На правах рукописи

ШЕСТАК Анна Александровна АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА И ИХ ИСТОЧНИКИ В ПРОГРАММИРОВАННОЙ ГИБЕЛИ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ И ЦИАНОБАКТЕРИИ АNABAENA VARIABILIS 03.00.25-03 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

Работа выполнена на кафедре физиологии микроорганизмов биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Самуилов Виталий Дмитриевич Московский государственный университет им. М.В. омоносова, Москва

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Ягужинский ев Сергеевич Научно-исследовательский институт физикохимической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, Москва доктор биологических наук, Доронин Юрий Константинович Московский государственный университет им. М.В. омоносова, Москва

Ведущая организация: Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

Защита состоится 20 ноября 2007 года в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д. 501.001.52 при Московском государственном университете им.

М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, енинские горы, д.1, корп. 12, биологический факультет МГУ, ауд. М1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им.

М.В.Ломоносова

Автореферат разослан 18 октября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, Е.Н. Калистратова кандидат биологических наук 2 Актуальность темы. Активные формы кислорода (АФК) в клетках растений образуются в электронтранспортных цепях хлоропластов и митохондрий, а также в пероксисомах, аппарате Гольджи, эндоплазматическом ретикулуме. АФК обладают высокой окислительной способностью и скоростью взаимодействия. Они способны регулировать рост, развитие растений, участвовать в иммунитете, могут быть использованы клеткой при реализации ПКС. Источники, механизмы образования АФК и их участие в сигнальных системах являются главными направлениями в этой области исследований. В зависимости от концентрации АФК может происходить активация или ингибирование ферментов, задействованных в гибели клеток по типу некроза или апоптоза.

Цель работы - исследовать активные формы кислорода и их источники в программируемой гибели клеток в истьях гороха и клеток Аnabаena variabilis.

Задачи работы:

1. Испытать действие соединений, стимулирующих или подавляющих образование АФК, на ядра замыкающих клеток устьиц в эпидермисе истьев гороха и нуклеоиды клеток А. variabilis.

2. Исследовать действие хинакрина (ингибитора флавиновых ферментов) и ингибиторов фотосистемы II фотосинтетической элетронтранспортной цепи на образование АФК в клетках эпидермиса из истьев гороха.

3. Исследовать действие ингибитора гликолиза 2-дезоксиглюкозы, ингибиторов энергетического обмена митохондрий и разобщителя окислительного и фотосинтетического фосфорилирования на образование АФК и их возможную роль в переходе с одного типа клеточной гибели к другому.

4. Исследовать действие ингибитора синтеза белка инкомицина на клетки А. variabilis.

_ Список сокращений и обозначений: БР - бенгальский розовый; БО - бромоксинил; ДГ - 2-дезоксиглюкоза; НСТ - нитросиний тетразолий; ПКС - программируемая клеточная смерть; УК - устьичные клетки; ФС - фотосистема; ХКФ - мхлоркарбонилцианидфенилгидразон; DCMU - 3-(3',4'-дихлорфенил)-1,1диметилмочевина, диурон; DAPI - 4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид; DCF - 2,7-дихлорфлуоресцеин; DCFH-DA - 2,7-дихлорфлуоресцин диацетат; NAC - Nацетил-L-цистеин; PI - пропидий йодид; TMRE - этиловый эфир тетраметилродамина;

О2 - супероксидный анион-радикал; ОН - гидроксильный радикал; О2 - синглетный кислород.

Научная новизна работы. Испытано влияние соединений, вызывающих или подавляющих образование АФК на ПКС у растений и A. variabilis. Полученные результаты показали, что О2, Н2О2 и ОН стимулируют ПКС устьичных клеток гороха.

Предположительно Н2О2 активирует NADРH-оксидазу плазматической мембраны.

Установлено образование АФК пероксидазой клеточной стенки. Фотосенсибилизаторы БР и TMRE, подобно ингибиторам переноса электронов в ФСII диурону и бромоксинилу на свету, приводили к гибели клеток по типу некроза. Н2О2 вызывал увеличение содержания АФК в клетках, разрушение нуклеоидов и гибель клеток A. variabilis от антибиотика инкомицина, ингибитора синтеза белка у бактерий. Клетки A. variabilis погибали с признаками автолиза.

Установлена роль различных компартментов клетки (хлоропластов, митохондрий, плазматической мембраны, клеточного ядра и клеточной стенки) в образовании АФК и гибели УК.

