Серологические реакции

 СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ

СЕРОЛОГИЯ - раздел иммунологии, изучающий взаимодействие АГ

и АТ в пробирочных реакциях (in vitro).

Серологические реакции - реакции с использованием АГ или АТ

(проводящиеся in vitro).

Серологическими методами (в диагностике инфекционных заболе-

ваний) называют совокупность пробирочных реакций, основанных на

Г-АТ-взаимодействии. /2640к/99/

1) Направленны на выявление в сыворотке крови и другиха жид-

костях организма АТ к АГ возбудителей инфекционных болезней.

2) Проброчные реакции, имеющие целью обнаружение в сыворотке

крови и другиха субстратаха растворимыха микробных АГ с помощью

стандартных иммунных сывороток.

Серологические реакции проводятся с использованием

1) АГ для поиска АТ

2) АТ для поиска АГ

 4+ 0 /?/ 4 IN VIVO (кожные пробы, РН in vivo...)

 4- серопрофилактика (введение АГ, АТ)

 В серологчиеские методы не входят реакции, которые ставят на

 4людях или животных (реакция Шика, Дика), и серологическая иден-

 4тификация культур микроорганизмов (это один из этапова бактерио-

 4логического метода.

КЛАССИФИКАЦИЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

1. Двухкомпонентные

- простые (РА,РП)

-- розеточные тесты (РОК)

-- цитофлюоресцентные методы

- сложные (РН /гемадсорбции, токсина,...,РТГА,РНГА, ре-

кция прямой имунофлюоресценции, реакции адгезии).

Реакции адгезии отличаются взаимодействием частиц, например,

клетки, с серологически активной поверхностью, в т.ч. с другой

клеткой. /2260к/

2. Трехкомпонентные

- простые

-- реакция бактериолиза,

-- реакция когглютинации

- сложные

-- реакция непрямой иммунофлюоресценции,

-- РИА,

-- РЭМА,

-- литические тесты (РСК, определение АОК с помощью

эритроцитарных АГ-ов),

-- использование электронного парамагнитного и ядерно-магнитного резонанса) /7271/87/,

Материал для серологических реакций:

- сыворотк крови (парные сыворотки). Заморозка в течение

10-14 дней.

- ликвор,

- моча,

- фильтрат испражнений,

- промывные воды бронхов, полости рта, глотки, носа /2640к/,

желудка.

- Слизь (шейки матки,... - здесь АТ порой больше, чем вы сы-

воротке)

чет серологических реакций осуществляется видуально, иногда

с помощью лупы и редко - микроскопа. /2640к/99/

При оценке серологических реакций применяют 3 главных крите-

рия /2640к/99/:

- наличие и интенсивность реакции (в плюсах и др.),

- диагностический титр, заранее отработанный для всех забо-

леваний,

- нарастание титра АТ в течение болезни в 4 и более раза.

В процессе оценки серологических реакций часто возникает не-

обходимость дифференцировки

1) специфической реакции (на видовые и типовые антигены) от

группоспецифической (на межвидовые АГ)а [Группоспец. АГ

Salm. - табл.]

 4-- дифференцировка по моноспецифическим антисывороткам,

 4-- по скорости нарастания титра АТ, которая выше к специ 4фическим АГ, 0

 4-- по реакции адсорбции АТ избытком антигена

 4-- по легкости диссоциации ИК под влиянием диссоцирующих

 4факторов 0

2) ИО на текущую инфекцию от ИО на перенесенное ранее заболе-

вание и иммунизацию. /2640к/99/

 5-- Оценивают по темпу нарастания АТ.

При постановке любой серологическойа реакцииа параллельно с

опытом ставятся  _контроли на каждый компонент реакции .:

- микробная культура не должна образовывать хлопья при ана-

логичном встряхивании;

- сыворотк и антисыворотк неа должны быть c хлопьями

(хлопья появляются в процессе хранения белков в связи с посте-

пенным оголением углеводных компонентов;а глеводные компоненты

белков, будучи жесткими разветвленными структурами, "запутыва-

ются друг в друге", обуславливая агрегацию белков);

- эритроциты не должны быть лизированы;

- сыворотка морской свинки, используемая как источник комп-

лемента, должна лизировать эритроциты (т.е. работать): компле-

мент + ЭБ --- лизис;

- диагностикум не должен содержать хлопьев и пр.

- при поиске АГ обязательно используется параллельно музей-

ный АГ, который должен однозначно выявляться при проведении ме-

тодики (это значит, что все компоненты реакции "работают", ме-

тодика поставлена правильно).

 РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ /РА/

РА - реакции склеивания микробов, частиц латекса или эрит-

роцитов /реакция гемагглютинации -а РГА/. АГ-несущие частицы

склеиваются антителами и выпадают в видимый осадок.

 Титром сыворотки 0а считаюта максимальное разведение, дающее

гглютинацию АГ.

┌ ┐

0 0 0 0 0 = а 0 0 │

\ / \ /а \ / \ /а \ / \ / │\ /а \ / \ /│

│ а │ а │ │ │ │ │

└ ┘n

0 - клетка

>── - молекула антитела

1)  _ Прямая РА

В этой реакции антитела (агглютинины) непосредственно агглю-

тинируют корпускулярные АГ (агглютиногены).

-  Зернистая 0 агглютинация происходит при склеивании микробов,

содержащих О-антиген.

-  Хлопьевидная 0 агглютинация происходит с бактериями, имеющи-

ми жгутики (Н-антигены).

а)  Прямая реакция агглютинации (РА)

-  _Ориентировочная РА . (на предметном стекле)

 Постановка реакции:

│Микробная суспензия

│+ антисыворотка к микробу

 Результат: 0 - хлопья (агглютинаты)

 Для определения микробного вида (серотипирования) на пред-

 5метное стекло наносится 1 капля (0,05мл) диагностическойа сыво-

 5ротки, разведеннойа физиологическим раствором 1:25. На вторую

 5половину стекл наносится капля физиологического раствора

 5(контроль). К каждой капле добавляется равный объем испытуемой

 5культуры.Слегка покачивая стекло, наблюдать за течениема реак-

 5ции:а феномена агглютинации проявляется выпадениема хлопьев и

 5просветлением жидкости в капле. В контроле микробная культура

 5должна остаться мутной и гомогенной. 0

-  _Развернутая РА . проводится в ряду пробирок или лунок для

раститровки сыворотки больного (определения титра АТ)

 Постановка реакции:

│Сыворотка больного, содержащая АТ к микробу --- рас│ титровка

│+ микробная суспензия (равное количество во все про бирки или лунки

 Результат: 0 - хлопья (агглютинаты) микробов

 Для определения антитела в сыворотке крови больного поста-

 5вить в штатив 7 пробирок и налить в каждую из них по 0,5 мл фи-

 5зиологического раствора. Добавить в первую пробирку 0,5 мл сы-

 5воротки больного, разведенную в 50 раз, перемешать. 0,5 мл из

 5первой пробирки перелить во вторую, перемешать; из второй про-

 5бирки 0,5 мл перелить в третью и т.д. Из последней пробирки вы-

 5лить для равенства объемов 0,5 мл в банку с дезраствором.В каж-

 5дую пробирку добавляют по 2 капли антиген или диагностикума.

 Оформить 2а контроля - контроль антигена (для исключения спон-

 5танной агглютинации) и контроль сыворотки в исходном разведении

 51:50.

