Книги по разным темам Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |

Другой штамм бактерий E. coli DL11 мог утилизировать немеченую глюкозу в качестве источников углерода и энергии по гликолитическому пути ассимиляции углерода, в то время как [1,4-13C]cукцинат и [1-13C]ацетат добавляли в ростовую среду для того, чтобы стимулировать биосинтез [13C]аминокислот, образующихся по циклу трикарбоновых кислот. Кроме того, в этом случае было необходимо ввести в бактериальный геном дополнительную мутацию, связанную c геном α-кетоглутаратдегидрогеназы, чтобы минимизировать процесс деградации метки в цикле трикарбоновых кислот.

6-фосфоглюконовая кислота

рибулозо-5-фосфат глюкоза

рибозо-5-фосфат глюкозо-6-фосфат

ксилулозо-5-фосфат фруктозо-6-фосфат

седогептулозо-7-фосфат фруктозо-1,6-дифосфат

эритрозо-4-фосфат фосфоглицеральдегид-3-фосфат 6 дегидроксиацетонфосфат

фосфоенолпируват

пируват лактат

2 1

ацетил-СоА

4 3

5

оксалоацетат цитрат

малат изоцитрат

фумарат СО2

α-кетоглутарат

сукцинат 7

СО2

сукцинил-СоА

Рис. 2. Мутации в генах метаболизма цикла гликолиза и трикарбоновых кислот (по ЛеМастеру Д. М., 1982).

Обозначения ферментов: 1 - пируватдегидрогеназа; 2 - фосфоенолпируваткарбоксилаза; 3 - фосфоенолпируваткарбоксикиназа; 4 - NAD-малатдегидрогеназа; 5 - NADP-малатдегидрогеназа; 6 - триозофосфатизомераза; 7 - α-кетоглутаратдегидрогеназа.

Выделение изотопномеченых аминокислот из белковых гидролизатов микроорганизмов.

Биомасса микроорганизмов, выращенных на средах, содержащих стабильные изотопы, является ценным источником различных изотопномеченых БАС, в том числе аминокислот. При этом наиболее распространённым и традиционным методом препаративного выделения аминокислот из клеточной биомассы является её гидролиз с использованием ферментативных или химических методов и последующая ионообменная хроматография на катионо- и анионообменных смолах (дауэкс, амберлит, пермутит, аминекс, дуолит и др.) [133]. Большое значение при проведении гидролиза белка имеет выбор того или иного гидролизирующего агента, который определяется целью исследования. Ферментативное расщепление протеолитическими ферментами может протекать ступенчато с концов молекулы (экзопептидазами) или путём расщепления специфических отдельных пептидных связей полипептидной цепи (эндопептидазами), причём специфичность зависит от конфигурации, аминокислотной последовательности и конформации белка [134]. Для селективного химического расщепления белков разработано очень много методов [135], среди которых имеется несколько методов расщепления по α-углеродному атому (например, через остатки дегидроаланина). Щёлочи и кислоты обладают высокой гидролизующей способностью и поэтому их использование приводит к разрушению некоторых аминокислот и к изотопному обмену в триптофане, тирозине и гистидине и в некоторых других аминокислотах. В условиях щелочного гидролиза (4 н. Ba(OH)2 или NaOH, 24 ч, 1100) реакций изотопного обмена водорода на дейтерий практически не наблюдается (исключением является протон (дейтерон) у атома С2’ гистидина) [136]. Существенным недостатком щелочного гидролиза, лимитирующим его использование, является значительная рацемизация аминокислот. Поэтому для препаративных целей щелочной гидролиз используется крайне редко, в то время как кислотный - очень широко. Кислотный гидролиз в стандартных условиях (6 н. НCl или 8 н. Н2SO4, 24 ч, 1100), как известно, приводит к полному разрушению триптофана и частичному разрушению серина, треонина и некоторых других аминокислот [137]. Добавление в реакционную среду фенола [138], тиогликолевой кислоты [139], β-меркаптоэтанола [140], позволяет сохранить до 80-85% триптофана. Кроме этого, в условиях кислотного гидролиза с высокой скоростью протекает изотопный обмен ароматических протонов (дейтеронов) в молекулах триптофана, тирозина и гистидина [141], а также протонов (дейтеронов) при атоме С3 аспарагиновой и С4 глутаминовой кислот [142]. Поэтому для получения реальных данных о биосинтетическом включении дейтерия в белок рекомендуется проводить кислотный гидролиз в присутствии дейтерированных реагентов. Этим способом могут быть выделены и анализированы с использованием ионообменной хроматографии большинство аминокислот в составе гидролизатов белка (рис. 3). Так, при помощи ионообменной хроматографии были препаративно выделены [2H], [13C]- и [15N]аминокислоты из белковых гидролизатов разных природных источников с выходами индивидуальных аминокислот от 77% до 95% и с уровнями изотопного включения, превышающими 95% [143]. Однако, метод выделения аминокислот из гидролизатов биомассы, будучи широко применяем на практике часто требует использования вредных буферных растворов (ацетат, формиат, пиридин и др.), нескольких колонок с последующей рехроматографией для полного выделения чистых аминокислот из гидролизатов биомассы.