Практическое значение работы. Полученные данные позволяют расширить представления о роли АФК и механизмах гибели клеток растений и бактерий. Испытан ряд гербицидов и цитотоксических агентов на образование АФК в клетках. Полученные результаты свидетельствуют о единстве путей ПКС у животных, растений, бактерий и могут быть использованы в клеточной биологии, микробиологии и биотехнологии в связи с работами в области сигнальных систем клеток, фитоиммунитета и екарственной устойчивости микроорганизмов.

Апробация работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на международной конференции Российская биоэнергетика: от молекул к клетке (Москва, 2005), всероссийской научной конференции Молодые исследователи регионам (Вологда, 2005), годичном собрании физиологов растений Физиологические и молекулярногенетичекие аспекты сохранения биоразнообразия (Вологда, 2005), XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых ломоносов 2006 (Москва, 2006), I (IX) международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2006), международной научной конференции Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах (Москва, 2006), международной 14-ой Европейской биоэнергетической конференции (Москва 2006), XIV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых ломоносов 2007 (Москва, 2007), международной конференции Рецепция и внутриклеточная сигнализация (Пущино, 2007), международной конференции Современная физиология растений: от молекул до экосистем (Сыктывкар, 2007), а также на заседаниях кафедры физиологии микроорганизмов МГУ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора итературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой итературы. Диссертация изложена на страницах, иллюстрирована 2 таблицами и 24 рисунками. Список итературы содержит библиографических названий.

Объекты и методы исследования. Исследования проводили на нижнем эпидермисе из истьев гороха (Pisum sativum L.) сорта Альфа и истьев кукурузы сахарной (Zea mays saccarata L.) сорта Монарх. Растения выращивали методом гидропоники при периодическом освещении (18 ч свет, 6 ч темнота) юминесцентной ампой (интенсивность света ~1000 к, температура 20Ц25С). В экспериментах использовали 8Ц15-суточные проростки. С помощью пинцета пленки эпидермиса отделяли и помещали в полистирольные культуральные планшеты и инкубировали в дистиллированной воде. Клетки цианобактерии A. variabilis АТСС 29413 (из коллекции кафедры физиологии микроорганизмов) культивировали в колбах объемом 750 мл, содержащих 200 мл среды, при постоянном освещении юминесцентными ампами (~1400 к), на минеральной среде BG-11 (Rippka et al., 1979) в периодических условиях, при температуре ~27 С. Перед посевом клеток среду стерилизовали при 0,5 атм в течение 30 мин. В экспериментах использовали клетки из 3Ц5-суточных культур, находящихся в экспоненциальной фазе роста.

Инфильтрация и инкубация с реагентами. Для обеспечения быстрого проникновения реагентов в клетки использовали метод вакуум-инфильтрации. Пленки эпидермиса инкубировали в растворе реагентов при 1,5Ц3 мм рт. ст. в течение 1Ц2 мин.

Инкубацию клеток проводили в темноте и на свету (~1000 к) при 20Ц25С.

Фиксация объекта, окрашивание и световая микроскопия. По завершении инкубации образцы обрабатывали 5 мин фиксатором Батталья (смесь хлороформа, 96%-ного этанола, едяной уксусной кислоты и 40%-ного формалина в соотношении 5:5:1:1). Затем образцы отмывали 96%-ным этанолом 10 мин для удаления фиксатора, инкубировали 5 мин в воде и окрашивали красителем ядер гематоксилином Карацци в течение 20 мин.

Окрашенные пленки эпидермиса отмывали водопроводной водой и анализировали с помощью светового микроскопа Leitz Diaplan Wetzlar ФРГ. Из 300Ц500 просмотренных клеток определяли долю клеток с разрушенными ядрами (Самуилов и др., 2000).

Флуориметрия. Для регистрации АФК в клетках использовали DCFH-DA. Пленки эпидермиса помещали в 50 мкМ раствор DCFH-DA и инкубировали 10 мин в темноте. Этот краситель, проникая в клетку, дезацетилируется при участии внутриклеточных эстераз, превращаясь в нефлуоресцирующий DCFH. DCFH в клетках окисляется Н2О2 с участием пероксидазы или неферментативно в присутствии Fe2+, образуя интенсивно флуоресцирующий DCF (LeBel et al., 1992). DCFH окисляется также ОН, СО3, NO2, но не О2 однако, вероятность окисления этими агентами в исследуемых клетках не велика (Wrona et al., 2005). Образцы отмывали 5 мин в темноте, закрепляли силиконом на прозрачную пластинку из полистирола и помещали в кювету под углом 45 к падающему учу, содержащую буферный раствор 25 мМ HEPES-NaOH, pH 7,2, и 25 мМ КСI. Флуоресценцию DCF возбуждали светом с 485Ц495 нм и регистрировали при 515Ц525 нм. Для обработки данных, полученных с флуориметра (VersaFluor фирмы Bio-Rad, США), использовали компьютерные программы Read COM Port, Graph 2, Microsoft Excel.