 Рабочая схема РА:

 5──────────────────────────────────────────────────────────────

 Ингредиенты │ Ряд пробирок

 5│----------------------------------------------- 5 1а 2а 3а 4а 5а │ 6 7

 5──────────────────────────────────────────────────────────────

 51. Физраствора 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 - 0,5

 52. Сыворотк 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

 5больного 1:50

 Полученные

 5титры 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:50 -

 53. Диагнос 5тикум в

 5каплях 2 2 2 2 2 - 2

 Инкубация в термостате 2 часа при 37С, затем при

 5необходимости 24 часа при комнатной температуре.

 Учет результатов реакции проводят через 24 часа по следующей

 5схеме:

 5++++ полная агглютинация, жидкость прозрачная, выраженный

 5осадок;

 5+++а жидкость слегка опалесцирует, но осадок хорошо выражен;

 5++ или + сомнительная реакция, жидкость равномерно мутная,

 5осадок отсутствует. 0

 5- отрицательная реакция, жидкость равномерно мутная,

 5осадок отсутствует.

 Титром агглютинирующей сыворотки считается то ее максималь-

 5ное разведение, при которома еще происходит реакция не менее,

 5чем на три плюса.

 Артефакты:

 5- наличие СРБ, агглютинирующего микробы (стафилококки,

 5стрептококки)

 5- наличие перекрестных антигенов

б)  Прямая реакция гемагглютинации (РГА)

- вирусами (эритроцитов любого вида животного)

- при смешивании двух разногруппных проб крови (определение групп крови)

 Постановка реакции:

│Субстанция, склеивающая эритроциты (сыворотка, вирусы)

│+ эритроциты --- хлопья

 Результат: 0 - хлопья (означают присутствие АТ)

 Варианты постановки:

-  _Ориентировочная РА . (на предметном стекле)

-  _Развернутая РА . проводится в ряду пробирок или лунок для

раститровки сыворотки больного (определения титра АТ)

 Материал с вирусом титруют от 1/10 до 1/1280. 0,5мл данного

 5материала смешивают с 0,5мл 1-2% эритроцитов. Инкубируют 30 ми-

 5нут при 37оС или 45 минут при комнатной температуре. Титром ви-

 5руса считается его наибольшее разведение, при котором наблюда-

 5ется агглютинация эритроцитов.

 Прямая гемагглютинация, вызываемая бактериями, коррелирует с

 5их способностью прикрепляться к клеткам макроорганизма, отража-

 5ет вирулентные свойства. (Предложен метод селекции наиболее ак-

 5тивных клеток из культуры путем их адсорбции н эритроцитаха с

 5последующим высевом на плотные среды.)-[11-301-81]

2)  _ Непрямая РА

=  РНГА (РПГА 0; РНГА=РПГА 2) (реакция пассивной 0  2или 0  2непрямой ге 2магглютинации)

 Варианты постановки:

-  _Ориентировочная РА . (на предметном стекле)

-  _Развернумая РА . проводится в ряду пробирок или лунок для

раститровки сыворотки больного (определения титра АТ)

┌ ┐

.0. .0. │

│\ / \ / \ /│

│ │ │ │ │

└ ┘n

К носителю (эритроцитам, стафилококку, частицам латекса /ла-

текс-агглютинация/ и пр. химическим способом "пришивают" анти-

гены, ампулируют и выпускают в биотехнологической промышленнос-

ти как диагностикумы.

 Постановка реакции:

│Сыворотка больного --- раститровка

│+ диагностикум в каждую лунку -- Результат: 0 - "зонтик" (реакция агглютинации есть),

- "пуговка" (РА нет)

Последняя ячейка с положительной пробой ("зонтиком") означа-

ет титр АТ.

 Сорбция н носителе либо АГ (РНГА=РПГА), либо АТ (обратная

 РПГА).

 Реакция ставится в двух вариантах. Антиген (РПГА) или анти-

 5тела (РНГА) связываются с крупным носителем с последующим выяв-

 5лением уровня специфических иммуноглобулинов или антигена.

 Исследуемый антигена "сшивается"а танином или глютаровым ди-

 5альдегидом с эритроцитами или частицами латекса.

 Сыворотка больного, прогретая 30 минут при 56оС, раститровы-

 5вается (0,5мл)а и смешивается с 2 каплями эритроцитарного диаг-

 5ностикума.

3)  _ Проба Кумбса . 0 (непрямая пассивная гемагглютинация;

антиглобулиновый тест)

Для постановки этой реакции необходима антиглобулиновая сы-

воротка, которую получают путем иммунизации кролика иммуногло-

булинами человека.

Используется для определения неполных (функционально однова-

лентных)а антител, например, "ро"-антител к эритроцитам плода

при резус-конфликте, ряд аутонтител, АТ к некоторым микробам и

пр. Эритроциты плода в словиях in vivo не агглютинируют, одна-

ко при обработке их in vitro антисывороткой к гамма-фракции ан-

тител человека происходит РА на стекле (= _ориентировочная . реак-

ция Кумбса). К сыворотке добавляется антиген (резус-фактор) и

затем антисыворотка против гамма-глобулинов, что вызовет агглю-

тинацию загруженных эритроцитов.а  _Развернутая . реакция Кумбса (в

ряду пробирок или лунок) применяется для определения титра цир-

кулирующих неполных антител в сыворотке больного.

┌ ┐

│ 0 0 │

│ \ /а \ / \ / \ / -АТ 41 0│

│ │ │ │ │

\ / \ / \ /а │

│ │ │

АТ 42 0 АТ 42 0 АТ 42 0 │

└ ┘n

 Постановка реакции:

│Сыворотка (АТ 41 0) --- раститровка

│+ эритроциты (с Rh-антигеном)

│+ антисыворотка к Fc-фрагменту Ig G (АТ 42 0).

 Результат: 0 - "зонтик" (реакция агглютинации есть),

- "пуговка" (РА нет)

Последняя ячейка с положительной пробой ("зонтиком") означа-

ет титр АТ.

4)  _ Реакция когглютинации 0  2(Ко 0, РКА 2)

 Варианты постановки:

-  _Ориентировочная РА . (на предметном стекле) --- хлопья

-  _Развернумая РА . проводится в ряду пробирок или лунок для

раститровки сыворотки больного (определения титра АТ)

 L[+]

┌ │ ┐

│ ┌─┴─┐ 4  0 │

│ 0> 4── 0┤St.├ 4─ 0─<0│

│ └─┬─┘ 4  0 │

│ │ │

└ ┘n

К носителю - клеткам инактивированного золотистого стафило-

кокк (Staphylococcusа aureus), несущего на своей поверхности

белок А (функциональный аналог FcR)а добавляюта необходимые АТ

(антисыворотку)а иа после инкубации -а исследуемую жидкость с

предполагаемыми АГ-ми.

 Постановка реакции:

│Стафилококковый диагностикум

│+ АГ

 Результат: 0 - "зонтик" (реакция агглютинации есть),

- "пуговка" (РА нет)

Последняя ячейка с положительной пробой ("зонтиком") означа-

ет титр АТ.

 Реакция Ко-агглютинации (РКА) предложена в 1973г. Kronvall

 5для постановки диагноза пневмококковой инфекции. Сейчас она ис-

 5пользуется для диагностики эшерихиозов, коклюша, менингококко-

 5вой, стрептококковой инфекции, сальмонеллезов и шигеллезов, а

 5также для обнаружения некоторых бактериальных токсинов.

