На правах рукописи

Ситдикова Лейсан Радисовна ИДЕНТИФИКАЦИЯ И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОВ МОБИЛИЗАЦИИ ПЛАЗМИДЫ pAH 36-4CPA 03.00.03. - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа 2006

Работа выполнена в Институте биологии Уфимского научного центра Российской академии наук.

Научный консультант: кандидат биологических наук, доцент Маркушева Татьяна Вячеславовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Чемерис Алексей Викторович кандидат биологических наук Плотникова Елена Генриховна

Ведущая организация: Башкирский государственный университет

Защита диссертации состоится л 27 декабря 2006 г. в часов на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.133.01. при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, проспект Октября, 71.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН.

Автореферат разослан л 25 ноября 2006 г.

Ученый секретарь Регионального диссертационного совета, к.б.н. Бикбулатова С.М.

2 Актуальность проблемы. В настоящее время проблема идентификации и исследования молекулярно-генетических особенностей строения экстрахромосомных элементов прокариот привлекает значительное внимание.

В рамках решения этой проблемы проводится анализ разнообразия и распространения плазмид в природе, определяются особенности их взаимоотношений с клетками-хозяев, выявляются эволюционные связи и происхождение, а также изучаются механизмы горизонтального переноса генетической информации. Понимание последних напрямую связано с оценкой риска распространения в современном мире генетически модифицированных организмов (ГМО).

Согласно способности к трансферу плазмиды классифицируются на коньюгативные (самотрансмиссибельные) и мобилизируемые (трансмиссибельные в присутствии дополнительных коньюгационных факторов). Конъюгативные плазмиды обладают детерминантами функций, требующихся для реализации механизмов передачи плазмид от клетки к клетке.

Мобилизируемые плазмиды имеют небольшие размеры, они обычно несут область мобилизации (mob), кодирующую специфические компоненты белков мобилизации и область начала переноса (oriT) (Pansegrau W., Lanka E., 1996;

Zechner E. L., et al., 2000). Отмечено, что плазмиды, способные к мобилизации, могут переносить генетическую информацию не только среди грамположительных и грамотрицательных бактерий, но также в клетки растений и эукариот (дрожжей) (Kado C.I., 1994; Bravo-Angel A. M., et al., 1999).

Как оказалось, именно мобилизируемые плазмиды имеют огромное значение в процессах поддержания и распространения экофизиологических признаков, в частности, деградации ксенобиотиков и устойчивости к химическим факторам среды, включая антибиотики.

Вместе с тем следует отметить, что анализ разнородности и разнообразия мобилизируемых плазмид проведен в меньшей степени, чем это сделано для коньюгативных плазмид. Поэтому исследования особенностей строения мобилизируемых плазмид становятся особенно важными (Francia, M.V., and Clewell, D.B., 2002). Изучение последовательностей нуклеотидов мобилизируемых плазмид позволяет раскрыть механизмы трансфера и установить филогенетические отношения среди членов различных таксонов.

Привлечение ресурсов современных баз данных для изучения структурных особенностей генов мобилизации позволяет предложить их классификацию в семействах и подсемействах, а описание генетической организации каждого семейства, их характерных черт и отношений среди кодируемых ими белков определяет подход к характеристике глобального генного пула мобилизируемых плазмид.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась идентификация и характеристика генов системы мобилизации плазмиды pAH 36-4CPA штамма Citrobacter hydrophyla IBRB-36 4CPA.

Задачи исследования:

1. провести рестрикционный анализ плазмиды pAH 36-4CPA штамма Citrobacter hydrophyla IBRB-36 4CPA;

2. определить последовательности нуклеотидов плазмиды pAH 36-4CPA;

3. идентифицировать гены мобилизации плазмиды pAH 36-4CPA;

4. выявить филогенетическое положение генов mob плазмиды pAH 36-4CPA;

5. изучить структуру кластера mob генов плазмиды pAH 36-4CPA;

6. провести сравнительный анализ последовательностей нуклеотидов генов mobA, mobC, mobB и mobD плазмиды pAH 36-4CPA;

7. оценить трансфер плазмиды pAH 36-4CPA в клетки других бактерий.

