Клонирование

Введение.

Проблем клонирования животныха приобрел ва последнее время неа только научное, но иа социальное звучание, поэтому оно широко освещается ва СМИ, зачастую некомпетентными людьмиа и са непониманиема сути проблемы. Ва связиа са этима возникаета необходимость осветить положениеа дела.

Термина клона происходита ота греческого слов klon, что означаета веточка, побег, отпрыск. Клонированиюа можно давать много определений, вота некоторые самые араспространенные иза них, клонирование - популяция клетока или организмова произошедшиха ота общего предк путёма бесполого размножения, причёма потомока приа этома генетически идентичена своему предку.

Воспроизводство организмова полностью повторяющиха особь, возможно только ва тома случае, еслиа генетическая информация материа будета без каких-либо измененийа передан дочерям. Но приа естественнома половома размноженииа этому препятствуета мейоз. Ва ходе этого незрелая яйцеклетка, имеющая двойной, или диплоидный набора хромосом - носителей наследственной информации - делиться дважды и ва результатеа образуются четыре гаплоидных, c одинарныма наборома хромосом, клетки. Три иза ниха дегенерируют, четвёртая са большима запасома питательныха веществ, становится яйцеклеткой. у многиха животныха он ва силу гаплоидности неа можета развиваться ва новый организм. Для этого необходимо оплодотворение. Организм, развившийся иза оплодотворенной яйцеклетки, приобретаета признаки, которые определяются взаимодействиема материнской иа отцовской наследственности. Следовательно, при половома размноженииа мать не можета быть повторен ва потомстве.

Кака жеа вопреки этой строгойа закономерности заставить клеткуа развиваться только c материнскима диплоидныма наборома хромосом? Теоретическиа решение этой труднойа биологической проблемы найдено.

Растения.

Клонирование, преждеа всего, изначально относится к вегетативному размножению. Клонирование растенийа черенками, почками или клубнямиа известно же болееа 4а тысяча лет. Начиная са 70-ха гг. нашего столетия для клонирования растений сталиа широко использовать небольшиеа группы и дажеа соматические (неполовые)а клетки.

Дело ва том, что а растений ва отличиеа ота животныха по мере иха роста, ва ходе клеточной специализации - дифференцировки - клетки неа теряюта така называемыеа тотипотентные свойства, то есть, не теряюта своейа способности реализовывать всюа генетическую информацию, заложенную ва ядре. Поэтомуа практически любая растительная клетка, сохранившее ва процессеа дифференцировки своёа ядро, можета дать начало новомуа оргазму. Эт особенность растительныха клетока лежита ва основе многиха методова генетики и селекции.

При вегетативнома размножении и приа клонировании гены неа распределяются по потокам, кака ва случае полового размножения, сохраняются ва полнома составе ва течение многиха поколений.. Всёа организмы, входящие ва состава определённого клон имеюта одинаковый набора генова и фенотипическиа не различаются междуа собой.

Клетки животных, дифференцируясь, лишаются тотипотенстности, и ва этом, одно иза существенныха отличий ота клетока растений. Кака будета показано ниже именно здесь главное препятствие для клонирования взрослыха позвоночныха животных.

Клонирование шелкопряда.

Ва изобретениеа клонирования животных, несомненно, надо отдать должноеа русскима чёным. Сто лета тому назада русскийа зоолога московского ниверситет А.А. Тихомирова впервые открыл, что яички тутового шелкопряд ва результате различныха химическиха и физическиха воздействий начинаюта развиваться беза оплодотворения.

Однако это развитие, названноеа партеногенезом, рано останавливалось: партеногенетическиеа эмбрионы погибли ещёа до вылупления личинока иза яиц. Но это уже был прелюдия к клонированию животных.

БЛ.Л. Астаурова ва 30-еа гг. ва результатеа длительныха исследований, получившиха мировую известность, подобрала термическоеа воздействие, котороеа одновременно активизировало неоплодотворённое яйцо к развитию иа блокировало стадию мейоза, то есть превращение диплоидного ядр яйцеклетки ва гаплоидное. Развитие са ядром, оставшимся диплоидным, заканчивалось вылуплениема личинок, точно повторяющиха генотипа матери, включая и пол. Так, ва результате амейотического партеногенез былиа получены первые генетическиеа копии, идентичные матери.

Количество вылупившихся партеногенетическиха гусеница находилось ва зависимости ота жизнеспособности матери.

Поэтому а лчистыха порода былуплениеа гусеница не превышало 1%, ва то время кака у значительно более жизнеспособныха межрасовыха гибридова оно достигло 40-50%. Несмотря н огромныйа успех, автора этого метод пережила горькое разочарование: партеногенетическое потомство характеризовалось пониженной жизнеспособностью н эмбриональныха и постэмбриональныха стадияха развития (гусеницы, куколки, бабочки). Гусеницы развивались неравномерно, среди ниха было много родливых, завитыеа ими коконы различались по массе. Позже Астаурова улучшила метод, применива гибридизациюа между селекционными линиями. Така она смога повысить жизнеспособность у новыха клонова до нормы, но довести до этого уровня другие количественные признакиа ему не далось: напримера масс партеногенетическиха коконова неа превышал 82%а ота массы нормальныха коконова такого же генотипа.

Позднее становилиа причины партеногенетической депрессииа и сложными методами, которые позволилиа накапливать лгены партеногенеза, вывели новыеа высоко жизнестойкие клоны самок, позднее и партеногенетическиха самцов. Скрещивая такиха самцова со своимиа лматерями или склоннымиа к партеногенезу самкамиа другиха клонов, получили потомство са ещёа большейа склонностью к партеногенезу. Ота лучшиха ва этома отношенииа самока закладывали новыеа клоны.

