На правах рукописи

ТОНЬШИН АНТОН АЛЕКСАНДРОВИЧ ДИНАМИКА И МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА В ТКАНИ МИОКАРДА ПРИ АНОКСИИ 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в НИИ физико-химической биологии им. А.Н.

Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В.

омоносова.

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Ягужинский Лев Сергеевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Звягильская Рената Александровна доктор биологических наук, профессор Зинченко Валерий Петрович

Ведущая организация: Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино

Защита состоится 30 октября 2006 г. в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д. 1, корп. 12, биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук М.В. Медведева 2

Общая характеристика работы

Актуальность работы Для аэробных форм жизни кислород является одним из важнейших метаболитов. С одной стороны, молекулярный кислород - конечный акцептор электронов при дыхании аэробных организмов, с другой стороны, активные формы кислорода (АФК) - это молекулы, играющие огромную роль во внутриклеточной и межклеточной сигнализации. В процессе онтогенеза, а также при некоторых патологиях в тканях могут возникать области с пониженным содержанием кислорода. Падение парциального давления кислорода в тканях индуцирует включение ряда сигнальных систем. В частности, при гипоксии может происходить активация апоптоза или пролиферации. Самым активным потребителем кислорода в организме млекопитающих является ткань миокарда. Снижение уровня кислорода приводит к нарушению ее функции. Реакция тканей сердца на снижение парциального давления кислорода активно изучается во многих лабораториях. Наибольший интерес представляет изучение изменений, происходящих в митохондриях, так как кислород является одним из основных субстратов для этих органелл и снижение его концентрации, с одной стороны, приводит к нарушениям энергетики клетки, а с другой стороны, резко изменяет скорость генерации АФК в дыхательной цепи.

Кроме этого митохондрия контролирует запуск апоптоза, который часто индуцируется в кардиомиоцитах в условиях гипоксии. В большинстве исследуемых моделей изучается быстрая реакция ткани на гипоксию, опосредованная окислительным стрессом, связанным с повышением скорости генерации АФК. В случае полного отсутствия кислорода (аноксии), когда генерация АФК невозможна, изменения в ткани миокарда развиваются более медленно. Изучение механизмов изменений, происходящих в ткани миокарда, при длительном анаэробиозе осложняется тем, что в таких условиях возникает значительное (более 2 единиц) снижение pH, вызванное активацией гликолиза. Сильное снижение pH приводит к некрозу тканей, как в аэробных, так и в анаэробных условиях. До настоящего времени изменения, происходящие в кардиомиоцитах в условиях длительной аноксии при слабом (около 1 единицы) снижении pH, исследовались лишь на моделях переживающих клеточных культур. Подобные исследования на сердечных тканях не проводились. До сих пор остаются неизвестными изменения структуры и функции митохондрий в составе ткани миокарда, происходящие в условиях длительной аноксии, а также механизм клеточной смерти, который развивается в этой ткани при полном отсутствии кислорода и без сильных изменений pH.

Цель работы - изучить изменения системы митохондриальной энергетики в ткани миокарда, происходящие в условиях длительной аноксии при отсутствии значительного снижения pH, и определить особенности механизма клеточной гибели, протекающей в этой ткани при полном отсутствии кислорода.

Задачи исследования:

1. Разработать экспериментальную модель, позволяющую исследовать биохимические изменения, происходящие в ткани миокарда в условиях продолжительной аноксии.

2. Исследовать изменения ультраструктуры и функции митохондрий в составе ткани миокарда, происходящие в условиях длительной аноксии:

а) изучить изменения системы окислительного фосфорилирования, б) изучить изменения проницаемости митохондриальных мембран, в) установить изменения ультраструктуры митохондрий.

3. Изучить особенности механизма клеточной гибели кардиомиоцитов, запускаемой в ткани миокарда в анаэробных условиях.

Научная новизна работы В работе найдены условия, при которых в переживающей в бескислородной среде ткани миокарда сохраняется ультраструктура миофибрилл и дыхательная активность митохондрий в течение 1Ц3 суток. В ткани миокарда впервые зарегистрирована индукция особого типа апоптоза, который характеризуется специфичной межнуклеосомной фрагментацией ДНК и не сопряжен с выходом цитохрома с из межмембранного пространства митохондрий. С помощью ингибиторного анализа доказано, что данный тип апоптоза включает в себя стадию открывания неспецифической поры в митохондриях. Показано, что открывание неспецифической поры является необходимым условием активации эндонуклеаз. Обнаружено, что в составе ткани миокарда митохондрии могут удерживать цитохром с в межмембранном пространстве в условиях открытой поры. Обнаружено, что в условиях аноксии целостность внешней мембраны митохондрий может нарушаться независимо от процесса открывания циклоспорин А чувствительной поры. Однако такое нарушение не приводит к индукции апоптоза. Изучена динамика изменения функции системы окислительного фосфорилирования митохондрий, а также изменения ультраструктуры митохондриальных мембран, происходящие в ткани миокарда во время длительной инкубации в аноксических условиях.