Научная новизна исследования. Идентифицирована последовательность нуклеотидов кластера генов мобилизации плазмиды pAH36-4CPA Citrobacter hydrophyla IBRB-36 4CPA. Длина последовательности составляет 1809 п.н. Показано, что система мобилизации плазмиды pAH364CPA объединяет 4 гена: mob А, В, С, и D. Длина mobА составляет 1497 п.н., mobВ - 489 п.н., mobС - 324 п.н., mobD - 216 п.н.

Выявлена структурная организация кластера генов мобилизации плазмиды pAH36-4CPA. Установлено, что гены mobВ и mobD располагаются внутри гена mobА, в то время как последовательность mobС частично перекрывается геном mobА.

Обнаружена возможность трансфера плазмиды pAH 36-4CPA в клетки штаммов Gluconobacter oxydans IBRB-2T и Raoultella planticola IBRB-33 4CPA.

Практическая значимость работы. Полученные в данном исследовании результаты раскрывают молекулярно-генетические особенности строения систем мобилизации малых плазмид и вносят существенный вклад в понимание процессов их функционирования. Результаты работы могут быть применены для создания новых штаммов векторных систем в области генной инженерии.

Апробация работы. Результаты работы были обсуждены в ходе работы Первого конгресса европейских микробиологов (Словения, 2003), 1-го Международного конгресса Биотехнология - состояние и перспективы развития (Москва, 2002), 2-й конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова Актуальные проблемы генетики (Москва, 2003), конференции ELSO (Франция, 2004), 7-ой, 9-ой и 10-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых Биология - наука XXI века (Пущино, 2003, 2005, 2006), международной конференции Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды (Саратов, 2005), Всероссийской Молодежной школы-конференции Актуальные аспекты современной микробиологии (Москва, 2005).

Гранты. Работа была проведена при содействии Государственного контракта Э0029 Экспедиционные исследования микроорганизмов промзоны нефтехимического производства, ФЦП Интеграция науки высшего образования России на 2002-2006 годы, РФФИ-Агидель 02-04-97911, гранта Программы фундаментальных исследований Президиума РАН Биоразнообразие и программы Президиума РАН Поддержка молодых ученых.

Публикации. Результаты диссертации изложены в 10 печатных работах, в том числе 3 статьях и публикации в базе данных NCBI (Microbial Genomes section of GenBank).

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, обсуждения результатов исследований, выводов, списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 111 страницах, содержит 30 рисунков и 18 таблиц. Библиография включает 179 источников.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Для исследования была выбрана плазмида pAH 36-4CPA штамма Citrobacter hydrophyla IBRB-36 4CPA, выделенного из образцов почв промзоны г. Уфы. Штамм был идентифицирован согласно критериев молекулярной классификации по последовательности 16S рРНК.

Для выделения плазмидной ДНК применяли методику Бирнбойма-Доли (Birnboim and Doly, 1979). Рестрикционный анализ плазмидной ДНК проводился по стандартной методике (Маниатис и др., 1984). Размеры фрагментов ДНК устанавливали с использованием пакета программ Gel Analysis. Для определения устойчивости штамма к антибиотикам применяли метод диффузии в агар с применением дисков (Лабинская, 1978). Определение устойчивости штамма к тяжелым металлам проводили с использованием селективных сред. Конъюгацию клеток бактерий осуществляли согласно указаниям, изложенным в руководстве Методы общей бактериологии (1984).

В качестве векторной системы для создания библиотеки генов плазмиды pAH 36-4CPA брали вектор pGEM-3Zf(+) Promega (США). Компетентные клетки E. coli готовили по стандартной методике (Sambrook et al., 1989).

Определение последовательностей выполнялось с использованием универсальных секвенирующих праймеров M13(F) и M13(R). Реакции проводили по методу Сенгера (Sanger et al., 1977) с использованием набора Silver Sequencing (Promega, США) на приборе SQ3 Sequencer (Hoefer, США), допуская незначительные модификации согласно рекомендациям производителя. Автоматическое секвенирование клонированных фрагментов плазмиды pAH364CPA выполняли с помощью набора BigDyeоTerminator v3.Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США), на приборе DNA Analyzes 3730, (Applied Biosystems, США) согласно рекомендациям производителя.