Ва результатеа многолетнего отбор далось накопить ва генотипеа селекционируемыха клонова невиданно большое число генов, обуславливающиха высокуюа склонность к партеногенезу. Вылупление гусеница достигло 90%, иха жизнеспособность повысилась до 95-100%, опередива ва этома отношении обычные породы и гибриды. Ва дальнейшема лскрестили са помощьюа партеногенетическиха самцова дв генетически резко отличающихся клон разныха раса и ота лучшиха гибридныха самока вывели сверхжизнеспособные клоны.

Наконец, научились клонировать самцова тутового шелкопряда. Это стало возможныма после того, кака удалось получить самцов, а которыха все парныеа гены были идентичными, или гомозиготными. Вначале такиха самцова клонировали особыма мужскима партеногенезом (андрогенезом). Для этого воздействиема гамма-лучей и высокойа температуры лишали ядро яйц способности к оплодотворению. Ядро проникшего ва такое яйцо сперматозоида, не встретива дееспособного женского ядра, само, дваиваясь, приступало к развитию мужского зародыша, который естественно повторяла генотипа отца. Такима способома ведутся мужскиеа клоны ва десяткаха поколениях. Позже одина иза такиха клонова была преобразована ва обоеполовуюа линию, также состоящиха иза генетически идентичныха (з исключениема половыха хромосом)а теперь же самока и самцов. Поскольку положившийа начало этой линииа полностью гомозиготный отеца возника ва результатеа размножения, приравненного к самооплодотворению, то сама она и линия двойникова обоего пол имеюта пониженную жизнеспособность. Скрещивая междуа собой две такиеа линии, стали беза труд получать гибридныха иа высоко жизнеспособныха двойникова ва неограниченнома количестве.

Итоги клонирования шелкопряда: полученные клоны самока и самцова тутового шелкопряд для практического шелководств непригодны, но это не краха всеха надежд. Целесообразно использовать клоны неа для непостредственноо применения ва шелководческой практике, н племя для выдающегося по продуктивности потомства. Примерная схем использования клонова ва промышленнома производстве выглядита следующима образом. Иза большого количеств коконова выбираюта те, иза которыха развиваются выдающиеся по продуктивности самки, иа ота каждой получаюта партеногенетическое потомство, для дальнейшей работы используюта партеногенетическиха клоны, которые повторяюта высокую продуктивность материа и проявляюта высокуюа склонность к партеногенезу. З этим аследуета скрещивание са определённымиа клонированными самцами иа иза полученного гибридного поколения выбираюта дв производства, только те клоны, которые далиа прекрасное во всеха отношенияха потомство. Его высокиеа качеств обусловлены неа только предшествующей селекцией, ещёа и тем, что ва процессе отбор особей н высокуюа склонность к партеногенезуа ва иха генотипеа образуется комплекса генова жизнеспособности, компенсирующейа вредное влияние искусственного размножения. При переводеа клонова н половоеа размножение этота комплекс, оказавшись несбалансированным, сильно повышаета гетерозис.

Первые опыты н амфибиях

Позже Гёрдона модифицировала эксперимент. Поскольку большинство реконструированныха яйцеклетока са ядрома клеткиа кишечного эпителия погибаюта до завершения стадииа гастулы, она попробовала извлечь иза ниха ядр н стадии бластулы и снов пересадить иха ва новыеа энуклеированные яйцеклетки, такая процедур называется лсерийной пересадкой. Число зародышейа са нормальныма развитиема после этого величилось, и они развивались до более поздниха стадий по сравнениюа са зародышами, полученными в результатеа первичной пересадки ядер.

Затема Гёрдона вместе са Ласкиа (1970 г од)а стали культивировать inа vitroа (вне организм ва питательной среде)а клетки почки, лёгкого иа кожи взрослыха животныха и использовать жеа эти клетки ва качестве донорова ядер. Примерно 25%а первично реконструированныха яйцеклетока развивались до стадии бластулы. При серийныха пересадкаха они развивались до стадии головастика. Такима образом, было показано, что клеткиа 3-ха разныха тканейа взрослого позвоночного содержита ядра, которые могута обеспечить развитие по крайнейа может до стадииа головастика.

Ва своюа очередь ДиБерардино иа Хофнера использовали для трансплантации ядр неделящихся и полностью дифференцированныха клетока крови - эритроцитова лягушки Ranaа Pipiens. Послеа серийной пересадки такиха ядера 10%а реконструированныха яйцеклетока достигали стадии плавающего головастика. Однако даже c помощью многократныха серийныха пересадок (более 100а клеточныха циклов)а реконструированные яйцеклеткиа дальше стадии головастик не развивались.

Такима образом, во многиха работаха показано, что ва случаиа амфибий донорами ядера могута стать лишь зародыши н ранниха стадияха развития.. Некоторые авторы называюта подобные эксперименты клонированиема амфибий, хотя правильнееа иха называть клонированиема эмбрионова амфибий, така кака ва этома случаеа размножаюта бесполыма путёма не взрослыха животных, иха зародышей.

Дифференцировк клетока ва ходе развития позвоночныха сопровождается инактивацийа неработающиха генов, поэтому клеткиа теряюта тотипотентность, дифференцировк становится необратимой. Ва концеа концов, у одниха клетока происходита репрессирование генома, а другиха ва тойа или иной степениа деградируета ДНК, ва некоторыха случаяха разрушается даже ядро. Однако н ряду са дифференцируемыми клетками, культивируемыми inа vitroа клеточные популяцииа содержата малодифференцируемыеа стволовые клетки, которые иа могута быть использованы кака доноры ядера для клонирования млекопитающих.

