На правах рукописи

ШУЛЕПКО МИХАИЛ АНАТОЛЬЕВИЧ ИССЛЕДОВАНИЕ ЛИГАНД-РЕЦЕПТОРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ НА ПРИМЕРЕ НИКОТИНОВОГО АЦЕТИЛХОЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА И ТОКСИНОВ ИЗ ЯДА ЗМЕЙ Специальность: 03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

Работа выполнена на кафедре биоинженерии Государственного учебно-научного учреждения Биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и в лаборатории инженерии белка Учреждения российской академии наук Институт биоорганической химии им.

академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научные руководители: профессор, д.б.н. Д.А.Долгих к.б.н. Е.Н.Люкманова

Официальные оппоненты: профессор, д.б.н. П.Г.Свешников доцент, д.х.н. В.В.Чупин Ведущая организация Учреждение Российской академии наук центр "Биоинженерия" РАН

Защита состоится У12Ф ноября 2009 г. в 15 ч. 30 мин. На заседании диссертационного совета Д.501.001.96 при кафедре биофизики Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, Новая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан л 9 октября 2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, профессор, д.б.н. Т.Е. Кренделева

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Изучение лиганд-рецепторных взаимодействий является одной из фундаментальных задач современной молекулярной биологии и биофизики. Эти взаимодействия играют центральную роль во многих процессах, таких как гормональная регуляция, межклеточная сигнализация, транспорт биомолекул, передача нервного импульса и др.

Никотиновый ацетилхолиновый рецептор (нАХР) представляет собой лигандзависимый ионный канал, встроенный в постсинаптическую мембрану нейронов, и является одним из наиболее распространенных рецепторов центральной и периферической нервных систем млекопитающих. В зависимости от локализации рецепторы семейства нАХР подразделяются на два больших класса: мышечные и нейрональные. -Нейротоксины яда змей известны как высокоспецифичные конкурентные ингибиторы нАХР. Эти белки имеют характерную трех-петельную -структуру, стабилизированную 4-5 дисульфидными связями. Небольшие размеры и жесткая структура делают -нейротоксины удобными инструментами для исследования свойств нАХР. Со структурной точки зрения -нейротоксины из яда змей можно подразделить на 3 класса: короткие, длинные и необычные нейротоксины (Рис.1). Короткие и длинные -нейротоксины эффективно ингибируют нАХР мышечного типа, однако только длинные -нейротоксины с пятой дисульфидной связью в центральной петле эффективно взаимодействуют с нАХР нейронального типа. Мишенями действия необычных токсинов с пятой дисульфидной связью, локализованной в N-концевой петле, выступают как мышечные нАХР, так и нейрональные нАХР, а также мускариновые ацетилхолиновые рецепторы, относящиеся к семейству G-белок сопряженных рецепторов.

Изучение механизмов, лежащих в основе взаимодействия -нейротоксин/нАХР, представляет интерес не только с фундаментальной точки зрения, но и необходимо для создания новых лекарственных препаратов, направленных на лечение заболеваний нервной системы, связанных с дисфункциями нАХР.

Цель исследования. Целью настоящей диссертационной работы являлось получение методами генной и белковой инженерии -нейротоксинов длинного и необычного типов, их мутантных и изотопно-меченых вариантов, а также выявление структурных детерминант, важных для взаимодействия этих токсинов с различными подтипами нАХР.

Основные задачи исследования.

1. Получить гены химерных длинных -нейротоксинов, созданных на основе нейротоксина II из яда Naja oxiana (NTII) путем введения в последовательность NTII дополнительных аминокислотных остатков, и слабого токсина из яда Naja kaouthia (WTX, weak toxin), относящегося к классу необычных токсинов.

2. Разработать эффективную схему биосинтеза, выделения и очистки рекомбинантных -нейротоксинов, их мутантных и изотопно-меченых вариантов.

Наработать рекомбинантные -нейротоксины, их мутантные и изотопно-меченые варианты в необходимых для исследования количествах. Провести физикохимический анализ рекомбинантных белков.

3. Исследовать биологические свойства химерных длинных -нейротоксинов.

Изучить специфичность химерных длинных -нейротоксинов по отношению к нейрональным нАХР 7 и 32 типов.

4. Исследовать биологическую активность рекомбинантного WTX и его мутантных вариантов по отношению к мышечному и нейрональному нАХР 7 типа.

Идентифицировать аминокислотные остатки мутантных вариантов WTX, которые важны для взаимодействия с различными типами нАХР.

5. Исследовать влияние конформационной гетерогенности в молекуле WTX на функциональную активность.

Научная новизна и практическая значимость работы. Все результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, получены впервые.

1. На примере химерных длинных -нейротоксинов впервые исследовано влияние точечной мутации Ala/Lys в центральной петле длинных -нейротоксинов на взаимодействие с нейрональным нАХР 32 типа.

