Книги, научные публикации
ПРОЕКТ Комитет по здравоохранению Администрации Санкт-Петербурга Санкт-Петербургский медицинский информационно-аналитический центр Эпидемиологический мониторинг антибиотикорезистентности
микроорганизмов с использованием компьютерной программы WHONET (методические рекомендации) Зуева Л.П., Поляк М.С., Кафтырева Л.А., Колосовская Е.Н., Соусова Е.В., Козлова Н.С., Гладин Д.В.
Санкт-Петербург 2004 1 ПРОЕКТ Содержание:
1. Введение 2. Современная классификация антибактериальных препаратов 3. Формулярная система применения антибактериальных средств 4. Правила внутрилабораторного контроля качества исследований антибиотикорезистентности/антибиотикочувствительности микроорганизмов 4.1. Контроль качества питательных средств, используемых для определения антибиотикорезистентности/ антибиотикочувствительности 4.2. Контроль катионного состава питательных сред 4.3. Контроль наличия антагонистов сульфаниламидных препаратов и триметоприма в питательных средах 4.4. Контроль воспроизводимости и точности процедуры определения чувствительности 4.5. Частота проведения контрольных исследований 5. Способы обработки результатов анализов тестирования микроорганизмов на антибиотикорезистентность / антибиотикочувствительность на популяционном уровне и интерпретация результатов в целях эпидемиологической диагностики 5.1 Построчный анализ (Line-listing) компьютерной аналитической программы WHONET 5.2. Распределение по доли резистентных (R), промежуточных (умеренно чувствительных) (I) и чувствительных штаммов (S)микроорганизмов 5.3. Анализ профилей резистентности 5.4. Функция Bak-Track (бак-след) 6. Пути влияния на антибиотикорезистентность Приложение №1. Инструкция по применению дисков с антибиотиками для постановки диско-диффузионного метода ПРОЕКТ Приложение №2. Определение антибиотикорезистентности/ антибиотикочувствительности микроорганизмов со сложными питательными потребностями 1. Определение резистентности/чувствительности пневмококков к антимикробным препаратам 2. Определение резистентности/чувствительности Haemophilus influenzae к антимикробным препаратам 2.1. Приготовление Haemophilus Test Medium (НТМ) агара 3. Определение резистентности/чувствительности N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам Приложение №3. Определение метициллинрезистентных стафилококков Приложение №4.
1. Определение продукции лактамаз расширенного спектра действия с помощью дисков 2. Метод двойных дисков (синергии с двумя дисками) для выявления бета-лактамаз расширенного спектра действия (ESBL) Приложение №5. Наиболее распространенные торговые названия антибактериальных препаратов Список литературы ПРОЕКТ 1.Введение В современных условиях проблема лекарственной устойчивости микроорганизмов приобрела глобальный характер. Полирезистентные микроорганизмы являются причиной возникновения тяжелых форм внутрибольничных гнойно-септических инфекций (ГСИ), вызванных условно-патогенными микроорганизмами, а также разнообразных инфекционных заболеваний (туберкулеза, дизентерии, сальмонеллезов).
Нерациональная антибиотикотерапия увеличивает сроки пребывания больных в стационарах, приводит к серьезным осложнениям и летальным исходам, наносит существенный экономический ущерб.
Это диктует необходимость внедрения в работу клинических эпидемиологов и бактериологов комплекса аналитических исследований и организованных мероприятий по проведению динамического мониторинга за структурой и уровнем лекарственной устойчивости микроорганизмов.
Антибиотикограммы возбудителей, выделенных от пациентов, должны регистрироваться не только в лабораторных журналах и историях болезни, но и формировать базу данных и использоваться различными специалистами. Эмпирическая антибиотикотерапия для отдельных нозологических форм ГСИ и инфекционных болезней должна учитывать фактические данные эпидемиологического мониторинга за антибиотикорезистентностью микроорганизмов, циркулирующих в конкретных регионах, городах, районах, стационарах, отделениях. Это важно как, для назначения оптимальной индивидуальной антибиотикотерапии для каждого конкретного больного, так и для построения формуляра антибактериальных средств и определения политики применения антибактериальных препаратов.
Основным звеном в этой работе является достоверная оценка антибиотикорезистентности выделяемых их клинического материала микроорганизмов, выполненная в различных клинико-диагностических лабораториях врачами-бактериологами разной квалификации.
Для рационального применения полученной информации, быстрого и обоснованного выбора оптимального метода лечения, проведения профилактических мероприятий в условиях функционирования системы инфекционного контроля целесообразно использование аналитической компьютерной программы, адаптированной к используемым в бактериологических лабораториях дисков для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.
Выработка рациональной стратегии и тактики применения антимикробных препаратов на основе постоянного динамического слежения за чувствительностью микроорганизмов, в конечном счете будет служить целям по сдерживанию формирования устойчивости к противомикробным препаратам.
ПРОЕКТ 2. Современная классификация антимикробных препаратов.
Общепризнанной классификации антимикробных препаратов (АМП) в настоящее время не существует. Традиционно АМП делятся на природные (собственно антибиотики, например пенициллин), полусинтетические (продукты модификации природных молекул:
амоксициллин, цефазолин) и синтетические (сульфаниламиды, нитрофураны). В современный период в связи с совершенствованием биотехнологий получения АМП такое деление потеряло актуальность.
Наиболее удобным следует признать разделение АМП на группы и классы. Это имеет значение с точки зрения понимания общности механизмов действия, спектра активности, фармакокинетических особенностей.
Сохраняется некоторое значение деления антибактериальных средств на бактериостатические и бактерицидные. К бактериостатическим средствам относят сульфаниламиды, тетрациклины, левомицетин (хлорамфеникол), эритромицин, линкомицин, клиндамицин, парааминосалициловую кислоту. Бактерицидными являются пенициллины, цефалоспорины, аминогликозиды, эритромицин (в высоких дозах), рифампицин, ванкомицин. В целом это деление следует учитывать при назначении комбинированной антибиотикотерапии, при которой сочетание средств из различных групп считается нецелесообразным.
Применение бактериостатических средств нежелательно у больных, у которых защитные свойства организма снижены и не всегда достаточны для разрушения бактерий, размножение которых приостановлено (при агранулоцитозе, иммунодепрессивной терапии, инфекционном эндокардите). В этих случаях, несмотря на результаты бактериологического исследования и чувствительности микроорганизмов к бактериостатическим средствам, предпочтительнее назначать бактерицидные препараты.
В современных популярных изданиях, посвященных проблемам антибиотикорезистентности, антибиотики сгруппированы по различным параметрам (происхождению, химической структуре, механизмам действия и спектру действия). Мы попытались обобщить эти материалы и представить в современной классификации антибактериальных средств (табл.№1).
ПРОЕКТ Таблица № Современная классификация антибактериальных препаратов Группа - лактамов 1. пенициллины бензилпенициллин (пенициллин), натриевая и калиевая соли природные бензилпенициллин прокаин (новокаиновая соль пенициллина) бензатин бензилпеницллин феноксиметил-пенициллин изоксазолилпенициллины оксациллин аминопенициллины ампициллин амоксициллин карбоксипенициллины карбенициллин тикарциллин уреидопенициллины азлоциллин пиперациллин ингибиторозащищенные амоксициллин/ пенициллины клавуланат ампициллин/ сульбактам тикарциллин/ клавуланат пиперациллин/ тазобактам 2. цефалоспорины цефазолин парантеральные поколение цефалексин пероральные цефадроксил цефуроксим парантеральные поколение цефуроксим аксетил пероральные цефаклор цефотаксим парантеральные поколение цефтриаксон цефтазидим цефоперазон цефоперазон/сульбактам цефексим пероральные цефтибутен цефепим парантеральные V поколение полусинтетические ПРОЕКТ 3. карбапенемы имипенем (тиенам) меропенем 4. карбацефемы лоракарбеф 5. монобактамы азтреонам Группа гликопептидов ванкомицин тейкопланин Группа аминогликозидов стрептомицин поколение неомицин канамицин гентамицин поколение тобрамицин нетилмицин амикацин поколение Группа хинолонов/ фторхинолонов налидиксовая кислота поколение оксолиновая кислота пипемидовая (пипемидиевая) кислота ломефлоксацин поколение норфлокацин офлоксацин пефлоксацин ципрофлоксацин левофлоксацин поколение спарфлоксацин моксифлоксацин V поколение Группа макролидов 14-членные природные эритромицин полусинтетические кларитромицин рокситромицин 15-членные полусинтетические азитромицин (азалиды) 16-членные природные спирамицин джозамицин мидекамицин полусинтетические мидемикацина ацетат ПРОЕКТ Группа тетрациклинов природные тетрациклин доксициклин полусинтентические метациклин миноциклин Группа сульфаниламидов и триметоприма (ко-тримоксазола) сульфадимидин сульфадиазин сульфа диметоксин сульфален сульфадиазин серебра сульфатиазол серебра ко-тримоксазол (триметоприм/сульфаметоксазол) Группа нитрофуранов нитрофурантоин нифурател нифуроксазид фуразолидон фуразидин Группа линкозамидов линкомицин клиндамицин Группа оксазолидинов линезолид Группа полимиксинов полимиксин В полимиксин М Группа нитромидазолов метронидазол тинидазол орнидазол секнидазол для интравагинального комбинированные метронидазол/хлорхинальдол перименения метронидазол/миконазол метронидазол/хлоргексидин для местного применения тернидазол/неомицин/нистатин/ преднизалон ПРОЕКТ Химиопрепараты других групп диоксидин нитроксолин спектиномицин фосфомицин фузидиевая кислота хлорамфеникол мупироцин Противогрибковые препараты полиены нистатин леворин натамицин амфотерицин В амфотерицин В липосомальный азолы кетоконазол для системного применения флуконазол интраконазол клотримозол для местного применения миконазол бифоназол эконазол изоконазол оксиконазол аллиламины тербинафин для системного применения нафтивин для местного применения препараты разных гризеофульвин для системного групп применения калия йодид аморолфин для местного применения циклопирокс ПРОЕКТ Противотуберкулезные химиопрепараты (ПТП) противотуберкулез- препараты гидразида изониазид ные препараты I ряда изоникотиновой кислоты (ГИНК) рифамицины рифампицин рифабутин синтетические ПТП пиразинамид этамбутол противотуберкулез- циклосерин ные препараты II этионамид ряда протионамид парааминосалициловая кислота (ПАСК) тиоацетазон капреомицин При выборе дисков с антибиотиками, которые следует использовать при тестировании микроорганизмов, необходимо руководствоваться прежде всего спектром активности антибиотиков, особенностями стационара, спецификой отделений, данными о микропейзаже выделенной флоры, а также результатами многоцентровых исследований чувствительности к антибактериальным препаратам микроорганизмов, наиболее часто вызывающих гнойно-септические и традиционные инфекции (табл. №2).
В каждой группе антимикробных препаратов приведены основные представители. В классификации даны генерические (непатентованные) названия препаратов. Наиболее распространенные торговые названия антибактериальных препаратов приведены в приложении №5.
