На правах рукописи

Солодовникова Ирина Михайловна Морфофункциональные характеристики митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда при инкубации в условиях гипоксии.

специальность 03.00.25-03 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007 1

Работа выполнена в отделе биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского, МГУ им. М.В.Ломоносова.

Научные руководители доктор биологических наук, Бакеева Л.Е.

доктор биологических наук, профессор, Ягужинский Л.С.

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор, Капелько В.И, рук. лаб.

экспериментальной патологии сердца, Инст. эксп. кардиол., Рос. кардиол. науч.произв.компл., Фед. агентство Росмедтехнологий доктор биологических наук, профессор, Мошков Д.А, зав. лаб. ультраструктуры нейрона, Инст. теор. и эксп. биофиз. РАН.

Ведущая организация: Институт морфологии человека, г.Москва.

Защита состоится У_18_Ф _декабря_2007 г. в _15:30_ часов на заседании Диссертационного Совета _ _._. при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские Горы, д.1, корп.12, Биологический факультет МГУ, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Автореферат разослан У14Ф ноября 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Е.Н.Калистратова Кандидат биологических наук 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вопросы взаимосвязи структуры и функции митохондрий постоянно находятся в центре внимания широкого круга исследователей. В последние годы произошли и происходят революционные события в митохондриологии. В традиционные представления о роли митохондрий в клетке внесены существенные коррективы. Ещё сравнительно недавно наши представления о митохондриях сводились только как к энергетическим станциям клетки, где роль митохондрий в развитии патологии ограничивалась нарушением энергообеспечения, и исключительно с этих позиций рассматривались все ультраструктурные преобразования митохондрий, в то время как многие ультраструктурные состояния митохондрий невозможно объяснить в свете таких представлений. В настоящее время основным компонентом в развитии многих патологий считается окислительный стресс. Термин локислительный стресс не имеет на сегодня чёткого определения, он используется для широкого круга разнообразных взаимосвязанных явлений, включающих как повышенную внутриклеточную генерацию активных форм кислорода (АФК), так и окислительное повреждение клетки. Как известно, ткань миокарда является одним из активных потребителей кислорода. Снижение уровня кислорода - гипоксия вызывает значительные нарушения структуры и функции миокарда. Наиболее чувствительными к гипоксии структурами клетки являются митохондрии, поэтому большой интерес представляет изучение состояния митохондрий в этих условиях.

Кислород является одним из основных субстратов для этих органелл и снижение его концентрации приводит не только к нарушению энергетики клетки, но и резко изменяет скорость генерации АФК митохондриями. Не смотря на огромное количество работ и неослабевающий интерес, на протяжении всего времени изучения ультраструктуры митохондрий, к состоянию этих органелл в условиях гипоксии, нехватка фактических данных пока ещё не позволяет составить полное представление о действии гипоксии на состояние митохондрий и прежде всего в ткани миокарда, где повреждающее действие гипоксии имеет место при многих патологиях миокарда.

Цель работы состояла в изучении морфофункциональных характеристик митохондрий кардиомиоцитов при длительном действии гипоксии. Был применен специальный экспериментальный подход: исследование проводили на кусочках изолированного миокарда, инкубированных при 200С в условиях длительной гипоксии начиная с 6 ч и далее через каждые 12 ч, в течение 3-х суток. Были поставлены следующие задачи исследования:

1. Исследовать особенности ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда после 72 ч инкубации в условиях гипоксии;

2. Исследовать динамику изменений ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда в течение 72 ч инкубации ткани в условиях гипоксии, начиная с 6 часов и далее через каждые 12 часов;

3. Изучить функциональные особенности митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда после 72 ч гипоксии на изолированных митохондриях, а так же непосредственно in situ методом электронномикроскопической гистохимии на выявление функциональной активности цитохром с-оксидазы.

Научная новизна. Определены основные ультраструктурные признаки ткани миокарда на модели изолированных кусочков ткани миокарда в условиях безкислородной среды, при которых сохраняется нативность ультраструктуры кардиомиоцитов и дыхательная активность митохондрий в течение 3-х суток.

Впервые описана динамика возникновения популяции мелких электронно-плотных митохондрий, располагающихся внутри митохондрий основной популяции - митохондрий внутри митохондрий. Впервые исследованы особенности специфических для условий гипоксии перестроек внутренней мембраны митохондрий кардиомиоцитов: геометрически упорядоченных ячеистых структур.

