Реферат: Белки: история исследования, химсостав, свойства, биологические функции

                        Глава 1. Введение.                        
Довольно банальными стали сейчас сообщения о революции в биологии. Бесспорным
считается и то, что эти революционные изменения были связаны с формированием
на стыке биологии и химии комплекса наук, среди которых центральное положение
занимали и занимают молекулярная биология и биоорганическая химия.
УМолекулярная биология - наука, ставящая своей целью познание природы явлений
жизнедеятельности путем изучения биологических объектов и систем на уровне,
приближающемся к молекулярному. характерные проявления жизни. обусловлены
структурой, свойствами и взаимодействием молекул биологически важных веществ, в
первую очередь белков и нуклеиновых кислотФ
УБиоорганическая химия - наука, изучающая вещества, лежащие в основе
процессов жизнедеятельности.основные объекты биоорганической химии -
биополимеры (белки и пептиды, нуклеиновые кислоты и нуклеотиды, липиды,
полисахариды и т.д.).
Из этого сопоставления становится очевидным, сколь важно для развития
современной биологии изучение белков.
Глава 2. История исследования белка
     2.1. Начальные этапы в химии белка
Белок попал в число объектов химических исследований 250 лет тому назад. В
1728 году итальянский ученый Якопо Бартоломео Беккари получил из пшеничной
муки первый препарат белкового вещества Ц клейковины. Он подверг клейковину
сухой перегонке  и убедился, что продукты такой перегонки были щелочными. Это
было первое доказательство единства природы веществ растительного и животного
царств. Он опубликовал результаты своей работы в 1745 году, и это была первая
статья о белке.
В XVIII Ц начале XIX веков неоднократно описывали белковые вещества
растительного и животного происхождения. Особенностью таких описаний было
сближение этих веществ и сопоставление их с веществами неорганическими.
Важно отметить, что в это время, еще до появления элементного анализа,
сложилось представление о том, что белки из различных источников Ц это группа
близких по общим свойствам индивидуальных веществ.
     
Формулы белков 
Д. Дальтона
В 1810 году Ж. Гей-Люссак и Л. Тенар впервые определили элементный состав
белковых веществ. В 1833 году Ж. Гей-Люссак доказал, что в белках обязательно
присутствует азот, а вскоре было показано, что содержание азота в различных
белках приблизительно одинаково. В это же время английский химик Д. Дальтон
попытался изобразить первые формулы белковых веществ. Он представлял их
довольно просто устроенными веществами, но чтобы подчеркнуть их
индивидуальное различие при одинаковом составе, он прибег к изображению
молекул, которые бы сейчас назвали изомерными. Однако понятия изомерии во
времена Дальтона еще не было.
     