ПРОЕКТ Таблица № Рекомендуемый перечень антибактериальных препаратов для определения чувствительности / резистентности микроорганизмов микроорганизмы антибактериальные препараты Streptococcus pneumoniae бензилпенициллин эритромицин цефалексин цефазолин линкомицин Streptococcus pyogenes бензилпенициллин цефазолин эритромицин Haemophilus influenzae ампициллин цефазолин цефуроксим цефотаксим Escherichia coli ампициллин нитрофурантоин ко-тримоксазол ципрофлоксацин гентамицин цефотаксим Shigella flexneri, нитрофурантоин Shigella sonnei ципрофлоксацин цефотаксим гентамицин ко-тримоксазол Salmonella spp. цефотаксим ципрофлоксацин гентамицин Staphylococcus spp. бензилпенициллин оксациллин цефазолин цефотаксим линкомицин ципрофлоксацин фузидин рифампицин ПРОЕКТ микроорганизмы антибактериальные препараты Enterococcus spp. ампициллин цефазолин цефотаксим гентамицин Klebsiella pneumoniae ампициллин цефазолин Enterobacter spp. гентамицин ципрофлоксацин цефоперазон (или цефтазидим, или цефепим) Acinetobacter spp. ципрофлоксацин гентамицин цефоперазон (или цефтазидим, или цефепим) Proteus spp. гентамицин амикацин ципрофлоксацин цефоперазон (или цефтазидим, или цефепим) Pseudomonas aeruginosa цефтазидим цефоперазон цефепим гентамицин амикацин ципрофлоксацин Neisseria meningitidis бензилпенициллин ампициллин цефотаксим цефтриаксон хлорамфеникол ципрофлоксацин При инфекциях центральной нервной системы не следует определять чувствительность выделенных микроорганизмов к цефоперазону, линкомицину, т.к. представленные антибиотики не проникают через гематоэнцефалический барьер.
Не следует определять чувствительность микроорганизмов, выделенных из отделяемого нижних дыхательных путей (мокроты, промывных вод из бронхов) и из синовиальных жидкостей, к гентамицину и другим аминогликозидам, так как эти препараты обладают плохой проникающей способностью.
ПРОЕКТ 1. Формулярная система применения антибактериальных препаратов Важность внедрения в клиническую практику рационально ограниченного списка антибиотиков связана с необоснованно высокой частотой их назначения в том числе, в отделениях интенсивной терапии:
свыше 90% пациентов ОРИТ в России и 70% - в странах Западной Европы (1), особенностями экологии в этих подразделениях и высокой затратностью терапии.
Формулярная система лекарственного обеспечения - это комплекс организационных, финансовых, медицинских и технических мероприятий, направленных на создание условий для гарантированного обеспечения лекарственными препаратами и изделиями медицинского назначения граждан, имеющих установленное законодательством право на лекарственное обеспечение за счет бюджетных средств.
Формуляры лечения являются документами, регламентирующими назначение лекарственных препаратов гражданам, находящимся на стационарном и амбулаторном лечении при типичном лечении заболеваний.
Типовой формуляр лечения - это документ, разработанный областной формулярной комиссией, содержащий в наиболее обобщенном виде схемы лечения заболеваний, и утвержденный центральным исполнительным органом государственной власти в сфере здравоохранения, для разработки на его базе муниципальных формуляров лечения в амбулаторных условиях, формуляров лечения для лечебно - профилактических учреждений стационарного типа и для специализированных лечебно - профилактических учреждений областного подчинения.
Формулярная комиссия (областная формулярная комиссия, формулярная комиссия муниципального образования) - орган, создаваемый по распоряжению центрального исполнительного органа государственной власти в сфере здравоохранения или органа управления здравоохранением муниципального образования с целью разработки и внесения дополнений или изменений в формуляры лечения, в работе которого принимают участие представители соответствующих органов управления здравоохранением и аптечной службой, наиболее профессионально подготовленные врачи и специалисты аптечной службы, а также представители других организаций (Фонда обязательного медицинского страхования, страховых компаний и др.).
ПРОЕКТ Определение торгового наименования лекарственного препарата, включаемого в формуляр лечения, производится формулярными комиссиями муниципальных образований на основании данных медико - экономического и фармако - экономического анализа зарегистрированных в Российской Федерации лекарственных препаратов, объединенных под одним международным непатентованным наименованием.
Основой построения формуляра являются нозологическая структура пациентов отделения, микробный пейзаж возбудителей инфекций, характер и уровень резистентности их к антибиотикам, результаты доказательных исследований по сравнительной оценке эффективности антимикробных препаратов, фармакоэкономический анализ, а также реальные возможности бюджета, фондов обязательного медицинского страхования (ОМС) и самих пациентов.
Основой для построения формуляра являются:
Х структура пациентов стационара;
Х микробный пейзаж возбудителей внебольничных и госпитальных инфекций;
Х уровень резистентности возбудителей к антибиотикам;
Х результаты исследований по оценке эффективности антибиотикотерапии (АБТ), выполненных в соответствии с принципами доказательной медицины (Evidence based medicine);
Х фармакоэкономический анализ;
Х реальные возможности бюджета, фондов медицинского страхования и пациентов.
ПРОЕКТ 2. Правила внутрилабораторного контроля качества исследований антибиотикорезистентности / чувствительности микроорганизмов Наиболее важным звеном в стандартизации лабораторного исследования оценки антибиотикочувствительности /резистентности микроорганизмов, является выполнение правил внутрилабораторного контроля качества, позволяющих существенно снизить вероятность получения ошибочных результатов. Достоверность оценки результатов (отнесение штамма к чувствительному или лустойчивому) зависит от ряда причин:
- качества питательной среды;
- реальной активности и содержания антибиотиков в дисках;
- соблюдения стандартности при выполнении различных процедур и др.
Требования к основным компонентам, необходимым для проведения исследований подробно изложены в методическом пособии Стандартизация и унификация метода определения чувствительности микроорганизмов к противомикробным препаратам. Эпидемиологические методы изучения антибиотикорезистентности на популяционном уровне Санкт-Петербург, 1999 г.
4.1. Контроль качества питательных сред, используемых для определения антибиотикочувствительности/резистентности В микробиологических лабораториях питательные среды относятся к основным средствам исследования, от качества которых зависит достоверность полученного результата. Они должны использоваться в работе в пределах срока годности в соответствии с инструкцией по применению предприятия изготовителя. При определении антибиотикограмм микроорганизмов можно использовать сухую питательную среду АГВ и агар Мюллера-Хинтона (Mueller-Hinton).
Каждая серия питательной среды должна проходить внутрилабораторный контроль. Контролируемые параметры, количество используемых тест штаммов определяются назначением среды.
Контролем качества питательных сред, используемых для изучения чувствительности к антибактериальным препаратам, являются: рН среды и оценка соответствия чувствительности референтных (контрольных) штаммов их паспортным данным. В отличие от циркулирующих среди людей микроорганизмов, референтные штаммы характеризуются генетической стабильностью биологических свойств, в том числе, и по уровню чувствительности к антибиотикам.
ПРОЕКТ 4.2. Контроль катионного состава питательных сред Для контроля катионного состава питательных сред рекомендуется использовать контрольный штамм Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
Среду следует считать удовлетворительной, если диаметр зоны ингибиции роста вокруг диска, содержащего 10 мкг гентамицина, находится в пределах 16 - 21 мм. Выбор гентамицина для контроля качества катионного состава связан с тем, что аминогликозидные антибиотики чувствительны к колебаниям концентрации двухвалентных катионов (Са2+ и Mg2+).
4.3. Контроль наличия антагонистов сульфаниламидных препаратов препаратов и триметоприма в питательных средах Рекомендуется использовать штамм Enterococcus faecalis ATCC 29212. Среду следует считать удовлетворительной, если диаметр зоны ингибиции роста вокруг диска, содержащего триметоприм /сульфаметоксазол (1,25 мкг + 23,75 мкг), составляет 20 мм и более.
Наличие в среде антагонистов сульфаниламидных препаратов, таких как тимин и тимидин (в повышенных количествах) снижают их антимикробную активность in vitro.
Согласно литературным данным, не каждая партия среды АГВ пригодна для определения чувствительности микроорганизмов к триметоприму /сульфаметоксазолу, поскольку содержит повышенное количество тимина и тимидина, снижающие их антимикробную активность in vitro. Поэтому каждую серию питательной среды следует проверять.
4.4. Контроль воспроизводимости и точности процедуры определения чувствительности Для контроля воспроизводимости и точности процедуры определения чувствительности необходимо параллельно с испытуемыми штаммами использовать эталонные штаммы с последующим сравнением полученных результатов с паспортными данными каждого штамма.
Пределы диаметров зон задержки роста эталонных штаммов, используемых для оценки точности исследований диско-диффузионным методом представлены в приложении (табл. №3).
Выбор референтных штаммов для проведения контрольных исследований определяется видом исследуемого микроорганизма. В ПРОЕКТ мировой микробиологической практике эталонные штаммы используются для проверки качества питательной среды, дисков, антибиотиков, правильности методики постановки всех этапов определения. Для контроля качества оценки антибиотикочувствительности используют следующие штаммы:
- для Enterobacteriaceae - E coli ATCC - для Pseudomonas spp. - P.aeruginosa ATCC - для Staphylococcus spp. - S.aureus ATCC - для Enterococcus spp. - E.faecalis ATCC - для Srteptococcus spp. - S.pneumomae ATCC - для Haemophilus spp. - Н.influenzae ATCC - для Neiseria gonorrhoeae - N.gonorrhoeae ATCC Тест штаммы микроорганизмов, используемые для контроля качества, должны быть включены в музейную коллекцию штаммов лаборатории.
Хранение, учет и работа с ними должны проводиться согласно Санитарным правилам Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV группы патогенности (СП 1.2.036-95).
4.5. Частота проведения контрольных исследований Оптимальным является проведение контроля качества при проведении каждого исследования. На практике, при получении повторяющихся достоверных стабильных результатов тестирования референтных штаммов, частота контрольных исследований может быть сокращена до 1 раза в две недели (2 раза в месяц). Контрольные исследования необходимо проводить при использовании новых партий реагентов, прежде всего питательных сред.
Для бактериологов, которые впервые осваивают диско диффузионный метод, следует ежедневно в течение месяца проводить контрольные анализы. Если за это время будет не более 3 (10%) выпадающих результатов, то контрольные исследования можно проводить один раз в две недели.
Если результаты повторных исследований не совпадают с паспортными данными референтных штаммов и врач получает большой разброс данных при испытании одного и того же контрольного штамма, это свидетельствует о нестабильности стандартных условий (в методических приемах, лабораторных процедурах, измерительной техники, вспомогательном оборудовании и др.). Если врач не может самостоятельно выявить или устранить причину вариабельности ПРОЕКТ результатов, следует проконсультироваться с главным бактериологом или обратиться в Научно-исследовательский центр фармакотерапии при Санкт Петербургском НИИ антибиотиков для получения консультативной и методической помощи.
Чтобы получить в свою лабораторию референс-штаммы, следует подать заявку в организационно-методический отдел клинической эпидемиологии Комитета по здравоохранению Администрации Санкт Петербурга (тел/факс 252 - 39 Ц10), e-mail omoke@miac.zdrav.spb.ru Таблица Пределы диаметров зон задержки роста (в мм) эталонных штаммов с обычными питательными потребностями, используемых для оценки точности исследований чувствительности методом дисков Антимикробный S.aureus E.coli P.aeruginosa препарат в диске ATCC 25923 ATCC 25922 ATCC Бензилпенициллин1 29-38 - Оксациллин 1 22-30 - Ампициллин 1 30-36 14-20 Карбенициллин 25 мкг1 - 19-25 Карбенициллин 100 мкг1 - 23-29 - Азлоциллин - - 24- Пиперациллин - 24-31 25- Азтреонам - 28-36 23- Цефалотин1 30-40 15-202 Цефазолин 29-35 23-29 Цефуроксим 27-35 20-26 Цефокситин 23-29 23-29 Цефотаксим 25-34 29-35 18- Цефтриаксон 25-34 29-35 17- Цефоперазон 24-33 28-34 23- Цефтазидим 17-21 25-32 22- Цефалексин 26-34 19-27 Цефаклор 27-35 23-27 Цефиксим - 23-27 Ванкомицин 17-21 - Линкомицин1 24-323 - Клиндамицин1 24-33 - Эритромицин1 22-31 - Олеандомицин1 22-29 - Азитромицин 21-27 - ПРОЕКТ Фузидин 28-35 - Тетрациклин1 22-31 17-26 Доксициклин 25-34 18-24 Левомицетин1 19-254 19-274 Неомицин1 20-27 13-17 Канамицин1 20-27 15-19 Стрептомицин1 20-25 14-19 Гентамицин1 22-32 21-30 16- Сизомицин 22-32 21-30 16- Тобрамицин 19-29 18-26 19- Амикацин 20-27 19-26 18- Нетилмицин 22-31 22-30 17- Полимиксин1 - 16-20 15- Рифампицин1 26-34 7-11 Фурагин 19-25 18-24 Фурадонин 20-28 20-26 Офлоксацин 27-35 30-38 21- Ципрофлоксацин 22-30 30-40 26- 1.Пределы диаметров зон даны в соответствии с инструкцией, утвержденной Министерством здравоохранения;
2.По данным НИТИАФ - 17-25 мм;
3.По данным НИТИАФ - 29-35 мм;
4.По данным НИТИАФ - 29-34 и 26-33 мм.