Клетки A. variabilis дважды отмывали раствором 25 мМ Hepes-NaOH, pH 7,2 и 25 мМ KCl центрифугированием при 3000 g 5 мин и суспендировали в том же растворе. Клетки обрабатывали в темноте 30 мин 50 мкМ DCF-DA между первым и вторым центрифугированием и использовали в экспериментах в течение 2Ц4 ч после отмывки.

Клетки хранили в темноте при комнатной температуре. Величина D540 суспензии клеток составляла 0,6Ц0,9.

Флуоресцентная микроскопия. Для прижизненного исследования состояния клеток использовали флуоресцирующие красители. Для определения состояния ядер использовали 20 мкМ 4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид (DAPI окрашивание проводили мин), 0,2 мкМ пропидий йодид (PI окрашивание проводили 20 мин), 20 мкМ DCF-DA (мин). Клетки A. variabilis окрашивали 20 мкМ DAPI в течение 1 ч и 20 мкМ DCF-DA в течение 20 мин в темноте, 2 мкМ PI в течение 1 ч. Наблюдения проводили на флуоресцентном микроскопе Carl Zeiss Axiovert 200M LSM510 (Германия). Для получения фотоснимков использовали встроенную цифровую видеокамеру и компьютерную программу AxiVision.

Конфокальная микроскопия. Изучение серийных оптических срезов объектов проводили с помощью микроскопа Carl Zeiss Axiovert 200M (Германия), оборудованного конфокальной сканирующей приставкой Zeiss LSM510Meta. Определение энергетического состояния митохондрий в УК эпидермиса из иста гороха проводили с помощью TMRE.

ТМRE является катионом, проникающим через мембраны. Внутриклеточные митохондрии генерируют мембранный потенциал со знаком минус внутри. Накопление проникающего катиона ТМRE в митохондриях напрямую свидетельствует об энергизации митохондрий.

Пленки эпидермиса из истьев гороха окрашивали ТМRE в течение 1 ч в темноте, затем отмывали дистиллированной водой. Для визуализации красителя использовали гелийнеоновый азер (возб 543), измерения флуоресценции проводили при 560 - 590 нм. Для регистрации образования АФК пленки эпидермиса и клетки цианобактерии окрашивали мкМ DCF-DA в течение 10 мин в темноте. Флуоресценцию DCF возбуждали при 495 нм (аргоновый азер) и регистрировали при 523 нм.

Оксиметрия. Выделение и поглощение кислорода измеряли с применением закрытого Pt-электрода Кларка. В ячейку с 25 мМ Неpes-NaOH, pH 7,2, и 25 мМ КСI помещали нарезки истьев гороха с концентрацией хлорофиллов 45Ц90 мкг/мл и инкубировали на магнитной мешалке. Напряжение на электроде составляло - 0,65 В. Свет от ампы накаливания пропускали через тепловой фильтр - слой воды толщиной 12 см. Интенсивность действующего света составляла ~ 0,1 Вт/см2. Электрический сигнал от электрода Кларка регистрировали на компьютере через аналого-цифровой преобразователь с помощью программы Record 4.

Спектрофотометрия. Концентрацию Н2О2 измеряли при 240 нм, = 43, 6 М-1. см-(Bielski and Allen, 1977) на спектрофотометре Uvidec-4 (Jasco, Япония). Рост цианобактерии при периодическом культивировании определяли по светорассеянию клеточных суспензий при 540 нм на спектрофотометре Uvidec-4 (Jasco, Япония) и с помощью вертикального фотометра Multiscan Plus 314 (Labsystem, США) с интерференционным светофильтром, максимум полосы пропускания - 540 нм. Исследование действия различных соединений в условиях периодического культивирования проводили с применением стандартных стерильных 96-луночных планшетов. Объем клеточной суспензии в унке составлял 200 мкл.

Результаты исследования и их обсуждение Флуоресценция DCF в клетках. В замыкающих клетках устьиц как показали опыты с пленками эпидермиса, изолированными из истьев гороха, DCF интенсивно флуоресцирует (рис. 1 А). DCF флуоресцирует в клетках A. variabilis, образующих трихомы - клеточные нити (рис. 1 Б).

Рис. 1. Флуоресценция DCF в клетках: А - флуоресценция DCF в пленке эпидермиса из иста гороха, Б - флуоресценция DCF в клетках A. variabilis.