На правах рукописи

УДК 576.316.577.1 ВОРОНОВ АЛЕКСАНДР СЕРГЕЕВИЧ СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭВОЛЮЦИЯ РИБОСОМНОЙ ДНК ЧЕШУЙЧАТЫХ РЕПТИЛИЙ ПОДОТРЯДА SAURIA Специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН, лаборатории организации генома

Научный консультант:

Кандидат биологических наук Куприянова Н.С.

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Альтштейн А.Д.

Доктор биологических наук, профессор Носиков В.В.

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Защита диссертации состоится У22Ф октября 2008 года в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва В-334, ул. Вавилова 32.

Автореферат разослан УЕЕФ ЕЕЕЕЕЕ 2008 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета канд. фарм. наук Грабовская Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время в молекулярной биологии быстрыми темпами идет накопление экспериментального материала по первичной структуре геномной и митохондриальной ДНК различных организмов. Одним из важнейших современных направлений в молекулярной биологии и генетике является изучение изменчивости генетического материала и поиск эволюционных связей между организмами. Однако интенсивные усилия, направленные на установление структуры и корней эукариотического древа путем филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей, пока не привели к построению общепринятого варианта такого древа [Arisue et al., 2005]. Нет окончательной ясности и в вопросе филогении рептилий.

Интерес к структурно-функциональной организации кластера рибосомных генов обусловлен центральной ролью рибосомной РНК в ряде важнейших клеточных процессов, а также особенностями строения рибосомной ДНК (рДНК). Для рДНК характерно чередование консервативных и вариабельных участков, которые удобно использовать для филогенетических исследований и поиска функционально значимых участков у организмов различной степени родства.

Для изучения эволюционных связей часто используется участок рибосомного оперона, включающий внутренние транскрибируемые спейсеры ВТС1 и ВТСпредшественников рибосомной РНК. В настоящее время в GenBank депонировано более 100 000 последовательностей ВТС2, подавляющее большинство этих видоспецифических последовательностей принадлежит беспозвоночным. Их интенсивно и успешно использовали для филогении и эволюционных сравнений растений, протистов и некоторых беспозвоночных. Очевидно, что ВТС2 можно использовать для филогении и эволюционных сравнений таксонов более высокого уровня, благодаря наличию высоко консервативных (консенсусных) последовательностей, обеспечивающих консервативность вторичной структуры соответствующего участка пре-рРНК [Joseph, 1999; Coleman, 2007].

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования являлось изучение структурной организации кластеров и эволюционной изменчивости отдельных участков рДНК у чешуйчатых рептилий подотряда Sauria.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Методом блот-гибридизационного анализа картировать и определить размер мономерного звена рДНК у ряда представителей подотряда Sauria.

2. Определить степень представленности повторов рДНК в геномах различных представителей подотряда Sauria.

3. Клонировать, секвенировать и провести сравнительный анализ первичных и вторичных структур ВТС2 ящериц между собой и с представителями других позвоночных..

Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе впервые определены особенности организации кластеров рДНК представителей отряда Squamata.

Показано, что повторяющаяся единица рДНК ящериц одна из самых коротких среди всех позвоночных (10 - 15 т.п.н.). Установлена степень повторности мономеров рДНК у ряда представителей рептилий, показано что у ряда ящериц она значительно меньше, чем у всех ранее исследованных позвоночных. Показано, что у Uta stansburiana (Iguanidae) рДНК локализована на одной хромосоме. Впервые у 15 представителей отряда Squamata определена полная нуклеотидная последовательность ВТС2. Сравнительный анализ полученных последовательностей между собой выявил различия в размерах и характерные особенности организации этого элемента рДНК у представителей инфраотряда Iguania и семейства Lacertidae. Показано, что увеличение размеров ВТС2 у исследованных рептилий является следствием коротких инсерций и локальных дупликаций.

Результаты исследования имеют ценность для выявления закономерностей эволюции рДНК и их взаимосвязи с эволюцией биологических видов. Данные, представленной диссертационной работы, являются новым научным материалом, необходимым для восполнения общего объема информации, на основании которой могут быть сделаны выводы о механизмах эволюции рДНК Рибосомная ДНК рептилий, имеющая, как выяснилось, наименьший размер повторяющегося звена при наименьшей степени повторности, представляет интересную модель для изучения механизмов поддержания необходимого уровня экспрессии генов рРНК. Полученные результаты могут найти применение в изучении возможных вариаций в способах регуляции транскрипции генов рРНК, необходимый уровень присутствия которой при абсолютной точности процессинга жизненно важен для любой клетки.

