Geum.ru

Тезисы докладов

Вид материалаТезисы

Содержание


Новые спектрально-флуоресцентные методы диагностики экстрацеллюлярной днк в плазме крови пациентов с болезнями органов кровообра
Создание биосенсора для неинвазивного определения уровня глюкозы на основе стеклокомпозитов с серебряными наночастицами
Подобный материал:
1   ...   30   31   32   33   34   35   36   37   ...   96

НОВЫЕ СПЕКТРАЛЬНО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ЭКСТРАЦЕЛЛЮЛЯРНОЙ ДНК В ПЛАЗМЕ КРОВИ ПАЦИЕНТОВ С БОЛЕЗНЯМИ ОРГАНОВ КРОВООБРАЩЕНИЯ

В.А.Кузьмин1), О.А.Рогинко2), А.И.Алехин2), А.А.Юдин2), Н.Н.Вейко3), Е.С.Лисицына1), Н.А.Дурандин1), Л.В.Литвинкова1), А.М.Виноградов1), В.А.Волнухин1), А.В.Шибаева1)



1) Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН, Москва

2) Центральная клиническая больница РАН, Москва

3)Медико-генетический научный центр, РАМН, Москва


Высокая концентрация экстрацеллюлярной ДНК в крови пациентов с болезнями органов кровообращения (ишемическая болезнь сердца, острый инфаркт миокарда) обусловлена нарушением клеточного апоптоза. В крови пациентов появляются крупные фрагменты ДНК, из которых впоследствии в результате межнуклеосомной деградации формируются более мелкие фрагменты ДНК. Высокая концентрация экстрацеллюлярной ДНК в крови больных свидетельствует о тяжести заболевания и отражает степень повреждения органа при ишемическом повреждение ткани. В проекте разрабатываются новые флуоресцентные методы определения внеклеточной ДНК в сыворотке крови больных с заболеваниями органов кровообращения и устанавливаются корреляции с различными биохимическими параметрами для использования этих данных в клинической практике.

Решение задачи отбора новых флуорофоров, специфичных к последовательностям, обогащенным АТ- или GC-парами, для детектирования внеклеточной ДНК проведено спектрально-кинетическими методами – флуоресцентная и абсорбционная спектроскопия, импульсный фотолиз, метод однофотонного счета для определения времен жизни синглетно-возбужденных комплексов краситель–ДНК. Для анализа экстрацеллюлярной ДНК были использованы комплексы, содержащие молекулы двух или трех разных красителей, обеспечивающих индуктивно-резонансный перенос энергии. Перенос энергии между двумя красителями в комплексах с АТ- и GC-богатыми сайтами внутри одной молекулы ДНК позволяет выявить абсолютные концентрации различных теломерных повторов в нуклеиновых кислотах. Увеличение содержания GC-ДНК в составе вкДНК является хорошим маркером развития в организме скрытой патологии, сопровождающейся интен­сификацией процесса гибели клеток. В составе вкДНК по сравнению с яДНК содержание ТОрДНК при патологии (ишемическая болезнь сердца у пожилых людей) выше в 10 раз.

При исследовании сыворотки 40 больных острым инфарктом (ОИМ) было установлено, что концентрация вкДНК увеличена в несколько раз по сравнению со здоровыми донорами и больными хронической формой ИБС. Повышение количества вкДНК наблюдается только в сыворотке больных ОИМ, когда в короткий срок происходит гибель большого числа клеток организма. Концентрация маркера GC-ДНК (рибосомного повтора, ТОрДНК) в крови здоровых людей варьирует от 0,2 до 1,2 нг/мл сыворотки. У больных ИБС концентрация ТОрДНК в крови повышается. Особенно высокие количества ТОрДНК (7–10 нг/мл) детектируются в сыворотке больных ОИМ.

Общее содержание антител существенно выше в сыворотке больных ИБС, чем в сыворотке здоровых доноров. В комплексе с вкДНК больных ИБС находится ~ 60 % антител, вырабатываемых против суммарной ДНК, и ~ 70 % антител против фрагментов оксиДНК.