 5/2119к/85/

 Реакция пригодна для идентификации различных антигенов путем

 5агглютинации стафилококков, сенсибилизированных антителами про-

 5тив детерминант бактериальной, вирусной или неинфекционной при-

 5роды. /2к/

 Например, для индикацииа шигелл зонне в молоке, кефире и в

 5материалах от людей. Для определения чувствитель-

 5ности Ко ставили с 10-кратными разведениями 1 млрд. микробной

 5взвеси шигелл Зонне. Чувствительность РКО составил 108-109

 5микробных тел в 1 мл взвеси. /2к/

 Стафилококковый реагента выпускается Ленинградским НИИЭМ им.

 Пастера и используется его 2%а взвесь. Для сенсибилизации ис-

 5пользуются сыворотки с титром антител в РПГА неа ниже 1:12800.

 5/2к/

 На предметное стекло капают 2 капли по 0,1 мла диагностикума

 5и испытуемый материал. Положительным результатом считалось об-

 5разование агглютината с полным просветлением смеси. (Контроль -

 5с физрастворома и реакция с заведомо инфицированным материалом.)

 Определение энтеротоксина в реакции

 4когглютинации

 Культуру сальмонелл осаждаюта (8а об./мин.;20а минут), к

 4осадку микробов добавляют 0,5 мл дистиллированной воды, готовят

 4лизат, вновь центрифугируют (8 об./мин.;20 минут) и са надо-

 4садком (супернатантом) проводят реакцию. /1804к/88/

 В реакции используют диагностикум - золотистый стафилококк с

 4"пришитыми" к нему антителами к токсину. 2-3 капли реагента + 1

 4капля супернатанта культуры сальмонелл больного ---(оценка

 4+, ++, +++, ++++ после 3-минутного покачивания). /1804к/88/

5)  _ РТГА (реакция торможения гемагглютинации)

Гемагглютинин (НА) вирусов заблокирована антителамиа (первые

ячейки с " _пуговками ." = РА нет):

 L[+]

┌ ┐

│ ┌───┐ ┌───┐ │

│ ──<0>── │Эр.а ──<0>── │Эр.а ──<0>── │

│ └───┘ 7  0 └───┘ гглютинации

└ ┘эритроцитов

нет

0 - вирус (=торможение

>── - антител агглютинации)

При "следовых" количествах антител к гемагглютитину (НА) или

их отсутствии гемагглютинина ("клейа для эритроцитов") вирусов

остается "открытым" (не закрыт антителами) и происходита склеи-

вание эритроцитов (последние ячейки с " _зонтиками ." = РА есть):

 L[+]

┌ ┐

│ ┌───┐ ┌───┐ │

│0│Эр.│0│Эр.│0│

│ └───┘ └───┘ │

└ ┘n

а) Определение титра АТ к определенному вирусу (добавляется

нтисыворотка к НА /гемагглютинин видоспецифичен/ данного виру-

са).

 Постановка реакции:

│Сыворотка больного --- раститровка

│+ суспензия музейных инактивированных вирусов

(или диагностикум)

│+ эритроциты любого вида животного

 Результат: 0 - "зонтик" (реакция агглютинации есть, АТ нет

- "пуговка" (РА нет, АТ есть

Последняя ячейка с положительной пробой ("пуговкой") означа-

ет титр АТ.

б) Определение типа вируса, допустим, гриппа (А, А или С) у

больного по выделенной культуре

 Постановка реакции:

3 ряда лунок в иммунологической планшете:

нтисыворотка к вирусу гриппа типа А --- раститровка

нтисыворотка к вирусу гриппа типа В --- раститровка

нтисыворотка к вирусу гриппа типа С --- раститровка

│+ Вирус-содержащий материал от больного (культура, но совая жидкость) во все 3 ряда

(Или наоборот, раститровка в 3 рядах вирусов + АТ,

если нужно сориентироваться в количестве вирусов)

│+ эритроциты любого вида животного

 Результат: 0 - ряд с "пуговками"а означает тип вируса.

 5- Сыворотку титруют (1/10-1/2560) - 0,25мл;

 5- добавляется вирус в четырехкратном титре (разведение ва 4

 5раза от исходного титра)

 5- инкубируют 30 минут при 37оС

 5- добавляют 0,5мл 1-2% взвеси эритроцитов

 5- инкубируют 30 минут при 37оС или 45а минута при комнатной

 5температуре.

в) Определение типа вируса, допустим, гриппа (А, А или С) у

больного по наличию антител в сыворотке крови

 Постановка реакции:

3 ряда лунок в иммунологической планшете:

│Сыворотка больного --- раститровка в 3 рядах

│+ Музейный вирус типа А (в первыйа ряд)

│+ Музейный вирус типа В (во второй ряд)

│+ Музейный вирус типа С (в третийа ряд)

│+ эритроциты любого вида животного

 Результат: 0 - ряд с наибольшим количеством "пуговок" означает

наибольший титр АТ у больного к данномуа типу

вируса, что предположительно говорит о соответствующем гриппе (для доказательства оценивают титра АТ в динамике с интервалом в 2 недели;

при величении титра минимум в 4 раза можно говорить об острой инфекции и соответствующем заболевании).

 РЕАКЦИИ ИММОБИЛИЗАЦИИ

Реакции иммобилизации основаны на способности специфических

Т, циркулирующих в сыворотке больных, подавлять подвижность

различных микроорганизмов.

На практике нашли применение реакции иммобилизацииа бледной

трепонемы и холерного вибриона.

 РЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ (РП)

- реакции взаимодействия между антигеном и антисывороткойа с

образованием видимого "осадка" (преципитата) - преципитирующих

иммунных комплексов (ПИК).  МАТ (моноклональные АТ) одновалент-

 5ные, поэтому в РП пока не используются. 0

┌───────────────── РП ────────────────────┐

 _В жидкой фазе .  _В агарозе . (1%)

- реакции кольце- - в т.ч. электрофоретические

преципитации (в этом случае агароза варится

- нефелометрия на веронал-мединаловом буфере

(ВМБ, рН 8,6)

Механизм взаимодействия антигенов и антител:

АГ │ АГ=АТ │ АТ

(пропорциональное

количество АГ и АТ;1:1)

а а а │ │

│ │

┌───┐ о о / \ / \ / \ / \ / \а Y Y ┌───┐

Г │ о о │ о о о о о │ Y Y Т │

└───┘ 7  0 о \ / \ / \ / \ / \ / Y └───┘

о о а а а │ │ Y

ПИК

(преципитирующие ИК,

преципитат)

1)  _ Реакция кольцепреципитации

│─│

│ │- АГ

│ │

│=│- зона преципитации (помутнения) в пробирке или капилляре

│ │

│ │ - Антисыворотка

└─┘

а)  _Определение С-реактивного белка . (СРБ): капилляр наполови-

ну заполняют антисывороткой к СРБ и дополняют сывороткойа боль-

ного. Капилляр вставляют в пластелиновую пробку и оставляюта до

утра. Помутнениеа на границе раздела свидетельствует о наличии

СРБ в кровотоке (количество СБа пропорционально интенсивности

деструктивных процессов в организме).