Практическая значимость работы Разработана новая экспериментальная модель для изучения процессов, происходящих в ткани миокарда в условиях длительной аноксии.

Продемонстрирована возможность использования данной модели для поиска и исследования механизмов действия биологически активных веществ, обладающих кардиопротекторными свойствами.

Апробация работы и публикации Результаты диссертации представлены на 8 научных конференциях. По теме диссертации опубликованы 3 статьи.

Структура и объем работы Диссертационная работа изложена на 126 страницах и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы, список цитируемой литературы. В работе содержится 24 рисунка и таблиц.

Материалы и методы исследования Экспериментальная модель Взрослых крыс (150-180 г) декапитировали, ткань желудочков извлекали и быстро измельчали на фрагменты с линейными размерами порядка 1-3 мм в растворе буфера, содержащего 250 мМ сахарозы, 250 мкМ ЭДТА, 10мМ Hepes-Tris, рН 7.4 при 0 C. В опытах, где исследовалось влияние ионной силы на изменения, происходящие в ткани миокарда в условиях аноксии, использовалась среда: 125 мМ сахарозы, 60 мМ KCl, 250 мкМ ЭДТА, 10мМ Hepes-Tris, рН 7.4. Препарат ткани помещали в пластиковые пробирки и доверху заливали тем же буфером, в котором нарезалась ткань, предварительно продутым азотом в течение 30 мин. При продувке удалялось 70Ц90 % кислорода (количество оставшегося кислорода контролировалось с помощью электрода Кларка). Образец быстро герметизировали и инкубировали при 20 оС в течение 24Ц72 часов. При измерении эндогенной скорости дыхания фрагментов ткани в среде предварительно продутой азотом было показано, что время удаления остатков кислорода из среды составляет менее 3-х минут. После окончания инкубации проводилось измерение pH среды с помощью pH электрода.

Выделение и электрофорез ДНК ДНК выделяли по стандартной методике фенольной экстракции. Осаждение ДНК проводили с помощью добавления изопропанола. От РНК избавлялись путем инкубирования смеси нуклеотидов с раствором РНКазы. Электрофорез ДНК проводили в течение 45 минут в 1%-агарозном геле, содержащем бромистый этидий.

Выделение митохондрий и приготовление митопластов Митохондрии для измерения функциональной активности и спектров выделяли с помощью стандартного метода дифференциального центрифурирования. Выделение проводили в среде содержащей 250 мМ сахарозы, 1мМ ЭДТА, 10мМ Hepes-Tris; рН 7.4. Ядерную фракцию осаждали при 750g, митохондрии осаждали при 9000g. Митопласты делали путем помещения митохондрий в среду с резко сниженной тоничностью (1мМ ЭДТА, 10 мМ Hepes-Tris, pH 7.4). Концентрацию белка в митохондриях определяли биуретовым методом.

Исследование функциональной активности митохондрий Исследование функциональной активности митохондрий проводили с помощью одновременной регистрации скорости поглощения кислорода электродом Кларка и мембранного потенциала митохондрий ТPP- селективным электродом. Среда инкубации содержала: 120 мМ KCl, 1мМ ЭДТА, 10мМ Hepes-Tris, 5 мМ глутамат, 5 мМ малат, 0.5 мкМ тетрафенилфосфоний (TPP), рН 7.4.

Определение содержания цитохрома с в суспензиях митохондрий и супернатантах Исследование содержания цитохрома с в митохондриях и супернатантах проводилось путем регистрации дифференциальных оптических спектров поглощения окисленной формы цитохромов против восстановленной.

Концентрация митохондрий в кювете составляла 1 мг белка на 1 мл среды. В суспензию митохондрий в кювете УобразецФ добавляли KCN (0.5 мМ) и несколько кристаллов дитионита; в кювете УсравнениеФ - ротенон (1мкМ) и FCCP (0.5 мкМ). В случае супернатантов в кювету УобразецФ добавляли несколько кристаллов дитионита, в кювету УсравнениеФ добавляли феррицианид (5мМ).