2. Впервые разработана эффективная система продукции слабого токсина из яда Naja kaouthia. Впервые разработаны протоколы выделения и очистки рекомбинантного WTX.

3. Впервые получены мутантные формы WTX, выявлены аминокислотные остатки токсина, важные для взаимодействия с нАХР мышечного и нейронального типов.

4. Впервые получен 15N-меченный WTX и проведено полное отнесение сигналов в ЯМР спектрах токсина.

5. Впервые изучено влияние точечных мутаций WTX на конформационную гетерогенность молекулы токсина.

Данные, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, будут интересны не только с точки зрения фундаментальной науки, но, в перспективе, также могут быть применены для разработки лекарственных препаратов, имитирующих свойства лигандов нАХР.

Апробация работы. Результаты настоящей работы докладывались на следующих российских и международных конференциях: Симпозиуме ФНейрорецепторы: Структура, механизм действия и роль в патологиях.Ф (Москва 2007); 37-й Ежегодной конференции общества нейробиологов, (Сан Диего, США 2007); 4-й Конференции, международном симпозиуме и летней школе УЯМР в биологии,Ф (Санкт-петербург 2007); 15-й Международной конференция УНовые информационные технологии в медицине, фармакологии, биологии и экологииФ (Гурзуф, Украина 2007); 20-й Зимней международной молодежной научной школе УПерспективные направления физико-химической биологии и биотехнологииФ (Москва 2008); 4-м Ежегодном саммите по инженерии белков (Бостон, США. 2008);

33-м Конгрессе европейских биохимических обществ УБиохимия клеточной регуляцииФ (Афины, Греция 2008); 4-й Конференции европейского общества нейробиологов ФУспехи изучения молекулярных механизмов нейрологических заболеванийФ (Лейпциг, Германия 2009), Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе 3 статьи в реферируемых научных журналах, включенных в список ВАК и 9 тезисов конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, содержит 5 таблиц и 24 рисунка. Список литературы содержит 173 наименования.

Основное содержание работы

I. Исследование влияния точечной замены Ala/Lys в центральной петле длинных -нейротоксинов на взаимодействие с нейрональным нАХР 32 типа 1. Конструирование химерных длинных -нейротоксинов Многочисленные исследования мутантных и химически модифицированных длинных и коротких -нейротоксинов установили, что участок центральной петли, содержащий дисульфидную связь (Рис.1), необходим для взаимодействия с нейрональными нАХР. Наряду с этим было замечено, что длинные -нейротоксины эффективно ингибируют нейрональные нАХР 7 типа, и только некоторые из них способны ингибировать нейрональные нАХР других типов. К таким токсинам Рис. 1. Пространственные структуры -нейротоксинов в ленточном представлении. (А).

Короткий нейротоксин II из яда Naja oxiana, (Б). Длинный -кобратоксин из яда Naja siamensis, (В). УНеобычныйФ токсин кандоксин из яда Bungarus candidus. Петли, образованные -листами, обозначены римскими цифрами. Желто-серыми линиями показаны консервативные S-S связи, красно-серыми линиями - дополнительная дисульфидная связь длинных и УнеобычныхФ нейротоксинов.

относится -бунгаротоксин из яда Bungarus multicinctus, высокоэффективный ингибитор нАХР 32 типа, также являющийся длинным -нейротоксином.

Сравнительный анализ аминокислотного состава центральной петли длинного кобратоксина из яда Naja siamensis (-Cbtx) и -бунгаротоксина показал, что концевые фрагменты центральных петлей этих двух токсинов отличаются лишь одним аминокислотным остатком в 29 положении (Рис.2). Было выдвинуто предположение, что, возможно, это различие и определяет способность бунгаротоксина ингибировать как нАХР 7 типа, так и нАХР 32 типа (Bourne et al.,EMBO J., 2005).

Рис. 2. (А). Сравнение аминокислотных поледовательностей -нейротоксинов яда змей и химерных токсинов. Аминокислотные остатки, локализованные на конце центральной петли, заключены в красный прямоугольник. Остатки Cys выделены желтым цветом. Остатки Ala/Lys в положении 29 выделены зеленым/красным цветом. (Б). Сравнение фрагментов центральных петель нейротоксина II, нейротоксина I и -бунгаротоксина.

Для проверки этой гипотезы на основе короткого NTII было сконструировано два химерных длинных -нейротоксина NTII/I и NTII/I[A29K]. Химерный токсин NTII/I был получен путем замены фрагмента центральной петли короткого токсина NTII на аналогичный фрагмент центральной петли длинного -нейротоксина I из яда Naja oxiana. В химерный токсин NTII/I[A29K] была введена дополнительная замена остатка аланина в положении 29 на остаток лизина (Рис.2). Гены NTII/I и NTII/I[A29K] были получены методом сайт-направленного мутагенеза с помощью ПЦР. В качестве матрицы была использована плазмида pET22b(+)/STII/NTII.