Были выведены первые эмпирические формулы белков и выдвинуты первые гипотезы
относительно закономерностей их состава. Так, Н.Либеркюн считал, что альбумин
описывается формулой  C72H112N18SO22
, а А.Данилевский полагал, что молекула этого белка по крайней мере на порядок
больше: C726H1171N194S3O214
.
Немецкий химик Ю. Либих в 1841 году предположил, что белки животного
происхождения имеют аналоги среди растительных белков: усвоение белка легумина
в организме животного, по Либиху, вело к накоплению аналогичного белка Ц
казеина. Одной из самых распространенных теорий доструктурной органической
химии была теория радикалов Ц неизменных компонентов родственных веществ. В
1836 году голландец Г. Мульдер высказал предположение о том, что все белки
содержат один и тот же радикал, который он назвал протеином (от
греческого слова УпервенствуюФ, Узанимаю первое местоФ). Протеин, по Мульдеру,
имел состав Pr = C40H62N10O12. В
1838 году Г. Мульдер опубликовал формулы белков, построенные на основании
теории протеина. Это были т.н. дуалистические формулы, где радикал протеина
служил положительной группировкой, а атомы серы или фосфора Ц отрицательной .
Вместе они образовывали электронейтральную молекулу: белок сыворотки крови Pr
10S2P, фибрин Pr10SP. Однако аналитическая проверка
данных Г. Мульдера, проведенная русским химиком Лясковским, а также Ю. Либихом,
показала, что Убелковых радикаловФ не существует.
В 1833 году немецкий ученый  Ф. Розе открыл биуретовую реакцию на белки Ц
одну из основных цветных реакций на белковые вещества и их производные в
настоящее время (подробнее о цветных реакциях на стр.53). Был сделан также
вывод о том, что это самая чувствительная реакция на белок, поэтому она в то
время привлекла наибольшее внимание химиков.
В середине XIX века были разработаны многочисленные методы экстракции белков,
очистки и выделения их в растворах нейтральных солей. В 1847 году К. Рейхерт
открыл способность белков образовывать кристаллы. В 1836 году Т. Шванн открыл
пепсин Ц фермент, расщепляющий белки. В 1856 году Л. Корвизар открыл еще один
подобный фермент Ц трипсин. Изучая действие этих ферментов на белки, биохимики
пытались разгадать тайну пищеварения. Однако  наибольшее внимание внимание
привлекли вещества, получающиеся в результате действия на белки протелитических
фермнтов (протеаз, к ним относятся вышеприведенные ферменты): одни из них были
фрагментами исходных молекул белка (их назвали пептонами),
другие же не подвергались дальнейшему расщеплению протеазами и относились к
известному еще с начала века классу соединений Ц аминокислот (первое
аминокислотное производное Ц амид аспарагин был открыт в 1806 году, а первая
аминокислота Ц цистин в 1810). Аминокислоты в составе белков впервые обнаружил
в 1820 году французский химик  А. Браконно. Он применил кислотный гидролиз
белка и в гидролизате обнаружил сладковатое вещество, названное им глицином. В
1839 году было доказано существование в составе белков лейцина, а в 1849 году
Ф. Бопп выделил из белка еще одну аминокислоту Ц тирозин (полный список дат
открытий аминокислот  в белках см. Приложение II).
К концу  80-х гг. XIX века из белковых гидролизатов было выделено уже 19
аминокислот и стало медленно укрепляться мнение, что сведения о продуктах
гидролиза белков несут важную информацию о строении белковой молекулы. Тем не
менее, аминокислоты считались обязательным, но неглавным компонентом белка.
В связи с открытиями аминокислот в составе белков французский ученый П.
Шютценберже в 70-х гг. XIX века предложил т. н. уреидную теорию 
строения белка. Согласно ей молекула белка состояла из центрального ядра, роль
которого выполняла молекула тирозина, и присоединенных к нему (с замещением 4
атомов водорода) слож ных группировок, названных Шютценберже лейцинами
. Однако гипотеза было очень слабо  подкреплена экспериментально, и дальнейшие
исследования показали  несостоятельность.
     
2.2. Теория Ууглеазотных комплексовФ А.Я.Данилевского
Оригинальную теорию о строении белка высказал в 80-х гг. XIX века русский
биохимик А. Я. Данилевский. Первым из химиков он обратил внимание на возможный
полимерный характер строения белковых молекул. В начале 70-х гг. он писал А.М.
Бутлерову, что Участицы альбумина есть смешанный полимеридФ, что для
определения белка он не находит Утермина более подходящего, чем  слово полимер
в широком смыслеФ. Изучая биуретовую реакцию он предположил, что эта реакция
связана со структурой перемежающихся атомов углерода и азота Ц N Ц C Ц N Ц C Ц
N Ц , которые входят в т.н. углеазотный комплекс RТ Ц NH Ц CO Ц
NH Ц CO Ц RФ. На  основе данной формулы Данилевский полагал, что в молекуле
белка содержится 40 таких углеазотных комплексов. Отдельные
углеазотноаминокислотные комплекс, по Данилевскому, выглядели так:
R Ц NH Ц CO Ц NH Ц CO Ц NH Ц CH2 Ц COOH
Глицин
R Ц NH Ц CO Ц NH Ц CO Ц NH Ц C2H4 Ц COOH
                                                      
Аланин
R Ц NH Ц CO Ц NH Ц CO Ц NH Ц C2H3(OH) Ц COOH
Серин
По Данилевскому углеазотные комплексы могли соединяться эфирной или амидной
связью с образованием высокомолекулярной структуры.
     