Условия ионообменного выделения [2H]аминокислот из гидролизатов суммарных белков биомассы микроводоросли Scenedesmus obliquus, состав элюирующих растворителей, время проведения хроматографического анализа и др, были исследованы в работе [144]. При этом, уровни изотопного включения дейтерия в аминокислоты, выделенные из гидролизатов белков Scenedesmus obliquus составили более 98%. Вследствие протекания реакций обратного изотопного (1Н-2Н)-обмена с протонированным растворителем в ходе элюирования [2H]аминокислот с сорбента, протоны в β-положении аспарагиновой кислоты и γ-положении глутаминовой кислоты были обогащены дейтерием на 90%, т. е. ниже, чем для других аминокислот. Подвижные атомы дейтерия в α-положении имидазольного кольца молекулы гистидина и атомы дейтерия при гетероатоме азота в индольном кольце триптофана также легко обменивались на протоны в составе водных растворителей при выделении аминокислот.

[13C]аминокислоты были выделены из гидролизатов суммарных белков биомассы штамма метаногенных бактерий Methanobacterium espanolae при росте бактерий на [1-13C]- и [2-13C]ацетате с уровнями включения 13С в молекулы аминокислот до 90% [145]. Согласно цитируемым там данным, менее 2% случайной метки в молекулах аминокислот были распределены между атомами углерода в позициях, происходящих из 13С карбоксильной или метильной группы ацетата и еще меньший процент включения метки детектировался в положениях углеродного скелета молекул, образованных из 13СО2.

Большой практический интерес представляет реализация преимуществ препаративной обращенно-фазовой высокоэфективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) при получении оптически чистых меченых аминокислот и их N-производных в количествах, необходимых для биоаналитических и синтетических целей [146, 147]. Так, в работе [147] описан метод препаративного выделения индивидуальных аминокислот из различных микробиологических источников с помощью ОФ ВЭЖХ в виде бензилоксикарбонильных производных (N-Cbz производных) аминокислот. Разработанный метод позволяет выделять аминокислоты с высоким выходом (от 67% до 89%) и хроматографической чистотой (96-99%) [147] и может быть использован для выделения [2H]-, [13C]-, [15N] и [18O]аминокислот из белковых гидролизатов различных источников.

ХИМИКО-ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ МЕТОД ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОТОПНОМЕЧЕНЫХ АМИНОКИСЛОТ И БЕЛКОВ.

Другим подходом по получению изотопномеченых аминокислот является химико-ферментативный метод, основанный на комбинации синтетических и ферментативных реакций. Для этого перспективно и экономически оправдано использование препаратов очищенных ферментов и их экстрактов, безклеточных ферментативных систем, а также иммобилизованных ферментов. Ферментативные реакции осуществляют на иммобилизованных ферментах, например, таких как аланиндегидрогеназе (КФ 1.4.1.1) в присутствии NADH при получении [2H]аланина [148], иммобилизованной на сахарозе фенилаланинаммонийлиазе (КФ 4.3.1.5) и фенилаланингидроксилазе (КФ 1.14.16.1), при получении [2H]фенилаланина [149] и [2H]тирозина [150], триптофансинтазе (КФ 4.2.1.20), при получении [2H]триптофана [151], глутаматдегидрогеназе (КФ 1.4.1.2), при получении [2H]глутаминовой кислоты [152], аспартазы (КФ 4.3.1.1), при получении [2Н]аспарагиновой кислоты [153] и серингидроксиметилазе (КФ 2.5.1.6) при получении [2H]серина [154].

Ферментативный метод давно используется для препаративного лабораторного и промышленного получения оптически активных аминокислот, благодаря высокой субстратной специфичности ферментов и возможности селективного введения стабильных изотопов по определённым положениям молекул аминокислот. Основными аспектами использования ферментативных систем являются каталитические реакции ассиметрического образования связи на прохиральных субстратах и ферментативное разделение рацематов аминокислот.

Что касается хроматографического разделения рацематов на прохиральных сорбентах, то оно все же недостаточно эффективно для разделения и обеспечивает в лучшем случае больше половины меченого продукта в виде одного из оптических антиподов. Ферментативная стадия часто завершает химический синтез меченых аналогов аминокислот, причем использование для этих целей интактных клеток или их экстрактов так же эффективно, как использование очищенных ферментов. Однако, субстратная специфичность ферментов, их ограниченная доступность, сложность их выделения и очистки ограничивают их применение для этих целей. Несмотря на то, что ферментативные синтезы преодолевают все вышеперечисленные проблемы, низкие выхода очищенных ферментов лимитируют использование химико-ферментативных реакций. Так, разработанный ферментативный процесс для получения [15N]аланина включает комплексное использование нескольких специфичных ферментов и меченых субстратов и имеет выход по целевому продукту не более 1 г [155]. С другой стороны, методы генной инженерии открывают возможности для получения большинства ферментных препаратов в препаративных количествах.