Показано, что эти структурные перестройки внутренней митохондриальной мембраны изменяют свою морфологию при добавлении в среду инкубации АДФ, а также полностью исчезают при выделении митохондрий по общепринятой методике в 0,25 М сахарозе. Изучены функциональные изменения системы окислительного фосфорилирования митохондрий во времени при глубокой длительной гипоксии кардиомиоцитов. Впервые удалось получить кластеры митохондрий, объединенные межмитохондриальными контактами во фракциях.

Показана функциональная активность цитохром с-оксидазы в мелких, электронноплотных митохондриях при полном или частичном отсутствии таковой в митохондриях основной популяции. Впервые обнаружена поразительная стабильность и получена функциональная характеристика межмитохондриальных контактов при гистохимическом исследовании экспериментальной ткани на цитохром с - оксидазную активность.

Практическая ценность работы. Предложенная в настоящей работе экспериментальная система исследования действия гипоксии может использоваться для изучения механизмов нарушения тканей сердца при тяжёлых поражениях миокарда. Установленные в работе закономерности изменений структуры митохондриального аппарата кардиомицитов также могут быть использованы при изучении и интерпретации ультраструктуры митохондрий при действии гипоксии в различных исследованиях клеток и тканей. Полученные данные углубляют фундаментальные знания о действии гипоксии на ультраструктуру митохондриального аппарата.

Апробация работы. Материалы работы были представлены: на II Всероссийской конференции Клинические и патогенетические проблемы нарушений клеточной энергетики (митохондриальная патология), (Москва, 2002), Международной конференции УМитохондрии в патологииФ (Пущино, 2003), 1-й Съезд Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003), FEBS Congress (Варшава,2004), III Съезде биофизиков России (Воронеж 2004), Международной конференции УМитохондрии в патологииФ (Пущино, 2005), XXI Российской th конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2006), 14 European Bioenergetics Conference EBEC, Moscow State University (Moscow, 2006), International Small-Angle Scattering Workshop is devoted to Yu. M. Ostanevich, (Dubna,2006), Первой Всероссийской школе-семинаре (Современные достижения бионаноскопии) физ-фак МГУ (Москва, 2007), Sixth National Conference on Application of X-ray, Synchrotron Radiation, Neutrons and Electrons for Material Characterization, (Москва, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: УВведениеФ, УОбзор литературыФ, УМатериалы и методы исследованияФ, УРезультатыФ, УОбсуждение результатовФ, УВыводыФ, УСписок литературыФ. Работа изложена на 103 страницах, включает 47 рисунков, список литературы содержит 220 ссылок.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Животные. В исследовании по действию гипоксии на кардиомиоциты миокарда были использованы взрослые беспородные крысы массой 150-180 г.

Экспериментальная модель. Крыс (150-180 г) декапитировали, ткань желудочков извлекали, измельчали на фрагменты 2 мм в растворе буфера: 250 мМ сахарозы, 250 мкМ ЭДТА, 10мМ Tris, рН 7.4 при 4C. Препарат ткани помещали в пластиковые пробирки и заливали тем же буфером, предварительно продутым азотом в течение 30 мин, в котором нарезалась ткань. Образец быстро герметизировали и инкубировали при 20 оС начиная с 6 часов и до 72 часов.

Выделение фракций митохондрий. Митохондрии для измерения функциональной активности выделяли с помощью стандартного метода дифференциального центрифурирования в среде выделения: 250 мМ сахароза, 250 мкМ ЭДТА, 10мМ Tris, рН 7.4, предварительно охлажденной до температуры 0оС. Фракции осаждали:

ядерную при 300g, тяжелую -1700g, среднюю -10000g и лёгкую Ц17000g.

Исследование функциональной активности митохондрий. Исследование проводили с помощью одновременной регистрации скорости поглощения кислорода электродом Кларка и мембранного потенциала митохондрий ТPP - селективным электродом (НИКО, Россия). Среда инкубации содержала: 120 мМ KCl, 1мМ ЭДТА, 10мМ Tris, 5 мМ глутамат, 5 мМ малат, 0.5 мкМ тетрафенилфосфоний (TPP), рН 7.4.

Для электронно-микроскопического исследования была использована общепринятая классическая методика.