 Треть капилляра заполняют антисывороткой и через этот же ко-

 5не 0ц 5 треть - исследуемой сывороткой. Капилляр покачивают 12-15

 5раз для смешивания ингредиентов и станавливают вертикально на

 5пластилиновый штатив. оставляют 24 часа при комнатной темпера-

 5туре. Помутнение на границе раздела свидетельствуета о наличии

 СБа ва кровотоке (количество СРБ пропорционально интенсивности

 5деструктивных процессов в организме).

 Результат оценивают по высоте преципитат ва капилляре.

б)  _Диагностика сибирской язвы

Прокипяченый инфицированный материал

+ антисыворотка (медленно наносить;а по стенке пробирки стекает под слой АГ)

Инкубация несколько минут. Зона помутнения свидетельствует о

присутствии АГ в материале.

2)  _ Нефелометрические, тербидиметрические методы

Принцип нефелометрии заключается в измерении количества све-

та, рассеиваемого частицами (ПИК) в жидкой среде. Для нефело-

метри оптимальны растворы низкойа концентрации (в отличие от

турбидиметрии, для которой оптимальны растворы высокой концент-

рации, посколькуа ва этом случае измеряется потеря проходящего

света).

 Чувствительность метода - 100 мкг/мла антитела илиа антигена

 5при исследовании цельной сыворотки и 1 мкг/мл при исследовании

 5чистых растворов. Данным методом можно проводить до 120 анали-

 5зов ва час. Время образования ИК можно значительно сократить,

 5если ее проводить в 4% полиэтиленгликоле с М. Д.

3)  _ Метод преципитации в геле по Оухтерлоню

Стекла или чашки Петри заливают 1-2%а агарома или агарозой.

После застывания агара вырезают по трафарету лунки. В одни лун-

ки вносят исследуемые сыворотки (препараты), в другие, располо-

женные напротив - соответствующие антисыворотки. Пластины инку-

бируют во влажной камере в течение 24-48 часов.

Варианты постановки:

- 2 лунки (диаметром 3-5 мм) на расстоянии 3-5а мма друга от

друга (одна с АТ, другая с АГ);

- в центре лунка с антисывороткой, вокруг лункиа са разными

пробами АГ-содержащего материала (или наоборот, в центре - АГ,

по периферии - АТ);

- бороздка (или полоска пропитанной фильтровальнойа бумагой,

наложенной на агарозу) с антисывороткой (АТ-ми), по бокам лунки

с АГ или бляшки микробов, синтезирующиха токсина (определение

токсигенности дифтерийной палочки).

4)  _ Метод преципитации в геле по Манчини

 _ 2(метод радиальной иммунодиффузии - РИД)

/ \---- зона преципитации

о--│---- лунка с точно дозированным количеством

\ 4--- 0/ сыворотки

Метод количественного определения антигенов основан на изме-

рении диаметра кольца преципитации, образующегося при внесении

исследуемой сыворотки в лунки, вырезанные в слое агара, в кото-

ром предварительно диспергирован моноспецифическая антисыво-

ротка. Ва слоеа агара пробойником вырезают лунки диаметром 2 мм

на расстоянии 15мм одна от другой. В лунки первого ряда вносят

с помощью микрошприц по 2мкл антигена (или стандартной сыво-

ротки) в разведениях 1/1, 1/2, 1/4, 1/8. Лунки следующих рядов

заполняются испытуемымиа препаратами. Пластины инкубируют во

влажной камере в течение 24 часов (пластины с анти-Igа Mа сыво-

роткойа -а 48 часов). По окончании инкубации измеряют диаметры

колец преципитации. Концентрацию антигена определяют по калиб-

ровочной кривой.

Например, определение концентрации Ig M,G,A в сыворотке кро-

ви больных.

5)  _ Ракетный электрофорез 0  2(электроиммунодиффузия)

1/4 о=== о - лунки с точно дизированным

1/2 о====== количеством сыворотки

1/1 о========== === - зоны преципитации

 2- +  0 (измеряется длина зон, мм)

Катод Анод

1/1, 1/2, 1/4 - разведения стандартной сыворотки (т.е.

сыворотки с известным количеством антител)

Ставятся для построения калибровочной кривой.

В 1966г. Laurell разработал метод, сочетающий иммунодиффузию

с электрофорезом. Антиген движется в геле агарозы, содержащем

нтисыворотку. Для электрофоретическиха реакцийа преципитации

гарозу расплавляют в веронал-мединаловом буфере (рН 8,6) в во-

дяной бане, остужают до 52 5о С, смешивают с антисывороткой и за-

ливают на стекло.

После застывания (через 5 минут) вдоль кромки слоя геля де-

лают ряд лунок, в которые помещают исследуемый материал. В слое

геля создаюта электрическое поле, благодаря которому антиген

входит в гель. Зона преципитации приобретает вид "ракеток". Вы-

сота "ракеты", образующейся в результате реакции, прямо пропор-

циональна концентрации антигена (она измеряется от верхней гра-

ницы лунки до высоты пика).

6)  _ Противоточныйа или встречный электрофорез . 0 (экспресс-диагностика вирусных и др. инфекций)

 Встречный ИФа (иммуноэлектрофорез)а был применен Бендарид в

 41969г. Электрическое поле силивает способность к взаимодейс-

 4твию низкореактогенныха Га и АТ. Чувствительность метода в 10

 4раз превышает чувствительность метода двойной иммунодиффузии по

 Оухтерлони. /2400к/

Основное словие метода - наличие электрофоретическойа под-

вижности АГ.

┌─────────────────────────────────┐

 2- 0 │ 0 0 0  2+

Катода │ АТ АГ АТ а Анод

│ ПИК │

└─────────────────────────────────┘

В две лунки геля заливают антиген и антитела, пластину ста-

вят в камеру для электрофореза и включают напряжение. Электри-

ческим полем значительно скоряется движение компонентов иа ре-

кция преципитации проходит за 30-40 минут. Экспресс-диагности-

ка

7)  _ Иммуноэлектрофорез (ИЭФ)

┌───────────────────────────────────────┐ +

█ █ █ █ █ █ █ █ █ │

█ █ █ █ █ █ █ █ █ │

█ █ █а а█ █ █ █ █ █ │

│ о █ о █ о █ о █ о █ о █ о █ о █ о █ о │

█ █ █ █ █ █ █ █ █ │

█ █ █ █ █ █ █ █ █ │

█ █ █ █ █ █ █ █ █ │

└───────────────────────────────────────┘  Постановка реакции:

│- В лунки заливается исследуемая смесь веществ,

пластина с агарозой ставится в электрофоретическую камеру

на ночь для разгонки белков.

│- Вынимается агароза из бороздок. В них заливается антисыво ротка (удобнее чередовать антицельную сыворотку с моноспе цифической к искомому компоненту). Ночь во влажной камере.

 Результат: 0 оценивается степень чистоты препарат по количеству а"лишних"а дуг зон преципитации примесей с

антицельной сывороткой (если препарат получали из

крови).

 В геле, приготовленном н веронал-мединаловома буфереа (рН

 58,6), по трафарету делаются бритвой полоски и лунки. Гель из

 5лунок вынимается (из бороздок нет) и лунки заполняют смесью ан-

 5тигенов или исследуемой сывороткой. Пластина ставится в прибор

 5для электрофореза и в течение ночи проводится разгонка исследуе-

 5мых белков. На следующий день освобождаются от геля бороздки и

 5заполняются моноспецифическими и полиспецифическими (часто ан-

 5тицельной) антисыворотками. Пластин оставляется н ночь во

 5влажной камере для реакции преципитации.