ПРОЕКТ 5. Способы обработки результатов анализов тестирования микроорганизмов на антибиотикорезистентность / антибиотикочувствительность на популяционном уровне и интерпретация результатов в целях эпидемиологической диагностики Анализ результатов тестирования микроорганизмов на антибиотикорезистентность имеет большое значение для проведения эпидемиологической диагностики в госпитальных условиях.
Центральным вопросом в этом направлении деятельности является анализ спектра активности антибиотиков по отношению к ведущим вариантам микрофлоры в стационаре.
В целях создания информационной базы обеспечения эпидемиологической диагностики в стационаре должен проводится мониторинг антибиотикорезистентности выделенных микроорганизмов, что включает в себя количественный учет резистентных штаммов (абсолютное число штаммов и долю представленности каждого вида возбудителя).
Ведущая микрофлора - это упорядоченный по частоте встречаемости список выделенных микроорганизмов по любому критерию (признаку) - биоматериалу, группе больных с одинаковым диагнозом, группе больных за любой промежуток времени и т.д.
Ведущая микрофлора может быть определена по отношению к группе больных в одном отделении, с одним диагнозом, или по любому другому, интересующему эпидемиолога, критерию. Доля представленности - соотношение количества штаммов микроорганизмов, в отношении которых изучалась антибиотикорезистентность к общему количеству выделенных штаммов данного вида микроорганизма.
ПРОЕКТ Чем выше этот показатель, тем надежнее информация об активности того или иного антибиотика. Анализ данных мониторинга антибиотикорезистентности штаммов, входящих в микропейзаж стационара (отделения) позволяет получать сведения об уровне чувствительности выделенных в стационаре в целом или в отдельном его подразделении штаммов микроорганизмов.
Изучение ведущей микрофлоры и доли представленности необходимо для анализа результатов тестов на чувствительность к антибиотикам. Он проводится с помощью группировки штаммов микроорганизмов устойчивых и чувствительных по отношению к изучаемому антибиотику (набору антибиотиков). Соотношение долей чувствительных и устойчивых микроорганизмов по отношению к тому или иному антибиотику (набору антибиотиков) дает представление о характере циркулирующих штаммов с позиций их принадлежности к госпитальным вариантам.
Полученные результаты:
Х объективизируют назначение антибактериальных средств в профилактических и лечебных целях до получения антибиотикограммы каждому больному Х дают возможность производить целенаправленные закупки определенных видов лекарственных препаратов для нужд данного стационара.
Распределение долей устойчивых и чувствительных к антибиотикам микроорганизмов может быть произведено путем рутинного подсчета соответствующих долей.
Рутинная обработка данных тестирования микроорганизмов на антибиотикорезистентность предполагает:
Х расчет долей представленности микроорганизмов Х оценку распределения долей устойчивых и чувствительных к антибиотикам микроорганизмов в целом по стационару, его отдельным подразделениям, по отдельным группам пациентов Х оценку распределения долей устойчивых и чувствительных к антибиотикам микроорганизмов в динамике с использованием различных временных промежутков (год, месяц, декада, неделя) и для разных когорт пациентов, сгруппированных по отделению пребывания, диагнозам, видам проводимых им манипуляций и т.д.
Х возможность заключения о ведущей микрофлоре.
Исходными данными для такой обработки может служить регистрация чувствительности к антибиотикам каждого изученного микроорганизма, зафиксированная в рабочем журнале микробиолога ПРОЕКТ или в протоколе определения чувствительности микроорганизмов к противомикробным препаратам.
Динамика показателей частоты выделения устойчивых к тому или иному антибиотику (набору антибиотиков) дает представление:
Х об изменение эпидемической ситуации в стационаре, Х позволяет отслеживать циркуляцию госпитальных вариантов микроорганизмов Х проводить анализ структуры генотипов антибиотикорезистентности по фенотипам бактерий и изменения, происходящие в этой структуре.
В целях эпидемиологической диагностики в практике госпитального эпидемиолога используются методы внутривидового типирования микроорганизмов. Внутривидовое типирование микроорганизмов требуется для подтверждения эпидемиологических данных по распространению общего микроорганизма среди больных, медицинского персонала и в окружающей среде.
Внутривидовое типирование микроорганизмов позволяет в рамках функционирования системы Инфекционного Контроля подтвердить эпидемиологические связи между источниками инфекции этиологически значимых возбудителей внутрибольничных инфекций.
Внутривидовая дифференциация штаммов может проводиться в ходе проведения текущих анализов в микробиологической лаборатории или с помощью дополнительных, специальных методик. Для идентификации однородных клонов (штаммов) микроорганизмов наиболее рациональными методиками, с точки зрения доступности в рутинной практике и достоверности получаемых результатов, является изучение данных тестирования на резистентность к антимикробным препаратам.
Все представленные способы обработки целесообразнеее проводить с использованием компьютерной аналитической программы WHONET, (програмное обеспечение разработано Thomas F. O'Brien, M.D., Microbiology Laboratory Brigham and Women's Hospital, Boston, John M.
Stelling, M.D., M.P.H. World Health Organization). Алгоритм работы по вводу данных и анализу результатов изложен в приложение 1 - "программное обеспечение базы данных микробиологической лаборатории" Данная программа позволяет производить анализ распределения резистентных и чувствительных штаммов микроорганизмов с помощью нескольких возможностей:
Х построчного анализа (Line-listing) Х распределения по доли резистентных (R), умеренно чувствительных (I) и чувствительных штаммов (S), которые могут быть представлены в виде:
таблицы %R, %I и %S, в виде гистограмм, ПРОЕКТ в виде графиков рассеяния (скатерграммы), в виде многофайловых сводок доли чувствительности или таблиц %R, %I и %S, Х оценки профилей резистентности Х функции BAC-TRACK.
Построчный анализ (Line-listing) позволяет получать результаты тестирования на антибиотикорезистентность в двух форматах:
Х простом построчном списке изолятов в соответствии с выбранными необходимыми для эпидемиологической диагностики в конкретной ситуации критериями Х в виде сводной таблицы изолятов.
5.1 Построчный анализ (Line-listing) компьютерной аналитической программы WHONET.
Простой построчный анализ.
Построчный список представляет результаты исследования каждого из изолятов на отдельной строке, где отмечаются идентификационный номер пациента (номер истории болезни), номер образца, палата (отделение), дата взятия образца, код материала, код микроорганизма и результаты исследования в соответствие с каждым протестированным антибиотиком.
Каждый антибиотик отмечается тремя буквами (трехбуквенный код).
Формат 1 (представленный в оригинальном виде распечатки программы является исходным для всей дальнейшей обработки, проводимой аналитической программой.
ПРОЕКТ Образец таблицы в формате Сводная таблица изолятов Анализ данных тестов на антибиотикорезистентность микроорганизмов начинается с выявления ведущих, эпидемиологически наиболее значимых видов возбудителей в данном стационаре, подразделении стационара, среди группы больных, видов материалов, откуда произведено выделение.
Формат 2 является сводной таблицей, которая позволяет:
Х проводить необходимую группировку материалов, Х выявлять ведущие микроорганизмы по частоте выделения (на 100 исследований) от пациентов в анализируемом отделении Изучаемые данные могут в зависимости от поставленной задачи суммироваться по:
Х видам штаммов микроорганизмов, Х виду материалов, взятых для исследования, Х палатам, Х отделениям, ПРОЕКТ Образец таблицы в формате 2. "Частота выделений микроорганизмов с учетом распределения по месяцам" Х полу, Х возрасту пациентов, Х диагнозам пациентов, Х или по любым другим критериям, занесенным в раздел "комментарии".
Сводная таблица, помимо указания числа протестированных изолятов, включает число пациентов по месяцам.
Так, из представленных материалов видно, что ведущими микроорганизмами по частоте выделения (на 100 исследований) от пациентов в анализируемом отделении были Staphylococcus epidermidis (2,39%), Ps. aeruginosa (7,18%) и Escherichia coli (7,73%).
В помесячном распределении максимальное число штаммов Pseudomonas aeruginosa определяется с февраля по июль, что может быть расценено как наличие в стационаре вспышки, вызванной данным возбудителем. Безусловно, для более корректных выводов требуется расчет интенсивных показателей выделения микроорганизмов.
Таким образом, сводные таблицы по микроорганизмам дают информацию о количестве пациентов, у которых были выделены возбудители каждого вида в течении каждого месяца, что позволяет обнаруживать вспышки, в том числе, вызванные необычными возбудителями.
ПРОЕКТ В том же формате 2 программа представляет возможность более детально изучить характер распределения выделяемых возбудителей по любому интересующему исследователя признаку - по полу, возрасту, диагнозу пациентов, местам их пребывания (палата, отделение, сестринский пост), виду биосубстрата, откуда выделен микроорганизм и т.д. В качестве примера такого распределения приведена таблица, содержащая информацию о количестве и частоте выделенных возбудителей из различных биосубстратах за 12 месяцев - "Распределение частоты встречаемости микроорганизмов по субстрату выделения".
Образец таблицы в формате 2. "Распределение частоты встречаемости микроорганизмов по субстрату выделения" Изучая эту таблицу, можно сформулировать гипотезу о возможной связи инфекции кровотока с таким фактором риска как постановка центрального венозного катетера. В 21,69% случаях обнаружен высев из крови, что свидетельствует о возможной связи между этими явлениями.
ПРОЕКТ 5.2. Распределение по доли резистентных о, промежуточных (умеренно чувствительных) (I) и чувствительных штаммов (S)микроорганизмов.
Данное распределение может быть представлено в нескольких вариантах:
A. Таблица распределения %R, %I и %S Представляет распределение диаметров зон задержки роста микроорганизма вокруг диска или, если используется тест МПК (определение минимальных подавляющих концентраций) - диаметр зон МПК.
Цель составления таблиц распределения %R, %I и %S установление соотношения долей чувствительных, устойчивых и промежуточных (умеренно чувствительных) к изучаемым антибиотикам микроорганизмов. Эти сведения могут быть в дальнейшем использованы для анализа антимикробной активности одного антибиотика.
ПРОЕКТ Образец таблицы распределения %R, %I и %S В таблице последовательно представлено: порядковый номер антибиотика, трехбуквенный код антибиотика, латинское название антибиотика, антимикробные контрольные точки (зоны задержки роста микроорганизмов на чашке, выраженные в мм), количество протестированных изолятов (штаммов), доля резистентных штаммов, штаммов со средней чувствительностью, устойчивых штаммов.
Б. Гистограммы распределения, - это распределение, составленное из долей зон задержки роста (или МПК).
Программа представляет возможность построения двух типов графиков распределения - 1) гистограммы по диаметрам зон задержки роста (или МПК), 2) сводка долей чувствительности.
Цель построения гистограмм распределения: анализ антимикробной активности одного антибиотика.
Гистограммы помогают исследователю рационально подходить к интерпретации результатов тестирования на антибиотикорезистентность.