Таким образом, наша работа, кроме результатов по молекулярной структуре и эволюционной изменчивости рДНК рептилий, содержит информацию, имеющую важное прикладное значение в области общей биологии как способствующая разработке систематики рептилий на основе филогенетически значимых молекулярных маркеров.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 12-ом Международном герпетологическом конгрессе (С. - Петербург, 1216 августа 2003 г.), на III съезде ВОГИС, (Москва, 6- 12 июня 2004 г.), на Международной конференции Вычислительная филогенетика и геносистематика (Москва, 16-19 ноября 2007 г.) и на межлабораторном семинаре ИБГ РАН (2008 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 97 страницах, включает рисунков, 4 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1 Структурная организация рДНК ящериц 1.1 Рестрикционное картирование рДНК ящериц В рДНК позвоночных эндонуклеаза рестрикции EcoRI дает два константных разрыва: за 220 п.н. до 3Т конца 18S рДНК и за 585 п.н. до 3Т конца 28S рДНК (Рис. 1). В случае отсутствия дополнительных EcoRI сайтов при гидролизе образуется два фрагмента, один из которых содержит 3Т конец 18S рДНК, внутренний транскрибируемый спейсер1 (ВТС1), 5,8S рДНК, внутренний транскрибируемый спейсер 2 (ВТС2) и основную часть 28S рДНК (внутренний фрагмент). Второй, внешний фрагмент, содержит рибосомный межгенный спейсер (рМГС), несущий на 5Т конце остаток 28S рДНК, а на 3Т конце - практически полноразмерную 18S рДНК. На основании нуклеотидных последовательностей, прилежащих с обеих сторон к консервативным EcoRI сайтам, изготовлялись маркерные олигонуклеотидные пробы RI - RIV таким образом, что RI и RIII могли служить маркерами для внутреннего фрагмента рДНК, а RII и RIV - для внешнего (Рис. 1).

Рис. 1. Схема организации повтора рДНК позвоночных. Вертикальными линиями показаны консевативные сайты рестрикции EcoRI, синими квадратами - положение гибридизационных зондов RI-RIV.

Pезультаты блот-гибридизационного анализа геномной ДНК D. raddei и D.

armeniaca (рис. 2) позволяют заключить, что размер повторяющейся единицы рДНК у этой ящерицы составляет примерно 15 т.п.н., т.к. расщепление геномной ДНК под действием трех рестриктаз (BamHI, BglII и KpnI) из четырех приводит к образованию единственного, одинакового по размеру фрагмента, гибридизующегося как с пробой RII (Рис. 2а), так и с пробами RI, RIII и RIV (данные не приведены). Совместная обработка ДНК D. raddei рестриктазой EcoRI в сочетании с любой из рестриктаз, перечисленных в скобках (PstI, SalGI, AccI, BglII, EcoRV, NotI и XhoI) и последовательная гибридизация с мечеными маркерами (RI-RIV) показывает, что сумма всех гибридизующихся фрагментов в каждой из дорожек составляет 15 т.п.н. (Рис. 2б-д).

Рис. 2. Блот-гибридизационный анализ ДНК Darevskia raddei.

а) Гидролиз эндонуклеазами рестрикции BamH I (1), BglII (2), EcoRI (3), KpnI (4), гибридизация с меченым олигонуклеотидным зондом RII; б-д) Гидролиз эндонуклеазой рестрикции EcoRI (1) совместно с PstI (2), SalGI (3), AccI (4), BglII (5), EcoRV (6), NotI (7), XhoI (8), гибридизация c мечеными олигонуклеотидными зондами RI (б), RIII (в), RII (г), RIV (д).

Аналогичная серия гибридизаций была проведена для представителя инфраотряда Iguania - Laudakia caucasia. Расщепление геномной ДНК четырьмя рестриктазами (BglII, BamHI, KpnI или HindIII) из шести приводит к образованию единственного фрагмента размером около 10 т.п.н., гибридизующегося как с пробой RII (Рис. 3а), так и с пробами RI, RIII и RIV (данные не приведены). Совместная обработка ДНК D. raddei рестриктазой EcoRI в сочетании с любой из рестриктаз, перечисленных в скобках (PstI, SalGI, AccI, BglII, EcoRV, NotI и XhoI) и последовательная гибридизация с мечеными маркерами (RIRIV) показывает, что сумма всех гибридизующихся фрагментов в каждой из дорожек составляет 10 т.п.н. (Рис. 3 б-д).

Рис. 3. Блот-гибридизационный анализ ДНК Laudakia caucasia.

а) Гидролиз эндонуклеазами рестрикции EcoRI (1), BglII (2), BamHI (3), PvuII (4), KpnI (5), HindIII (6), гибридизация с меченым олигонуклеотидным зондом RII; б-д) Гидролиз эндонуклеазой рестрикции EcoRI (1) совместно с PstI (2), SalGI (3), AccI (4), BglII (5), EcoRV (6), NotI (7), XhoI (8), гибридизация c мечеными олигонуклеотидными зондами RI (б), RIII (в), RII (г), RIV (д).

