Geum.ru

Тезисы докладов

Вид материалаТезисы

Содержание


Инициированные импульсным лазерным излучением 308 нм агрегация и постагрегация белков
Подобный материал:
1   ...   9   10   11   12   13   14   15   16   ...   96

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ТРОМБОЦИТАРНЫХ Р2-РЕЦЕПТОРОВ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ АНТИАГРЕГАНТНОЙ ТЕРАПИИ, ВЗАИМОСВЯЗЬ С ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИЕЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИМИ НАРУШЕНИЯМИ ТРОМБОЦИТАРНОГО РЕЦЕПТОРА ДЛЯ ФАКТОРА ВИЛЛЕБРАНДА

О.В.Сироткина1,2), А.Е.Тараскина1), А.Б.Ласковец2), Н.О.Зайцева2), П.М.Асадуллаева2), С.М.Туаршева2), В.В.Голдобин2), Т.В.Вавилова2)



1) Петербургский институт ядерной физики

им. Б.П.Константинова, Гатчина

2) Северо-Западный государственный медицинский университет

им. И.И.Мечникова


Реакции активации Р2-рецепторов координировано запускаются после активации тромбоцитарных рецепторов фактора Виллебранда GPIba при повреждении эндотелия сосудов. Цель исследования: проанализировать генетические варианты рецептора фактора Виллебранда GPIbа и количество зрелых комплексов GPIb-IX-V на мембране тромбоцитов пациентов с различными сердечно-сосудистыми заболеваниями и здоровых доноров. В исследование были включены 315 человек, в том числе 123 пациента с цереброваскулярной патологией (41 – с ишемическим инсультом вследствие макроангиопатии, 41 – с лакунарными инсультами, 41 – с патологической извитостью церебральных артерий), 98 пациентов с острым коронарным синдромом (ОКС) и 94 добровольца без сердечно-сосудистых и цереброваскулярных заболеваний в анамнезе. У всех включенных в исследование были проанализированы полиморфизм рецептора фактора Виллебранда Thr145Met GPIbа методом ПЦР-ПДРФ и количество рецепторов GPIbа на поверхности тромбоцитов методом проточной цитометрии, а также показатели активности тромбоцитарного гемостаза – АДФ-индуцированная агрегация (Т (%) при 2,5; 5 и 10 мкМ АДФ), средний объем тромбоцитов (MPV), число тромбоцитов, количество рецептора для фибриногена GPIIb-IIIa и экспрессия Р-селектина с помощью стандартной агрегатометрии, гематологического анализатора и проточной цитометрии, соответственно.

Количество GPIba достоверно коррелирует у обследованных пациентов с показателем MPV – R=0,27 (p=0,004) в группе с цереброваскулярной патологией и R=0,51 (p<0,001) у больных с ОКС. Аналогичная зависимость наблюдается для рецептора GPIIb-IIIa и MPV – R=0,41 (p<0,0001) в группе с цереброваскулярной патологией и R=0,65 (p<0,001) у больных с ОКС. Количество GPIbα также достоверно коррелирует с изменением экспрессии Р-селектина на поверхности тромбоцитов до и после индукции АДФ – R=0,25 p=0,006 и R=0,36 p=0,00004, соответственно, в группе с цереброваскулярными заболеваниями, что свидетельствует о прямой зависимости между количеством рецептора для фактора Виллебранда и активацией тромбоцитов в сосудах головного мозга. Более того, у пациентов с ишемическим инсультом вследствие макроангиопатии функциональная активность тромбоцитов зависела от полиморфизма Thr145Met GPIbа – степень АДФ-индуцированной агрегации (5 мкМ АДФ) была выше у носителей аллеля 145Met GPIbа по сравнению с нормальным генотипом ThrThr (68±6 % против 62±10 %, соответственно, p=0,06). Во всех исследованных группах на активность тромбоцитов оказывало влияние количество рецептора GPIIb-IIIa – корреляция с АДФ-индуцированной агрегацией составила R=0,22 (p=0,002) у пациентов с цереброваскулярной патологией, R=0,36 (p=0,02) у больных с ОКС в отсутствие антиагрегантной терапии и R=0,51 (p=0,002) у здоровых доноров. Следует отметить, что у пациентов на фоне приема антиагрегантов (аспирин+клопидогрел) функциональная активность тромбоцитов не зависела от вышеназванных показателей, что можно оценивать как эффективное подавление тромбоцитарной функции. В то же время между количеством рецепторов GPIIb-IIIa и числом тромбоцитов наблюдается обратная корреляция – R = -0,27 (p = 0,003). Такой же характер и направленность связи отмечены между MPV и числом тромбоцитов – R = -0,44 (p = 0,000001). Полученные данные позволяют предположить, что, чем менее активен каждый отдельный тромбоцит, тем больше клеток циркулирует в крови, и, наоборот, поддерживая баланс тромбоцитарного гемостаза.