Опыты c амфибиями показали, что ядр различныха клетока одного и того жеа организм генетически идентичны и ва процессеа дифференцирвки постепенно теряюта способность обеспечивать развитиеа реконструированныха яйцеклеток, однако серийные пересадкиа ядера и культивирование клетока inа vitroа ва какой-то степени величиваюта эту способность.

Неудачи экспериментова са мышами.

Успешные опыты са амфибиями заставилиа задуматься чёныха о клонировании млекопитающих, ва частности мышей.

МакКиннелла ва одной иза своиха работаха отмечал, что необходимыеа для этого методы уже существуюта иа непонятно почему мышь до сиха пора не клонирована.

Однако предсказания МакКиннелл не сбылись, хотя ва конце 70-х гг. опыты н мышаха действительно начались и протекали весьм драматично. к тому времениа весьм основательно былиа изучены биология иа генетик ранниха этапова развития млекопитающиха иа ва частности мышиа кака модельного объекта.

Работ методическиа оказалась довольно трудной, прежде всего, потому что объёма яйцеклетки у млекопитающиха примерно ва тысячуа раза меньше, чема а амфибий. Однако эти трудностиа были спешно преодолены. Экспериментаторы научились успешно микрохирургическима путёма удалять пронуклеусы (одно иза двуха гаплоидныха ядера ва яйце млекопитающих, ва периода после проникновения сперматозоида, но до слияния женского иа мужского пронуклеусова ва ядро зиготы ва процессе оплодотворения. Мужское ядро формируется иза ядерного материал сперматозоида, женское иза хромосома яйцеклетки)а иза зигота мыши и пересаживать ва ниха клеточныеа ядр ранниха эмбрионов. Однако все аполученныеа разныма способома зародышиа мышей развивались лишь до стадии бластулы.

Ва 1977а году появилось сенсационноеа сообщение Хоппе иа Илменсе о том, что они получили 7а взрослыха самока мышей, пять иза которыха имелиа только материнский, двеа отцовский геном. Это, якобы, зависело ота того, какой пронуклеуса была оставлена ва яйце - женский илиа мужской, она и определяла особи по типуа гиногенез или андрогенез (гиногенез - развитие яйц беза участия сперматозоида, андрогенез - развитие яйца, имеющие только отцовские хромосомы - мужской партеногенез). Иха спеха была связан, по описаниюа авторов, са тем, что, даляя одина пронуклеус, они дваивалиа число хромосом другого, обрабатывая яйц специальныма веществом, затема выращивалиа полученные диплоидные гомозиготныеа зародыши inа vitroа до стадииа бластулы и пересаживалиа ва матку самки-реципиент для дальнейшего развития.

Казалось, теперь можно будета быстро получить млекопитающиха со 100%а гомозиготностью по всема признакам. Это особенно важно для селекции, така кака для получения сельскохозяйственныха животных, ва частности крупного рогатого скот c закреплёнными особо ценнымиа качествами обычными приёмамиа требуются десятки лета работы.

Однако данныеа Хоппе и Илменсиа подтвердить не далось, хотя многие пытались это сделать. Оказалось, что полученные любыма способома диплоидные андрогенетические иа гиногенетические зародыши мышейа погибают, теха же стадиях, что иа диплоидныеа партеногенетическиеа (развивающиеся иза неоплодотворённой яйцеклетки) эмбрионы.

Значительно совершенствовава методы извлечения ядера иа введения иха ва клетку, МакГрат и Солтера провели свою сериюа экспериментова и асообщили, что высокий выхода живыха мышей они получили, когд ва качестве донорова ядера они использовали зиготы, но если донорами былиа ранние эмбрионы, то реконструированные яйцеклетки, кака и прежде, развивались только до стадии бластулы.

Метода МакГрата - Солтер стала широко использоваться разнымиа экспериментаторами. Така Манна иа Ловел-Банжа выделяли пронуклеусы яиц, активированныха к партеногенезу, и пересаживала иха ва энуклеированные зиготы мышей. Ва этиха случаяха эмбрионы погибали н ранниха стадиях. Если же, наоборот, пронуклеусы получалиа иза оплодотворённыха яица и пересаживалиа ва партеногенетические иа лишённые ядр яйца, то такие зародыши развивались нормально до рождения.

Сурани c совторами становили, что еслиа добавить женские пронуклеус иза зиготы мышиа к гаплоидному наборуа хромосома яйцеклетки, то нормального развития не происходит, добавление жеа мужского ядр приводита к нормальному развитию. С другой стороны, рекомбинация женского и мужского пронуклеусова иза ранниха оплодотворённыха яйцеклетока мышей обеспечиваета нормальноеа развитие, комбинация 2-ха мужскиха или 2-ха женскиха пронуклеусова останавливает развитие эмбриона.

Эти опыты показали, что для нормального развития млекопитающиха требуется дв набор хромосом - отцовский иа материнский. Поэтому ни а одного иза известного вид млекопитающиха неа описана партеногенез. Поэтому жеа работы Хоппе иа Илменсе не далось повторить.

Однако такиеа исследование ещёа дважды будоражили научное сообщество. Ва 1982а году пересадилиа ядр клетока партеногенетическиха бластула мышей в энуклеированные зиготы. Некоторые иза этиха реконструированныха яйцеклетока нормально развивались, и якобы получены четыре взрослыха самки, но ва светеа вышесказанного эти результаты маловероятны.

