На правах рукописи

ЮЛДАШЕВ РУСЛАН АДИКОВИЧ РЕГУЛЯЦИЯ 24-ЭПИБРАССИНОЛИДОМ МЕТАБОЛИЗМА ЦИТОКИНИНОВ В РАСТЕНИЯХ ПШЕНИЦЫ 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

УФА 2009 2

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Шакирова Фарида Миннихановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Клячко Нелла Леопольдовна Институт физиологии растений РАН доктор биологических наук, профессор Веселов Станислав Юрьевич Башкирский государственный университет

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный университет

Защита состоится л 2009 г. в л_ ч на заседании диссертационного совета ДМ002.133.01 при ИБГ УН - РАН по адресу: 450054, Уфа, пр. Октября, 71

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71 и на сайте ИБГ УН - РАН:

Автореферат разослан л 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н. С.М.Бикбулатова 3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Гормональной системе отводят лидирующую роль в регуляции метаболизма растений, лежащего в основе роста и развития в ходе онтогенеза, а также адаптации к изменяющимся условиям произрастания. Каждый из фитогормонов участвует в регуляции таких интегральных физиологических процессов как рост, развитие и дифференцировка растений в нормальных условиях произрастания и при их изменении, что указывает на активное взаимодействие их друг с другом в единой системе регуляции жизнедеятельности (Chow, McCourt, 2004; Reski, 2006; Goda et al., 2008; Fukaki, Tanaka, 2008; Kuppusamy et al., 2008; Bari, Jones, 2009). Нужно отметить, что изучение молекулярных механизмов действия брассиностероидов (БС) имеет общебиологическое значение. В связи с тем, что они являются структурными аналогами стероидных гормонов животных, это может способствовать пониманию общих закономерностей функционирования систем регуляции метаболизма не только растений, но и других организмов (Geldner et al., 2007).

К настоящему времени накопилось много сведений об участии БС в регуляции протекания разнообразных метаболических процессов в растениях, причем благодаря отличительной особенности БС проявлять свой эффект на разные культуры в исключительно низких в сравнении с действием других гормонов концентрациях их относят к уникальному классу фитогормонов (Haubrick, Assmann, 2006; Howell et al., 2007; Jager et al., 2008), более того, высказывают мнение об их лидирующей роли среди фитогормонов (Khripach et al., 2000). С начала открытия у БС было продемонстрировано сочетание ярко выраженного ростстимулирующего и защитного в отношении разных по природе неблагоприятных факторов действия на растения, обусловленного их тесным взаимодействием с другими фитогормонами (Kuperin et al., 2008;

Arteca, Arteca, 2008; Vert et al., 2008; Bari, Jones, 2009).

Ранее в нашей лаборатории было выявлено, что обработка проростков пшеницы 24-эпибрассинолидом (ЭБ) в оптимальных в стимуляции ростовых процессов концентрациях вызывает в них стойкое двукратное накопление цитокининов (ЦК) на фоне отсутствия изменений в уровне индолилуксусной (ИУК) и абсцизовой (АБК) кислот (Шакирова и др., 2002; Авальбаев и др., 2003). Это позволило предположить, что эндогенные цитокинины могут играть важную регуляторную роль в проявлении физиологического действия ЭБ на растения, как в нормальных условиях произрастания, так и при стрессовых воздействиях. В пользу возможности вовлечения цитокининов в реализацию физиологического действия ЭБ могут служить сведения об участии гормонов цитокининовой природы в активации ростовых процессов и формировании защитных реакций, обусловленных индукцией под их влиянием чувствительных к ним генов (Hare et al., 1997; Liu, Huang, 2002; Boonman et al., 2007; Werner et al., 2008; Potters et al., 2009). Однако встает вопрос, что лежит в основе ЭБ-индуцированной стимуляции накопления цитокининов и поддержания их повышенного вдвое содержания в растениях пшеницы при обработке ЭБ.

Цель и задачи исследований. Цель работы заключалась в выявлении механизмов регуляции 24-эпибрассинолидом метаболизма гормонов цитокининовой природы в растениях пшеницы. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) Исследовать характер влияния ЭБ на новообразование цитокининов в растениях пшеницы посредством оценки количественного уровня нуклеотида зеатина и изопентиниладенозина, являющихся первыми соединениями на пути биосинтеза зеатина.

2) Провести анализ динамики содержания О-глюкозидов как наиболее распространенной запасной формы активных цитокининов в проростках пшеницы при обработке 24-эпибрассинолидом.