Методы получения [15N]аминокислот связаны с использованием [15N]аммонийных или [15N]нитратных солей в качестве источников 15N-метки [156], в то время как ферментативный метод более эффективен для получения прежде всего [15N]аспарагиновой и [15N]глутаминовой кислот за счёт аминирования α-кетопроизводных аминокислот и в тех случаях, когда необходимы высокие уровни включения изотопа 15N в молекулы [157].

Осуществление различных методов включения 15N-метки в молекулы аминокислот связано с использованием методов газовой подпитки 15NН3 [158], иммобилизацией клеток с последующей активацией носителя 15NН4Cl [159], или с оптимизацией концентраций [15N]предшественников аминокислот в ростовых средах [160]. C использованием вышеперечисленных подходов были получены [15N]аспарагиновая кислота и [15N]аланин с уровнями изотопного включения 15N, превышающими 95% [161]. При этом иммобилизованные клетки E. coli были использованы как источник аспартазы, которая катализирует превращение [15N]фумаровой кислоты и [15N]фумарата в [15N]аспарагиновую кислоту, в то время как для получения [15N]аланина из [15N]аспарагиновой кислоты в качестве источника аспартат-4-декарбоксилазы использовали бактерию Pseudomonas decahee. [15N]глутаминовую кислоту получали за счёт процесса ферментации бактерий Brevibacterium lactofermentum с предшественниками аминокислот в присутствии 15NН4ОН [162].

Для включения изотопа 13С в молекулы аминокислот могут применяться аналогичные ферментативные подходы с применением [13С]глюкозы, однако при проведении ферментативной реакции требуются значительные количества высокообогащённой [13C]глюкозы и поэтому даный метод является слишком дорогим для получения [13C]аминокислот. Кроме того, большая часть глюкозы (до 70%) идёт на обеспечение процесса дыхания клетки, поэтому эффективность мечения молекул БАС изотопом углерода за счёт ферментативного окисления [13С]глюкозы невысокая. Так, уровни изотопного обогащения [13C]глутамата, полученного ферментативно с участием [13C]глюкозы, были менее 50% [163].

Перспективны также подходы с использованием комбинации химико-ферментативных и биотехнологических способов получения изотопномеченых аминокислот. В работах [164, 165] сообщается о получении более десятка аналогов триптофана, специфически меченных изотопами 2Н, 13C, 15N по индольному кольцу молекулы. Моно-изотопномеченые производные индолов и их 4, 5 и 7-гидроксипроизводные были ферментативно превращены в меченые аналоги триптофана при помощи генетически сконструированного штамма бактерий E. coli, содержащего рекомбинантную плазмиду с триптофановым (Тrp) опероном, который кодировал ряд ферментов, ответственных за биосинтез этой аминокислоты.

В заключение следует отметить, что несмотря на многочисленность описанных в современной литературе подходов по получению БАС, меченных стабильными изотопами, в настоящее время практически не существует способов, которые позволяют получать аминокислоты и белки, меченные 2Н, 13С, 15N и 18O за счет того или иного универсального подхода, хотя химико-ферментативные методы позволяют использовать одну и ту же химико-биохимическую реакцию для получения меченых аминокислот за счет применения различных меченых низкомолекулярных реагентов (субстратов). Получение аминокислот и белков, высокообогащённых стабильными изотопами удобнее всего проводить с использованием биотехнологических подходов, в то время как селективности включения стабильных изотопов в молекулы БАС можно достичь за счёт применения комбинации синтетических и ферментативных реакций. Выбор метода получения БАС, несущих ту или иную изотопную метку, определяется прежде всего целью исследования.

ИТЕРАТУРА.

1. Smith K., Barua J. M., Watt P. W. // Am. J. Physiol. - 1992. - V. 262. - N 3. - P. 1372-1376.

2. McIntosh L. P., Dahlquist F. W. // Quarterly Reviews of Biophysics. - 1990. - V. 23. - N. 1. - P. 1-38.

3. Harbison G. S., Smith S. O., Pardoen J. A., Mulder P. P. J., Lugtenburg J., Herzfeld R., Mathies R., Griffin R. G. // Biochemistry. - 1984. - V. 23. - P. 2662-2667.

4. Ames J. B., Ros M., Raap J., Lugtenburg J., Mathies R. A. // Biochemistry. - 1992. - V. 31. - P. 5328-5335.

5. Fischer M. R., de Groot H. J. M., Raap J., Winkel C., Hoff A. J., Lugtenburg J. // Biochemistry. - 1992. - V. 31. - P. 11038-11043.

6. Lewis A., Marcus M. A., Ehrenberg B., Crespi H. L. // Proc. Nat. Acad Sci. USA. - 1978. - V. 75. - P. 4642-4646.

7. Fesik S. W., Eaton H. L., Olejniczak E. T., Zuiderweg E. R. P., McIntosh L. P., Dahlquist F. W. // J. Am. Chem. Soc. - 1990. - V. 112. - P. 886-888.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |    Книги по разным темам