2.3. Теория УкириновФ А.Косселя
Немецкий физиолог и биохимик  А. Коссель, изучая протамины и гистоны,
относительно просто устроенные белки, он установил, что при их гидролизе
образуется большое количество аргинина. Кроме того он открыл в составе
гидролизата неизвестную тогда аминокислоту Ц гистидин. На основании этого
Коссель предположил, что эти белковые вещества можно рассматривать как некие
простейшие модели более сложных белков, построенных, по  его мнению, согласно
следующему принципу: аргинин и гистидин составляют центральное ядро
(Упротаминовое ядроФ), которое окружено комплексами из других аминокислот.
Теория Косселя представляла собой наиболее совершенный пример развития гипотезы
о фрагментарном строении белков (впервые предложенной, как было сказано выше,
Г.Мульдером). Этой гипотезой воспользовался немецкий химик М. Зигфрид в начале
XX века. Он полагал, что белки построены из комплексов аминокислот
(аргинин+лизин+глутаминовая к-та), названных им киринами (от
греческого УкириосФ - основной). Однако эта гипотеза была высказана в 1903
году, когда Э. Фишер активно разрабатывал свою пептидную теорию,
давшую ключ к тайне строения белков.
     2.4. Пептидная теория Э.Фишера
Немецкий химик Эмиль Фишер, уже прославившийся на весь мир исследованиями
пуриновых соединений (алкалоидов группы кофеина) и расшифровкой структуры
сахаров, создал пептидную теорию, во многом подтвердившуюся практически и
получившую  всеобщее признание еще при его жизни, за что он был удостоен
второй в истории химии Нобелевской премии (первую получил Я.Г. Вант-Гофф).
Немаловажно, что Фишер построил план исследования, резко отличающийся от
того, что предпринималось раньше, однако учитывающий все известные на тот
момент факты. Прежде всего он принял, как наиболее вероятную гипотезу о том,
что белки построены из аминокислот, соединенных амидной связью:
R Ц CH Ц NH Ц CO Ц CH Ц RТ
|                            |
HOOC                           NH2
Такой тип связи Фишер назвал (по аналогии с пептонами) пептидной.
Он предположил, что белки представляют собой полимеры аминокислот,
соединенных пептидной связью. Идея о полимерном характере строения
белков как известно высказывалась еще Данилевским и Хертом, но они считали, что
УмономерыФ представляют собой очень сложные образования Ц пептоны или
Ууглеазотные комплексыФ.
Доказывая пептидный тип соединения аминокислотных остатков. Э. Фишер исходил
из следующих наблюдений. Во-первых, и при гидролизе белков, и при их
ферментативном разложении  образовывались различные аминокислоты. Другие
соединения было чрезвычайно трудно описать а еще труднее получить. Кроме того
Фишеру было известно, что у белков не наблюдается  преобладания ни кислотных,
ни основных свойств, значит, рассуждал он, амино-  и карбоксильные группы в
составе аминокислот в белковых молекулах замыкаются и как бы маскируют друг
друга (амфотерность белков, как сказали бы сейчас).
Решение проблемы строения белка Фишер разделил, сведя ее к следующим положениям:
1)     Качественное и количественное определение продуктов полного гидролиза
белков.
2)     Установление строения этих конечных продуктов.
3)     Синтез полимеров аминокислот с соединениями амидного (пептидного) типа.
4)     Сравнение полученных таким образом соединений с природными белками.
Из этого плана видно, что  Фишер применил впервые новый методологический
подход Ц синтез модельных соединений, как способ доказательства по аналогии.
     