Первичный сравнительный анализ последовательностей с последовательностями из базы данных GenBank проводили с помощью пакета программ BLAST.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Рестрикционный анализ плазмиды pAH 36-4CPA штамма Citrobacter hydrophila IBRB 36 4CPA В начале исследований из клеток Citrobacter hydrophila IBRB-36 4CPA был получен препарат плазмиды pAH 36-4CPA. На основе RFLP-анализа (restriction fragment length polymorphism) с использованием BamHI, HincII и PvuII ферментов была построена рестрикционная карта изучаемой плазмиды, позволяющая разработать стратегию ее секвенирования (Рис.1).

A B C Рис. 1. A, B. Результаты электрофоретического анализа BamHI-, HinсII- и PvuII- рестрикционных фрагментов плазмиды pAH 36-4CPA Citrobacter hydrophila IBRB-36 4CPA.

C. Рестрикционная карта плазмиды pAH 36-4CPA построенная по BamHI-, HincII- и PvuII- сайтам.

Условные обозначения: 1, 7 - маркер молекулярной массы ДНК 1 т.п.н.

(Сибэнзим); 2, 8 Цмаркер молекулярной массы ДНК 100 т.п.н.

(Сибэнзим); 3, 9 - нативный препарат pAH 36-4CPA; 4, 14 - BamHI- фрагменты; 5 - HincII - BamHI-фрагменты; 6, 10 - HincII - фрагменты;

11 - HincII - PvuII- фрагменты; 12 - PvuII- фрагменты;

13 - BamHI- PvuII- фрагменты.

