Книги, научные публикации
Российская Академия медицинских наук Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта М. А. Башмакова, А. М. Савичева Вирусы папилломы человека и их роль в образовании опухолей
Москва Х МЕДИЦИНСКАЯ КНИГА Н. Новгород Х Издательство НГМА 1999 УДК 612.017 М.А. БАШМАКОВА, А.М. САВИЧЕВА. Вирусы папилломы человека и их роль в образовании опухолей. Ч М.: Медицинская книга;
Н. Новгород: Изд-во НГМД, 1999. Ч 16 с.: илл.
Пособие раскрывает роль вирусов папилломы человека в образовании опухолей. Изложены вопросы эпидемиологии, диагностики и лечения папилломавирусной инфекции.
Издание предназначено акушерам-гинекологам, венерологам, инфекционистам, эпидемиологам, а также будет полезно широкому кругу читателей.
ISBN 5 - 86093 - 002 - X ВВЕДЕНИЕ Во всем мире наблюдается рост папилломавирусной инфекции. Это происходит потому, что вирус передается при половом контакте, а в современных условиях имеет место либерализация половых связей, раннее вступление в половую жизнь юношей и девушек, частая смена половых партнеров и большое их количество на протяжении жизни. Но папилломавирусная инфекция имеет особенности, отличающиеся от многих других инфекций, передаваемых половым путем, поскольку папилломавирусы относятся к опухолеродным вирусам, которые способны вызвать доброкачественные, а некоторые их типы и злокачественные опухоли. Поэтому понятен не только биологический и медицинский интерес к папилломавирусам, но также оценка знаний об этой группе вирусов как социально значимых агентов, причастных к смертельным заболеваниям у лиц молодого возраста.
Заражение вирусом происходит при прямом контакте. Попав на кожу или слизистые оболочки, папилломавирус вызывает разрастания клеток эпителия в виде бородавок, иногда обширных образований - кондилом. Разрастания заразны, легко передаются от человека к человеку, обычно не вызывают метастазов, т.е. переноса в отдаленные органы и ткани, часто они самопроизвольно исчезают, как это наблюдается при юношеских бородавках.
Вирус заражает самый нижний глубокий слой кожи или слизистой оболочки, происходит усиленное размножение клеток этого слоя, что и приводит к образованию разрастании. Сам вирус в глубоких слоях не размножается, его интенсивное размножение происходит в поверхностных слоях Ч в чешуйчатых клетках, которые по мере оттеснения к по верхности перестают делиться и становятся более пригодными для размножения вируса.
Вирус папилломы человека, в отличие от многих других вирусов, не размножается в культуре клеток и не может быть получен в виде массы вирусных частиц Ч вирионов. Однако с помощью электронного микроскопа вирионы этого вируса обнаружены в пора женных тканях. На рис. 1 представлены вирионы папилломавируса в ткани опухоли.
Рис.1. Вирионы папилломавируса Вирус может быть найден также с помощью современных молекулярно-биологических методов, которые основаны на обнаружении дезоксирибонуклеиновой кислоты, являющейся геномом вируса. Нуклеиновые кислоты ДНК и РНК обладают способностью к гибридизации. С помощью нагревания или действия химических веществ ДНК из двухнитевой спирали переходит в однонитевую, но сохраняет способность достраивать вторую нить, комплементарную к существующей при наличии в реагирующей среде затравок (праймеров), которые определяют направление достройки второй нити, и химических веществ для построения ДНК. Процесс воссоздания второй нити по образцу одиночной нити и/или ее части называют молекулярной гибридизацией, а участок который используют в гибридизации (участок ДНК или РНК), называют зондом. На рис. 2 схематически представлена двойная спираль ДНК и соединение составляющих ее нуклеотидов.
Рис. 2. Гибридизация ДНК (схема) Благодаря молекулярно-гибридизационным методам стало известно, что существует много типов папилломавирусов, 30 из них инфицируют половые органы и область заднего прохода. У женщин инфицируется и покрывается генитальными бородавками область преддверия влагалища, стенки влагалища, шейка матки, наружное отверстие уретры. У мужчин поражается головка полового члена, крайняя плоть, мошонка, анальная область. В родах папилломавирус передается новорожденному ребенку, вызывая у него папилломатоз гортани.
Разные типы вируса папилломы человека (ВПЧ) вызывают отличающиеся друг от друга заболевания. На рис. 3 даны возможные виды экзофитных и эндофитных разрастании, вызванных папилломавирусами.
В табл. 1 даны заболевания у людей, обусловленные папилломавирусами.