3) Для принципиальной оценки участия 24-эпибрассинолида в катаболизме цитокининов исследовать его влияние на активность ключевого фермента деградации цитокининов цитокининоксидазы и уровень экспрессии кодирующего этот фермент гена в растениях пшеницы.

4) В сравнительном аспекте исследовать пути гормональной регуляции транскрипции гена дегидрина и концентрации пролина, как важнейших осмопротектантов растений под влиянием 24-эпибрассинолида и синтетического аналога зеатина 6-бензиламинопурина.

Научная новизна. Раскрыты механизмы регуляции индуцированного 24-эпибрассинолидом стойкого двукратного увеличения концентрации цитокининов в растениях пшеницы. Выявлено, что они связаны как с усилением новообразования цитокининов, о чем судили по увеличению уровня нуклеотида зеатина и суммарного содержания производных изопентиниладенина и резкому возрастанию запасных форм цитокининов О-глюкозидов, так и с уменьшением ферментативной активности и уровня экспрессии гена цитокининоксидазы, что обеспечивало торможение распада цитокининов. Получены приоритетные сведения о существовании альтернативных путей гормональной регуляции количественного уровня пролина и экспрессии TADHN гена дегидрина пшеницы: 6-бензиламинопурин (БАП) регулирует накопление пролина и усиление транскрипции гена дегидрина опосредовано через повышение эндогенной АБК, тогда как ЭБ - независимо от АБК.

Практическая значимость работы. Совокупность полученных результатов свидетельствует о тонкой регуляции 24-эпибрассинолидом метаболизма гормонов цитокининовой природы в растениях пшеницы и расширяет знания об особенностях функционирования разных групп фитогормонов в единой гормональной системе. Сочетание у брассиностероидов свойств стимулировать ростовые процессы растений и одновременно индуцировать в них формирование защитных реакций делает их привлекательными для широкого использования в растениеводстве.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на 9 и 10 международной Пущинской школе-конференции молодых ученых Биология - наука XXI века (Пущино, 2005; 2006), годичных собраниях Общества физиологов растений России (Ростов, 2006, Екатеринбург, 2008), международном симпозиуме Сигнальные системы клеток растений: Роль в адаптации и иммунитете (Казань, 2006), XV международном конгрессе Федерации Европейских Обществ Физиологов Растений (Франция, 2006), VI съезде Общества физиологов растений России (Сыктывкар, 2007).

Конкурсная поддержка работы. Исследования поддержаны грантами РФФИ №№ 04-04-48853, 04-04-48900, 08-04-01563а, а также Программой государственной поддержки ведущих научных школ РФ - НШ-1785.2003.4, НШЦ3692.2006.4, НШЦ915.2008.4.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 3 статьи в журналах из перечня ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 145 страницах и иллюстрирована 27 рисунками и 1 таблицей. Список литературы включает наименования.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования служили проростки пшеницы Triticum aestivum L.

сорта Башкирская 24. Семена пшеницы проращивали в кюветах на фильтровальной бумаге, смоченной водопроводной водой, при 21-230С, 16-часовом фотопериоде и освещенности 15 клк в течение 3-х суток. После отделения эндосперма проростки выдерживали сутки на растворе 2%-ной сахарозы для снятия раневого стресса (Шакирова, Безрукова, 1998) и переносили на среду, содержащую смесь 2%-ной сахарозы с различными фитогормонами, после чего корни и побеги фиксировали в жидком азоте для последующего анализа в зависимости от задач. Контролем служили проростки, инкубированные на растворе 2%-ной сахарозы.

Содержание свободных форм АБК, ИУК и цитокининов определяли в одной растительной навеске, состоящей из корней 4-суточных проростков, методом непрямого твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа с использованием специфичных к этим соединениям кроличьих антител и меченных пероксидазой антикроличьих антител, детально описанного ранее (Shakirova et al., 2003). Концентрирование и очистку цитокининов проводили с использованием картриджа С18, как описано ранее (Vysotskaya et al., 2003).

Количество О-глюкозидов оценивали по разнице иммунореактивности до и после обработки водного остатка образца - глюкозидазой (Веселов, 1998).

Активность цитокининоксидазы определяли согласно оригинальной методике (Веселов, Симонян, 2004). Оценку содержания пролина проводили с использованием метода Bates (1973).

О росте судили по изменению линейных размеров проростков, корней и побегов, а также их сырой и сухой массы. Митотическую активность апикальной меристемы корней проростков оценивали цитологическими методами с использованием окуляр-микрометра при анализе не менее клеток (Паушева, 1988). Митотический индекс (МИ) рассчитывали как процент делящихся клеток.