Иммуногистохимия Ткань фиксировали в PBS-буфере, а затем нарезали на 10 мкм срезы на криомикротоме. Далее проводилось иммуноокрашивание первичными моноклональными антителами мыши anti-Cytochrome c (BD Biosciences) и вторичными антителами козы anti-mouse IgG Cy-2 (Jackson) по стандартной методике. Клеточные ядра окрашивали с помощью Hoechst 33342 (Sigma).

Электронная микроскопия Для электронно-микроскопического исследования материал фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида в течение 2 ч при температуре 4, затем дофиксировали 1% раствором четырехокиси осмия в течение 1,5 ч и обезвоживали в серии спиртов с возрастающей концентрацией спирта (70% спирт содержал насыщенный раствор уранил ацетата). Материал заливали в эпоксидную смолу Эпон-812. Срезы делали на ультрамикротоме LKB-III.

Окрашивали срезы свинцом по Рейнольдсу. Полученные препараты просматривали и фотографировали в электронном микроскопе HU-11B (лHitachi, Япония) Результаты и обсуждение 1. Модель срезов ткани миокарда, переживающих в условиях аноксии.

В первом разделе работы были подобраны условия, при которых в ткани миокарда в условиях аноксии не происходит резкого снижения pH при активации гликолиза. Объектом исследования были переживающие срезы ткани миокарда, помещенные в изотонические растворы с относительно высокой концентрацией буфера. В экспериментах было подобрано такое соотношение количества среды инкубации на единицу массы ткани, чтобы, с одной стороны, эндогенная скорость дыхания была достаточной для удаления остатков кислорода из среды за время, не превышающее 3 минуты, а с другой стороны, количества буфера хватало для того, чтобы удерживать скорость снижения pH среды на достаточно низком уровне, не превышающим 0.3-0.4 единицы в сутки. Эксперименты показали, что в этом случае ультраструктура ткани не претерпевает драматических изменений в течение 24 ч инкубации. Основная масса кардиомиоцитов имеет нативную структуру. Признаки некроза мышечной ткани отсутствуют. Видна хорошая сохранность миофибрилл, выражены Z-диски и Н-зоны, митохондрии располагаются рядами вдоль миофибрилл. При увеличении сроков инкубации до 72 ч ультраструктура ткани также не претерпевала драматических изменений. Важно подчеркнуть, что отличительной особенностью представленной модели является использование в качестве объекта исследования небольших фрагментов ткани, что позволяло предотвратить сильное снижение pH равномерно во всем объеме ткани. В Рисунок 1. Ультраструктура срезов ткани миокарда, инкубированных в условиях аноксии 24 ч, при незначительном (0.3-0.4 ед.) снижении pH.

опытах, где соотношение среда/ткань было таким, что количества буфера было не достаточно, и pH среды падал ниже, чем 5.5 единиц, ультраструктура ткани, инкубированной в таких условиях 72 ч, нарушалась.

Наблюдался лизис миофибрилл и разрушение митохондрий (рис. 2). Такая морфология характерна для кардиомиоцитов при некрозе. Следовательно, соотношение количества буфера на единицу массы ткани является ключевым параметром в данной модели. Можно заключить, что некротические изменения ультраструктуры ткани в условиях аноксии предполагают снижение pH среды, а не только снижение концентрации кислорода. В бескислородных условиях при приблизительном постоянстве pH ткань миокарда может сохранять свою ультраструктуру десятки часов.

Разработанная модель была использована для исследования биохимических изменений, происходящих в ткани миокарда в условиях продолжительной аноксии.

2. Ультраструктура и динамика изменений функциональной активности митохондрий ткани миокарда в условиях аноксии Рисунок 2. Ультраструктура срезов ткани миокарда, инкубированной в условиях аноксии 72 ч, при значительном (2 ед.) снижении pH (некроз).

Кислород является одним из основных субстратов системы окислительного фосфорилирования митохондрий. Поэтому длительное отсутствие кислорода, прежде всего, должно вызывать повреждение этой системы. В связи с этим исследование изменений структуры и функции митохондрий, происходящих в ткани миокарда при длительном отсутствии кислорода, явилось одной из основных задач данной работы. В настоящем разделе описаны структурные и функциональные изменения митохондриальных мембран, а также динамика изменений системы окислительного фосфорилирования, происходящих в ткани миокарда в условиях аноксии. Обнаружено, что митохондрии в составе ткани способны удерживать цитохром с в межмембранном пространстве при открытой неспецифической поре.