На правах рукописи

ВОРОБЬЕВА Наталья Юрьевна МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ МАРКЕРЫ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЧЕЛОВЕКА К ВОЗДЕЙСТВИЮ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ 03.00.01- радиобиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

Работа выполнена в лаборатории радиационной биофизики и экологии Института химической физики им.Н.Н. Семенова Российской Академии Наук

Научный консультант: доктор биологических наук Осипов Андреян Николаевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Засухина Галина Дмитриевна Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН доктор биологических наук, профессор Саенко Александр Семенович Медицинский радиологический научный центр РАМН

Ведущая организация: Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля Российской академии наук

Защита состоится Е.. _ 2007 г. в л часов на заседании диссертационного совета Д.501.001.65. в Московском государственном университете им. Ломоносова по адресу: 119899, г. Москва, ГСП, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ по адресу: 119899, г. Москва, ГСП, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.

Автореферат разослан л _2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Т.В.Веселова 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время человек часто подвергается воздействию радиации (совместно с другими агентами) в малых дозах, которые могут изменить радиочувствительность организма в сторону:

снижение радичувствительности (адаптивный ответ) и ее увеличение. Следует учитывать и малоизученные виды комплексного воздействия на организм - так, в последние десятилетия резко увеличилось число полетов на больших высотах, где человек подвергается воздействию целого ряда неблагоприятных факторов: космическое излучение, перегрузки, вибрация, гиподинамия, стресс и др. Результаты многочисленных медикобиологических исследований свидетельствуют о том, что подобные комплексные воздействия приводят к увеличению частоты цитогенетических нарушений (Heimers, 2000), заболеваниям опухолевого (Buja et al., 2005) и неопухолевого генеза (Grosz et al., 2007), изменениям уровня повреждений генома и чувствительности клеток к дополнительным воздействиям (Пелевина и др., 2007). Эти изменения являются предпосылками для развития нестабильности генома (Zha et al., 2007). Однако, как правило, оценивается лишь принципиальная возможность возникновения генотоксических эффектов путем сравнения средних показателей исследуемых групп с контролем. Анализ вариабельности индивидуальных различий отдельных лиц в большинстве исследований не проводится, в то время как их радиочувствительность может различаться в десятки раз.

С другой стороны для лечения онкологических заболеваний человека часто используется лучевая терапия, где опухоли подвергают локальному облучению в высоких дозах. Известно, что чувствительность опухолей одного и того же типа к облучению у различных индивидуумов существенно различается (Пелевина и др., 2006). Также резко различается последствия лучевой терапии для организма при облучении опухолей в сходных дозах (Pinar et al., 2007). Поэтому при онкологических заболеваниях также чрезвычайно важно определять индивидуальную реакцию на радиационное воздействие.

Из вышеизложенного следует, что поиск адекватных критериев оценки индивидуальной радиочувствительности человека и ее вариабельности является одной из важнейших проблем современной радиобиологии и медицины.

Так как радиочувствительность организма связана главным образом со способностью клеточных систем: 1) предотвращать возникновение повреждений ДНК; 2) репарировать индуцированные радиацией повреждения ДНК; 3) эффективно элиминировать клетки, в которых репарация повреждений ДНК невозможна (запуск апоптоза), то в настоящей работе были изучены основные компоненты, определяющие клеточную радиочувствительность.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в оценке индивидуальной чувствительности лимфоцитов крови человека к дополнительному облучению в условиях in vitro и выявления маркеров, характеризующих вариабельность радиочувствительности и ее изменение при воздействии профессиональных факторов, развитии онкологических заболеваний и их лучевой терапии.

Были поставлены следующие задачи исследования:

Х на лимфоцитах периферической крови контрольных доноров, летчиков, космонавтов и онкологических больных:

1. Оценить уровень разрывов ДНК и повреждаемость ДНК при дополнительном облучении клеток в условиях in vitro;

2. Изучить эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК и ее индивидуальную вариабельность;

3. Сравнить динамику клеточной гибели (апоптоз, некроз);

4. У онкологических больных до и во время проведения курса лучевой терапии исследовать уровень разрывов ДНК, повреждаемость ДНК при дополнительном облучении клеток в условиях in vitro, эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК и гибель клеток по механизмам апоптоза и некроза.