При анализе гистограмм используются два подхода:
ПРОЕКТ 1. Установление критериев, которые дают возможность предсказать клинический лечебный эффект, т.е. установить фармакологические контрольные точки. Данные точки зависят от ряда факторов, таких как достижение определенного уровня антибиотика в сыворотке, проникновения в ткани или наличие бактериальных ассоциаций.
2. Установление критериев, которые свидетельствуют о наличие механизмов резистентности, т.е. поиск антимикробных контрольных точек. Эти точки устанавливаются при анализе гистограмм в референс лабораториях.
На рисунках 1 и 2 представлено распределение долей штаммов микроорганизмов в соответствии с их степенью чувствительности к цефазолину и ампициллину. Из рисунка 1 видно, что из всех циркулирующих в стационаре штаммов золотистого стафилококка, абсолютное большинство протестированных на чувствительность к цефазолину штаммов оказались чувствительными: 88,5% из 174 штаммов.
Это распределение свидетельствует о том, что использование цефазолина в данном стационаре возможно в большинстве случаев.
На рисунке 2 представлено распределение долей штаммов S. aureus по чувствительности к ампициллину. Большинство штаммов оказалось резистентными (76,3%). С учетом такого широкого распространения резистентных к ампициллину штаммов S. aureus в данном отделении назначение этого антибиотика должно быть рекомендовано только после оценки степени чувствительности возбудителей у каждого конкретного пациента.
На рисунках 3 и 4 представлены гистограммы других ситуаций распределения долей чувствительности к цефазолину и ампициллину штаммов S. aureus. Данные примеры демонстрируют возможность использования анализа гистограмм, который помогает описывать механизмы резистентности, включая раннее обнаружение новых генов резистентности при наличие материалов, собранных на региональном уровне. О наличии множественных механизмов резистентности можно предполагать, если на гистограмме видно несколько пиков.
Гистограммы дают информацию о качестве тестирования микроорганизмов на антибиотикорезистентность. Распределение чувствительных изолятов обычно подчиняется закону нормального распределения (как это представлено на рисунке 1).
ПРОЕКТ Рисунок 1. Гисторграмма распределения R,I и S штаммов микроорганизмов к цефазолину Неправильное распределение или преобладание в диаметрах зон (например, 10, 15, 20, 25 и 30 мм) определенной части измерений свидетельствует о том, что для интерпретации результатов тестирования необходимо проверить качество тестирования в своей лаборатории или референс-леборатории (например, как это представлено на рис. 4).
В работе референс-лабораторий гистограммы могут оказать значительную помощь при определении сравниваемости данных в разных лабораториях, при условиях разного качества сред и дисков, других различиях в методах тестирования и различных рекомендаций по интерпретации. Лучше всего сравнивать изоляты с истинной чувствительностью (микробиологически чувствительные без наличия механизмов резистентности). Хотя резистентные штаммы значительно различаются в различных больницах, чувствительные штаммы одинаковы во всем мире, что позволяет осуществлять международный контроль качества.
Анализ гистограмм помогает описывать механизмы резистентности, включая раннее обнаружение новых генов резистентности при наличие материалов, собранных на региональном уровне. О наличии множественных механизмов резистентности можно предполагать, если на гистограмме видно несколько пиков (рис.2).
ПРОЕКТ Рисунок 2. Гистрграмма распределения R,I S штаммов микроорганизмов к ампициллину B. Графики рассеяния (скатеграммы).
Целями проведения данного анализа является:
Х Выбор антибиотиков для клинического использования Х Описание механизмов резистентности Х Оценка перекрестной резистентности в случае изучения двух антибиотиков Для выполнения данной цели, требуется построение графиков для сравнения чувствительности к двум антибиотикам, чувствительность к которым определялась одним и тем же методом (либо дискодиффузионным: зона задержки - зона задержки, либо МПК - МПК, либо Е-тест - Е-тест), располагая один антибиотик по оси абсцисс, а другой - по оси ординат. Графики такого вида служат для анализа распределения изолятов микроорганизмов по результатам определения чувствительности к обоим антибиотикам.
При использовании скатеграмм возможно сравнение как отдельных штаммов бактерий, так и групп штаммов, объединенных по интересующему исследователя признаку (виду материала, откуда ПРОЕКТ получены штаммы, определенные временные промежутки, группы пациентов и т.д.). Также возможно построение графиков, исходя из сравнения "зона задержки - МПК", "МПК- Е-тест", "зона задержки - Е тест" и т.д., используя либо один и тот же антибиотик, либо два различных. Графики такого вида отражают распределение изолятов в соответствии с результатами обоих тестов определения чувствительности, при этом может быть рассчитана линия регрессии и определен коэффициент корреляции.
В практической лаборатории обычной практикой является использование диско-диффузионного метода изучения антибиотикорезистентности микроорганизмов.
Графики рассеяния могут иметь два вида:
1. в случае, когда распределение изолятов по чувствительности произведено с помощью одного и того же теста для обоих антибиотиков (диско-диффузионного метода, метода минимальных подавляющих концентраций).
2. В случае, когда распределение изолятов по чувствительности произведено с помощью различных методов для одного и другого антибиотика (например, спектр резистентности для одного антибиотика определен с помощью диско-диффузионного метода, а для другого - с помощью метода минимальных подавляющих концентраций). В этом случае рассчитывается также линия регрессии и коэффициент корреляции. В том случае, если для изолята было использовано несколько методов тестирования, можно построить график и линию регрессии, определяющую корреляцию результатов двух методов тестирования одного и того же антибиотика. Такие графики зона задержки - метод подавляющих концентраций могут быть использованы для определения контрольных точек.
При распечатке числа на графике отражают процент (или, по выбору) абсолютное число изолятов, у которых имеется такая же комбинация результатов тестирования.
Для описания механизмов резистентности обычно выбираются два антибиотика одного класса, например, гентамицин и тобрамцин или цефтазидим и цефотаксим.
Выбирая два антибиотика из разных классов, можно оценить множественную (перекрестную) резистентность (например, оксациллин и ципрофлоксацин).
В референс-лабораториях можно по этим данным проводить контроль качества. Если гистограмма отражает группу изолятов со "сниженной чувствительностью" к какому-либо антибиотику, можно ПРОЕКТ предполагать наличие резистентности или проблемы с методом (качеством) тестирования, например использование некачественных дисков. При сравнении двух антибиотиков на графике рассеяния сниженная чувствительность к обоим препаратам свидетельствует о том, что проблема не ограничивается только одним антибиотиком и не связана с некачественным диском.
В качестве примера использования данного аналитического приема приведен график рассеяния долей чувствительных и резистентных штаммов по отношению к гентамицину и цефазолину (рис. 3,4). Всего к обоим антибиотикам одновременно было протестировано 80 штаммов кишечной палочки и из графика рассеяния видно, что 67,5% (сумма долей в зоне S1S2) штаммов чувствительны к 2 антибиотикам, 7,5% (сумма долей штаммов в зоне R1R2) резистентные к ним, а остальные штаммы располагаются по степени чувствительности в средней зоне.
Рисунок 3. Скатерграмма рассеяния долей чувствительности и резистсентности штаммов микроорганизмов по отношению к антибиотикам ПРОЕКТ Рисунок 4. Скатерграмма рассеяния долей чувствительности и резистентности штаммов микроорганизмов по отношению к антибиотикам с интерпретацией результатов На рисунках 5 и 6 представлена скатерграмма, отражающая распределение долей чувствительных и устойчивых штаммов синегнойной палочки к гентамицину и ципрофлоксацину. Данное распределение свидетельствует о преобладании устойчивых штаммов одновременно к двум антибиотикам (68,2%). Таким образом, очевидно, что в случае с синегнойной палочкой оба протестированные антибиотика могут быть рекомендованы к использованию, а случае с инфекцией синегнойной этиологией использование обоих протестированных антибиотиков возможно только после определения чувствительности для каждого конкретного штамма.
ПРОЕКТ Рисунок 5. Скатерграмма распределения долей чувствительности и резистентности штаммов микроорганизмов к антибиотикам ПРОЕКТ Рисунок 6. Скатерграмма распределения долей чувствительности и резистентности микроорганизмов к антибиотикам с интерпретацией результатов На рисунках 9 и10 представлена скатеграмма, отражающая доли чувствительности и резистентности к ампициллину и цефазолину штаммов золотистого стафилококка. Из данного распределения видно, что препаратом выбора в случае возникновения инфекции данной этиологии должен быть цефазолин, т.к. именно к нему большее число штаммов (60,7%) являются чувствительными.
ПРОЕКТ Г. Многофайловые сводки доли чувствительности или таблицы %R, %I и %S.
Цель составления многофайловых сводок доли чувствительности или таблицы %R, %I и %S:
сравнение множественных файлов, что обеспечивает прямое сравнение результатов тестирования за разные периоды времени, например, несколько месяцев, или результаты тестирования, полученные в различных лабораториях.
Данная функция находит наибольшее применение в деятельности референс-лабораторий.
5.3. Анализ профилей резистентности.
Цель анализа профилей резистентности:
возможность использования тестов антибиотикорезистентности как внутривидового маркера штамма, позволяющего идентифицировать однородные штаммы возбудителей и отследить закономерности их циркуляции в госпитальных условиях.
Функция "построчного анализа" (Line-listing) (формат 1) компьютерной аналитической программы WHONET позволяет провести такой анализ с наибольшей точностью, т.к. сопоставление штаммов идет не просто с позиций "чувствителен" - "не чувствителен" к определенному антибиотику (чаще, набору антибиотиков), а с учетом конкретных данных зон задержки роста (в мм).
В Примере таблицы распределения %R, %I и %S - представлена доля чувствительных, резистентных и промежуточных по чувствительности среди всех выделенных в стационаре за определенный промежуток времени (с января 2002г. по декабрь 2002г.) микроорганизмов по отношению к каждому из протестированных антибиотиков, что дает представление о характере наиболее часто встречающихся ситуациях чувствительности. Так, к амикацину, цефотаксиму, цефуроксиму, цефалексину, хлорамфениколу, эритромицину, линкомицину, пенициллину, ванкомицину, полимиксину В, цефазолину и др. доля чувстительных микроорганизмов было более 50%, а к карбенициллину, тобрамицину и канамицину доля чувствительных микроорганизмов составила чуть более 13%.
ПРОЕКТ Пример таблицы распределения %R,%I и %S ПРОЕКТ Аналогичное распределение, но для одного возбудителя - E. сoli представлено ранее (на стр. 28) в виде таблицы " Образец таблицы распределения %R, %I и %S".
В следующем, приведенном ниже примере дано распределение долей каждой зоны задержки роста всех микроорганизмов, выделенных в стационаре за определенный промежуток времени (в ноябре - декабре 2001г.). Такое распределение дает возможность судить о характере наиболее часто встречающихся профилей резистентности микроорганизмов, что необходимо для целей внутривидовой дифференциации микроорганизмов и использования этих результатов для эпидемиологической диагностики.
Образец таблицы в формате 1 Распределение построчного анализа профилей резистентности микроорганизмов ПРОЕКТ Образец таблицы в формате 1. Сводные данные профилей резистентности микрорганизмов В данном примере представлено 26 вариантов профилей резистентности S. aureus по отношению к 8 антибиотикам, что может быть использовано как внутривидовая метка при проведении эпидемиологического анализа.
Анализ профилей резистентности важен и для понимания эпидемиологии генов антибиотикорезистентности. Гены резистентности распределены не случайно. Профиль резистентности является фенотипическим эквивалентом генотипа резистентности каждого из изолятов. Некоторые механизмы резистентности опосредованы хромосомными механизмами и характерны для всех представителей данного вида, в то время как другие зависят от наличия соответствующих плазмид. Плазмида может содержать только один ген резистентности, но наличие и роль плазмид как переносчиков множественных генов резистентности становится все более значимой.