Полученные данные позволили установить, что свойства вкДНК при сердечно-сосудистых заболеваниях значительно изменены и коррелируют с тяжестью патологии. Таким образом, вкДНК и системы ее элиминации – это новые потенциальные цели терапии при сердечно-сосудистой патологии.


СОЗДАНИЕ БИОСЕНСОРА ДЛЯ НЕИНВАЗИВНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ ГЛЮКОЗЫ НА ОСНОВЕ СТЕКЛОКОМПОЗИТОВ С СЕРЕБРЯНЫМИ НАНОЧАСТИЦАМИ

А.В.Нащекин1), П.А.Образцов1), О.А.Подсвиров2), А.И.Сидоров3), О.В.Степаненко4), К.К.Туроверов4), О.А.Усов1)



1) Физико-технический институт им. А.Ф.Иоффе РАН,

С.-Петербург; 2) СПб Государственный политехнический университет, С.-Петербург;

3) СПбГУ информационных технологий, механики и оптики,

С.-Петербург; 4) Институт цитологии РАН, С.-Петербург


В настоящее время можно назвать множество подходов к решению важной проблемы современной медицины – обнаружения и количественного анализа широкого ряда биологически активных веществ. Одним из устройств, позволяющих эффективно и с высокой чувствительностью решить эту задачу, являются оптические биосенсоры (БС) [1], работающие на эффекте поверхностного плазмонного резонанса (ППР). В общем случае БС состоят из чувствительного элемента – биологически активного соединения, специфически взаимодействующего с аналитом (лиганд-связывающим белком, антителом, энзимом и т.д.), и трансдуктора – устройства, позволяющего фиксировать изменения сигнала в результате взаимодействия. Одним из перспективных трансдукторов являются стекла с металлическими наночастицами (НЧ), обладающие эффектом локализованного ППР. Успешная разработка и применение таких устройств позволит повышать чувствительность БС, значительно усиливать сигналы флуо-ресценции, а также удешевлять технологию и миниатюризировать БС.

В работе представлена технология создания подложек БС на основе фототерморефрактивных (ФТР) стекол с серебряными НЧ [2], исследование их оптических, структурных свойств и анализ взаимодействия НЧ с аналитом. Показано, что НЧ имеют размеры порядка 5 нм, располагаются слоями в приповерхностной области стекла, их концентрация в слое достигает 6∙1016 см-3. Характерные пики в спектрах оптического поглощения, связаные с ЛПР в НЧ, лежат в диапазоне 410-450 нм, положение и ширина линии чувствительны к размеру, форме, материалу и окружающей НЧ матрице. Положение пика, ширина и форма спектральной линии адекватно описываются с помощью обобщенной модели рассеяния света Ми [3].

В качестве чувствительного элемента разрабатываемого БС на глюкозу нами была получена мутантная форма D-галактоза/D-глюкоза связывающего белка (GGBP) с присоединенным флуоресцентным красителем баданом. Этот белок был успешно иммобилизован на поверхность ФТР стекол. При взаимодействии GGBP с глюкозой, добавленной в буферный раствор с pH 7.4, наблюдается значительное увеличение интенсивности флуоресценции красителя в области 420 нм и гашение флуоресценции на длине волны порядка 560 нм. Таким образом, показано, что вблизи слоев серебряных наночастиц на частоте ППР наблюдается значительное усиление регистрируемого сигнала, при этом тушение флуоресценции, по-видимому, связано с эффектом резонансного переноса энергии флуоресценции между флуоресцентным белком и наночастицами серебра.

Работа поддержана грантом Президиума РАН «Фун-даментальные науки – медицине», а также частично в рамках Гос. контракта, шифр «2011-1.2-512-034-078».

  1. J. Homola, Chem. Rev. 108, 462-493 (2008).
  2. Vostokov et al. Technical Physics Letters, 35(17), 35-40 (2009).
  3. Kreibig U. et al. Optical properties of metal clusters. Springer-Verlag, Berlin (1995).