РНК выделяли гуанидинтиоцианатным методом (Boothe et al., 1995).

Дот-блот анализ проводили по методу, описанному Sambrook et al. (1989).

Количественную оценку РНК генов цитокининоксидазы и TADHN дегидрина пшеницы в точках гибридизации осуществляли сканированием рентгеновской пленки и обработки изображений с помощью программы TotalLab.

Для получения кДНК на основе мРНК исследуемых генов проводили реакцию обратной транскрипции с использованием M-MuLV обратной транскриптазы согласно протоколу поставщика. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в амплификаторе типа ТП4-ПЦР-01-УТерцикФ (УДНК-ТехнологияФ, Россия). После амплификации фрагменты ДНК фракционировали методом электрофореза в 1-2% агарозном геле или 7% ПААГ.

Опыты проводили в двух-четырех биологических и четырех-шести аналитических повторностях. В иллюстрациях представлены средние арифметические значения и ошибки средних.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Значение эндогенных цитокининов в проявлении ростстимулирующего действия 24-эпибрассинолида на растения пшеницы. Ранее было выявлено, что оптимальными в активации роста корней являются концентрации ЭБ 0.4 нМ и 0.4 мкМ (Шакирова, 2001). Поскольку ЭБ в этих концентрациях вызывал почти двукратное увеличение содержания ЦК в растениях (Авальбаев и др., 2003), можно предположить, что именно с этим эффектом ЭБ связано проявление его ростстимулирующего действия на проростки пшеницы. В связи с этим нами были предприняты опыты с обработкой растений пшеницы ЭБ в вышеуказанных концентрациях, а также в концентрации 4 нМ, характеризующейся наименьшим стимулирующим действием на рост корней (Шакирова, 2001).

На рис. 1А видно, что обработка проростков ЭБ в оптимальных в стимуляции роста концентрациях вызывала почти двукратное увеличение количественного уровня ЦК в корнях, тогда как при воздействии ЭБ в концентрации 4 нМ, неоптимальной в стимуляции роста, наблюдалось существенно меньшее повышение содержания ЦК в корнях.

Известно, что одной из наиболее характерных для ЦК ответных реакций является стимуляция роста клеток делением и растяжением (Кулаева, 1973;

Pasternak et al., 2000; Kim, Park, 2007). Активация деления и элонгации клеток разных растительных объектов также выявлена и для брассиностероидов (Rao et al., 2002; Mussig, 2005; Howell et al., 2007; Fu et al., 2008). В связи с этим мы проанализировали влияние ЭБ в разных концентрациях на митотическую активность апикальной меристемы корней 4-суточных проростков пшеницы.

Из рис. 1Б видно, что ЭБ во всех исследованных концентрациях оказал стимулирующий эффект на деление клеток апикальной меристемы корней, однако вновь обращает на себя внимание факт наличия корреляции митотической активности клеток корней с уровнем эндогенных цитокининов:

ЭБ в оптимальных в стимуляции роста корней концентрациях, 0.4 нМ и 0.4 мкМ, повышал митотический индекс корней более чем на 50% в сравнении с контролем, тогда как 4 нМ ЭБ - не более чем, на 30%.

А Б 0.4 нМ ЭБ 4 нМ ЭБ 0.4 мкМ ЭБ 3 9 0.4 нМ 4 нМ 0.4 мкМ 24-Эпибрассинолид Bремя, ч Рис. 1. Влияние 24-эпибрассинолида в разных концентрациях на динамику содержания эндогенных цитокининов (А) и митотический индекс клеток кончиков корней 4-сут проростков пшеницы (Б). 4-сут проростки инкубировали 24 ч на опытных растворах Полученные результаты указывают на корреляцию между способностью ЭБ стимулировать рост корней в исследованных концентрациях и накоплением цитокининов в них, соответственно, и дают основание полагать, что стимуляции роста корней обработанных ЭБ проростков может реализоваться опосредовано через увеличение содержания эндогенных цитокининов.

Динамика ЭБ-индуцированного накопления цитокининов в корнях и побегах пшеницы. Обнаружено, что ЭБ в корнях вызывал существенное увеличение концентрации ЦК уже через 5 минут от начала воздействия (рис. 2), которое сохранялось на уровне почти вдвое выше контрольного значения даже на протяжении 30 ч инкубирования проростков на ЭБ (рис. 3). В побегах двукратное накопление ЦК наблюдалось позднее, через час (рис. 2), что согласуется с данными о том, что местом преимущественного синтеза ЦК являются корни, из которых они затем транспортируются в побеги (Кулаева, 1973; Incoll et al., 1990; Sakakibara, 2005).