Для изучения профилей резистентности используется также функция "построчного анализа" (Line-listing) (формат 1). Результаты, как уже указывалось, могут быть получены в виде построчного списка или сводной таблицы. В построчном списке представлены все изоляты, причем изоляты с одинаковым профилем резистентности объединяются в одну группу и располагаются в порядке нумерации пациентов. В построчной распечатке индивидуальных профилей возбудителей штаммы расположены в алфавитном порядке кода микроорганизмов, а внутри кода - в порядке нумерации пациентов, по дате их обследования, также указывается палата, дата взятия образца, материал, откуда штамм выделен.
Из представленных данных распечатки "построчный анализ" (Line listing page 10), видно, что у пациента под номером 31065 из отделяемого раны выделен S. aureus, идентичный по профилю чувствительности к ПРОЕКТ антибиотикам (к которым проводилось изучение чувствительности) - пенициллину, ампициллину, оксациллину, гентамицину, линкомицину, рифампицину, доксициклину и цефазолину и затем точно такой же штамм был выделен из раны у пациентов под номерами 22798, 32853, 35019, 38017, 39138, 39662, 39928, 40370, 40462, 40492, 40969, находившихся с пациентом 31065 в одной палате, что дает основание предполагать возможность внутрибольничного заражения, связанного с проведением манипуляций, т.к. речь идет о пациентах ожогового отделения со строго закрепленным за палатами персоналом.
Более точный ответ на этот вопрос может быть дан в результате проведения эпидемиологического расследования и изучения клинических проявлений инфекции у зараженных пациентов, путей и факторов передачи инфекции.
В сводной таблице, как уже указывалось, представлено количество изолятов микроорганизмов каждого профиля резистентности. Таким образом, анализ профилей антибиотикорезистентности микроорганизмов позволяет оценить действие на бактерии нескольких антибиотиков одновременно. Изоляты с одинаковыми профилями резистентности перечисляются вместе. В начале списка представляются изоляты, чувствительные ко многим антибиотикам, множественно резистентные показаны в конце списка. В таблице может быть произведено группировка по интересующему исследователя признаку, например, по группам пациентов с одинаковым диагнозом, помещенных в одном отделении, палате и т.д. В пределах одной группы пациентов они представляются в соответствии с нумерацией пациентов и датой анализа. Обычно отмечается несколько профилей. Одни из них - профили типичных внебольничных штаммов, резистентных только к тем антибиотикам, к которым имеется видовая резистентность, (например к ампициллину у Klebsiella pneumoniae). Часто наблюдается выделение нескольких идентичных по профилю резистентности изолятов от пациента, в том числе полученных из разных биосубстратов. В сводных таблицах может быть суммирована выше перечисленная информация с указанием числа изолятов и количества пациентов для каждого профиля резистентности. Кроме того, количество пациентов с каждым из профилей представлено по месяцам и указаны отделения (палаты) в которых наиболее часто встречаются такие профили.
Такие данные значительно облегчают расследование вспышек. Особое внимание необходимо уделять обнаружению новых множественно резистентных штаммов и особые усилия следует направлять на предотвращение распространения таких штаммов.
ПРОЕКТ 5.4. Функция Bak-Track (бак-след) Цель анализа:
создание и анализ сводных файлов с использованием данных микробиологического анализа резистентности микроорганизмов.
Используя все виды и все антибиотики программа создает два файла:
сводный файл доли чувствительных микроорганизмов и сводный файл профилей чувствительности. Сравнение сводных файлов позволяет попарно сравнивать все комбинации. Все статистически значимые результаты (р менее 0,05) или различия большей величины будут зафиксированы. Эти данные необходимы при анализе необычных изолятов и сравнении сводных файлов долей чувствительности. Данный вид анализа позволяет выявлять изоляты, которые с низкой частотой встречались в базе данных лаборатории. Оценка "необычности" может основываться на одном из следующих критериев:
- Необычен вид, исходная установка - отсутствие аналогичных изолятов за весь анализируемый промежуток времени.
- Антибиотик, к которому определялась чувствительность, необычен для этого вида, исходная установка - отсутствие подобных ситуаций (например, ванкомицин для Escherichia coli) - Чувствительный результат необычен для этого вида, исходная установка - отсутствие подобных ситуаций (например, чувствительность к ампициллину у Klebsiella pneumonia) - Резистентный результат необычен для данного вида, исходная установка - менее 5% (например, резистентность к ванкомицину у энтерококков) - Профиль резистентности необычен для данного вида, исзодная установка менее - менее 2%, в распечатке указывается количество пациентов с таким профилем по месяцам и месту расположения их в стационаре (по отделениям, по палатам).
Анализ облегчает обнаружение ошибок идентификации и определения чувствительности и сохранения важных резистентных штаммов для подтверждения и изучения в референс-лабораториях (создание банка штаммов). Этот метод позволяет специалистам инфекционного контроля идентифицировать новые множественно резистентные штаммы на ранних этапах, когда принятие мер, направленных на предотвращение циркуляции данных штаммов максимально эффективно. Использование функции "Bak-Track" наиболее удобно, когда есть необходимость сравнения результатов наблюдения за характером антибиотикорезистентности за большие промежутки времени (например, за ряд лет) или сравнения ситуации в различных стационарах, на разных территориях и регионах. Эти возможности обязательно должны ПРОЕКТ использоваться в практике референс-лабораторий, производящих сравнительный анализ и отслеживающих качество проведения тестирования различными лабораториями.
Данная функция позволяет автоматизировать и другие возможности скрининга всех видов и всех антибиотиков.
6. Пути влияния на антибиотикорезистентность.
С генетической точки зрения основные причины развития антимикробной устойчивости можно разделить на две категории:
- Хромосомные изменения вследствие спонтанных мутаций - Внехромосомные изменения, которые обусловлены переносом генетической информации плазмидами и, в связи с чем, они представляют гораздо более серьезную проблему, нежели хромосомные изменения.
В результате этих изменений микроорганизмы приобретают новые свойства, обеспечивающие их устойчивость к действию антимикробных препаратов. Примеры диссеминации генов получены при изучении профилей антибиотикорезистентности. Гены резистентности, расположенные на хромосомах имеют шанс распространяться только в пределах экологической ниши этого штамма. Гены резистентности, находящиеся в составе транспозона, способны перемещаться на другие плазмиды и занимать нишу, не доступную ранее. Особая ситуация создается при передаче гена резистентности микроорганизму, уже имеющему другой ген резистентности, генетические процессы при этом ускоряются и усиливается процесс диссеминации. Так, добавление антимикробного препарата в пробирку, содержащего 1 микроорганизм, обладающий резистентностью к антибиотику и 1 млрд микроорганизмов чувствительных к нему достаточно, чтобы в течение 10-12 часов резистентная микробная клетка размножилась и заместила популяцию чувствительных. Распространение генов резистентности приводит к тому, что применение антибиотиков в одних местах влияет на резистентность к ним на отдаленных территориях. В связи с этим, проблема антибиотикорезистентности - это проблема эпидемии генов резистентности в глобальных сетях экосистем микроорганизмов, подвергающихся селекции.
ПРОЕКТ Путями влияния на явление антибиотикорезистентности является:
- наблюдение и контроль за антимикробной резистентностью на глобальном уровне, т.к. гены резистентности и резистентные штаммы свободно циркулируют между странами и регионами.
Надзор за антимикробной резистентностью должен осуществляться на нескольких уровнях:
- уровне одной страны, т.к. в разных странах существуют различные подходы определения и оценки антимикробной резистентности - местном уровне, в каждом конкретном лечебном учреждении, т.к. именно этот наблюдения дает информацию для точного определения масштаба проблемы.
Перемещение генов и резистентных штаммов популяции (в стационаре, у однородной группы больных и даже у одного пациента) могут быть сложнее, чем циркуляция вируса гриппа среди населения всего мира.
Причины перемещения генов резистентности зависят от особенностей местной практики. Эффективность общенационального и глобального наблюдения зависит от наблюдения на местах - местные лаборатории обеспечивают главное - основную массу достоверной информации. Для проведения анализа требуется интерпретация потока наблюдений, созданного микробиологическим мониторингом, понимание закономерностей циркуляции генов резистентности и их продуктов.
Это достигается с помощью:
- отслеживания фенотипов антибиотикорезистентности клинических изолятов - осуществление перекрестной проверки с целью скрининга качества тестирования - формирования представления о генах, приводящих к определенному фенотипу - оценки значимости этих фенотипов - тактики антибиотикотерапии Для управления явлением антибиотикорезистентности надо знать:
- какие существуют и циркулируют гены резистентности - какие существуют связи между микроорганизмами, носителями этих генов ПРОЕКТ Основные пути влияния на антибиотикорезистентность бактерий это:
Задержка распространения генов резистентности - основной путь влияния на антибиотикорезистентность, что достигается путем:
- снижения воздействия на микроорганизм всеми антибактериальными препаратами, что приведет к замедлению распространения генов резистентности. Этому способствует и оптимальный выбор препарата для лечения конкретной инфекции, обладающего наименьшим эффектом селекции - оптимального выбора совокупности мер, предлагаемых системой ИК и лечения препаратами с наименьшим селекционным эффектом Дистрибутив программы WHONET.5.2 находится на сайте ВОЗ по адресу:
ПРОЕКТ Приложение № Инструкция по применению дисков с антибиотиками для постановки диско-диффузионного метода 1. Выбор дисков.
В таблице 1 приведен рекомендуемый выбор дисков при определении чувствительности бактерий к антимикробным препаратам. В основу градации положены спектр действия антимикробных лекарственных средств, их безвредность, удельная активность, фармакокинетические свойства, экономическая целесообразность. Выделены антибиотики, к которым определение чувствительности микроорганизмов должно быть обязательным (наиболее активные и доступные препараты), помеченные (++++). О них лечащий врач должен иметь полную информацию. Во вторую группу (+++) отнесены препараты ближайшего резерва, применение которых возможно при наличии каких-либо причин, исключающих использование лекарственных средств первой группы. Бактериолог вносит эту информацию в официальный ответ по согласованию с лечащим врачом или по собственному усмотрению. Широкое распространение вторично устойчивых штаммов определяет целесообразность оценки чувствительности к другим противомикробным средствам. Решение об этом принимает микробиолог по результатам первичного анализа. Следует также учитывать многообразие клинических ситуаций, неоднородность микроорганизмов, особенно отнесенных к группам грамотрицательных бактерий, включающих очень отличные по конститутивной чувствительности микроорганизмы. Это предполагает знание микробиологом базовых данных о противомикробных препаратах и основам их клинического применения, дает ему основание для дополнительного выбора дисков с противомикробными соединениями.
Рассмотрим в качестве примера выбор дисков с антимикробными препаратами при определении чувствительности стафилококков. К числу обязательных относятся диски с бензилпенициллином, оксациллином, цефалотином, цефазолином, эритромицином, ванкомицином.
Перечисленные антибиотики являются основными в терапии стафилококковых инфекций. При определенных обстоятельствах к числу основных могут быть отнесены цефуроксим (патология суставов, смешанная микрофлора, непереносимость или неэффективность базовых антибиотиков и др.), азитромицин или другой макролид (сокращение числа введений), фузидин (лметициллинрезистентность), ванкомицин (лметициллинрезистентность, непереносимость бета-лактамных антибиотиков). Диски с этими препаратами целесообразно использовать уже при первичном анализе, но информация о результатах исследования может передаваться лечащему врачу в зависимости от реальной клинической ситуации. За микробиологом остается право выбора. Диски с остальными антимикробными средствами являются дополнительными. Их ПРОЕКТ используют при каких-либо особых обстоятельствах. Например, с нитрофуранами при патологии мочевыводящих путей, с аминогликозидами при необходимости сочетанной терапии или резистентности стафилококков.
Во всех случаях это может быть повторный (дополнительный) анализ, если первичное исследование микробиолог считает недостаточно информативным.