 58)  _Перекрестный электрофорез

 Смесь исследуемыха белкова разгоняется поперека пластины в

 5электрическом поле, затем к полоске геля с разделенными белками

 5приливается расплавленныйа гель с антисывороткой к исследуемым

 5компонентам и разгонк проводится ва продольнома направлении.

 Формируются широкие отдельные зоны преципитации исследуемых

 5компонентов белков.

 РЕАКЦИЯ ФЛОККУЛЯЦИИ

┌ ┐

0 0 - хлопья флоккулята

│\ /а \ / \ /│ (помутнение в пробирке)

│ │ а │ │

└ ┘n

0 - молекула антигена (токсина или др.)

>── - молекула антитела

 В результате взаимодействия токсина или анатоксин са анти-

 5токсической сывороткойа выпадаюта хлопья флоккулята. Наиболее

 5ранняя флоккуляция наблюдается в пробирке, где антиген и анти-

 5тело содержатся в эквивалентных соотношениях.

 Одна флокуллирующая единица токсина (Lf - Limes flocculatio-

 5nis) в 1 мл определяется минимальным количеством токсина, даю-

 5щим начальную флоккуляцию с 1 международной единицей (МЕ) сыво-

 5ротки.

 52мл токсина (20 Lf в 1 мл) смешивают в пробиркаха са разными

 5количествами сыворотки (0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 мл), инкубируют

 530 минут при 45оС до выпадения хлопьев ва однойа иза них. Если

 5флоккуляция произошла в 3 пробирке, значит, в 0,4мл сыворотки

 5находится 4МЕ. Следовательно, 1мл сыворотки содержит

 540:0,4=100 МЕ. 0

 РЕАКЦИЯ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ

(ИФМ - иммуно-флюоресцентный метод)

1)  _Прямойа метод . иммунофлюоресценции (по Кунсу) основан на

взаимодействии антител, меченых флюорохромом, с антигеном, ко-

торый находится на клетке, в клетке или в тканях.

В качестве флюорохром используют

- флюоресцеинизотиоционат (ФИТЦ), дающий зеленое свечение в

Ф-ых лучах;

- тетраметилродаминизотиоцианата (ТРИТЦ)а с оранжево-красным

свечением. /2551к/

┌────────────────────────┐  4Y

а  1┌┬┬┐ 0 │ │ - АТ

а  1└┴ 4Y 1┘ 0 │ * - метка флюорохрома (светя│ │* │ щаяся в темном поле зрения

└────────────────────────┘ люминесцентного микроскопа)

Предметное стекло с препаратом

 4(после промывки от несвязавшихся АТ)

 Постановка реакции:

│Фиксированный мазок

│+ диагностическая сыворотка с АТ-ми, мечеными ФИТЦ.

│Отмывка от несвязавшихся антител.

│Люминесцентная микроскопия (приа положительнома результате

│ видно свечение.

 Материал (препарат ткани, микроорганизмов или антигена) на-

 5носится на стекло, фиксируется 15 минут в спирте или в пламени

 5горелки, обрабатывается флуоресцирующей сывороткой (15-30 минут

 5при комнатной температуре), промывается 15 минут физиологичес-

 5ким раствором;а проводится люминесцентная микроскопия. Отсутс-

 5твие свечения свидетельствует об отсутствии антигена н препа-

 5рате.

 Для получения флуоресцирующих антител к раствору иммуногло-

 5булинов добавляют раствора флуоресцетин изотиоцианата натрия

 5(можно 5-диметиламино-1-нафталинсульфонилхлорид иа изотиоцианат

 5лизамин родамина В 200).

2)  _Непрямой метод

┌────────────────────────┐  4Y 0 >─── - АТ 42 0 (меченые

а  1┌┬┬┐ 0 │ │ - АТ 41 0 флюорохромом)

а  1└┴ 4Y 1┘ 0 │ * - метка флюорохрома

│ │>───* │

└────────────────────────┘

Предметное стекло с препаратом

 4(после промывки от несвязавшихся АТ)

 Постановка реакции:

 _1 вариант

│Фиксированный мазок больного (микробы больного)

│+  _диагностическая сыворотка . (обычные АТ; первого порядка),

допустим, кролика.

Отмывка от несвязавшихся антител.

│+ Антисыворотка против иммуноглобулинов кролика с АТ-ми

(второго порядка), меченными ФИТЦ.

Отмывка от несвязавшихся антител.

│Люминесцентная микроскопия (приа положительнома результате

│видно свечение.

 _2 вариант

│Фиксированные мазки музейных микробов (диагностикума),

│+ (раститрованная)  _сыворотка больного

Отмывка от несвязавшихся антител.

│+ Антисыворотка против иммуноглобулинов (АТ второго поряд ка), меченными ФИТЦ.

Отмывка от несвязавшихся антител.

│Люминесцентная микроскопия (приа положительнома результате

│видно свечение.

 Антисыворотку к иммуноглобулинам кролика получают иммуниза-

 5цией барана иммуноглобулинами кролика.

 Метод иммуннойа флюоресценцииа применяюта для идентификации

 5риккетсий и других бактерий, вирусов, также для определения

 5рецепторов и АГ-ов животных клеток человека и животных.

 ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ИФА)

ELISA-МЕТОД=РЭМА

(Enzyme-linked immunosorbent assay =

реакция энзим-меченных атомов)

 Метод независимо разработалиа ва начале 70-х годов шведские

 5исследователи Энгвалл и Перлманн, голландские ван Веемен и Шуур

 5и американские исследователи под руководством Рубинстайна.

К настоящему времени созданы многочисленные модификации ба-

зовой методики и наибольшее распространение получил гетероген-

ный ИФА на твердой фазе ( _твердофазныйа ИФА .). Коммерческие МАТ

(или АГ) фиксируют на лукнах пластиковых панелей, реже иммоби-

лизуют на бусах или нитроцеллюлозных мембранах. /2400к/

Лунка иммунологическойа планшеты са "пришитыми"а антигенами

(диагностические планшеты)

│ │

│ >── - АТ 41 0 (антитело первого порядка)

Г>── 4Y 0 │ 4а Y

│ │* а - АТ 42 0 (молекула АТ второго порядка,

│ │ меченая пероксидазой хрена)

└────────────────┘а * - пероксидаза (ПХ) хрена

Н 42 О 42 ─────  Н 42 О + [O]

 ПХ 0 радикал кислорода

+ раствор Н 42 О 42 0 и красителя (хромогена),

изменяющего цвет в присутствии радикалов кислорода (орто-фенилендиамин) --- спектрофотометрия (под вертикальным лучом)

После каждого этапа обработки планшета промывается физраст-

вором или буфером.

 ИФМ можно определить белки, содержащиеся в количестве нес-

 5кольких нанограммов в 1 мл. В качестве ферментных меток исполь-

 5зуют пероксидазу хрена, глюкозоксидазу, бета-галактозидазу или

 5щелочную фосфатазу. 0

 Этапы:

 Первым этапома является связывание моноспецифических антител

 5(или антигена, если искомым белком является антитело) на твер-

 5дом субстрате, обычно на стенках пластиковой пробирки или план-

 5шеты. Связывание происходит путем физической адсорбции белка на

 5гидрофобной поверхности. 0

 5- Полистироловая (полистереновых)а планшетка обрабатывается

 5антигеном для их сорбции (или антителами).