2.5. Разработка методов синтеза аминокислот
Для того чтобы перейти к синтезу производных аминокислот, соединенных
пептидной связью, Фишер  провел большую работу по изучению строения и синтезу
аминокислот.
До Фишера общим методом синтеза аминокислот был циангидринный синтез А.
Штреккера:
+ NH3;HCN                                      +H+;H2O
     RRТC=O                  RRТC(NH2)CN                RRТC(NH2)COOH
По реакции Штреккера удалось синтезировать аланин, серин и некоторые другие
аминокислоты, а по ее модификации ( реакции Зелинского-Стадникова) как a-
аминокислоты, так и их N-замещенные.
Однако сам Фишер стремился разработать методы синтеза всех известных тогда
аминокислот. Он считал метод Штреккера недостаточно универсальным. Поэтому Э.
Фишеру пришлось искать общий метод синтеза аминокислот в том числе
аминокислот со сложными боковыми радикалами.
Он предложил аминировать бромзамещенные в a-положении карбоновые кислоты. Для
получения бромпроизводных он использовал, как например, в синтезе лейцина,
арилированную или алкилированную малоновую кислоту:
     Br2
Ц
CO2                                 
     (CH3)2CHCH2CH(COOH)2            (CH3)2CHCH2CHBr(COOH)2
                                                                  NH3
                (CH3)CHCH2CHBrCOOH            (CH3)2CHCH2CHNH2COOH
Но создать абсолютно универсальный метод Э. Фишеру не удалось. Были
разработаны и более надежные реакции. Например, ученик Фишера Г. Лейкс
предложил следующую модификацию для получения серина:
     
     
HCN
     C2H5OCH2CHO             C2H5OCH2CH(NH2)CN
                                                                             HBr
              C2H5OCH2CH(NH2)COOH           HOCH2CHNH2COOH
Фишер также доказал, что белки состоят из остатков оптически активных
аминокислот (см. стр.11). Это заставило его разработать новую номенклатуру
оптически активных соединений, методы разделения и синтеза оптических
изомеров аминокислот. Фишер также пришел к выводу, что в белках содержатся
остатки L-форм оптически активных аминокислот, и он доказал это, впервые
использовав принцип диастереоизомерии. Этот принцип заключался в следующем: к
N-ацилпроизводному рацемической аминокислоты добавляли оптически активный
алкалоид (бруцин, стрихнин, цинхонин, хинидин, хинин). В результате этого
образовывались две стереоизомерные формы солей, обладающие различной
растворимостью. После разделения этих диастереоизомеров алкалоид
регенерировали и ацильную группу удаляли путем гидролиза.
Фишер сумел разработать метод полного определения аминокислот в продуктах
гидролиза белков: он переводил хлоргидраты эфиров аминокислот обработкой
концентрированной щелочью на холоду в свободные эфиры, которые заметно не
омылялись. Затем смесь этих эфиров подвергал фракционной перегонке и из
полученных фракций выделял отдельные аминокислоты путем дробной
кристаллизации.
Новый метод анализа не только окончательно подтвердил, что белки состоят из
аминокислотных остатков, но позволил уточнить и пополнить список  встречающихся
в белках аминокислот. Но все же количественные анализы не могли дать ответа на
основной вопрос: каковы принципы строения молекулы белка. И Э.Фишер
сформулировал одну из основных задач в изучении строения и свойств белка:
разработка экспериментальные методы синтеза соединений, основными
компонентами которых были бы аминокислоты, соединенные пептидной связью.
Таким образом Фишер поставил нетривиальную задачу Ц синтезировать новый класс
соединений с целью установления принципов их строения.
Задачу эту Фишер решил, и химики получили убедительные доказательства, что
белки представляют собой полимеры аминокислот, соединенных пептидной связью:
ллл Ц CO Ц CHRТ Ц NH Ц CO Ц CHRТТ Ц NH Ц CO CHRТТТ Ц NH Ц ллл
Это положение подтверждалось биохимическими доказательствами. Попутно
выяснилось, что протеазы гидролизуют не все связи между аминокислотами с
одинаковой скоростью. На их способность расщеплять пептидную связь влияли
оптическая конфигурация аминокислот, заместители по азоту аминогруппы, длина
цепи пептида, а также набор входящих в него остатков.
Главным доказательством пептидной теории стал синтез модельных пептидов и
сопоставление их с пептонами гидролизата белков. Результаты показали, что из
белковых гидролизатов выделяются пептиды, идентичные синтезированным.
В процессе выполнения этих исследований Э.Фишер и его ученик Э.Абдергальд- ен
впервые разработали метод определения аминокислотной последовательности в
белка. Сущность его заключалась в установлении природы аминокислотного
остатка полипептида, имеющего свободную аминогруппу (N-концевую
аминокислоту). Для этого они предложили блокировать в пептиде аминоконец b-
нафталин-сулфониловой группой, которая не отщепляется при гидролизе. Выделяя
затем из гидролизата аминокислоту, меченую такой группой, можно было
определить, какая из аминокислот была N-концевой.
После исследований Э.Фишера стало ясно, что белки представляют собой
полипептиды. Это было важное достижение, в том числе и для задач синтеза
белков: стало ясно, что именно нужно синтезировать. Только после этих
работ проблема синтеза белка приобрела определенную направленность и
необходимую строгость.
Говоря о работе Фишера в целом, следует отметить, что сам подход к
исследованию был типичен скорее для наступающего XX века Ц он оперировал
широким набором теоретических положений и методических приемов; его синтезы
все менее и менее походили на искусство, основанное на интуиции, чем на
точном знании, и приближались к созданию серий точных, почти технологических
приемов.
     