2.Посев (инокуляция) исследуемой культуры на поверхность питательной среды.
Допустимы два варианта посева.
а). 1-2 мл взвеси наливают на поверхность питательной среды, покачиванием равномерно распределяют взвесь, пипеткой удаляют избыток взвеси и в течение 10-15 минут приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре. Необходимо контролировать достаточное подсыхание поверхности инокулированного агара. Если остается тонкий слой жидкости, диски накладывать нельзя. Сушить чашки более 15 минут приоткрытыми также не рекомендуется.
б). Взвесь наносят на поверхность агара тампоном. Стерильный ватный тампон на держателе погружают в микробную суспензию, ротируют его, чтобы он равномерно пропитался, затем тщательно отжимают тампон о сухую стенку пробирки выше уровня жидкости. Тампоном культуру наносят на всю поверхность питательной среды, поворачивая чашку каждый раз на 60. Таким образом, тампоном обрабатывают поверхность агара 3-4 раза. В этом случае возможность избыточного увлажнения поверхности питательной среды исключается.
3.Наложение дисков.
Диски должны быть распределены по поверхности агара равномерно.
Если чашка Петри имеет диаметр 100 мм, то диски следует располагать на расстоянии 2,4-2,5 см от центра по кругу. Их должно быть не более 5-6 на чашку. Не следует дополнительный диск располагать в центре чашки. Диск, нанесенный на поверхность питательной среды, нельзя перемещать на новое место.
Целесообразно использовать трафарет с нанесенными метками (5 или 6 по кругу в 2,4 см от центра). Его подкладывают под чашку. При боковом освещении эти метки хорошо видны и над ними накладывается диск.
Диск должен быть плотно (без пустот) прижат к поверхности питательной среды. Через 15 минут после нанесения на питательную среду диска чашки в перевернутом виде ставят в термостат. Инкубацию ведут при 35-37С.
ПРОЕКТ Таблица Выбор дисков с противомикробными препаратами для определения чувствительности бактерий.
Антимикробный Энтеро- Палочка Стафилокок- Энтерокок- препарат бактерии сине-зеленого ки ки гноя, другие грамотрицатель- ные бактерии Бензилпенициллин - - ++++ ++++ Оксациллин - - ++++ Ампициллин ++++ ++ - ++++ Карбенициллин ++ - - (диск 25 мкг) Карбенициллин - ++++ - (диск 100 мкг) Азлоциллин - ++++ - Пиперациллин +++ ++++ - Азтреонам ++ ++ - Имипенем ++ ++ ++ ++ Цефазолин ++++ - ++++ Цефалотин ++++1) - ++++ Цефуроксим +++ - +++ Цефотаксим +++ - ++ Цефтриаксон +++ - ++ +(++) Цефтазидим ++ ++++ - +(++) Цефоперазон ++ ++++ - Гентамицин ++++ ++++ ++ (диск 10 мкг) Гентамицин - - - ++++ (диск 120 мкг) Тобрамицин ++ ++ ++ ++ Сизомицин Нетилмицин Стрептомицин - - - ++++ (диск 300 мкг) Канамицин ++ - ++ Эритромицин - - ++++ Азитромицин - - +++ Кларитромицин Рокситромицин ПРОЕКТ Левомицетин ++2) ++ ++ Тетрациклины ++ ++ ++ Ванкомицин - - ++++ ++++ Фузидин - - +++ Клиндамицин - - +++ Линкомицин Рифампицин - - ++ ++ Полимиксин ++ +++ - Ципрофлоксацин +++ +++ ++ ++ Офлоксацин Нитрофураны + + + + (фурадонин и др) ++++ определение чувствительности обязательно, информация врачу обязательна +++ то же, информация врачу обязательна, но решение о выборе антибиотика принимается комиссионно ++ определение чувствительности при наличии показаний + определение чувствительности культур, выделенных из мочи 1) Культуры, чувствительные к цефалотину чувствительны к цефалексину и цефаклору 2) Определение чувствительности S.typhi обязательно.
4.Учет и интерпретация результатов.
Производится через 18 часов инкубации с соблюдением следующих правил.
Рост культуры должен быть сплошным, равномерным и не плотным.
Чашки с изолированными колониями или очевидным избыточным ростом выбраковываются.
Для измерения зон подавления роста используют линейку, прозрачную со скошенным краем и четкими рисками, кронциркуль или шаблон, возможно использование специальных бумажных линеек, производства НИЦФ, Санкт-Петербург. Чашки рекомендуется держать над темной поверхностью (например, черным не глянцевым листом бумаги).
Поверхность среды должна быть хорошо освещена отраженным светом.
Линейку или кронциркуль прикладывают к задней поверхности чашки.
Если в среду добавлена кровь, то измерение делают со стороны поверхности среды при снятой крышке.
За зону, подлежащую измерению, следует считать тот ее участок, на котором рост отсутствует полностью (среда прозрачна). Не следует учитывать иногда имеющийся слабый рост (лободок) по периферии зоны.
ПРОЕКТ Это рост культуры и он в зону подавления роста не входит. Если внутри зоны имеются колонии, их следует выделить и изучить на принадлежность к исследуемому штамму и на чувствительность к тестируемому антимикробному веществу. Исключения могут быть только при работе с культурой Proteus vulgaris, дающей ползучий рост, роение. Если внутри зоны подавления роста протея имеется чуть видная вуаль, ее можно не учитывать и определять размер зоны по очевидному четкому краю.
ПРОЕКТ Приложение № Определение антибиотикорезистентности/ антибиотикочувствительности микроорганизмов со сложными питательными потребностями К микроорганизмам, имеющим сложные питательные потребности, относятся прежде всего стрептококки (включая пневмококки), энтерококки, гемофильная палочка и гонококки. Они требуют особого подхода при проведении тестирования на резистентность / чувствительность к антимикробным препаратам.
Определение чувствительности данных микроорганизмов к антибактериальным препаратам сопряжено с определенными трудностями.
До настоящего времени в России этому уделялось недостаточно внимания.
В Методических указаниях по определению чувствительности микроорганизмов методом диффузии в агар с использованием дисков Минздрава СССР (1983), в методическом письме Минздрава РСФСР Определение антибиотикочувствительности микроорганизмов диско диффузионным методом (1984) и Методических указаниях по определению чувствительности стрептококков к антибиотикам (1985) Минздрава СССР методика тестирования не описана и не приведены интерпретационные критерии для пневмококков, энтерококков, гонококков и H.influenzae.
В настоящее время большинство исследователей при определении чувствительности микроорганизмов к антибиотикам руководствуется стандартами NCCLS - Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам США. Вследствие этого основные исследования чувствительности привередливых микроорганизмов к антибиотикам проводятся в соответствии с этими рекомендациями.
1. Определение чувствительности пневмококков к антимикробным препаратам Пневмококки требуют для роста на искусственных питательных средах высокого содержания аминного азота и нативного белка животного происхождения.
Наилучшей средой для их роста является Мюллер-Хинтон агар (МХА) с добавлением 5% дефибринированной бараньей кровью.
Обязательным является определение чувствительности пневмококков к пенициллину, эритромицину, триметоприму/сульфаметоксазолу (I группа). Определение чувствительности к другим препаратам, например тетрациклину, офлоксацину и ванкомицину, проводится только при необходимости ПРОЕКТ (наличии резистентности к препаратам I группы и др.). При системных инфекциях и при резистентности к пенициллину в обязательный набор антибиотиков для определения чувствительности входят цефалоспорины III поколения (цефотаксим или цефтриаксон).
Наибольшее значение имеет резистентность S.pneumoniae к пенициллину, который на протяжении десятилетий являлся препаратом выбора при лечении пневмококковых инфекций.
Особенности определения чувствительности к пенициллину. Механизм резистентности S.pneumoniae к пенициллину и другим бета-лактамным антибиотикам обусловлен изменением пенициллино-связывающих белков (ПСБ) клеточной стенки. В результате ступенчатых мутаций штаммы S.pneumoniae, чувствительные к пенициллину, могут иметь сниженную чувствительность к цефалоспоринам и наоборот. Иногда ПРП обладают резистентностью к цефалоспоринам III поколения (цефотаксиму и цефтриаксону).
Для определения чувствительности пневмококка к пенициллину проводят "скрининг" диско-диффузионным методом с дисками, содержащими 1 мкг оксациллина.
Не рекомендуется использовать диски, содержащие пенициллин (бензилпенициллин), так как он не всегда выявляет умеренно резистентные штаммы, поскольку зоны подавления роста пенициллином у таких штаммов перекрывают значения для чувствительных штаммов.
Определение чувствительности пневмококка к другим антибиотикам (за исключением амоксициллина, ампициллина, карбапенемов, цефалоспоринов) проводится с использованием соответствующих дисков.
Интерпретация результатов:
1. пневмококки, имеющие зону задержки роста >20 мм, являются чувствительными к пенициллину и считаются чувствительными к ампициллину, амоксициллину, амоксициллину/клавуланату, ампициллину/сульбактаму, цефаклору, цефуроксиму, цефтриаксону, имипенему, меропенему;
2. пневмококки с зоной задержки роста <19 мм не всегда являются резистентными к пенициллину поэтому необходимо определение МПК к пенициллину методом серийных разведений или Е-тестами.
ПРОЕКТ Таблица №4.
Критерии интерпретации чувствительности пневмококков диско- диффузионным методом на агаре МюллераЦХинтона c 5% дефибринированной бараньей кровью Кол-во Диаметр зоны задержки роста, мм антибиотик анти биотика резистент- умеренно чувствитель в диске ный резистент- ный мкг ный пенициллин 1 - - > (диск с оксациллином) эритромицин 15 <15 16 - 20 > тетрациклин 30 <18 19 - 22 > 1,25/23, триметоприм/ <15 16 - 19 > сульфаметоксазол хлорамфеникол 30 <20 - > офлоксацин 5 <12 13 - 15 > Принимая во внимание, что Мюллер-Хинтон агар (МХА) недоступен для многих лабораторий, было проведено исследование возможности использования вместо него отечественной питательной среды АГВ, обогащенной 5% дефибринированной человеческой крови (в соответствии со сложившейся практикой).
Показано, что при определении чувствительности пневмококков на среде АГВ диско-диффузионным методом к пенициллину (с использованием диска, содержащего 1 мкг оксациллина), макролидам (кларитромицину, азитромицину), клиндамицину и офлоксацину диаметры зон подавления роста существенно не отличаются от полученных на МХА с 5% дефибринированной бараньей крови. Следовательно, при отсутствии МХА определение чувствительности пневмококков к оксациллину, кларитромицину, азитромицину, клиндамицину, офлоксацину диско диффузионным методом можно проводить на среде АГВ и использовать для интерпретации результатов критерии NCCLS (табл. №5)*.
* Для рокситромицина и мидекамицина критерии интерпретации результатов определения чувствительности пневмококков NCCLS не разработаны.
ПРОЕКТ Таблица № Критерии интерпретации чувствительности пневмококков диско диффузионным методом на среде АГВ c добавлением 5% дефибринированной человеческой крови Кол-во Диаметр зоны задержки роста, мм антибиотик анти биотика резистент- умеренно чувствитель в диске ный резистент- ный мкг ный пенициллин 1 - - > (диск с 1 мкг оксациллином) азитромицин 15 <13 16 - 20 > кларитромицин 15 <16 19 - 22 > клиндамицин <15 16 - 19 > офлоксацин 5 <12 - > Для проведения контроля качества используется S. pneumoniae ATCC 49619. Методика постановки и учета соответствует методике работы с испытуемым штаммом. Результаты оцениваются по критериям, изложенным в таблице №6.