 5- Добавляется альбумин (забиваются все свободные сайты свя-

 5зывания, чтобы не было затем неспецифической сорбции антител). 0

 5- Обработка антителами или сывороткойа больного, содержащей

 5предполагаемую разновидность антител.

 5- Добавляется антисыворотка, меченная ПХ (пероксидазой хре-

 5на).

 5- Приливается реактив АВТSа илиа др., которыйа окрашивается

 5после воздействия пероксидазы. Можно использовать смесь переки-

 5си водорода и хромогена (ортофенилдиамина, изменяющего окраску

 5в зависимости от количества радикальных форм кислорода от свет-

 5ло-желтой до коричневой).

 5- О наличии и количестве АТ судят по изменению цвет и ин-

 5тенсивности окраски раствора. Измерение интенсивности окраски

 5на спектрофотометре /СФ/. 0

 5[ИФМ можно проводить двумя путями - по непрямому (описанному

 5выше) и конкурентному типу. В первом случае конкурентные отно-

 5шения отсутствуют: исследуемая биологическая жидкость реагирует

 5с твердофазными антителами, после чего на даляется из и в ре-

 5акцию вводят меченые ферментома антитела, которыеа связываются

 5уже иммобилизованныма антигеном. В этом случае ферментативная

 5активность прямо пропорциональна количеству антигена в исследу-

 5емом материале. Во втором случае антиген, меченный ферментом,

 5конкурирует с немеченым исследуемым антигеном за выделенныеа на

 5твердой фазе антитела, и ферментативная активность обратно про-

 5порциональна количеству антигена в исследуемом образце.]

 В качестве твердой фазы используют вещества различного хими-

 5ческого состава -а полистирен, полипропилен, поливинил, гели

 5декстрана, агарозы, полиакриламида, целлюлозы, нитроцеллюлозы,

 5нейлон.

 РАДИОИММУННЫЙ МЕТОД /АНАЛИЗ/ (РИМ=РИА)

РИСТ - радиоиммуносорбентный метод

Ставится аналогично ИФА, но с использованием антител, мече-

ных радиоктивным изотопом.

│ │

│ >── - АТ 41 0 (антитело первого порядка)

Г>── 4Y 0 │ 4а Y

│ │* а - АТ 42 0 (молекула АТ второго порядка,

│ │ меченая изотопом)

└────────────────┘а * - радиоктивная метка --- счетчик

радиоктивности

Работ проводится в радиоизотопных лабораториях.

Используются антитела, меченные радиоктивным элементома -

иодом ( 5125 0I,  5131 0I) или др. - с последующим измерением радиок-

тивности. Еслиа предыдущие иммунохимические методы способны

улавливать концентрациюа белка не ниже 1 мкг/мл, то с помощью

РИМ можно определить концентрации, измеряемые ва пикограммах,

поэтому метод РИА считается одним из подходящих количественных

методов иммунохимического анализа.

чет реакцииа проводята по быванию или по возрастанию ради-

октивности (в зависимости от методики РИА) с помощью специаль-

ных счетчиков бета- или гамма-излучения. Метод высокочувствите-

лен, но постепенно вытесняется иммунофлюоресцентныма анализом.

/2551к/

 ИММУНОБЛОТТИНГ

и дот-микросвязывание

 Постановка методики:

│- Вертикальный электрофорез пробы в течение ночи

│- Снятие отпечатка на нитроцеллюлозную бумагу (полоски

или цельную)

│- Инкубация полосок бумаги в растворе антисыворотки к иско мому антигену. Промывка от несвязавшихся АТ.

│- Инкубация в растворе противовидовой антисыворотки (раст воре АТ второго порядка), меченых ПХ (пероксидазой хрена)

│- +а раствор Н 42 О 42 0 и красителя, изменяющего цвет в присутствии радикалов кислорода. Присутствие АГ расценивается по

наличию окрашенных красителем пятен на бумаге.

 Метод основан на разделении полипептидов в ПГ (полиакрила-

 5мидном геле)а иа анализе разделения иммунохимическими методами

 5после переноса разделенных белков на нитроцеллюлозную мембрану,

 5на которой белки доступны для любого вида твердофазного иммуно-

 5анализа (иммуноферментного или радиоиммунного).

 Этапы:

 51. Электрофорез исследуемой смеси пептидов и маркеров са из-

 5вестной молекулярной массой в ПГ.

 52. Окраска геля нитратом серебра.

 53. Перенос следов белка на нитроцеллюлозную бумагу или мемб-

 5рану н основе нейлон (отпечаток геля) с получением реплики

 5электрофореграммы. Процесса перенос называется блоттингом, а

 5полученный отпечаток - блотом или блотограммой. 0

 54. Обработк бумаги в полиэтиленовом пакете в антисыворотке

 5к исследуемым антигенам. Промывка.

 55. Обработка антителами к фракции иммуноглобулинов, связан-

 5ных с пероксидазой или с биотином (ИФМ).

 56. Окраска авидин-пероксидазой или диаминбензидином с добав-

 5лением перекиси водорода. Промывка. Высушивание. 0

.

 РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ /РН/

 _ 21) РН вирусов в цветной пробе (в культуре ткани).

Допустим, у больного грипп типа В:

│ а │ а │

│ │РН │ │

├───┤ ├───┤ ├───┤

│ В │ │ В │ │ В │

└───┘ └───┘ └───┘

+ АТ к + АТ к В + АТ к С

(+ антисыворотк - " - (+ антисыворотка

к вирусу типа А) │ к вирусу типа С)

│

Во второй пробирке

произойдет нейтрализация вируса (РН).

Добавленные клетки

останутся живыми.

 Постановка методики:

│Вирусная культура

│+ антисыворотка к белкам адгезии вирусов (НА)

--- инактивация вируса (неспособность проникать в клетки

для репродукции)

│+ культура клеток --- гибели нет (метаболизм клеток продол жается, среда закисляется и окраска среды 199 меняется на

желтую.

При выявлении одного, допустим, из 3 типов вирусова гриппа

(А,В,С) в 3 пробирки добавляют исследуемую культуру вируса (ал-

лантоисную жидкость куриного эмбриона), затем в каждую пробирку

свою антисыворотку (против А, против В, против С) и после пре-

динкубации - культуру клеток в среде 199. В двух из трех проби-

рок АТ не свяжут вирусы, вирусы проникнут в клетки; клетки по-

гибнут, метаболизм прекратиться (среда перестанет желтеть и ос-

танется исходной - малиновой).

 _ 22) РН вирусов в культуре ткани . 0 или курином эмбрионе по нейт-

рализации ЦПД.

Ставится аналогично, но наблюдается не изменение цвета пита-

тельной среды, а (чаще под микроскопом) отсутствие ЦПД (цитопа-

тогенного действия вируса) - образование многоклеточного синци-

тия, гигантских многоядерных клеток, появление включений, вези-

куляция клеток и пр.

 _ 23) РН токсина антитоксической сывороткой

а) in vitro

- Реакция флоккуляции (хлопьеобразования)

б) in vivo

 1-  Например, определение типа токсина Clostridiumа botulinum

при ботулизме. Клостридии ботулизм способны продуцировать 7

серотипов токсина - А,В,С,D,E,G,F, из которых ва нашейа стране

встречаются чаще токсин типа А, типа В и типа Е.