Таблица Папилломавирусы человека (по Грин М., 1985) Тип вируса Заболевания HPV-1 Подошвенные бородавки HPV-2 Обычные бородавки на руках HPV-3 Плоские бородавки;
бородавчатая эпидермодисплазия HPV-4 Подошвенные бородавки HPV-5 Плоские бородавки;
бородавчатая эпидермодисплазия (перерождающаяся в злокачественную) HPV-6 Генитальные бородавки;
рак шейки матки HPV-7 Папилломы мясников HPV-8 Бородавчатая эпидермодисплазия (перерождающаяся в злокачественную) HPV-9 Плоские бородавки;
бородавчатая эпидермодисплазия (перерождающаяся в злокачественную) HPV-10 Плоские бородавки;
бородавчатая эпидермодисплазия (перерождающаяся в злокачественную);
рак шейки матки;
рак наружных женских половых органов HPV-11 Папилломы гортани и кондиломы;
рак шейки матки HPV-12 Бородавчатая эпидермодисплазия (перерождающаяся в злокачественную) HPV-13 Очаговая гиперплазия полости рта HPV-14 Бородавчатая эпидермодисплазия HPV-15 То же HPV-16 Рак шейки матки;
папулозность типа болезни Боуэна По мере изучения гибридизационными методами ВПЧ выяснилось, что риск злокачественного перерождения связан с несколькими типами ВПЧ. Они были обозначены как вирусы высокого риска онкогенного заболевания. Это типы ВПЧ 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59 и 68. Перечень типов ВПЧ высокого онкогенного риска расширяется за счет уточнения строения ДНК и появления новых типов промежуточного риска. Вирусами низкого риска остаются 5 типов ВПЧ Ч 6,11,42,43,44.
Отмечено, что 16 тип наиболее часто встречается в ткани плоскоклеточного рака шейки матки, а 18 тип Ч в ткани железистого рака-аденокарциномы. Установлено, что существуют дозависимые отношения, т.е. при высоком содержании ДНК ВПЧ в материале, взятом из шеечного канала матки, риск опухоли или неоплазии более высок и наоборот. В табл. сведены признаки, связанные с ВПЧ инфекцией, обусловленной онкогенными и неонкогенными типами ВПЧ.
Таблица Различия ВПЧ инфекции в зависимости от генотипа вируса Признак Типы вируса Онкогенные Неонкогенные (6, (16,18 и др.) 11и др.) Персистирующее течение Всегда Редко Количество вируса (число 111,5 3, копий на клетку) Максимальная заболеваемость, обусловленная ВПЧ, наблюдается в возрасте от 18 до 28 лет. Однако и в старших группах в силу возрастных изменений иммунитета и гормональной функции, которые благоприятствуют многим факторам канцерогенеза, возможны проявления папилломавирусной инфекции и клеточная трансформация ракового характера.
ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Обширные эпидемиологические исследования о папилломавирусной инфекции были проведены в 1991 - 1997 гг. Было установлено, что большинство, если не все случаи рака шейки матки, связаны с папилломавирусной инфекцией, что имеет значение тип ВПЧ, продолжительность инфекционного процесса, поскольку заражение происходит в юношеском возрасте.
Характер половых связей как женщин, так и мужчин является главным фактором риска инфицирования, наибольший фактор риска - большое количество половых партнеров и у женщин, и у мужчин.
При массовых исследованиях ВПЧ обнаружен у 40 - 50% молодых женщин, но в большинстве случаев вирус спонтанно исчезает, лишь у 5 - 15% ВПЧ вызывает хроническую инфекцию шейки матки, реже - вульвы и влагалища. Те женщины, у которых длительно персистирует ВПЧ в шейке матки, по сравнению с теми, у которых нет этого вируса, находятся под высоким риском (примерно 65-кратным) развития рака шейки матки. Риск еще выше (130-кратный) у женщин старше лет, если они инфицированы типами ВПЧ высокого онкогенного риска, включая в первую очередь типы 16 и 18. При клинически установленном раке шейки матки ВПЧ современными методами исследования обнаруживается во всех случаях.
Рак шейки матки и предшествующие ему состояния до недавнего времени определяли преимущественно цитологическими методами. Здесь уместно отметить, что цитологическая диагностика в большой степени связана с опытом работы врача Ч микроскописта и, разумеется, с тем как взят материал из эндоцервикса для цитологического исследования.
Различия в оценке одного и того же клеточного препарата разными исследователями достигают 20%. Подтверждением неопределенного результата цитологического исследования служит кольпоскопическое исследование с обработкой пораженных участков слизистой раствором Люголя. При такой обработке участки плоского эпителия, пораженные ВПЧ, выглядят побелевшими и приподнятыми над окружающей тканью, дают картину мозаики, лейкоплакии. Имеют значение четкость границ йод-негативного эпителия.