Таблица № Допустимые диапазоны значений диаметров зон подавления роста для контрольного штамма S.pneumoniae ATCC антибиотик Диаметр зоны задержки роста S.pneumoniae ATCC 49619, мм пенициллин (диск с оксациллином) 8 - эритромицин 25 - азитромицин 19 - кларитромицин 25 - тетрациклин 27 - триметоприм/сульфаметоксазол 20 - хлорамфеникол 23 - офлоксацин 16 - клиндамицин 19 - ПРОЕКТ 2. Определение чувствительности Haemophilus influenzae к антимикробным препаратам Потенциальной активностью в отношении H.influenzae обладают следующие антибиотики: аминопенициллины (ампициллин, амоксициллин), уреиодопенициллины (пиперациллин), ингибиторозащищенные пенициллины (амоксициллин/клавуланат, ампициллин/сульбактам, пиперациллин/тазобактам, тикарциллин/клавуланат), цефалоспорины II (цефуроксим, цефаклор), III (цефтриаксон, цефотаксим, цефоперазон) и IV (цефепим, цефпиром) поколений, карбапенемы, макролиды (азитромицин, кларитромицин), тетрациклины (тетрациклин, доксициклин), фторхинолоны (ципрофлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин, левофлоксацин), рифампицин, хлорамфеникол, ко-тримоксазол.
Несмотря на то что пенициллин, аминогликозиды, эритромицин могут проявлять умеренную in vitro активность в отношении H.influenzae, терапия этими антибиотиками не может привести к микробиологической или клинической эффективности в ходе лечения.
Наиболее значимой является проблема резистентности гемофильной палочки к аминопенициллинам за счет продукции -лактамаз (Felmingham D., Washington J.,1999). Такие микроорганизмы обычно чувствительны к ингибиторозащищенным пенициллинам и цефалоспоринам, а для быстрого выявления продукции -лактамаз достаточно провести тест с нитроцефином.
В последние годы описаны штаммы H.influenzae, устойчивость которых к ампициллину связана с изменением мишени действия лактамных антибиотиков (пенициллинсвязывающих белков) или снижением проницаемости наружной клеточной стенки (Jacoby G.A., 1994). Эти штаммы получили название -лактамазонегативные ампициллинорезистентные (БЛНАР) и считаются нечувствительными к ингибиторозащищенным пенициллинам и таким цефалоспоринам, как цефаклор, цефуроксим, цефиксим, цефтибутен.
В соответствии с международными рекомендациями для выявления ампициллинорезистентности у гемофильной палочки в рутинной лабораторной практике достаточно определения чувствительности к ампициллину диско-диффузионным методом и теста на продукцию лактамаз с нитроцефином.
Эти два теста позволяют подразделить штаммы на ампициллиночувствительные, бетта-лактамазопродуцирующие ампициллинорезистентные (чувствительные к ингибиторозащищенным пенициллинам и цефалоспоринам IIЦIV поколений) и БЛНАР, которые следует расценивать как резистентные к ингибиторозащищенным ПРОЕКТ пенициллинам и некоторым цефалоспоринам (Fuchs P.C., Barry A.L., 1994).
Причем тестирование с диском, содержащим ингибиторозащищенные пенициллины, например амоксициллин/ с клавулановой кисслотой, не позволяет отличить БЛНАР от ампи.циллиночувствительных штаммов H.influenzae.
Определение чувствительности гемофильной палочки к макролидам (азитромицину, кларитромицину) представляет нерешенную проблему во всем мире (Crokaert F., Aoun M., Duchateau V., 1995, Acar J., 1999).
Не получено клинических штаммов H.influenzae, устойчивых к цефалоспоринам IV поколения, карбапенемам и фторхинолонам.
Определение чувствительности гемофильной палочки к антимикробным препаратам представляет сложную задачу. В России основным агаром для определения чувствительности микроорганизмов является среда АГВ.
Результаты проспективных сравнительных исследований показали, что для определения чувствительности штаммов гемофильной палочки нельзя использовать среду АГВ с добавками и шоколадный агар на основе АГВ.
Согласно рекомендациям NCCLS (NCCLS Document M100-S9 1999;
NCCLS Document M7-A5 2000;
NCCLS Document M100-S10(M7) 2000) для определения чувствительности гемофильной палочки необходимо использовать среду НТМ (Haemophilus Test Medium - среда для тестирования гемофил), которая содержит все необходимые для гемофил факторы роста. Среда НТМ выпускается компанией "Unipath" в виде HTM основы и добавок. Однако ее можно приготовить и в лаборатории на основе агара МюллераЦХинтона (см. приложение №2).
Учитывая относительно высокую стоимость и недоступность среды НТМ, при ее отсутствии не следует определять чувствительность H.influenzae на других средах в связи с высокой частотой ошибочных результатов.
Для интерпретации результатов определения чувствительности гемофильной палочки к антибиотикам используют специфические критерии, отличные от критериев интерпретации результатов определения чувствительности "непривередливых" микроорганизмов (табл. №7).
Контроль качества определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят путем тестирования контрольных штаммов H.influenzae ATCC 49247 и E.coli ATCC 35218 (при тестировании ингибиторо-защищенных пенициллинов). Методика постановки и учета соответствует методике работы с испытуемым штаммом. Результаты оцениваются по критериям, изложенным в таблице № 8.
ПРОЕКТ Таблица № Критерии интерпретации чувствительности гемофильной палочки диско-диффузионным методом на HTM агаре (NCCLS, 1999) Кол-во Диаметр зоны задержки роста, мм антибиотик анти биотика резистент- умеренно чувствитель в диске ный резистент- ный мкг ный ампициллин 10 <18 19 - 21 > амоксициллин/ 20/10 <19 - > клавуланат мкг меропенем или 10 - * - * > имипенем - * - * > 1,25/23, триметоприм/ <10 11 - 15 > сульфаметоксазол цефотаксим или 30 - - > цефтриаксон или 30 - * - * > цефтазидим 30 - * - * > хлорамфеникол 30 <25 26 - 28 > азитромицин или 15 - * - * > кларитромицин 15 <10 11 - 12 > тетрациклин 30 <25 26 - 28 > ципрофлоксацин 5 - * - * > * Резистентные штаммы не выделены.
Каждая серия чашек при постановке чувствительности долж.на проверяться на их пригодность для роста тестируемых микроорганизмов.
Для этого используется контрольный штамм H.influenzae ATCC 10211, из суточной культуры которого готовят микробную взвесь, соответствующую по мутности 0,5 по МакФарланду. Из полученной микробной взвеси готовят серию последовательных разведений 1:10. Затем на приготовленные чашки со средой НТМ высевают по 0,1 мл взвеси -5, -6, - разведений. При хороших питательных свойствах агара должен отмечаться рост микроорганизмов из -6 и -7 разведений.
ПРОЕКТ Таблица № Допустимые диапазоны значений диаметров зон подавления роста для контрольных штаммов H.influenzae ATCC 49247 и E.coli ATCC (NCCLS, 1999) антибиотик H.influenzae E.coli АТСС 49247 АТСС ампициллин (10 мкг) 13-21 - амоксициллин/клавуланат (20/10 мкг) 15-23 18- триметоприм/сульфаметоксазол 24-32 - (1,25/23,75 мкг) меропенем (10 мкг) 20-28 - имипенем (10 мкг) 21-29 - цефотаксим (30 мкг) 31-39 - цефтриаксон (30 мкг) 31-39 - хлорамфеникол (30 мкг) 31-40 - азитромицин (15 мкг) 13-21 - кларитромицин (15 мкг) 11-17 - тетрациклин (30 мкг) 14-22 - ципрофлоксацин (5 мкг) 34-42 - 2.1. Приготовление Haemophilus Test Medium (НТМ) агара После растворения основы в нее добавляют дрожжевой экстракт до конечной концентрации 5 мг/мл и раствор гематина до конечной концентрации 15 мг/л. Для приготовления основного раствора гематина к 50 г порошка добавляют 100 мл 0,01N NaOH (0,01 моль/л) и нагревают при тщательном перемешивании до полного растворения.
В подготовленную для автоклавирования среду на 1 л вносят 30 мл основного раствора гематина. После автоклавирования и охлаждения основы на водяной бане до температуры 45Ц50оС в нее асептически вносят матричный раствор НАД 3 мл на 1 л агара до конечной концентрации мг/л.
Для приготовления матричного раствора 50 мг НАД растворяют в мл дистиллированной воды и стерилизуют фильтрацией через мембранные фильтры с размером пор 0,45 мкм.
При тестировании триметоприма или ко-тримоксазола следует дополнительно асептически добавить 0,2 МЕ/мл тимидинфосфорилазы.
Приготовленный агар разливают в стерильные чашки Петри на ровном, строго горизонтальном рабочем столе. На чашку диаметром 100 мм необходимо 25 мл агара, диаметром 90 мм - 20 мл, для того чтобы толщина агара в чашке была 40,5 мм.
ПРОЕКТ Агар должен застыть при комнатной температуре. Чашки с застывшим агаром необходимо подсушить с приоткрытыми крышками в термостате при температуре 35оС в течение 10Ц30 мин, чтобы удалить избыток конденсата.
3. Определение чувствительности гонококков к антимикробным препаратам Несмотря на наличие эффективных противогонококковых препаратов, гонорея считается трудно контролируемым заболеванием.
В настоящее время растет количество штаммов, устойчивых к традиционным препаратам для лечения гонореи (пенициллины, тетрациклины, спектомицин, фторхинолоны и др.).
Определение чувствительности гонококков к антибиотикам - очень важный этап разработки рекомендаций по рациональной терапии гонококковой инфекции.
Согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения, если уровень резистентности N. gonorrhoeae к антимикробному препарату составляет более 5%, он не может рутинно применяться для эмпирической терапии гонореи (WHO, 1989, WHO 1997).
Рекомендуемый набор антибиотиков для тестирования гонококков включает наиболее характерных представителей различных групп препаратов, применяемых для лечения этих инфекций. К ним относятся пенициллин, цефтриаксон, тетрациклин, ципрофлоксацин, спектомицин.
Для постановки чувствительности N. gonorrhoeae диско диффузионным методом используется гонококковая агаровая основа (GC Agar Base, BBL) и 1 % комплексная питательная добавка - КПД (PolyVitex, Bio Merieux или собственного приготовления) без гемоглобина. При тестировании карбапенемов и клавулановой кислоты необходимо использовать добавку, не содержащую цистеин.
Результаты метода учитывают через 20 - 24ч и интерпретируют в соответствии с критериями, представленными в таблице №9 (NCCLS Document M100 - S12.2002).
ПРОЕКТ Таблица № Критерии интерпретации чувствительности N. gonorrhoeae к антимкробным препаратам диско-диффузионным методом Кол-во Диаметр зоны задержки роста, мм антибиотик анти биотика резистент- умеренно чувствитель в диске ный резистент- ный мкг ный бензипенициллин 10 ЕД <26 27 - 46 > цефтриаксон 30 - - > тетрациклин 30 <30 31 - 37 > ципрофлоксацин 5 <27 28 - 40 > спектиномицин 100 <14 15 - 17 > Контроль качества также осуществляется при определении чувствительности с использованием контрольного штамма N. gonorrhoeae АТСС 49226 (см. табл. №10).
Результаты определения чувствительности считают достоверными, если зоны задержки роста для контрольного штамм укладываются в допустимые пределы.
Таблица № Допустимые диапазоны значений диаметров зон подавления роста для контрольного штамма N. gonorrhoeae ATCC антибиотик Диаметр зоны задержки роста N. gonorrhoeae ATCC 49226, мм бензилпенициллин 26 - цефтриаксон 39 - тетрациклин 30 - ципрофлоксацин 48 - спектиномицин 23 - при диаметре < 19 мм высока вероятность выработки штаммом -лактамазы критерии резистентности не разработаны при диаметре < 19 мм высока вероятность плазмидной резистентности ПРОЕКТ Приложение № 1. Определение метициллинрезистентных S.aureus К так называемым проблемным возбудителям инфекционных заболеваний в настоящее время относятся метициллинрезистентные стафилококки. Необходимо помнить, что метициллинрезистентные стафилококки (MRSA) обладают перекрестной устойчивостью ко всем бета-лактамным антибиотикам, включая ингибитор защищенные, и имипенему, кроме этого, для них характерна также ассоциированная резистентность к препаратам многих других классов. К сожалению, в Российской Федерации уровень информированности клиницистов и бактериологов о проблемах метициллинрезистентности недостаточен, что приводит к существенным ошибкам в тактике этиотропного лечения инфекций данной этиологии и снижению его эффективности.