Определение активности цитохром c - оксидазы в митохондриях нативной и экспериментальной ткани сердца проводили по методике, описанной Селигманом с соавт. (Seligman et al., 1968). Ткань миокарда фиксировали 3%-ным раствором глутарового альдегида в PBS-буфере (0,15 NaCl/ 27 mM KCl/ 12 mM NaH2PO4, рН 7,2) в течение 10 минут при 4; затем ткань инкубировали в растворе:

5 mg 3, 3'- диаминобензидина тетрагидрохлорида / 9 ml 0,05 M фосфатного буфера, рН 7,4/ 1 ml каталазы (20g/ml)/ 10 mg цитохрома с/ 750 mg сахарозы в течение часов при 37С. Ткань отмывали в PBS-буфере 1 час, дофиксировали 1%-ным раствором четырехокиси осмия в буфере 1,5 ч и далее обрабатывали по стандартной методике для электронно-микроскопического исследования.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Ультраструктура кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда, инкубированных 72 часа в условиях гипоксии.

Проведённое электронно-микроскопическое исследование состояния ткани кусочков изолированного миокарда, инкубированных 72 часа в гипоксии при 20С показало, что в этих экспериментальных условиях в кардиомиоцитах изолированной ткани миокарда выраженных деструктивных процессов не происходит. На препаратах исследуемой ткани можно видеть расположенные рядами вдоль миофибрилл цепочки нативных по своей ультраструктуре митохондрий, объединённых межмитохондриальными контактами. Наличие межмитохондриальных контактов показывает, что выбранные нами экспериментальные условия позволяют сохранить в исследуемой ткани объединённую митохондриальную систему - характерную ультраструктурную особенность нативной ткани миокарда.

Однако обращает на себя внимание выраженная ультраструктурная гетерогенность популяции митохондрий: основную популяцию составляют электронно-светлые митохондрии с обводненным, просветленным матриксом, контрастными, хорошо выраженными мембранами, в тоже время в ткани можно видеть и митохондрии иной ультраструктуры: мелкие электронно-плотные органеллы с электронно-плотным матриксом, выраженным обводнённым межмембранным пространством. Электронно-плотные митохондрии значительно варьируют по размерам от чрезвычайно мелких, имеющих 2-3 кристы, до сопоставимых по размеру с основной массой митохондрий. Электронноплотные митохондрии могут располагаться непосредственно среди миофибрилл, а так же в межмембранном пространстве более крупных электронно-светлых митохондрий, как правило, на периферии органеллы (фот. 1). Эта удивительная морфологическая особенность является характерным ультраструктурным признаком исследуемой ткани.

В наших экспериментальных условиях мы также обнаружили изменения ультраструктуры митохондрий, хорошо известные в литературе для условий гипоксии.

Это прежде всего большое количество септированных митохондрий, а также образование включений во внутрикристном пространстве, которые имеют вид электронно-плотного материала. Наряду с этими изменениями морфологии митохондрий мы обнаружили в нашей экспериментальной ткани неизвестные ранее перестройки внутренней организации митохондрий. Так в отдельных митохондриях можно видеть участки повышенной электронной плотности, которые можно Фот.1. Последовательные срезы митохондрии изолированной ткани миокарда после 72 ч инкубации в условиях гипоксии. В межмембранном пространстве расположена мелкая, электронно-плотная митохондрия.

принять за мелкую, электронно-плотную митохондрию.

Анализ этих структур при большом увеличении показывает, что это участки повышенной электронной плотности, в которых происходит образование внутренней митохондриальной мембраной упорядоченФот. 2 а, б. Локальная перестройка внутренней митохондриальной ных струкмембраны с образованием упорядоченной структуры: а-обзорная тур в резульфотография, б-при большем увеличении.

тате перехода ламеллярной упаковки мембран соседних крист в трубчатую. На фот. 2 а, б видно, что внутренняя мембрана митохондрии образует электронно-плотную ячеистую структуру. Расположение ячеек упорядочено, хорошо различимы как бы узлы, в результате чего на поперечном сечении они имеют гексагональные очертания. Структура этих образований напоминает кристаллическую решетку.

Различим плавный переход внутренней митохондриальной мембраны в эту структуру, поэтому данное образование не является изолированной самостоятельной структурой. Образования такого типа внутри митохондрий до настоящего времени в литературе не установлены. При изменении условий инкубации, добавлением в среду инкубации 0,1мМ АДФ, эти структурные образования резко меняют свою морфологию (фот. 3 а, б). На поперечном сечении это скопление треугольных структур, а при наклонном - это треугольные призмы, расположенные на одинаковом расстоянии и параллельно друг другу (3, а). На продольном сечении - это параллельно расположенные тяжи крист (фот. 3, б).