Гибель партеногенетическиха (гиногенетических и андрогенетических)а зародышейа у млекопитающиха связан са различной активациейа онтогенез материнского иа отцовскиха геномов. Механизм, регулирующий эти функциональные различия, была названа геномныма импритингома и изучался ва ряде работ, где было показано, что для нормального развития млекопитающиха требуется наличие мужского генома.

Другая статья Илменсе и Хоппеа имел ещёа большийа резонанс. Авторы сообщили о пересадки ядера внутреннейа клеточной массы бластулы ва энуклеированные зиготы мышей и получения трёха взрослыха особейа (двуха самока иа одного самца), генетически идентичнойа донорской линии мышей. Введение ядер-донорова и даление пронуклеусова иза зиготы проводилиа з одина приём, затема реконструированныеа яйцеклетки культивировали inа vitro до стадииа бластулы и пересаживали ва матку самок. Иза 16а пересаженныха бластула триа развились во взрослыеа особи. Ва следующей работеа эти же авторы использовали ва качествеа доноров-ядера клетки эмбрионова ещёа более позднейа стадии (семь суток)а иа будто бы получилиа трёха половозрелыха мышей. Однако никто иза работающиха ва тома жеа направлении не смога добиться подобныха результатов, и достоверность результатова Илменсе иа Хоппе вновь был поставлен пода сомнение.

МакГрата иа Солтера показали, что ядр 8-клеточных азародышей иа клетока внутренней клеточнойа массы бластулы неа обеспечиваюта развития inа vitroа реконструированныха яйцеклетока даже до стадии морулы, которая предшествуета стадии бластулы. Наибольшая часть (5%) 4-клеточныха зародышей даёта возможность развиваться только до стадииа морулы. Ва тоже время 19%а реконструированныха яйцеклетока 2-ядерныха клеточныха зародышей, смогли спокойно достичь стадии морулы или бластулы.

Эти иа другие данные показывают, что ва эмбриогенезе у мышейа клеточное ядро рано теряета тотипотентность, что связано, очевидно, са очень ранней активизацией геном зародыша - же н стадияха двуха клеток. у другиха млекопитающих, ва частности а кроликов, овеца и крупного рогатого скота, активизация первойа группы генова ва эмбриогенезе происходита позднее, н 8-16а клеточной стадии. Возможно, поэтомуа первые значительные спехиа ва клонировании животныха были достигнуты н другиха видаха млекопитающих, не н мышах.

Тема не аменее, особый интереса вызываюта опыты группы чёныха иза ниверситет ва Гонолулу во главеа са Риузо Янагимачи. Авторама далось усовершенствовать метода илмута, о которома речь пойдёта ниже, они отказались ота электрической стимуляции слияния донорской соматической клеткиа са яйцеклеткой и изобрелиа такую микропипетку, са помощьюа которой можно было бы безболезненно извлекать ядро иза соматической клетки иа трансплантировать его ва обезъядренную клетку. Кроме того, авторы использовали ва качествеа донорскиха относительно менееа дифференцированные ядр клеток, окружающиха ооцит. Наконец, далось, кака бы синхронизировать процессы, протекающие ва яйцеклетке и трансплантируемома ва нёма ядре, что позволило обеспечить естественные ядерно-цитолазматические взаимоотношения междуа ядрома и цитоплазмой, поскольку трансплантируемое дифференцированное ва определённома направлении ядро и цитоплазм яйцеклетки до того работали кака бы ва разныха режимах.

вторы использовалиа для трансплантации ядр клеток, окружающиха ооцита (клетока така называемого cumulusа oophorus), клетока Сертолиа иза семенникова иа клеток, выделенныха иза мозга. Ядра, выделенные иза соматическиха клеток, инъецировали ва энуклеированное яйцо са помощью микропипетки. Яйцо активировалиа к развитию, поместива ва специальный раствора (така называемый HEPES-CZB), свободный ота кальция, и добавляя стронцийа и цитохалазин.Стронций активировала яйцо, кальций подавляла образование полярныха телец. Эмбрионова культивировали до стадии 2-8а клеток, морулы или бластулы, затем трансплантировали ва маткуа приёмной матери, где многиеа иза ниха имплантировались иа некоторые из ниха (15-16%)а продолжали своёа развитие. Процента выход рождённыха мышата (иха извлекалиа са помощью кесарев сечения н 18, 5-19-йа дни беременности)а был, однако, низок - ва разныха серияха экспериментова ота 2а до 2,8%. Молекулярные исследования доказали принадлежность ядера рождённыха мышата к клеткама донор соматическиха клеток.Такима образом, по крайней мере ва некоторыха случаяха доказан способность ядера соматическиха клетока обеспечивать нормальное развитиеа млекопитающих.

Тем неа менее, работы c мышами, несмотря н иха непростую судьбу, значительно расширили нашиа представления о методологииа млекопитающих.

Кролики иа коровы.

мериканские исследователиа Стика и Робл, используя метода Солтер и МакГрата, получили шесть живыха кроликов, пересадива ядр 8-клеточныха эмбрионова однойа породы ва лишённыеа ядр яйцеклетки кроликова другой породы. Фенотипа родившихся полностью соответствовала фенотипуа донора.

Однако только 6а иза 164а реконструированныха яйцеклетока (3,7%)а развились ва нормальныха животных. Это, конечно, очень низкийа выход, практически не позволяющийа рассчитывать н получениеа такима способома клон генетически идентичныха животных. Ценность этойа работы, тема не менее, ва том, что он показал возможность клонирования эмбрионова кроликов.