На практике при оценке антибиотикорезистентности стафилококков необходимо в первую очередь оценивать их чувствительность к оксациллину и выявлять продукцию бета-лактамаз (чувствительность к пенициллину). При чувствительности к оксациллину и отсутствии продукции бета-лактамаз препаратами выбора являются природные и незащищенные полусинтетические пенициллины. При продукции бета лактамаз и чувствительности к оксациллину такими препаратами являются цефалоспорины III поколения или ингибиторзащищенные бета-лактамы.
Параллельно следует определять чувствительность к макролидам, линкозаминам, тетрациклинам, ципрофлоксацину, триметоприм/сульфометоксазолу, которые могут быть использованы в случае аллергических реакции на бета-лактамы. При устойчивости к оксациллину препаратом выбора будет ванкомицин.
Для детекции метициллинрезистентности следует соблюдать следующие правила:
1. Использовать диск с 1 мг оксациллина.
2. Использовать повышенную концентрацию NaCl в питательной среде (2-4%) 3. Готовить бактериальную суспензию из колоний с плотной питательной среды после 18-24 часов инкубации без подращивания 4. Инкубацию посевов проводить при 33-35 С (не выше) в течение полных 24 часов 5. Внимательно изучить зону отсутствия роста вокруг диска в проходящем свете для выявления мелких колоний или легкого роста, в сомнительных случаях продолжить инкубацию еще на сутки.
ПРОЕКТ 6. При сомнительных результатах необходимо использовать метод серийных разведений.
.
О метициллинрезистентных S.aureus и коагулазонегативных стафилококках сообщается как об устойчивых ко всем цефалоспоринам и другим бета-лактамным антибиотикам, включая ингибиторзащищенные, и имипенему, даже если они проявляют к ним чувствительность in vitro. Это связано с тем, что in vivo терапия бета-лактамными антибиотиками инфекций, вызванных метициллинрезистентными стафилококками, в большинстве случаев является малоэффективной.
Необходимо отметить, что в настоящее время описаны промежуточно-резистентные к ванкомицину штаммы стафилококков, как S.aureus, так и коагулазонегативных. Метод диффузии в агар не позволяет дифференцировать такие штаммы (МИК 4-8 мг/мл) от чувствительных (МИК 0,5-2 мг/мл), поэтому для их детекции следует использовать метод серийных разведений. Для скрининга можно применять диско диффузионный метод с диском с ванкомицином, как это описано для энтерококков, чашки инкубировать в течение полных 24 часов при 35 С, внимательно изучить зону отсутствия роста вокруг диска в проходящем свете для выявления роста, однако этот факт следует подтвердить определением МИК.
Выявление полирезистентности у стафилококков может быть свидетельством их метициллинорезистентности ПРОЕКТ Приложение № 1.Определение продукции лактамаз расширенного спектра действия с помощью дисков Еще одной группой проблемных микроорганизмов являются штаммы грамотрицательных бактерий, преимущественно энтеробактерий, продуцирующие бета-лактамазы расширенного спектра действия (extended spectrum beta-lactamases - ESBL). Последние эффективно гидролизуют цефалоспорины III-IV поколений, а также монобактамы, что является причиной их клинической неэффективности, и проявляют чувствительность к ингибиторам бета-лактамаз. Плазмидная локализация генов этих ферментов позволяет им быстро распространяться внутри семейства. Известно большое количество типов ESBL, присущих энтеробактериям, при этом наиболее частыми представителями бета-лактамаз расширенного спектра действия являются ферменты, принадлежащие к ТЕМ и SHV семействам. Наиболее характерны эти типы ESBL для госпитальных штаммов Klebsiella pneumoniae (от 7% до 75% в разных странах), в меньшей степени для Escherichia coli и Proteus mirabilis, реже - у других представителей энтеробактерий, например, сальмонелл и шигелл, и некоторых неферментирующих грамотрицательных палочек, включая Pseudomonas aeruginosa.
Стандартные методы определения чувствительности не всегда позволяют выявить резистентность, обусловленную продукцией ESBL, так как последние часто проявляют in vitro чувствительность к цефалоспоринам.
В то же время выявление продукции ESBL необходимо для проведения рациональной и эффективной антибиотикотерапии, и в первую очередь у всех нозокомиальных штаммов Klebsiella spp. и E.coli, а также любых штаммов энтеробактерий с пониженной чувствительностью к одному из цефалоспоринов III поколения (МИК>1 мг/мл).
Для фенотипической детекции ESBL используются методы, основанные на подавлении их активности клавулановой кислотой.
Настораживающим в отношении ESBL является превышение диаметра зоны задержки роста вокруг диска с амоксициллином/клавулановой кислотой на мм над зоной вокруг амоксициллина. Наиболее простым из них является метод двойных дисков (или синергии с двумя дисками).
2. Метод двойных дисков (синергии сдвумя дисками) для выявления бета-лактамаз расширенного спектра действия (ESBL) 1. Используемая среда - агар Мюллер-Хинтона 2. Бактериальная суспензия готовится из колоний с плотной питательной среды без подращивания ПРОЕКТ 3. В центр чашки накладывается диск с амоксициллином /клавулановой кислотой (20/10 мкг), по бокам от него - по два диска с цефтазидимом (30 мкг) и цефотаксимом (30 мкг). Первый диск каждого антибиотика помещается на расстоянии 20 мм, второй - 30 мм от диска с амоксициллином /клавулановой кислотой (подразумевается расстояние между центрами дисков).
4. Инкубация посевов проводится при 35 С 18-20 часов 5. Использовать бета-лактамазопродуцирующий эталонный штамм Klebsiella pneumonia ATCC 700603 как положительный контроль и E.coli ATCC 25922 как отрицательный контроль.
6. О наличии ESBL судят по расширению зон подавления роста вокруг дисков с цефалоспоринами третьего поколения напротив диска, содержащего клавулановую кислоту (см. рис.) Таблица № Антибиотики, рекомендуемые для выявления ESBL методом двойных дисков у разных видов энтеробактерий.
микроорганизмы антибиотик концентрация (мкг) в диске Кlebsiella oxytoca цефтазидим Proteus vulgaris, P.penneri, цефтазидим Citrobacter diversus азтреонам Enterobacter spp., Citrobacter freundii, цефепим Serratia spp., Morganella morganii, цефпиром Providencia stuartii, P.rettgeri Остальные энтеробактерии цефтазидим цефотаксим Вследствие особенностей продукции хромосомных бета-лактамаз некоторыми видами энтеробактерий для того, чтобы избежать ложноположительных результатов, рекомендуется использовать диски с определенными антибиотиками.
Расстояние между дисками может быть изменено в зависимости от предварительных данных о чувствительности исследуемых штаммов. В случае исследования штаммов с высокой устойчивостью расстояние можно уменьшить до 15 мм, чувствительных - увеличить до 35 мм.
Все штаммы, продуцирующие ESBL, считаются устойчивыми ко всем пенициллинам, цефалоспоринам (за исключением цефамицинов) и монобактамам.
ПРОЕКТ Рис. Детекция ESBL методом двойных дисков. Схематическое изображение зоны ингибиции роста вокруг дисков с амоксициллином/клавуланатом (АМС) и цефтазидимом (CAZ).
ПРОЕКТ Рис. Выявление бета-лактамазы расширенного спектра действия CTX-M- методом двойных дисков у S.typhimurium 1 2 На рисунке стрелками 1 и 2 обозначены зоны расширения роста штамма S. typhimurium за счет ингибиции СТХ-М-4 клавулановой кислотой, находящейся в центральном диске (положительный результат). Стрелкой 3 обозначен чувствительный штамм S. enteritidis (отрицательный результат) ПРОЕКТ Приложение № Таблица № Наиболее распространенные торговые названия антибактериальных препаратов Генерическое название Торговое название (фирма) азитромицин сумамед (Pliva) амоксициллин флемоксмин солютаб (Yamanochi Europe) хиноксил (KRKA) амоксициллин/клавуланат aугментин (Glaxo SmithKline) амоксиклав (Lek) импенем тиенам (Merck Sharp& Dohme) кларитромицин клацид (Sanofi-Syntelabo) фромилид (KRKA) левофлоксацин таваник (Aventis) меропенем меронем (Astra-Zeneca) моксифлоксацин авелокс (Bayer) офлоксацин таривид (Hoechst) пефлоксацин абактал (Lek) тикарциллин/клавуланат тиментин (Glaxo SmithKline) цефепим максипим (Bristol-Myers Squibb) цефоперазон цефобид (Pfizer) цефоперазон/сульбактам сульперазон (Pfizer) цефотаксим клафоран (Aventis) цефтазидим фортум (Glaxo SmithKline) цефтриаксон роцефин (Hoffman La - Roche) лендацин (Lek) цефуроксим зинацеф(Glaxo SmithKline) цефуроксим аксетил зиннат (Glaxo SmithKline) ципрофлоксацин ципробай (Bayer) ципринол (KRKA) ПРОЕКТ Список литературы:
Богданович Т.М.. Стецюк О.У., Кречикова О.И., Боронина Л.Г., Катосова Л.К., Фаустова М.Е., под ред. Страчунского Л.С. Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам H.influenzae// Клиническая микробиология и антимикробная терапия, том №2, 2000г., стр.93 Ц109.
Кречикова О.И., Козлов Р.С., Богданович Т.М.. Стецюк О.У., Суворов М.М., Катосова Л.К., Вишнякова Л.А, Фаустова М.Е., под ред.
Страчунского Л.С. Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам Streptococcus pneumoniae// Клиническая микробиология и антимикробная терапия, том 2 №1, 2000г., стр.88 Ц98.
Сехин С.В., Вознесенский Д.Л., Васильев М.М., Кубанов А.А.
Определение чувствительности гонококков к антибактериальным препаратам// Клиническая микробиология и антимикробная терапия, том №2, 2003г., стр.175 - Felmingham D., Washington J. Trends in antimicrobial susceptibility of bacterial respiratory tract pathogens - findings of the Alexander project 1992-1996. J Chemother 1999;
11:5-21.
Jacoby G.A. Prevalence and resistance mechanisms of common bacterial respiratory pathogens. Clin Infect Dis 1994;
18:951-7.
Fuchs P.C., Barry A.L. Interpretative criteria for susceptibilities of Haemophilus influenzae to ampicillin, amoxicillin and amoxicillin/clavulanate. J Clin Microbiol 1994;
32:2846-50.
Crokaert F., Aoun M., Duchateau V. Are macrolides active against Haemophilus influenzae? Are the in vitro tests reliable? Proceedings of the 35th ICAAC, San Francisco, 1995.
Acar J. Resistance patterns of Haemophilus influenzae. J Chemother 1999;
11:44-50.
National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing;
ninth informational supplement. NCCLS Document M100-S9 1999;
19(1).
ПРОЕКТ National Committee for Clinical Laboratory Standards. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard. 5th ed. NCCLS Document M7-A5 2000;
20(2).
National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing;
tenth informational supplement. NCCLS Document M100-S10(M7) 2000.
National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing;
tenth informational supplement. NCCLS Document M100-S12. 2002.p. World Health Organization. STD Treatment Strategies. WHO 1989. p.30.
World Health Organization. Management of sexually transmitted diseases.
WHO 1997. p.47.
Книги, научные публикации