Применение методов определения ДНК ВПЧ повышает эффективность выявления предраковых состояний, во-первых потому, что чувствительность метода исключительно велика, его предсказательный уровень неизмеримо выше, чем цитологического, во-вторых, совпадение данных цитологического исследования и ВПЧ-диагностики позволяет избежать кольпоскопического исследования.
На рис. 4 приводим последовательность обследования больных при обнаружении атипичных клеток в мазках из шейки матки. Предлагается также использовать одновременное исследование материала взятого из шейки матки как цитологическими методами, так и применением ДНК-диагностики. Многочисленными работами установлено, что в 99% случаев наличие ДНК ВПЧ сопровождается наличием в шейке матки клеточных дисплазий разной степени выраженности.
Комбинированный метод обследования больных, как показал опыт его применения, помогает в 100% случаев выявить цервикальную интраэпителиальную неоплазию (ЦИН) высокой степени выраженности - 2 и 3 ее степени, а тестирование ВПЧ в комбинированном методе служит квалифицированным индикатором присутствия ВПЧ с разграничением типов высокого, среднего и низкого онкогенного риска.
Рис. 4. Порядок обследования при обнаружении атипичных клеток КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ДНК-ДИАГНОСТИКИ ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ Если в материале, взятом из эндоцервикса, обнаруживается присутствие ВПЧ, это служит довольно строгим предсказательным признаком клеточной дисплазии и возможности опухолевой трансформации клеток.
Х Обобщенные данные показывают, что наибольшее количество цервикальных интраэпителиальных неоплазий возникает у женщин, инфицированных вирусами папилломы человека.
Х Прогрессирование клеточного перерождения в большой степени связано с типом ВПЧ;
находки ДНК ВПЧ типов высокого онкогенного риска - 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56 и 58 дают основание предполагать, что клетки эпителия могут скорее всего подвергнуться злокачественному перерождению.
Напротив, нахождение только типов низкого онкогенного риска - 6,11,42,43 и 44 - очень редко при раке шейки матки.
Х Высокий уровень содержания ВПЧ связан с тяжестью заболевания.
Х Повторные определения ДНК ВПЧ в комбинации с цитологией мазка из шейки матки могут служить альтернативой кольпоскопии. Они могут представить возможность увеличения интервалов между обследованиями у женщин с отрицательными данными цитологического исследования. Принимая во внимание психологические аспекты, важно избежать частых повторных осмотров пациенток, а взятие единственной пробы для цитологического определения клеточных изменений и определения ДНК ВПЧ делает обследование женщин более экономичным, более объективным и более квалифицированным.
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ В лабораторной диагностике практически применяют исключительно ДНК-методы. Существуют три основных категории лабораторных методов определения ДНК ВПЧ: неамплификационные, амплификационные и сигнальные амплификационные (табл.3).
Таблица Методы обнаружения ДНК вирусов папилломы человека Категории методов Названия методов Неамплификационные Дот-блот, саузерн-блот гибридизация, гибридизация in situ на фильтре и в ткани Амплификационные Полимеразная цепная реакция - ПЦР, лигазная цепная реакция - ЛЦР Сигнальные амплификационные Система гибридной ловушки Ч Digene Hybrid Capture System II Неамплификационные методы определения ДНК ВПЧ в настоящее время с диагностической целью не используются.
Они в ходу в научно-исследовательских лабораториях.
Среди амплификационных методов наибольшее распространение получила ПЦР, благодаря которой были получены ценные сведения о типах ДНК. Однако постановка ПЦР имеет большое количество ограничений, чтобы не получить ложноположительных результатов. Ограничения в первую очередь касаются строгого разграничения и разобщения по отдельным помещениям разных этапов работы, строгого соблюдения правил пользования перчатками, халатами, лабораторным оборудованием в пределах помещения, предназначенного для определенного этапа исследования, иначе может случиться перенос какого-либо количества ДНК с последующим его намножением в ПЦР. Кроме того, в мире еще нет стандартных реактивов для всех типов ВПЧ, практически используются праймеры и другие реактивы собственного лабораторного изготовления.
Не останавливаясь подробно на мишень-амплификационных методах, обратимся к сигнальным амплификационным методам, которые не требуют тех ограничений в деятельности, которые характерны для ПЦР-лабораторий. Среди них привлекает внимание система двойной генной ловушки - Digene Hybrid Capture System II фирмы Abbott, которая обеспечивает:
- количественный анализ;
- компьютерную интерпретацию результатов, что исключает субъективизм в оценке;
- воспроизводимость и достоверность результатов;
- полный цикл исследования в течение одного рабочего дня;
- абсолютную специфичность.