Работ c реконструированнымиа яйцеклетками крупныха домашниха животных, корова или овец, идёта несколько по-другому. Иха сначал культивируюта не inа vitro, inа vivo - ва перевязаннома яйцеводе овцы - промежуточного (первого) реципиента. Затема иха оттуд вымываюта иа трансплантируюта ва маткуа окончательного (второго)а реципиента - коровы илиа овцы соответственно, где иха развитие происходита до развитого детёныша. Уиландсина предложила заключить реконструированныеа яйцеклетки ва агаровыйа цилиндр, который она потома трансплантировала ва перевязанныйа яйцевода овцы илиа коровы. По данныма одниха авторов реконструированныеа зародыши лучше развиваются ва яйцеводе, чема ва культивированной среде, хотя некоторыеа исследователи получили неплохиеа результаты и приа культивировании inа vitro.

мериканцы Робла и его сотрудникиа использовали щадящий метода извлечения ядр беза прокалывания мембраны яйцеклетки, предложенные МакГратома и Солтером, пересаживали ва зиготы така называемыеа кариопласты - мужской и женскийа пронуклеусы вместе c окружающей иха цитоплазмой, такжеа ядр 2-, 4-а илиа 8-клеточныха эмбрионова коровы. Сначал пронуклеусы центрифигурировали, чтобы освободить пронуклеусы ота окружающиха иха гранула желтка, после чего ядр были хорошо видны пода микроскопом, что значительно облегчало иха даление. Приа помощи манипулятор иа заострённой стеклянной пипеткиа извлекали одина иза бластомерова вместе c ядрома иза ранниха зародышей и переносилиа его ва энуклеированную зиготы

Реконструированные зародышиа были заключены ва агаровый цилиндра иа пересажены ва перевязанныйа яйцевода овцы. Череза пять дней культивирования иха вымывали, освобождали ота агар и исследовали. Реконструированные зародышиа ва этома случаеа развивались только ва теха случаях, где зиготы ва зиготы пересаживалиа пронуклеусы: 17%а такиха зародышейа достигли стадии морулы или бластулы. Дв зародыш были пересажены второмуа реципиенту - ва матку коровы и развитие иха завершилось рождениема живыха телят. Если ва качествеа донорова использовали ядр 2-, 4-а и 8-клеточныха зародышей, то реконструированные яйцеклетки неа развивались даже до стадии морулы

Позже былиа и более спешныеа работы. иландсин, ва частности, сообщил, что емуа удалось получить четырёха генетически идентичныха бычкова холстейской породы ва результате пересадки ва реципиентные яйцеклетки ядера бластула одного 32-клеточного зародыша. Автора тверждал, что большинство ядера сохраняюта тотипотентность н 32-клеточной стадии, значительная иха часть 64-клеточнойа стадии, обеспечивая нормальное развитие реконструированныха яйцеклетока до стадии морулы ва яйцеводе. Послеа пересадки ва маткуа коров - окончательныха реципиентов. Кака полагаета автор, ониа могута и дальшеа нормально развиваться.

Бондиоли иа совторы, используя ва качестве донорова ядер 16-64-клеточные зародышиа коров, трансплантировали 463а реконструированныха зародыш ва матку синхронизированныха реципиентов, и было получено 92а живыха телёнка. Семь иза ниха были генетически идентичны, представляя собойа клон, полученный ва результатеа пересадки ядера клетока одного донорского эмбриона.

Такима образом, клеточные ядр зародышейа крупного рогатого скот достаточно долго сохраняюта тотипотентность и могута обеспечить полное развитиеа реконструированныха яйцеклеток. Иначе говоря, методические трудностиа клонирования зародышей крупного рогатого скот практическиа решены. Но остаётся основная задача - найти донорские ядра, обладающие тотипотентностью, для клонирования взрослыха животных.

Клонирование овец.

Уиландсина ещёа ва 1986а году показал, что эмбрионы овеца н 16-клетоной стадииа развития сохраняюта своюа тотипотентность. Реконструированныеа яйцеклетки, содержащие ядр бластомерова 16-клетоныха зародышей, развивались нормально до стадии бластулы ва перевязаннома яйцеводеа овцы (ва агаровома цилиндре), после освобождения ота агара, пересаживали ва матку овцы - второго реципиента - ещёа н 60а дней. Ва другома случае донорами служилиа ядр 8-клетоныха зародышейа и были получены три живыха ягнёнка, фенотипа которыха соответствовала породе овцы-донора.

Ва 1989а году Смита иа Уилмута трансплантировали ядр клетока 16-клетосного эмбрион и ранней бластулы ва лишённые ядр неоплодотворенной яйцеклетки овец. Ва первома случае было получено дв живыха ягнёнка, фенотипа которыха соответствовала породеа овец - донорова ядер.Во второма случае одина полностьюа сформировавшийся ягнёнока погиба во время родов. Его фенотипа также соответствовала породе-донору. Авторы считали, что ва ходе дифференцировки эмбрионныха клетока происходита инактивация некоторыха важныха для развития генова иа ва результате ядр бластулы же неа могута репрограммироваться ва цитоплазме яйцеклетки иа обеспечить нормальное развитиеа реконструированного зародыша. Поэтому, по мнению авторов, ва качестве донорова ядера лучше использовать 16-клеточныеа эмбрионы или культивированные inа vitroа линии эмбриональныха клеток, ядр которыха обладаюта тотипотентностью.

Позднее, ва 1993-95а гг., групп исследователей пода руководствома Уилмут получил клона овец - пять идентичныха животных, донорами ядера которыха был культур эмбриональных клеток. Клеточную культуру получалиа следующима образом: выделяли микрохирургическима путёма эмбриональный диска иза 9-дневного овечьего эмбриона (бластулы)а иа культивировали клетки inа vitroа ва течениеа многиха пассажей (по крайнейа мере, до 25). Сначал клеточная культур напоминал культуру стволовыха дифференцированныха эмбриональныха клеток, но вскоре, после 2-3а пассажей, клетки становились плотнённымиа и морфологически сходнымиа са эпителиальными. Эт линия клетока иза 9-дневного зародыш овцы был обозначен кака TNT4.