5. Сопоставить информативность изученных показателей для характеристики индивидуальной реакции Положения, выносимые на защиту:

1. Полеты на больших высотах приводят к увеличению повреждаемости ДНК в лимфоцитах крови при дополнительном облучении клеток в условиях in vitro и возрастанию индивидуальной вариабельности радиочувствительности;

2. У онкологических больных (рак простаты) до лучевой терапии в лимфоцитах крови отмечается повышение уровня разрывов ДНК, увеличение повреждаемости ДНК при дополнительном облучении клеток в условиях in vitro и доли гибнущих клеток. В процессе лучевой терапии рака простаты увеличивается уровень разрывов ДНК лимфоцитов крови и частота их гибели.

3. Использованный в работе комплекс клеточно-молекулярных методов и подходов позволяет дать адекватную оценку индивидуальной радиочувствительности человека и ее вариабельности.

Научная новизна. Впервые на лимфоцитах крови контрольных доноров, летчиков, космонавтов проведено исследование исходного уровня разрывов ДНК, выхода двунитевых разрывов ДНК при дополнительном облучении клеток в условиях in vitro, эффективности их репарации и динамика гибели клеток (ранний и поздний апоптоз, некроз) при инкубации в условиях in vitro.

Впервые на лимфоцитах крови больных раком простаты до и в процессе лучевой терапии изучено изменение уровня разрывов ДНК, повреждаемости ДНК при дополнительном облучении клеток в условиях in vitro, эффективности репарации двунитевых разрывов ДНК и динамика клеточной гибели (ранний и поздний апоптоз, некроз) при инкубации в условиях in vitro.

Впервые с применением современных клеточно-молекулярных методов дана комплексная сравнительная оценка вариабельности радиочувствительности в когортах контрольных доноров, летчиков, космонавтов и онкологических больных до и во время лечения.

Научно-практическая ценность работы. Результаты работы могут быть использованы: в радиационной биологии для определения различий в индивидуальной реакции на облучение; в медицине и космической биологиии для выявления у пилотов и космонавтов ранних признаков необходимости прекращения полетов; в медицине для прогнозирования эффективности и последствий лучевого лечения онкологических заболеваний.

ичный вклад диссертанта. Представленная работа является частью исследований, проведенных лабораторией радиационной биофизики и экологии ИХФ РАН с личным вкладом диссертанта, в получение представленных в работе материалов не менее 70 %. Автор самостоятельно осуществляла постановку и проведение исследований, первичную обработку и анализ полученных данных, формулировала положения и выводы работы.

Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на Международной конференции БИОРАД-2006 Биологические эффекты радиации и радиоактивное загрязнение среды (Сыктывкар, 2006); 4th International Workshop on Space Radiation Research and 17th Annual NASA Space Radiation Health InvestigatorsТ Workshop (Moscow - St. Petersburg, Russia, 2006); 35th Annual Meeting of the European Radiation Research Society and the 4th Annual Meeting of the Ukrainian Society for Radiation Biology (Kiev, Ukraine, 2006); International Free Radical Summer School 2006 (Spetses Island, Greece, 2006); III Международном симпозиуме Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии (МоскваДубна, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, использованных в работе, трех глав результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит таблиц и рисунков. Список литературы включает источников, из них на иностранном языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для исследований были подобраны четыре различных когорты людей.

1) Группу контроля составили здоровые сотрудники лаборатории лабораторных методов исследований клинико-диагностического отделения ФГУ РНЦРР Росмедтехнологии, доноры пункта переливания крови МРН - РАМН. У всех контрольных доноров было получено согласие на проведение данного исследования. Всего было обследовано 33 контрольных доноров.

2) В группу летчиков вошли 41 пилот гражданской авиации, летавшие на разной высоте (6000Ц17000 м), различное количество часов (390 - 4520 ч). Общий налет составил от 390 до 4520 часов, а накопленная доза 0,019 - 1,4 сГр.

3) В группу космонавтов вошли 8 человек, обследование которых проводилось спустя 10 - 20 лет после завершения полетов, время в космосе составляло от 11 до 679 суток (суммарно за несколько полетов) и накопленная доза составила 0,14 - 22,7 сГр.

4) Группу онкологических больных до лечения составили 18 пациентов с диагнозом рак предстательной железы, которые были госпитализированы в отделение урологии ФГУ РНЦРР Росмедтехнологий в период с апреля по сентябрь 2007 года. Диагноз был подтвержден морфологически и методом ИФА. У 10 человек размер опухоли был определен как T1N0M0, у 7- T2N0M0.