Система двойной генной ловушки - Digene Hybrid Capture System II использует РНК-ДНК гибридизацию в растворе с последующей "хвостовой" иммунологической реакцией между гибридом РНК пробы - ДНК мишени и специфическими антителами к этому гибриду. Тест обязан своей высокой специфичностью нескольким независимым источникам.
Во-первых, весь геном вируса является мишенью. Длинная одноцепочечная РНК эффективно гибридизуется со всеми 8000 нуклеотидов ДНК ВПЧ. Гибрид ДНК-РНК более стабилен, что позволяет избежать нежелательных побочных реакций.
Во-вторых, источником дополнительной чувствительности в реакции является использование антител к гибриду РНК ДНК, конъюгированных с множеством молекул щелочной фосфатазы. Эти меченные антитела распознают короткие цепочки РНК-ДНК гибрида способом, который не имеет отношения к последовательностям нуклеотидов ДНК и РНК.
Тысячи молекул антител могут покрыть единичный геномный гибрид ДНК ВПЧ.
В-третьих, каждый иммобилизированный энзим щелочной фосфатазы реагирует с множеством молекул хемилюминесцента диоксетана за 1 минуту и вызывает постоянный поток фотонов, которые подсчитываются фотомультиплейерной трубкой люминометра.
В-четвертых, система генной ловушки имеет преимущества перед естественной амплификацией, т.к. вовлекает большой объем (10-20%) клинического материала в реакцию. Интенсивность испускаемого света пропорциональна количеству ДНК мишени и выражается как отношение сигнала к положительному контролю. На рис. 5 приводим схему опыта по выявлению ДНК ВПЧ по Lorincz А. и Davies P.
Рис. 5. Детекция ВПЧ с помощью HCS II (по Lorincz А. и Davies P.О) В "гибридной системе ловушки" Ч HCS II используются РНК-пробы, комплементарные к полной геномной последовательности 13 канцерогенных типов ВПЧ и 5 типов ВПЧ низкого риска. Составляются смеси - "коктейли" высокого и низкого риска соответственно. Каждый "коктейль" раздельно инкубируется с денатурированной (одноцепочечной) ДНК из клинического образца. Образующийся РНК-ДНК гибрид переносится в лунки микропанели, на которых иммобилизованы моноклональные антитела к РНК-ДНК гибри ду. Антитела специфически распознают гибрид, который прикрепляется к лунке панели. Уловленные таким образом РНК-ДНК гибриды затем вступают в реакцию с моноклональными антителами к гибриду, меченными щелочной фосфатазой. Избыток антител и негибридизированных молекул удаляют промыванием. В лунки добавляют люминесцирующий субстрат диоксетан. Если субстрат присоединяется к меченному щелочной фосфатазой конъюгату, то происходит испускание света. Эмиссию света можно измерить с помощью люминометра. Количество света генерируется в пропорции к числу мишеней ДНК в образце. HCS II может определить и различить канцерогенные типы ВПЧ (16,18,31,33,39,45,51,52,56,58,59 и 68) и типы низкого риска (6,11,42,43 и 44). Аналитическая чувствительность системы - 0,2 пикаграмма/мл (1000 копий генома ВПЧ). Учитывая клиническую необходимость обследования женщин с низкой степенью клеточной атипии, прибор установлен на определение 5000 копий ДНК/мл, т.е. на определение 1.0 пикаграмма/мл.
В комплексе с цитологическим исследованием, определение ВПЧ с использованием HCS II достигает 95% обнаружения ЦИН-1 и ЦИН-2, т.е. может служить эффективным дополнением к цервикальной цитологии и может помочь снизить заболеваемость и смертность от цервикального рака.
ЛЕЧЕНИЕ Поскольку полного излечения от ВПЧ-инфекции в настоящее время достичь невозможно, целью терапии является удаление экзофитных кондилом, а не элиминация возбудителя. Эффективность лечения экзофитных кондилом составляет 50-94%, уровень рецидивирования исчисляется 25% в течение трех месяцев после лечения. Рецидивы по большей части связаны с реактивацией, а не реинфекцией.
При отсутствии лечения генитальные кондиломы могут разрушаться сами собой, оставаться без изменения или прогрессировать. Возможно персистирование инфекции без каких-либо клинических проявлений При выборе терапии следует избегать дорогих, токсичных схем лечения.