ИНИЦИИРОВАННЫЕ ИМПУЛЬСНЫМ ЛАЗЕРНЫМ ИЗЛУЧЕНИЕМ 308 НМ АГРЕГАЦИЯ И ПОСТАГРЕГАЦИЯ БЕЛКОВ

Л.В.Соустов1), Н.М.Битюрин1), Н.В.Сапогова1), А.И.Коган1), А.А.Болдырев2), М.А.Островский3)



1)Институт прикладной физики РАН, Н. Новгород; 2)Международ-ный биотехнологический центр при МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва; 3)Институт биохимической физики, Москва


Исследованы инициированные УФ излучением процессы агрегации и постагрегации основных белков хрусталика глаза: альфа-, бета-кристаллинов и их комбинации при различных концентрациях альфа-кристаллина и при различных режимах УФ облучения. Появление и рост высокомолекулярных агрегатов (образование таких агрегатов в хрусталике глаза является причиной развития катаракты) в процессе и после воздействия УФ (при постагрегации) контролировалось по изменению мощности Р рассеянного в растворах белков пробного пучка HeNe лазера (633 нм). Обнаруженный нами эффект постагрегации заключается в том, что после прекращения воздействия на растворы белков УФ излучения с некоторой экспозицией D0 может происходить самостоятельное образование крупных высокомолекулярных агрегатов. Исследование этого эффекта позволяет получить информацию о поведении агрегатов в отсутствие внешних денатурирующих факторов.

Исследования агрегации и постагрегации бета-кристаллина и его смеси с альфа-кристаллином при концентрации каждого белка 0,5 мг/мл показали, что в достаточно широком диапазоне изменения D0 происходит постагрегация. При этом мощность Р монотонно возрастает после окончания УФ облучения.

Исследована постагрегация альфа-кристаллина в растворах с концентрациями белка 0,5 и 1,0 мг/мл. При малых значениях D0 мощность рассеянного излучения пробного пучка быстро выходит на стационарный уровень и не меняется в течение нескольких часов. С увеличением D0 появляется постагрегация. Так, при воздействии УФ излучения с плотностью энергии 7,8 Дж/см2 за 1 минуту при частоте повторения лазерных импульсов 2 Гц на раствор с концентрацией белка 1,0 мг/мл рассеяние начинает расти при дозе 650 Дж/см2. При экспозиции D0 = 830 Дж/см2 мощность рассеянного излучения резко (за 2 минуты) увеличивается в 3 раза, что существенно превышает скорость роста рассеяния в процессе УФ облучения. Зависимость мощности рассеянного излучения близка к шестой степени от размеров рассеивающих частиц, поэтому можно считать, что резкое увеличение рассеянной мощности обусловлено резким увеличением размеров белковых агрегатов. Мы полагаем, что одной из возможных причин такого скачка может являться конкуренция процессов агрегации и фотолиза. К моменту прекращения УФ воздействия (при дозе меньше D0) образуются большие агрегаты, в которых могут образовываться связи с энергией меньше 4 эВ, что меньше энергии кванта излучения 308 нм (4эВ). Это приводит к появлению фотолиза, который замедляет процесс агрегации. При выключении УФ излучения процесс фотолиза прекращается, и происходит резкий рост рассеянного излучения за счет эффекта постагрегации – самопроизвольного образования агрегатов больших размеров.

Построена теоретическая модель УФ индуцированной агрегации бета-кристаллина, в которой было сделано предположение о конечном времени жизни агрегатов, образованных двумя исходными молекулами белка. Нами было учтено, что через некоторое время происходит диссоциация этих агрегатов на исходные молекулы. В рамках такой усовершенствованной модели получено хорошее согласование теоретических расчетов с экспериментальными данными.

В настоящее время начаты исследования влияния широкого класса коротких пептидов, синтезированных в Международном биотехнологическом центре при МГУ им. М.В.Ломоносова, на процессы агрегации и постагрегации кристаллинов.