Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации

Вид материала

Содержание

IV. Медико-биологическое тестирование безопасности наноматериалов на культурах клеток высших животных 4.1. Требования к использу
4.2. Схема введения наноматериалов животным и сроки наблюдения
4.3. Подготовка аэрозольно обработанных наноматериалами животных
4.4. Приборы и оборудование

Подобный материал:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 ... 17

IV. Медико-биологическое тестирование безопасности наноматериалов на культурах клеток высших животных

4.1. Требования к используемым культурам клеток

Используемые в экспериментах перевиваемые культуры клеток должны быть получены из организаций, сертифицированных по соответствующему профилю. На хранение и ведение культур клеток и тканей должны составляться инструкции или СОП, гарантирующие качество клеточных и тканевых культур. Перед использованием культуры клеток должны быть протестированы на жизнеспособность и функциональною активность и иметь соответствующий стандарт, указанный в методике.

Работы по исследованию токсичности и биологической активности наноматериалов на первичных и перевиваемых культурах тканей in vitro, а также на первичных культурах макрофагов в системе ex vivo должны проводиться по утвержденным инструкциям и СОП. Эти документы должны регламентировать каждый этап эксперимента, соответствовать требованиям проведения безопасных работ с данным видом материалов.

4.2. Схема введения наноматериалов животным и сроки наблюдения

Группы мышей обрабатывают исследуемым наноматериалом для определения острой токсичности аэрозольно, подкожно, внутривенно, перитонеально, внутрижелудочно (в зависимости от предполагаемого пути попадания наноматериала). Исследования проводят на 1, 10 и 30-е сутки после введения наноматериалов на животных.

Для изучения хронической иммунотоксичности животных подвергают воздействию наноматериала ежедневно на протяжении 21 дня. Исследования проводят на 1-е, 30-е и 60-е сутки после окончания введения наноматериалов.

4.3. Подготовка аэрозольно обработанных наноматериалами животных

В экспериментах по воздействию наночастиц в аэрозольном состоянии используются морские свинки, линейные белые мыши для последующего получения и изучения in vitro их альвеолярных макрофагов. Животные обрабатываются аэрозольно в затравочной камере. Затравочная камера должна иметь объем не менее 100 дм³ и позволять одновременно обработать до 10 морских свинок или до 60 мышей, которых предварительно помещают в специальную корзину. Аэрозоль генерируется из водной или водно-органической дисперсии наноматериала калиброванным стеклянным распылителем, представляющем конструктивно трубку Вентури с объемом распыляемой жидкости до 7 см³. Система снабжается HEPA-фильтрами на входе воздушного потока, на выходе воздух фильтруется через HEPA-фильтр с термообработкой выходящего воздуха при температуре 840 °С. Камера имеет возможность регулирования времени ингаляции аэрозоля, времени распада облака. Работает по заранее выбранной программе в автоматическом режиме.

Перед экспериментом необходимо провести подбор рецептур жидкости для распыления предлагаемого для исследования наноматериала, исходя из его физико-химических свойств и токсичности самой жидкости. После обработки животные выдерживаются в условиях вивария необходимое количество времени и далее поступают либо на гистологические эксперименты, либо из них получают альвеолярные макрофаги с целью изучения их функций в условиях in vitro в культуре тканей. Последним исследованиям придается особое значение, так как на макрофагах одного и того же животного возможно исследовать действие различных веществ в разных концентрациях и оценить различные функции (фагоцитоз, бактерицидную активность, цитотоксичность, окислительный взрыв).

4.4. Приборы и оборудование

4.4.1. Средства измерения:

- весы лабораторные электронные, погрешность при измерении не более 0,001 г, Sartorius, Германия или аналогичные;

-весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104-2001;

-pH-метр лабораторный МР220, Mettler-Toledo GmbH, Швейцария или аналогичный;

4.4.2. Оборудование:

-цитофлюориметр FACSCalibur, BD – 2 – лазерный с возможностью одновременной детекции 4-х различных флюорохромов или аналогичный;

-плашечный термостатируемый универсальный сканер флюоресцентных сигналов, Victor, Perkin Elmer или аналогичный;

-планшетный спектрофотометр Titertek Multiscan Plus или аналогичный;

-планшетный сцинтилляционно-люминесцентный счетчик Top Сount, Paсkard, США или аналогичный;

-термостат, поддерживающий рабочую температуру + 28-45^оС с отклонением от заданной + 1^оС по ТУ 64-1-1382-72;

-ламинарный шкаф марки ЛШ1 фирмы Вiokom или аналогичный отечественный ламинарный шкаф БОВ-001-АМС (вариант СПШ), Россия;

- центрифуга со скоростью вращения ротора до 3000 об/мин для пробирок вместимостью 15 см³ СМ 6.03 ELMI (Латвия) или аналогичная;

- встряхиватель вибрационный типа вортекс со скоростью вращения до 3000об/ мин;

- шейкер планшетный термостатируемый;

- холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678-85;

- мембранные установки для получения деионизованной воды по ОСТ 11-029.003-80;

- облучатель бактерицидный настенный ОБН-150;

- автоклав ВК-75, завод медоборудования, Тюмень, Россия;

- аппарат для приготовления деионизованной воды Direct-Q 5, Millipore, США или аналогичный;

- баня водяная с электрическим подогревом, ГСП-2, завод РЭМО, Львов, Украина или аналогичная;

- дистиллятор ДЭ-4-2, завод медоборудования, г. Саранск, Россия;

- морозильная камера бытовая, обеспечивающая температуру -18 С, Stinol, Россия;

- шкаф сушильный ШС-80-01 СПУ, ОАО «Смоленское СКТБ СПУ» или аналогичный;

- CO₂-инкубатор Nuaire CF AUTOFLOW или аналогичный;

- харвестер для переноса клеток на фильтр;

- инвертированный микроскоп Биолам П2-1, ЛОМО, С-Петербург, Россия или аналогичный;

- регулируемые автоматические пипетки (0,5-10, 10-100, 100-1000, 500-5000 мм³), Ленпипет, Россия или аналогичные.