Основные методы лечения 1. Применение цитотоксических препаратов Ч подофиллина, подофилотоксина, 5-фторурацила.
2. Деструктивные методы Ч физические (криодеструкция, лазеротерапия, диатермокоагуляция, электрохирургическое иссечение), химические (трихлоруксусная кислота, ферезол, солкодерм).
3. Иммунологические методы:
-, - и - интерфероны.
4. Комбинированные методы - сочетание различных методов лечения (криотерапия, лазерное иссечение, электрокоагуляция, диатермокоагуляция, озонотерапия).
Если кондиломы реагируют на лечение, в последующем наблюдении нет необходимости. Для женщин с генитальными кондиломами рекомендуется ежегодный гистологический скрининг.
Лечение половых партнеров При лечении генитальных кондилом рекомендуется осмотр половых партнеров. Партнеров с экзофитными аногенитальными кондиломами следует предупредить, что они являются контагиозными по отношению к неинфицированным партнерам. Однако подавляющее большинство партнеров уже инфицировано вирусом в субклинической форме, даже если у них нет видимых кондилом.
Лечение беременных и детей Во время беременности видимые кондиломы часто рецидивируют, имеют тенденцию к разрастанию и становятся рыхлыми.
Лечение беременных желательно проводить на ранних сроках беременности, соблюдая особую осторожность.
Рекомендуется применять только физические деструктивные методы (криотерапию, СО2-лазер). Цитологические препараты Ч подофиллин, подофиллотоксин и 5-фторурацил противопоказаны для лечения беременных.
Аналогичные подходы должны соблюдаться и при выборе метода лечения детей.
ВПЧ 6 и 11 могут вызывать ларингеальный папилломатоз у детей. Путь передачи инфекции (трансплацентарный, при прохождении плода по родовому каналу или постнатальный) в каждом конкретном случае трудно или невозможно установить. Описаны случаи ларингеального папилломатоза у детей, рожденных с помощью кесарева сечения, поэтому кесарево сечение не должно выполняться с единственной целью - предупредить заражение ВПЧ новорожденного.
Сопутствующие состояния и их лечение У больных с папилломавирусной инфекцией часто наблюдается нарушение микробиоценоза влагалища - резкий дефицит лактобацилл, избыток условно патогенной микрофлоры. Отмечается значительная обсемененность дрожжеподобными грибами. В большом проценте случаев имеет место инфицированность микроорганизмами, передающимися половым путем Ч хламидиями, генитальными микоплазмами, вирусом простого герпеса 2-го типа.
Необходимо назначение этиотропной терапии, а также коррекция микробиоценоза влагалища назначением биопрепаратов Ч эубиотиков Ч лактобактерина и бифидобактерина.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Сейчас фактически установлено, что папилломавирусная инфекция является главной причиной цервикальной интраэпителиальной неоплазии и рака шейки матки. Вдумчивое обследование женщин на ВПЧ предотвращает лечение легких и пограничных поражений путем выяснения, какие именно следует считать действительно предраковыми.
Цервикальная интраэпителиальная неоплазия представляет собой обычную и раннюю манифестацию цервикальной инфекции, вызванной ВПЧ, наиболее часто типами 16 и 18 ВПЧ. Помимо ВПЧ в патогенезе плоскоклеточного рака и аденокарциномы имеют значение и другие факторы риска, в частности стероидные половые гормоны. Поэтому к факторам риска относят число родов более 3, длительное применение оральных контрацептивов (более 10 лет), а также курение, хотя механизм действия курения остается неясным.
Необходимо сказать, что аденокарцинома in situ кольпоскопически не выявляется, между тем она предшествует инвазивной аденокарциноме. Доминирующим типов ВПЧ при этой патологии является 18 тип. При отсутствии клинической симптоматики определение ВПЧ, в особенности 18 типа, весьма полезно для диагностики аденокарциномы in situ и инвазивной аденокарциномы.
Разработанные современные методы определения ДНК папилломавирусов с разграничением типов высокого и низкого онкогенного риска могут использоваться в любой клинической лаборатории, т.к. вся аппаратура Digene Hybrid Capture System II умещается на одном столе, а сам опыт не требует тех предосторожностей, которые необходимы при использовании ПЦР-диагностики, тем более, что для ПЦР-диагностики ВПЧ во всем мире нет стандартных реактивов.
СОДЕРЖАНИЕ Введение Эпидемиологические исследования Клиническое применение ДНК-диагностики папилломавирусной инфекции Лабораторная диагностика папилломавирусной инфекции Лечение
Книги, научные публикации