5) Группу онкологических больных во время лечения составили пациентов. Взятие материала было произведено до начала лечения и спустя 2-5 месяцев после начала лечения (локальная суммарная поглощенная доза на предстательную железу составляла 41-123 Гр).

Выделение лимфоцитов из гепаринизированной венозной крови проводили путем центрифугирования в градиенте плотности фиколлверографин (Histopaque, Sigma) в соответствии с прилагаемой инструкцией.

После выделения лимфоциты отмывали и ресуспензировали в фосфатносолевом буфере (рН 7,4) до конечной концентрации 1-2 x 106 клеток/мл.

Для оценки уровня двунитевых разрывов ДНК и эффективности их репарации в лимфоцитах использовали метод электрофореза единичных клеток (метод ДНК-комет) в нейтральных условиях. Степень поврежденности ДНК, определяемая этим методом, оценивается по увеличению количества мигрировавшей из ядерной области ДНК и расстояния ее миграции после проведения электрофореза ДНК иммобилизованных в агарозу единичных клеток. Сравнительные фотографии ДНК-комет лимфоцитов крови контрольных доноров после облучении в различных дозах представлены на рис. 1.

Рис.1 Сравнительные фотографии ДНК-комет лимфоцитов крови контрольных доноров после облучении в различных дозах.

Краткое описание метода:

20 мкл суспензии лимфоцитов смешивали со 100 мкл 0.5 % раствора легкоплавкой агарозы (тип IV) в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4) при температуре 37С и наносили на предварительно покрытые 1% слоем нормоплавкой агарозы предметные стекла, накрывали покровными стеклами и выдерживали 5 мин при 4С на предварительно охлажденной металлической пластине. После солидификации агарозы удаляли покровные стекла и полученные сайды помещали в охлажденный (4С) фосфатно-солевой буфер.

Облучение проводили на терапевтической установке Алтай (Россия, источник гамма-излучения 60Co) в дозе 1 и 10 Гр при мощности дозы 1,5 Гр/мин.

Через 1-2 мин после окончания облучения слайды переносили в холодный (4C) лизирующий буфер (2.5 M NaCl, 100 мM Na2EDTA, 20 мM Tris-HCl, pH 10.0, 1 % Triton X-100 и 10 % DMSO) в течение 2 ч. После лизиса клеток слайды переносили в холодный (4C) трис-боратный буфер (TBE, рН 8.2, Sigma) и выдерживали 20 мин. Электрофорез проводили в ТBE буфере при напряжении 1.5 В/см при температуре 4С в течение мин. После электрофореза слайды слегка подсушивали и фиксировали в % этаноле в течение 10 мин.

Для исследования эффективности репарации ДНК, агарозные слайды с облученными клетками помещали в среду RPMI-1640, содержащей 20% сыворотки крупного рогатого скота и инкубировали при 37С в течение 60 мин. После чего проводили лизис, электрофорез и фиксацию согласно описанной выше процедуре.

Для окраски ДНК использовали акридиновый оранжевый (Sigma) (2 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере, рН 7.4). Визуализацию ДНК-комет проводили с помощью люминесцентных микроскопов ЛЮМАМ И8 и МИКМЕД-2 вар 11 (ЛОМО, Россия) и видеосистемы на основе цифровой камеры. Фильтр возбуждения ФС1-5 (400-440 нм), запирающий фильтр (515 нм). Использование запирающего фильтра 515 позволяет фиксировать преимущественно зеленую флуоресценцию, характерную для комплексов акридиновый оранжевый - двунитевая ДНК. Для анализа ДНК-комет использовали программу СometScore (TriTek Corp.

Оценивали момент хвоста ДНК-комет равный произведению расстояния от центра ядра до центра плотности хвоста кометы на % ДНК в хвосте.

Дополнительно у отдельных индивидуумов проводили исследования уровня радиационно-индуцированных двунитевых разрывов ДНК, при помощи анализа фосфорилированного гистона H2AX (-H2AX). Фосфорилирование серина 139 гистона H2AX на сайтах повреждений ДНК является наиболее ранним откликом клеток млекопитающих на образование двунитевых разрывов ДНК и свидетельствует о распознавании повреждения ДНК-зависимыми киназами ATM, ATR и DNA-PK (Ismail et al., 2007). Анализ проводится с помощью специфических антител к -H2AX, конъюгированных с флуоресцентными красителями.

Для определения уровня -H2AX использовали набор anti-phosphoHistone H2AX (Millipore Corp.), согласно прилагающемуся протоколу.