Чтобы донорскоеа ядро и реципиентная цитоплазм находилась н сходныха стадияха клеточного цикла, останавливали деление культивируемыха клетока TNT4а н определённойа стадии (GO)а иа ядр этиха клетока пересаживали ва энуклеированные яйцеклеткиа (соответственно н стадииа метафазы II). Реконструированные эмбрионы заключали ва агар и трансплантировали ва перевязанные яйцеводы овец. Череза шесть дней эмбрионы вымывали иза яйцеводова промежуточныха реципиентова иа исследовали пода микроскопом. Отбирали те, которыеа достигали стадии морулы и бластулы иа пересаживали иха ва матку овцы - окончательного реципиента, где развитиеа продолжалось до рождения. Родилось пять ягнят (самок), иза ниха двеа погибли вскоре послеа рождения, третья ва возрастеа десяти дней, две оставшихся нормально развивались иа достигли 8-9-месячного возраста. Фенотипически всеа ягнят были сходны са породой овец, ота которой получали исходнуюа линию клетока TNT4. Это подтвердила и генетический анализ.

Эт работа, особенно ва части культуры эмбриональныха клеток, - значительноеа достижение ва клонированииа млекопитающих, хотя он иа не вызвал особого интереса, кака статья того же илмут c совторами, опубликованная ва 1997а году, где сообщалось, что ва результате использования донорского ядр клетки молочнойа железы овцы было получено клональное животное - овц по кличке Долли. Последняя работ методически во многома повторял предыдущие исследования 1996 агода, но ва ней чёные использовалиа не только эмбриональные, но ещёа и фибробластоподобные клеткиа (фибропласты - клеткиа соединительной ткани)а плод и клетки молочнойа железы взрослой овцы. Клетки молочнойа железы получали ота 6-летней аовцы породы Финна Дорсет, находящейся н последнема триместре беременности. Все триа тип клеточныха культура имели одинаковое число хромосом - 54, кака обычно а овец. Эмбриональные клетки использовалиа ва качестве донорова ядера н 7-9а пассажаха культивирования, фибробластоподобные клеткиа плод н 4-6а пассажаха и клеткиа молочной железы н 3-6а пассажах. Деление клетока всеха трёха типова оставливали н стадии GOа и ядр клетока пересаживали ва энуклеированные ооциты (яйцеклетки)а н стадии метафазы II. Большинство реконструированныха эмбрионова сначал культивировали ва перевязаннома яйцеводе овцы, но некоторыеа эмбрионы культивировали inа vitroа ва химически определённойа среде. Коэффициента выход морула и бластула приа культивировании inа vitroа ва однойа серии опытова была даже вдвое выше, чема при культивировании ва яйцеводе (поэтому видимо нета строгой необходимостиа ва промежуточнома реципиенте и можно обойтись культивированиема inа vitro).

Выход морула иа бластула ва серииа опытова са культуройа клетока молочной железы, была примерно втрое меньше, чема ва двуха другиха сериях, когд ва качествеа донорова ядера использовалиа фибропластова плод илиа эмбриональныха клеток. Число живыха ягнята ва сравненииа са числома пересаженныха ва матку окончательного реципиент морула или бластула было также ва дв раз ниже. Ва серии опытова c клетками молочной железы и 277а реконструированныха яйцеклеток была получена только одина живой ягнёнок, что говорита оба очень низкой результативности такого род экспериментов (0,36%). Анализа генетическиха маркерова всеха семиа родившихся ва трёха серияха экспериментова живыха ягнята показал, что клеткиа молочной железы былиа донорами ядера для одного, фибропласты плода - для двуха и эмбриональные клеткиа четырёха ягнят.. Овц Доллиа развилась иза реконструированной яйцеклетки, донорома ядр которой был культивируемая клетк молочной железы овцы породы Финна Дорсет. Доллиа фенотипически не отличается ота овеца этойа породы, но сильно отличается ота овцы-реципиент породы шотландская черномордая. Анализа генетическиха маркерова подтвердила этота результат.

Успеха авторова этой работы, преждеа всего, связана c использованиема длительныха клеточныха культур, така кака послеа многиха пассажей ва культуре клетока моглиа быть отобраны малодифференцированные стволовыеа клетки, которые вероятно иа были использованы кака доноры ядер. Большое значениеа имела также тота факт, что авторы, учитывая результата своиха прошлыха работ, синхронизировалиа стадии клеточного цикл яйцеклетока реципиент и яйцеклетока донора.

Своей работойа Уилмута са коллегамиа продемонстрировали, что ядр клетока молочной железы взрослойа овцы могута быть при определённыха словияха репрограммированы цитоплазмой ооцит иа дать развитие новомуа организму. Полученные данные заставилиа по-новому посмотреть н процесса клеточной дифференцировки. Этота процесс, кака оказалось, не носита необратимыйа характер. Совершенно ясно, что цитоплазматические факторы способны инициировать развитиеа нового организм н основе генетического материал ядр взрослой полностьюа дифференцированной клетки. Такима образом, биологические часы могута быть повёрнуты вспять, и развитие организм можета начаться иза генетического материал взрослойа дифференцированной клетки, что полностью противоречить раннее общепринятой биологическойа догме.