2,6, Кризис пептидной теории
В связи с применением новых физических и физико-химических методов
исследований в начале 20-х гг. XX в. появились сомнения в том, что молекула
белка представляет длинную полипептидную цепь. К гипотезе о возможности
компактной укладки пептидных цепочек относились со скептицизмом. Все это
потребовало пересмотра пептидной теории Э.Фишера.
В 20-30-е гг. распространение получила дикетопиперазиновая теория. Согласно
ей, центральная роль в построении структуры белка играют дикетопиперазивные
кольца, образующиеся при циклизации двух аминокислотных остатков. Также
предполагалось, что эти структуры составляют центральное ядро молекулы, к
которому присоединены короткие пептиды или аминокислоты (УнаполнителиФ
циклического скелета основной структуры). Наиболее убедительные схемы участия
дикетопиперазинов в построении структуры белка были представлены
Н.Д.Зелинским и учениками Э.Фишера.
Однако попытки синтеза модельных соединений, содержащих дикетопиперазины
мало, что дали для химии белка - впоследствии восторжествовала пептидная
теория, однако эти работы оказали стимулирующее влияние на химию пиперазинов
в целом.
После пептидной и дикетопиперазивной теорий продолжались попытки доказать
существование только пептидных структур в молекуле белка. При этом стремились
представить себе не только тип молекулы, но и общие ее очертания.
Оригинальную гипотезу высказал советский химик Д.Л.Талмуд. Он предположил,
что пептидные цепи в составе белковых молекул свернуты в большие кольца, что
в свою очередь стало шагом к созданию им представления о белковой глобуле.
Одновременно появились данные, свидетельствующие о различном наборе
аминокислот в различных белка. Но закономерности, которым подчиняется
последовательность аминокислот в структуре белка, были не ясны.
Первыми ответ на этот вопрос пытались дать М.Бергман и К.Ниман в
разработанной ими гипотезе Уперемежающихся частотФ. Согласно ей
последовательность аминокислотных остатков в белковой молекуле подчинялась
числовым закономерностям, основы которых были выведены из принципов строения
белковой молекулы фиброина шелка. Но этот выбор был неудачным, т.к. этот
белок фибриллярный, строение же глобулярных белков подчиняется совсем другим
закономерностям.
По М.Бергману и К.Ниману, каждая аминокислота встречается в полипептидной
цепи через определенной интервал или, как говорил М.Бергман, обладает
определенной УпериодичностьюФ.эта периодичность определяется природой
аминокислотных остатков.
Молекулу фиброина шелка они представляли себе следующим образом:
     
