов были лицевые дисморфии (запавшая переносица, густые брови, вывернутые ноздри, толстые губы и язык, низко посаженные уши, долихоцефалической формы голова, выраженные лобные бугры), изменения скелета (укороченная грудная клетка, кифоз в нижнегрудном или верхнепоясничном отделе позвоночника, ограниченная подвижность в суставах, особенно в плечевых и межфаланговых, контрактуры, шея короткая, низкий рост), гепатоспленомегалия, изменения органов зрения (очаги помутнения на роговице, атрофия зрительного нерва), снижение слуха, нарушения со стороны нервной системы, снижение интеллекта.

3 группа - 55 больных сахарным диабетом (СД), 30 мужчин и 25 женщин, в возрасте от 16 до 63 лет (средний возраст 34,3+1,8 года). 46 обследованных страдали СД 1 типа, 9 - СД 2 типа. Длительность заболевания варьировала от 3 месяцев до 36 лет, составляя в среднем 9,8+1,1 года. В зависимости от наличия и выраженности диабетической нефропатии больные этой группы были распределены на 3 группы: в 1-ю вошли больные с нормальной экскрецией белка с мочой - 12 человек, во 2-ю - больные с микроальбуминурией или протеинурией до 0,3 г/сут - 31 человек, в 3-ю - больные с выраженной протеинурией - 12 человек. Выделенные группы были сопоставимы по половому, возрастному составу и степени компенсации сахарного диабета. Пациенты с выраженной нефропатией отличались большей длительностью заболевания и тенденцией к повышению систолического и диастолического артериального давления.

Контрольную группу составили 156 человек в возрасте от 5 месяцев до 58 лет, практически здоровые люди. Женщин было 87 человек (56 %), мужчин 69 (44 %). Пациенты были разделены на возрастные группы согласно возрастной периодизации онтогенеза человека (Доскин и соавт., 1997).

Забор крови осуществляли по добровольному согласию пациентов утром натощак. Для выделения взвеси лейкоцитов и получения плазмы крови использовали гепарин. Пробы хранили при -20 С и использовали для определения активности лизосомных ферментов.

Определение количества и качественного состава ГАГ проведено в случайных порциях мочи человека и экспериментальных животных в различных группах. Забор биологических образцов проводили согласно требованиям этического комитета.

2. Экспериментальные исследования

В эксперименте воспроизведена модель мукополисахаридоза с помощью однократного введения сурамина крысам (Короленко, 1990). Исследования выполнены на 26 половозрелых крысах Вистар обоего пола в возрасте 2-2,5 мес., с массой 200-290 г (виварий ГУ НИИ физиологии СО РАМН).