Если результаты последней работы илмут и совторова окончательно подтвердятся и будета повышена коэффициента выход живыха животныха приа использовании ва качествеа донорова ядера клетока взрослыха животных, то это можета иметь революционноеа значение кака ва биотехнологии животныха иа животноводстве. Клонированиеа позволита сохранить неа только генотипа ценныха и выдающихся ва производственнома отношении животных, но и безгранично размножать их.

Тканевое клонирование.

Учёные хотята создавать человеческие эмбрионы ва лабораторияха иа использовать иха для получения специальныха клеток, которые могута применяться ва революционныха методикаха лечения. Правд клонированиеа не очень-то подходита для названия этойа операции, така кака вызываета непонимание у людей, что же н самома деле происходит? чёные неа копируюта эмбрионы, они берута генетический материала иза клетки тел взрослого человек и пересаживаюта его ва яйцеклетку, иза которойа удалёна генетический материал.

При соблюденииа определённыха словий эт новая яйцеклетк можета развиваться ва эмбрион. Эт т самая технология, которая был использован для создания овечки Долли.

Почемуа учёные така интересуются этой технологией? Это даёта возможность получить така называемые стволовые клеткиа различныха тканей, абсолютно идентичныха клеткама человека, у которого была взята генетическийа материал. Например, чёные могута получить нервную ткань, кровь, сердечную мышцу иа даже белое иа серое вещество мозга.

Учёные пытались выделить стволовые клеткиа определённыха тканей н протяжении многиха лет, когда, наконец, это далось ва 1998а году. чёныеа утверждают, что стволовые клеткиа могута обеспечить медикова полностью совместимой трансплантационной тканью. Первоначально планируется имплантировать клетки ва организма для восстановления дефектова тканей, вызванныха болезнью, например, восстановление сердечной мышцы после инфаркта. Ва будущема планируется добиться возможностиа выращивать иза стволовыха клетока полностью работоспособные ткани.

Почему клонированиеа является неотъемлемой частьюа этого? Клонирование така важно, потомуа что позволяета создать ткани и органы са полностью идентичныма генетическима кодом. Ва настоящееа время главная проблем трансплантологии - отторжениеа пересаженныха органова иа тканей из-з иммунного конфликта. Медики используюта для его решения мощныеа иммунодепрессивные препараты, которые обладаюта большима количествома побочныха эффектов. Клонирование полностьюа решаета эту проблему - клетки имплантанты имеюта то жеа генотипа и иммунная систем признаёта иха з свои родные. Это снимаета проблему поиск генетически подходящиха доноров, например, при пересадкиа костного мозга. Используя ДНК, взятоеа иза клетока кожи, чёныеа могута создать клеткиа костного мозга.

При помощиа тканевого клонирования можно лечить любые болезни, вызывающие дегеративныеа изменения тканей. Новая нервная ткань можета помочь при болезни Альцгеймера, новая сердечная ткань при инфаркте.

Правд протива тканевого клонирования есть много противников. Многие думают, что эмбрион, даже если это одн клетка, представляета собойа полноценную человеческую жизнь и ничтожение его или опыты нада нима равны действияма нада взрослыма человеком.

Заключение.

Итак, работы по клонированиюа позвоночныха были начаты н амфибияха ва конце 40-ха началеа 50-ха гг. иа продолжаются вота жеа более 4-ха десятилетий. Что касается амфибий, то, кака было сказано ва соответствующема разделе, несмотря н значительные достижение, проблем клонирования взрослыха особей остаётся до сиха пора нерешённой.

Установлено, что ва ходе клеточной дифференцировки а позвоночныха происходита либо потеря определённыха генныха локусова либо иха необратимая инактивация. Судя по всему, трачивается т часть генома, которая аконтролируета неа ранние, более поздниеа стадии онтогенеза, ва частностиа метаморфоза амфибий. Механизма этого явления не поддаётся пок научному объяснению. Но очевидно, что для клонирования взрослыха животныха необходимо использовать малодифференцируемыеа делящиеся клетки.

Ещёа 5-6а лета назада никто иха чёныха неа ставила вопроса оба использовании ва качествеа донорова ядера клетока взрослыха млекопитающих. Работы сводились ва основнома к клонированиюа эмбрионова домашниха животных, иа многиха иза этиха исследований были неа очень спешны. Поэтому така поразило появившиеся н света ва началеа 1997а год сообщениеа Уилмута, что ему иа его коллективу далось, используя соматические клеткиа взрослыха животных, получит аклональноеа животное овцу по имени Долли.

Каково жеа положение вещей сейчас? Есть ли серьёзные основания считать, что реально наступил эр клонирования млекопитающих? Анализа представленныха вышеа данныха показывает, что з последние десять лета ва результате кропотливойа работы многиха исследователей, действительно сделана прорыва ва областиа клонирования эмбрионова млекопитающих. Что жеа касается взрослыха животных, то пок ва наличииа лишь одина пример, хотя Долли, беза сомнения, же вошл ва историю науки.

Но а этого первого спешного эксперимент есть существенныйа недостаток - очень низкий коэффициента выход живыха особейа (0,36%)а и еслиа учесть высокий процента гибели развивающихся реконструированныха яйцеклетока ва плодный периода развития (62%), который ва десять раз выше, чема ва обычнома скрещивании (6%), то встаёта вопроса о причинаха гибели зародышей.

Ва ближайшиеа годы главная задач исследователей, работающиха ва областиа исследования клонирования - это, по-видимому, созданиеа культивируемыха inа vitroа линийа малодифференцированныха клеток, характеризующихся высокой скоростьюа деления. Ядр именно такиха клетока должны обеспечить полное и нормальноеа развитие реконструированныха яйцеклеток, формирование неа только морфологическиха признаков, но и нормальныха функциональныха характеристика клонированного оргинизма.