GlyAlaGlyTyr GlyAlaGlyArg GlyAlaGlyx GlyAlaGlyx
(GlyAlaGlyTyr GlyAlaGlyx GlyAlaGlyx GlyAlaGlyx)12
GlyAlaGlyTyr GlyAlaGlyx GlyAlaGlyx GlyAlaGlyArg
(GlyAlaGlyTyr GlyAlaGlyx GlyAlaGlyx GlyAlaGlyx)13
Гипотеза Бергмана-Нимана оказала значительное влияние на развитие химии
аминокислот - большое количество работ было посвящено ее проверке.
В заключение этой главы следует отметить, что к середине XX в. было накоплено
достаточно доказательств справедливости пептидной теории, основные ее
положения  были дополнены и уточнены. Поэтому центр исследований белков в XX
в. лежал уже области исследования и поиска методов синтеза белка
искусственным путем. Эта задача была успешно решена, были разработаны
надежные методы определения первичной структуры белка - последовательности
аминокислот в пептидной цепи, разработаны методы химического (абиогенного)
синтеза нерегулярных полипептидов (подробнее эти методы рассматриваются в
гл.8, стр.36), в том числе методы автоматического синтеза полипептидов. Это
позволило уже в 1962 г. крупнейшему английскому химику Ф.Сенгеру расшифровать
структуру и синтезировать искусственным путем гормон инсулин, что
ознаменовало новую эру в синтезе полипептидов - функциональных белков.
                Глава 3. Химический состав белков.                
     
3.1. Пептидная связь
Белки представляют собой нерегулярные полимеры, построенные из остатков
a-аминокислот, общую формулу которых в водном растворе при значениях pH близких
к нейтральным можно записать как NH3+CHRCOO Ц 
. Остатки аминокислот в белках соединены между собой амидной связью между
a-амино- и a-карбоксильными группами. Пептидная связь между двумя 
a-аминокислотными остатками обычно называется пептидной связью, а
полимеры, построенные из остатков a-аминокислот, соединенных пептидными
связями, называют полипептидами. Белок как биологически значимая
структура может представлять собой как один полипептид, так и несколько
полипептидов, образующих в результате нековалентных взаимодействий единый
комплекс.
     
3.2. Элементный состав белков
Изучая химический состав белков, необходимо выяснить, во-первых, из каких
химических элементов они состоят, во-вторых, -  строение их мономеров. Для
ответа на первый вопрос определяют количественный и качественный состав
химических элементов белка. Химический анализ показал наличие во всех
белках углерода (50-55%), кислорода (21-23%), азота (15-17%), водорода
(6-7%), серы (0,3-2,5%). В составе отдельных белков обнаружены
также фосфор, йод, железо, медь и некоторые другие макро- и микроэлементы, в
различных, часто очень малых количествах.
Содержание основных химических элементов  в белках может различаться, за
исключением азота, концентрация которого характеризуется наибольшим
постоянством и в среднем составляет 16%. Кроме того, содержание азота в
других органических веществах мало. В соответствии с этим было предложено
определять количество белка по входящему в его состав азоту. Зная, что  1г
азота содержится в 6,25 г белка, найденное количество азота умножают
коэффициент 6,25 и получают количество белка.
Для определения химической природы мономеров белка необходимо решить две задачи:
разделить белок на мономеры и выяснить их химический состав. Расщепление белка
на его составные части достигается с помощью гидролиза Ц длительного кипячения
белка с сильными минеральными кислотами (кислотный гидролиз) или
основаниями (щелочной гидролиз). Наиболее часто применяется кипячение
при 110