Плазмиды, содержащие гены NTII/I и NTII/I[A29K], были названы pET22b(+)/STII/NTII/I и pET22b(+)/STII/NTII/I[A29K], соответственно (Рис.3).

Рис. 3. Конструкция для секреции в E. coli химерных токсинов NTII/I и NTII/I[A29K].

2. Биосинтез, выделение и очистка NTII/I и NTII/I[A29K] Экспрессионная система, разработанная ранее в лаборатории инженерии белка ИБХ РАН для бактериальной секреции NTII, была адаптирована для продукции NTII/I и NTII/I[A29K], и позволила получить достаточные для структурнофункциональных исследований количества рекомбинантных токсинов. В этой системе NTII/I и NTII/I[A29K] синтезировали вместе с лидерным пептидом энтеротоксина II из E.coli, - STII. Наличие лидерного пептида определяло преимущественное накопление рекомбинантных токсинов в периплазматическом пространстве клеток E. сoli и в культуральной жидкости.

Наработку NTII/I и NTII/I[A29K] осуществляли в штамме BL21(DE3) E. coli.

Культивирование клеток, трансформированных соответствующей плазмидой, проводили в среде ТВ при 37С до достижения плотности культуры показателя оптического поглощения 0.6 на длине волны 600 нм. Затем клетки центрифугировали в течение 15 мин при 1000 g и переносили в минимальную среду M9. Индуцировали экспрессию генов NTII/I и NTII/I[A29K] добавлением 0.05 мМ ИПТГ и продолжали культивирование в течение 15 часов при 37С.

После культивирования клетки осаждали центрифугированием и продолжали работу с культуральной жидкостью. Очистку белков осуществляли в два этапа: с помощью хроматографии на смоле SP-Sepharose (GE Healthcare) и на смоле Ceramic hydroxiapatite (Bio-Rad). Конечные выходы химерных токсинов NTII/I и NTII/I[A29K] составили 1 мг/л и 5 мг/л, соответственно.

3. Анализ физико-химических свойств NTII/I и NTII/I[A29K] Анализ химерных -нейротоксинов NTII/I и NTII/I[A29K] методом деградации по Эдману показал, что полученные белки имеют N-концевую последовательность идентичную последовательности NTII. Масс-спектрометрический анализ NTI, NTII, NTII/I и NTII/I[A29K] выявил соответствие экспериментальных масс теоретически рассчитанным. Чистота полученных химерных токсинов NTII/I и NTII/I[A29K] была проанализирована с помощью ВЭЖХ, и составила не менее 95% (Рис. 4). На рисунке видно, что время элюции химерных -нейротоксинов NTII/I и NTII/I[A29K] находится в интервале между временами элюции природного NTII и природного NTI. При этом, химерный токсин NTII/I[A29K] сходил с колонки несколько раньше, что видимо, обусловлено понижением гидрофобности токсина, вызванным заменой остатка аланина на остаток лизина.

Рис. 4. ВЭЖХ анализ NTI, NTII, NTII/I и NTII/I[A29K]. Хроматография была выполнена на колонке Jupiter C(4.6X250мм) в градиенте ацетонитрила 15-45% за 30 мин в присутствии 0,1% трифторуксусной кислоты. В качестве контрольных препаратов были использованы NTI и NTII, выделенные из яда Naja oxiana.

4. Исследование пространственной структуры химерных -нейротоксинов Все структурные исследования, описываемые в этой работе, были выполнены совместно с З.О. Шенкаревым, научным сотрудником лаборатории биомолекулярной ЯМР спектроскопии ИБХ РАН. Фрагмент центральной петли, пересаженный в молекулу нейротоксина II из молекулы нейротоксина I, состоит из остатков и содержит дополнительную дисульфидную связь. С целью установить возможные изменения в пространственной структуре химерных -нейротоксинов, вызванные введением этой замены, было проведено исследование химерных нейротоксинов методами ЯМР-спектроскопии. Анализ 1D Н ЯМР спектров рекомбинантных белков NTII/I и NTII/I[А29K] выявил узкие линии сигналов и значительную дисперсию химических сдвигов NH-протонов. Большой сдвиг сигналов протонов некоторых алифатических боковых цепей в сильное поле свидетельствовало о пространственной сближености этих боковых цепей с ароматическими остатками, что часто наблюдается в -структре. Сравнение 2D 1Н15 N корреляционных ЯМР спектров рекомбинантного N-меченного NTII и химерного токсина NTII/I (Рис. 5А,Б) выявило практически полное совпадение 1 химических сдвигов Н и N для амидных групп общих остатков токсинов.