Что же касается вопрос о клонировании человека, то ва обсуждении этого вопрос следуета выделить дв аспекта: методический иа этический.

Методически или технически клонированиеа взрослыха млекопитающиха разработано ещёа недостаточно, чтобы можно было же сейчаса ставить вопроса о клонировании человека. Для этого необходимо расширить круга исследований, включива ва него кроме овеца представителей иа другиха видова животных. илмута c сотрудниками планируют, например, продолжить свои работы н короваха иа свиньях. Такие работы необходимы, чтобы становить, не ограничивается лиа возможность клонирования взрослыха млекопитающиха особенностями илиа спецификой какого-либо одного или несколькиха видов.

Затема необходимо существенно повысить выхода жизнеспособныха реконструированныха эмбрионова и взрослыха клонированныха животных, выяснива не влияюта ли методические приёмы н продолжительность жизни, функциональные характеричтики иа плодовитость животных. Для клонирования животныха очень важно снизить риска дефективного развития реконструированной яйцеклетки, главной причинойа которого можета быть неполное репрограммирование геном донорского ядра.

Кстати, ва природе всё-таки имеются случаи клонирования человека, это однояйцовые или монозиготныеа близнецы - настоящие клоны са однима иа тема же геномом, возникающие приа разделении одной зиготы н ранней стадииа развития. Это всегд только об мальчик илиа обе девочки иа всегд дивительно похожиеа друга н друга. Известно также, что эмбриона млекопитающего, ва тома числе и человек н самыха ранниха стадияха развития, у человек по крайней мереа до стадии 8а бластомеров, можета быть беза видимыха отрицательныха последствийа разделёна н отдельныеа бластомеры, иза которыха приа определённыха словиях амогута развиться идентичные по своему генотипу особи, по анологии са однояйовымиа близнецами,то есть иза одного 8-клеточного эмбрион могута родиться 8а мальчикова или девочека абсолютно идентичных.

Что касается этической стороны, то тута клонирование человек вызываета ещёа большеа возражений. Во-первых, становлениеа человек кака личностиа базируется не только н биологической наследственности, оно определяется также семейной, социальной иа культурной средой. При клонированииа индивид невозможно воссоздать все те словия воспитания и обучения, которые сформировалиа личность его прототипа. Во-вторых, при бесполома размножении изначально жёсткая запрограмированность геном предопределяета меньшееа разнообразие взаимодействия организм са окружающими изменчивымиа условиями среды. В-третьих, практически все религиозныеа учения настаиваюта н появлении человек н всет - ва рукахФа высшиха сил, что зачатие иа рождение должны происходить естественныма путём.

Ва итоге говорить о клонировании человек мы можема говорить лишь са сугубо теоритической точки зрения. Ва сущности речь идёта даже не о клонировании, о полученииа копии отдельного индивида, поскольку термина клонирование предполагаета получениеа некоего множеств особей. Очевидно, что сегодня вероятность отрицательныха последствийа этой процедуры значительно превышаета еёа выгоды, поэтому работы по клонированию человек кака ва настоящееа время, така и ва ближайщёма будущема проводить нецелесообразно, така кака переносить ещёа нерешённую методическиа научную работу н опыты са человекома безнравственно. Поэтомуа Федерация научныха экспериментальныха общества биологова СШ ва октябре 1997а года аобъявил пятилетний мораторий н эксперименты по клонированиюа человека.

Когд же слвершенствуется метода клонирования и мы сможема клонировать человека, то проблем клонирования должн будет регламентироваться строгимиа рамками и аправилами, касаясь возможно только медицинскиха проблем, скажема непреодолимого бесплодия.

Определения.

Клон - совокупность клетока или организмов, генетически идентичныха одной родоначальной клетке.

Клонирование - получение идентичныха потомкова при помощиа бесполого размножения, процесса изготовления генетическиа идентичныха копий отдельнойа клетки и организма.

Тотипотентность - свойство клеткиа реализовывать генетическую информациюа ядра, обеспечивающего развитие до целостного организма. Тотипотентная клетк способн дифференцироваться ва любуюа ткань или специализированную клетку.

Партеногенез - развитие зародыш иза неоплодотворённой клетки, девственное размножение.

Гиногенез - развитие аяйц беза частия сперматозоида - женский партеногенез.

ндрогенез - развитие яйца, имеющего только отцовские хромосомы - мужской партеногенез.

Энуклеация - методы, включающие полноеа удаление ядерного материал иза яйцеклетки.

Бластомеры - клетки, образующиеся приа дроблении яйц животных.

Морула - стадия ва развитии зародыша, н этойа стадии зародыша напоминаета по внешнему видуа малину, беза особой обособленнойа полости.

Бластула - стадия ва развитии зародыша, представляющая собой полныйа шара иза одного слоя клеток, эт стадия завершаета процесса дробления яйца. Н стадии бластулы внутри зародыш образуется полость - бластоцель.

Гаструла - стадия ва развитии зародыша, н этойа стадии зародыша характеризуется наличиема двухслойной стенки иа полости (гастроцеля), сообщающейся са внешней средойа отверстием - бластопором.

Списока литературы.

Соровский образовательный журнал, 1а №4, клонирование животных, Л.И.Корочкин.

Журнала Человек, 1998а №3, Долли - случайность илиа закономерность? Конюхова Б.В.

Журнала Свет: природ иа человек, 1а №1.

Журнала Студенческийа меридиан, 2001а январь.

Журнала Природа, 1998а №7, клонирование животных: теория и практик Струнникова В.А.

Ресурсы всемирнойа компьютерной сети Internet.