1 mob -c- start- ATG CTC ACC ATG TGG GTG ACG GAG GGC GAG CAC 46 CGG CGG CTG CTT GAG CGC TGC GAC GGC AGG CCG CTG GCG GCG TGG 91 ATG CGG CAG ACC TGC CTG GAC GAA AAG CCT GCG CGC ACC GGA AAG 136 CTC CCC TCA CTC TCG CCG GCG CTG CTG CGC CAG CTT GCC GGT ATG 181 GGC AAT AAC CTG AAC CAG ATA GCC CGC CGT GTT AAC GCC GGC GGC 226 GGC ACC GGC CAT GAC AGG GTA CAG ATT GTG GCG GCG CTG ATG GCC 271 ATC GAT GCC GGG CTT GAG CGG CTG CGG CAC GCC GTT CTT GAG AAA 316 GGA ACG GAC G-- -mob-a Цstart- -AT GAT CGT TAA --mob- c-end 361 -- -AT TTC ATC CAC GCG GTC GCG GCG GTG GCG CCG GGC CGG TGG 406 ACT ATC TGC TGG GTA AAG ACC GGC AGC GTG AAG GCG CCA GCG TCC 451 TGC AGG GGA AGC CGG AAG AAG TCC GGG AGC TGA TTG ACG CGT CGC 496 CTT ACG TGA AGA AAT ACA CCT CCG GCG TTC TGT CGT TTG CGG AGG 541 CCG ATC TGC CTC CCG GCC AGC GGG AAA AAC TGA TGG CCA GCT TCG 586 AGC GGG TTC TGA TGC CCG GAC TCG ATA AAG ATC AGT ACA GCA TTC 631 TGT GGG TGG AGC ACG CGG ACA AGG GGC GTC TGG AGC TGA ACT TTC 676 TGA TCC CCA ATA CCG AAC TGC TGA CCG GCA GGC GGC TCC AGC CGT 721 ACT ACG ACC GCG CCG ACC GGC CGC GCA TCG ATG CCT GGC AGA CCA 766 TCG TGA ACG GCA GAC TGG GGC TGC ATG ACC CGA ACG CGC CGG AAA 811 ACC GCC GGG CGC TGG TCA CGC CGT CCG GAC TGC CGA AAA CGA AGC 856 AGG AGG CCA CTG AAG CCA TCA CGC GCG GAC TGC TGA CCC TTG CTT 901 CGT CCG GGG AGC TGA AAA ACC AGT CAG GAC AGT CAC TGA GGC GCT 946 CGG AAG GTA CAG GTT TTA TGA GGC TGG TGC GCA CCA CGA AAA GCA 991 GTA TCA CGC ATT GCC GAC CCG GAC GGG GGG CGA ACA TCC GAC TGA 1036 AGG GAG CCA TCT -- mob b-start- - ATG AGC AGT CTT TTA ACG 1081 CTG GCG AAG GAC TTA GAG CAG CAA TCG AAA GCG CAG AAG CAG AGT 1126 ACC GGC GAG ATG CTG AAA GCC GCA TTC AGC GAG CAC GAG CAG TCT 1171 GTC AGA GCG GAA CTG AGC GCA AGC GCG AGG AGA ATC AGC GAC GCC 1216 ATC CTC GCC CAC GAG CAG AGT ATG AGC GAG GCG ATG GAG AAA AAC 1261 CGG CGG AGC GTA CTG CGG ACT GCC GGG CGG ACA TGG CTC ACC ATC 1306 CTG ATG GTG TCA GCG CTG CTG ATC GGC ACG AGC GGG AGC ATT CTG 1351 TGG TGG CAG GGG CAG CAG ATA ACC GAC AAT TAC ACG CAT CTT CGT 1396 CAG CAG GAA GAT ACC CTG GCG AAA ATG ACC GCC CGG ACG TGG GGA 1441 GTG CGC TAT CAG GAG AGC AGC GAC GGC CGG AGG TTT CTT ATC CTG 1486 CCG CCG GGG ATG CAA ACC GAA GCC ATC CCC TAC GAC GGG ACG ACA 1531 TGG ATC CGC CTG AAA CAG GAG --mob- b-end- ATA GCG GAA ACT 1576 mob -d- start- -AT GAC AGA GCT GGA AAA GCA GTT GCT GAG CGC 1621 ATT AGA GCA GCT ACA GCA GGA CTA CTC GCA AAG GCT GGA CGA ATG 1666 GGA GAG CGC CTT CGC GGA ATG GCG GAG CAT GTG TGG GCT TAT GCA 1711 ACG GGA GAA CGC GGT GCT GAA CGA GCG CGT GTC GGA CTT GAG CAC 1756 GCA GGT GCT GAG TTT AAG CGA GCA GCT GCG CCG CTT GTC CGG GAA 1801 CTG A-- mob -d- end --A TGC CAT CGA GCT CCG GCA GAG GGA GAA 1846 TGA GTA TCA GAA AAC ACT GGA GCT GGA GCG CCA GCC GCA GAA AAC 1891 CTA CCG CGG GCC GAC ACT TTA A-- mob -a- end Рис. 2. Последовательность фрагмента нуклеотидов плазмиды pAH 36-4CPA Citrobacter hydrophila IBRB-36 4CPA.

Условные обозначения: Закрашенные прямоугольники показывают области начала и конца генов mobA, B, C и D, а также место начала сдвига рамки считывания (№ 645).

Секвенирование фрагментов pAH 36-4CPA Citrobacter hydrophila IBRB36 4CPA позволило идентифицировать фрагменты плазмиды, последовательность нуклеотидов одного из них представлена на рис. 2.

Результаты сравнительного анализа выявленной последовательности плазмиды pAH 36-4CPA Citrobacter hydrophila IBRB-36 4CPA с ресурсами базы данных GenBank обнаружили существенное сходство этого фрагмента pAH 364CPA с участками плазмид нескольких штаммов бактерий, а именно: pECOEnterobacter cloacae - 99%, pAH3680 Aeromonas hydrophila - 99%, pECEscherichia coli 278B - 98%. При этом изучаемый фрагмент pAH 36-4CPA, длина которого составила 1809 п.н., обладал наибольшим уровнем гомологии с последовательностью плазмиды pECO1, несущей кластер генов мобилизации (mob).

Сравнение последовательностей также указало на то, что кластер генов мобилизации плазмиды pAH 36-4CPA объединяет 4 гена mobA, mobB, mobC и mobD (рис. 2). Анализ расположения открытых рамок считывания позволил установить, что размер гена mobA pAH 36-4CPA Citrobacter hydrophila IBRB-4CPA составляет 1497 п.н., mobB - 489 п.н., mobD - 216 п.н., mobC - 324 п.н.

(табл. 1).