Допустим, человек отравился токсином Е:

│ │ │

│ │ │ РН│

├───┤ ├───┤ ├───┤

│ Е │ │ Е │ │  Е 0 │

└───┘ └───┘ └───┘

+ АТ к + АТ к В + АТ к  Е

│ │ │

мышь погибнет мышь погибнет мышь выживет

Токсин-содержащий материал разливают по 3 пробиркам и добав-

ляют в первую - антисыворотку к токсину А,

во вторую - антисыворотку к токсину В,

в третью - антисыворотку к токсину Е.

В 3 пробирке произойдет образование ИК, т.е. нейтрализация ток-

сина (РН). Для выявления данной пробирки содержимое вводят трем

мышкам. Третья мышь выживет.

 Минимальной летальнойа дозойа токсина 0а считается количество

токсина. которое при подкожном введении морскойа свинкеа весом

250г вызывает ее гибель в течение 4-5 дней.

4) Феномен гашения сыпи (in vivo), например, при диагностике

скарлатины.

Для диагностики скарлатины в область наиболее обильнойа сыпи

вводят антисыворотку к эритрогенному токсину;а если у больного

скарлатина, то сыпь в месте инъекции пропадает.

5) РН для определения напряженности антитоксического иммуни-

тета к дифтерийному токсину (проба Шика), скарлатинозному ток-

сину (проб Дика) в здоровом организме.

В область предплечья внутрикожно вводята определенноеа коли-

чество соответствующего токсина (1/40 DLM). При наличии в ога-

низме антитоксинов произойдет нейтрализация токсин и реакция

будет отрицательной. При отсутствии антитоксинов (антитоксичес-

ких АТ) в организме возникает воспалительная реакция (покрасне-

ние) на месте введения токсина. /2551к/

Подкожное введение эритрогенного токсина иммунным лицам при-

водит к нейтрализации токсина (покраснения не будет).

 РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК)

 _ Реакции иммунного лизиса . используются в нескольких вариантах

 51) Для определения АТ к эритроцитам барана (ЭБ)

 52) Для определения HLA на В-лимфоцитах (лимфоциты +а МТа к

 5определенному Га системы HLAа + комплемент --- лизис клеток +

 5гемсистема - е (эритроциты /Е/ барана, нагруженные антителами

 5/А/ к ним /ЕА/). 6-12 ячеек из 100 будут с целыми эритроцитами,

 5остальные - с лизированными (ИК нет, нет активации комплемента,

 5нета потребления комплемента, свободныйа комплемента лизирует

 ЭБ). РСК.

 53) Для определения титра АТ к любому АГ (РСК).

 В реакциях иммунного лизиса специфические АТ взаимодействуют

 4с различными клетками, в том числе с бактериями и простейшими,

 4что приводита к активации системы комплемента по классическому

 4пути и последующему лизису клеток. Среди них известны реакции

 4гемолиза и вибриолиза. /2400к/98/ 0

 Реакция гемолиз считается активной при использовании АТ к

 5эритроцитам барана. При пассивной реакции иммунного лизиса про-

 5изводята адсорбцию антигена на эритроцитах барана с последующим

 5добавлением искомых антител к АГ-ну и комплемента. 0

 Определение титра антител по РСК

 2(реакции связывания комплемента)

1/10а 1/100 5  01/1 5 и т.д. (раститровка)

= 10 5-1 0 = 10 5-2  0 10 5-3 0  5а  010 5-4а  0 10 5-5а  0 10 5-6 0 10 5-7 0  5  0 10 5-7

а а а а а │

а а а а а │

├───┤а ├───┤а ├───┤а ├───┤а ├───┤а ├───┤а ├───┤а ├───┤а ├───┤

│ о │ о │ о │ о │ - │ - │ - │ - а │

└───┘а └───┘а └───┘а └───┘а └───┘а └───┘а └───┘а └───┘а └───┘

\/а \/ Контроли

Эритроциты барана целы Эритроциты барана лизированы

(муть или осевшие на дне)

 Постановка методики:

│- Раститровка сыворотки для определения титра АТ

│+ АГ (музейная культура микробов, лекарственный препарат,

анатоксин и пр. --- ИК в первых пробирках по бывающей

│+ комплемент (сыворотка морской свинки) --- связывание ИК с

C1q. Инкубация 15 минут.

│+ е (гемсистема;а другой вид ИК). Инкубация 15 минут.

--- Лизиса в первых пробирках нет, т.к. C1q весь связан с

первым типом ИК.

┌────┐ ┌────┐

│ АГ │ │ ЭБ │

└──┬─┘а ┌────┐ └──┬─┘

├────┤ Са │ --- гемолиза эритроцитов нет

┌──┴─┐а └────┘ ┌──┴─┐ (положительная РСК)

│ АТ │ │ АТ │

└────┘ └────┘

ИК ИК [С- комплемент]

┌────┐ ┌────┐

│ АГ │ │ ЭБ │

└────┘ ┌────┐а └──┬─┘

│ c ├─────┤ --- гемолиз эритроцитов

┌────┐ └────┘а ┌──┴─┐ (отрицательная РСК)

│ АТ │ │ АТ │

└────┘ └────┘

ИК нет или мало ИК

(антител к искомому

Г нет или мало)

 Примечание 0:

- Сыворотк больного предварительно инактивируется от собс-

твенного комплемента (56 5о 0 20 минут), поскольку активность комп-

лемента у разных больных разная (сбои в результатах).

- Предварительно отрабатывается рабочая доза АГ (не влияющая

сама по себе на реакции активации комплементарного каскада).

- Подбирается рабочая доза комплемента (избытока недопустим,

так как C1q будет оставаться и на ИК второго порядка).

 51. Приготовление 5% суспензии эритроцитов барана (Е):

 50,5 мл осадка отмытых эритроцитов + 9,5 мл физраствора.

 52. Определение титр гемолитическойа сыворотки (антител /А/

 5к эритроцитам барана):

 Титром гемолитической сыворотки считается максимальное раз-

 5ведение в объеме 0,5 мл, при котором наблюдается полный гемолиз

 50,5мл 3%а взвеси эритроцитов барана в присутствии 0,5мл компле-

 5мента (1:10). Пробы выдерживаются при температуре 37С в тече-

 5ние 1 часа.

 53. Приготовление рабочего раствор гемолитическойа сыворотки

 5(1:3):

 Например, исходный титр 1:2700;а 2700 :а 3 = 900, т.е. сыво-

 5ротку необходимо развести в 900 раз (взять 1/900 часть от ко-

 5нечного объема). Если надо 10 мла гемсистемы, то нужно взять

 510:900=1/90мл=0,011мл исходной гемолитической сыворотки.

 54. Приготовление гемолитической системы (индикаторной систе-

 5мы для комплемента):

 Смешиваются равные объемы 5%а суспензии эритроцитов барана и

 5гемолитической сыворотки (1:6);а при этом сыворотка при непре-

 5рывном встряхивании выливается в суспензиюа эритроцитов, не

 5наоборот. Смесь встряхивается 5 минут и инкубируется 30 минут в

 5термостате. Отмывается.

 55. Определение рабочей дозы комплемента:

 В качестве источника комплемента можно использовать сыворот-

 5ку здоровых доноров (при этом комплемент сыворотки аинактивиру-

 5ется прогреванием в течение 30 минут при 56С) или лиофилизиро-

 5ванную сыворотку морской свинки.