Сходные размеры мономера рДНК были получены еще для восьми видов рептилий отряда Squamata (табл.1). Рестрикционный анализ показал, что рДНК исследованных рептилий содержит два консервативных EcoR I сайта рестрикции, типичных для всех позвоночных.

Полученные результаты указывают на стандартную организацию рДНК ящериц при необычно малой для позвоночных (~10 - 15 т.п.н.) длине мономера рДНК. У человека эта величина составляет около 43 т.п.н. при степени повторности 200-300 [Gonzalez et al.,1995], у Xenopus laevis - 20-25 т.п.н. при степени повторности 600 [Long et al.,1980], костистой рыбы вьюн (Misgurus fossilis L.) имеется два типа мономеров рДНК - длинный - 20-25 т.п.н. с числом повторов 250 и короткий - 15 т.п.н., составляющий около 10% от основного [Куприянова и др., 1981], а у дрожжей S. cerevisiae эта величина составляет около 11 т.п.н при повторности 140 [Long et al.,1980].

Таблица 1. Размер мономеров рДНК у разных видов ящериц.

Размер семейство вид мономера в т.п.н.

Darevskia armeniaca ~Darevskia raddei ~Lacertidae Darevskia valentini ~Lacerta agilis ~Zootoca vivipara ~Scincidae Eulamprus murrayi ~Varanidae Varanus exant ~ Iguana iguana ~ Iguanidae Uta stansburiana ~Agamidae Laudakia caucasia ~1.2 Определение количества мономеров в кластерах рДНК Скрининг фильтров, содержащих упорядоченные колонии 2x BAC-библиотеки ящерицы Uta stansburiana, выявил 12 клонов-кандидатов: из них четыре колонии, давали интенсивный сигнал и восемь - слабый сигнал (Рис. 4).

Рис. 4. Гибридизация одного из фильтров геномной библиотеки Uta Stansburiana с олигонуклеотидным зондом RII. Стрелками и цифрами обозначены клоны дающие интенсивный сигнал (1), клоны дающие слабый позитивный сигнал (2).

класс отряд подотряд Sauria Reptilia Squamata Iguania Varanoidea Scincomorpha инфраотряд Методом блот-гибридизационного анализа показано, что только восемь клонов из 12 содержат рДНК. Четыре клона дают интенсивную гибридизацию со всеми четырьмя олигонуклеотидными зондами (рис. 5 б-д, дорожки 1-4), а еще четыре - слабую гибридизацию только с олигонуклеотидным зондом RIII (Рис. 5 г, дорожки 6, 8, 11 и 12).

Эти результаты показывают, что клоны 1-4 содержат центральные области кластеров рДНК, а в клонах 6, 8, 11 и 12, по-видимому, присутствуют сегменты, имеющие гомологию с 3Т - концевым участком 18S рДНК. Зная среднюю длину вставки в BAC клоне (120 т.п.н.) и длину мономера рДНК (15 т.п.н.), определенную с помощью блотгибридизационного анализа (рис. 5б-д), можно предположить, что каждый из четырех клонов (1-4) содержит не более восьми мономеров рДНК. Поскольку работа проводилась с двукратной библиотекой диплоидного организма полученные результаты позволяют предположить, что в гаплоидном геноме ящерицы Uta stansburiana присутствует не более 8 мономеров рДНК, расположенных на одной хромосоме. Гибридизация с мечеными пробами RII и RIV выявила наличие внутригеномного полиморфизма в коллинеарно расположенных повторах рДНК (Рис. 5 г-д). Положение проб RII и RIV на карте рДНК с большой степенью вероятности указывает на то, что полиморфные участки локализуются в рМГС.

Рис. 5. Рестрикционно-гибридизационная характеристика клонов, содержащих рДНК, из BAC библиотеки Uta stansburiana. а) УФвизуализация рестрикционных фрагментов;

б-д) Блот-гибридизация фрагментов, полученных в результате обработки ВАСклонов, содержащих рДНК, эндонуклеазой рестрикции EcoRI. Меченные олигонуклеотидные пробы RI (б), RII (в), RIII (г), RIV (д). Звездочками обозначено местоположение слабогибридизующихся фрагментов (дорожки 6, 8, 11 и 12).

Оценку содержания повторов рДНК в геномах шести представителей отряда Squamata проводили методом ПЦР в реальном времени. В качестве контрольного образца использовали геномную ДНК человека (размер генома 3х109 п.н.; число копий рДНК на гаплоидный геном - 200-300) [www.genomesize.com]. Пробы ДНК, взятые у трех индивидов (по 100 нг), достигали C(Т) к 18,5му0,3 циклу. Образцы, содержащие аналогичное количество (100 нг) геномной ДНК разных видов ящериц, достигали С(Т) к 17му- 20му циклам (Табл. 2).