 Титр комплемента - то наименьшее количество комплемента, ко-

 5торое будучи смешанныма са 0,5мла гемолитическойа сыворотки (в

 5трехкратном титре), гемолизирует 0,5мл 3% взвеси эритроцитов в

 5течение 30 минут.

 Для титрования пользуются основным разведением комплемента

 51:10 и разливают в ряд пробирок от 0,05 до 0,5мл. Затем в каж-

 5дую пробирку добавляют физраствор до 1,5мл и 1 мл гемолитичес-

 5кой системы. Инкубируют 30 минут при 37Са иа определяюта титр

 5комплемента. Параллельно ставится два контроля - контроль гемо-

 5литической сыворотки (с физраствором) и контроль комплемента.

 Определив титр комплемента, высчитываем рабочую дозу, кото-

 5рая представляет собой титр комплемента, величенный на 20-30%,

 5так как комплемент в опыте подавляется антигеном.

 56. Определение рабочей дозы антигена:

 Раститровывают антиген в конечном объеме 1мл, затем добавляют

 5комплемент, штатив встряхивают и оставляют на 1 час при 37С. К

 5смеси приливаюта по 1мла гемолитической системы и инкубируют 1

 5час.

 Титром считается наименьшая доза, при которой прекращается

 5задержка гемолиза, т.е. отсутствует его комплементарное дейс-

 5твие. Для постановки РСК берут рабочую дозу антигена, составля-

 5ющую примерно 1/2 - 2/3 ее титра во избежаниеа комплементарного

 5действия при постановке реакции.

 57. Постановка реакции РСК.

 5- Раститровывают сыворотку больного, предварительно прогре-

 5тую при 52С в течение 20а минута для инактивации собственной

 5системы комплемента.

 5- Добавляют рабочую дозу антигена,

 5- комплемента и инкубируют 10-30 минут при 37С.

 5- Затем вносится гемолитическая система и штатив инкубирует-

 5ся еще 30 минут при 37С.

 Задержка гемолиза свидетельствует о наличии антитела к ис-

 5пользуемому антигену ва сыворотке больного.

 Учет РСК с парными сыворотками. (титром специфических в дан-

 5ному антигену антител считается титр последнего разведения сы-

 5воротки, полностью тормозящего гемолитическую реакцию.)

 Титром гемолизин считается наибольшее разведение гемолизи-

 5на, с которым получается полный гемолиз 0,5мла взвеси бараньей

 5крови в присутствии комплемента.

Реакция Вассерман (РСК) используется для диагностики сифи-

лиса. Антигеном служит экстракт пораженного орган или другой

налогичный материал.

II.  _ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

 ЦЕПНАЯ ПОЛИМЕРАЗНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)

 5- Неа серологическая (без использования АГ и АТ), но также

 5гибридизации фрагментов ДНК и РНК. 0  5высокоспецифическая диагнос-

 5тическая реакция.

ПЦР - чрезвычайно чувствительный метод, теоретически для по-

лучения результата достаточно иметь в среде одну молекулу ДНК.

/2400к/

 ПЦР была разработана Мюллесом в 1983г. на основе технологии

Методы ДНК-гибридизации и ЦПР используются для геносистема-

тики и идентификации патогенных микроорганизмов. /2287к/96/

 Основа метода 0 - катализируемое ДНК-полимеразойа многократное

образование копий (амплификация) определенного частка ДНК.

 Этапы метода:

│- термическое разделение 2-нитевой молекулы ДКа на отдель ные цепочки (30-40с. при 93-95 5о С),

│- охлаждение среды и

│- внесение праймеров, комплементарных нуклеотидныма после довательностям обеих цепочек.

Для запуска реакции используют синтетические  _ 1праймеры . 0 - оли-

гонуклеотиды, состоящие из 10-20 нуклеотидов, взаимодействующие

с окончаниями последовательностейа и образующие последователь-

ности в 50-1 оснований. Затем в среду вносят термостабильную

полимеразу (tag-полимеразу /от вид бактерии Thermus aquati-

cus/), что запускает образование вторичныха копийа цепейа ДНК,

после чего образующиеся 2-нитевые молекулы ДНК снова подогрева-

ют. Образующиеся отдельные цепочки остужают, вносят праймеры и

снова повторяют процедуру прогрева и охлаждения. /2400к/

После 30-80 циклов накопления копий ДНК проводят иха иденти-

фикацию методом электрофореза. /2400к/

 Для подтверждения принадлежности ДКа возбудителю молекулы

 5можно подвергнуть рестрикции специфическими эндонуклеазами или

 5провести реакцию ДНК-гибридизации. /2400к/

 ПЦР позволяюта анализировать геномную ДНК или РНК-транскрип-

 5ты, выделенные из единственной клетки. И хотя этиа методы не

 5требуют большого количеств клеток, их ограничения связаны с

 5доступностью специфических праймеров и их, как правило, приме-

 5няли для выявления жеа известныха или родственных им генов.

 Такое ограничение было преодолено после разработки методов,

 5позволивших амплифицировать весь спектр мРНК. В них использова-

 5лась природная особенность всех мРНК нести поли(А+)-последова-

 5тельность на 3'-конце. Комплементарная ДНК (кДНК), полученная с

 5мРНК в реакции обратной транскрипции, приобретала таким образом

 5сайт связывания одного из праймерова для амплификацииа ва ЦПР.

 Другойа сайта была образована путема добавления гомополимерного

 5хвоста с помощью терминальной трансферазы. Однако все эти мето-

 5ды использовали стадию экстракции ДНК, что затрудняло их приме-

 5нение в отношении небольшого количества клеток. /2286к/96/ 0

┌──── 76 0а ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬

│ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴

│ │

│ │ термическая денатурация ДНК (95 5о 0)

│ ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬

│

│ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴

│ │

│ │ Отжиг праймеров

│ ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬

│ ┴┴┴┴┴┴

│ ┬┬┬┬┬┬ - праймер

│ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴

│ │

│ │ Синтез комплементарных нитей ДНК при охлаждении

│ ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬

│  2┴┴┴┴┴┴ 0┴┴┴┴┴┴┴┴┴

│ ┴а ┴а ┬ ┬

│ ┬┬┬┬┬┬┬┬ 2┬┬┬┬┬┬

│ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴

│ │

│ │ Завершение первого цикла

│ ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬

│ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴

│ +

└─────а ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬

и т.д. ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴

 Этот недостаток был преодолен в работе Brady, в которой все

 5стадии синтеза кДНК были проведены в одной первичнойа клеточной

 5суспензии без единой экстракции. /2286к/96/

 В последнее время стали пользоваться большойа популярностью

 5магнитные бусы фирмы "Dynal". Последовательности олиго(дТ)25,

 5ковалентно сшитые с бусами, позволяют легко выделять мРКа из

 5общего пула РНК или лизата клеток. /2286к/96/а (...)

 Все стадии синтеза кДНК проводятся на магнитных бусах. Воз-

 5можность работы с ДНК, находящейся на магнитных бусах, в соче-

 5тании с ПЦР позволяет применять данный подхода к малому коли-

 5честву исходного материала. /2286к/96/

Преимуществом метода является также возможность быстро полу-

чать вторые цепиа кДКа н же синтезированных первых цепях с

олиго(дЦ)-хвостами. Такие матрицы хорошо хранятся в буфереа при

4 5о С. /2286к/96/