Диплом: Атф индуцированное изменение внутриклеточной концентрации кальция в нейронах неокортекса крыс
МИНИСТЕРСТВО ВЫСШЕГО И СРЕДНЕГО СПЕЦИАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИИ
МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ
ДИПЛОМНАЯЯ РАБОТА
АТФ индуцированное изменение внутриклетоЧной концентрации кальцияЯ в нейронах
неокортекса крыс.
НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ академик Магура И.С.
КОНСУЛЬТАНТ к. б. н.
Войтенко Н.В.
рецензент
к.б.н. Исаев Д
ДИПЛОМНИК кругликов
И.А.
Москва 1998
Оглавление
1.
ÂÂÅÄÅÍÈÅ....................
.............................................................................
.
2. ÎÁÇÎÐ
ËÈÒÅÐÀÒÓÐÛ.......
..........................................................................
2.1 Ãîìåîñòàç êàëüöèßÿ â íåðâíûõ êëåòêàõ........................................
2.1.1 Êàëüöèåâûå êàíàëû ïëàçìàòè÷åñêîé ìåìáðàíû........................................
2.1.2 Êàëüöèåâûå
áóôåðû..........................................................................
2.1.3 Êàëüöèåâûå êàíàëû ýíäîïëàçìàòè÷åñêîãî ðåòèêóëóìà............................
2.1.4 Êàëüöèåâûå
íàñîñû..........................................................................
2.1.5 Êàëüöèåâûå îáìåííèêè.......................................................................
2.1.6 Ñà2+-ñâÿçûâàþùèå îðãàíåëëû............................................................
2.2 Вëèßÿíèå ÀÒÔ íà êàëüöèåâûé ãîìåîñòàç.......................................
2.2.1 Ñòðîåíèå è ñâîéñòâà ÀÒÔ................................................................
2.2.2 Íîìåíêëàòóðà è ñóáêëàññèôèêàöèÿ ïóðèíîðåöåïòîðîâ............................
2.2.3 Ð1
ïóðèíîðåöåïòîðû............................................................................
2.2.4 Ð2
ïóðèíîðåöåïòîðû............................................................................
2.2.5 Ðåêëàññèôèêàöèÿ ïóðèíîðåöåïòîðîâ...................................................
3. ÎÁÚÅÊÒ È
ÌÅÒÎÄÛ
ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍ&Egr
ave;É............................................................
3.1 Ïîäãîòîâêà ïðåïàðàòà........................................................................
3.2 Õàðàêòåðèñòèêè êàëüöèåâîãî çîíäà............................................
3.3 Îêðàñêà ñðåçîâ ôëóîðåñöåíòíûì êðàñèòåëåì..............................
3.4 Ñòðóêòóðà
ýêñïåðèìåíòàëüíîé
óñòàíîâêè
äëÿß
äâóõ-âîëíîâîãî
èçìåðåíèÿ
êîíöåíòðàöèè
êàëüöèÿß........................................................................
3.5 Ðàñòâîðû è ñìåíà ðàñòâîðîâ...........................................................
4. ÐÅÇÓËÜÒÀÒÛ
ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍ&Egr
ave;É.................................................................
5.
ÎÁÑÓÆÄÅÍÈÅ...
.............................................................................
............
6.
ÂÛÂÎÄÛ....................................
.................................................................
7. ÑÏÈÑÎÊ
ËÈÒÅÐÀÒÓÐÛ.......
.......................................................................
1. ВВЕДЕНИЕ
Молекула АТФ давно известна как повсеместно распространенный источник энергии
для внутриклеточного метаболизма. Но ее свойства как нейротрансмитера были
обнаружены сравнительно недавно. Сегодня уже не осталось никаких сомнений, что
АТФ является нейротрансмитером в автономных нейромышечных соединениях, ганглиях
и центральной нервной системе. К примеру, было показано, что АТФ вовлечена в
генерацию болевых сигналов через Р2Х1 и Р2Х2 рецепторы.
Однако роль и распределение пуринорецепторов в коре головного мозга и особенно
в моторной коре до сих пор остается слабо изученной. Поэтому изучение
механизмов действия АТФ в коре головного мозга представляет несомненный
интерес. Мы изучали действие АТФ посредством измерения концентрации
внутриклеточного кальция, - одного из найболее важных и универсальных
регуляторов клеточных функций.
Цель работы состояла в изучении механизмов генерации АТФ - индуцированных
внутриклеточных кальциевых сигналов в нервных клетках моторной коры.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Гомеостаз кальция в нервных клетках
Концентрация цитозольного кальция в эукариотических клетках регулируется
трансмембранным транспортом и цитоплазматическим связыванием кальция. Движение
ионов кальция через мембрану контролируется: 1) двумя семействами Са2+
каналов, как то: кальциевыми каналами плазмалеммы и кальциевыми каналами,
расположенными в мембране эндо(сарко)плазматического ретикулума (ЭР или СР),
которые формируют пути входа кальция в цитоплазму; 2) выводом кальция из
цитоплазмы благодаря активности кальциевых насосов плазмалеммы и/или кальциевых
обменников; и 3) аккумуляцией ионов кальция внутриклеточными кальциевыми депо и
митохондриями. Последние служат системами кальциевого буфера, способными
аккумулировать и накапливать ионы кальция, поддерживая таким образом гомеостаз
кальция в цитоплазме.
2.1.1 Кальциевые каналы плазматической мембраны
Нервные клетки экспрессируют различные типы кальциевых каналов плазмалеммы,
которые могут быть активированы различными воздействиями. Основываясь на
механизмы активации, кальциевые каналы могут быть разделены на несколько
типов потенциал - управляемых и рецептор - управляемых каналов.
Потенциал - управляемые каналы вносят существенный вклад как в регуляцию
входа кальция в цитоплазму, так и в нейрональный электрогенез. Белки,
образующие кальциевые каналы, состоят из 5 субъедениц (a1, a2
, b, g, d). Главная субъеденица a1 формирует собственно канал и
содержит места связывания для различных модуляторов кальциевых каналов. Было
обнаружено несколько структурно различных a1 субъедениц кальциевых
каналов в нервных клетках млекопитающих (обозначенных как A, B, C, D и E).
Функционально кальциевые каналы различных типов отличаются друг от друга
активацией, кинетикой, проводимостью одиночного канала и фармакологией. В
нервных клетках описано до 6 типов потенциал - управляемых кальциевых каналов
(T-, L-, N-, P-, Q-, R- каналы). Активность потенциал - управляемых каналов
плазмалеммы регулируется различными внутриклеточными вторичными посредниками и
мембраносвязанными G-белками (33,26).
Второй важный путь потока ионов кальция через мембрану связан с активацией
агонист - управляемых каналов. Многие агонист - управляемые каналы обладают
значительной кальциевой проницаемостью при физиологических условиях. Такую
кальциевую проницаемость обнаруживают нейрональные
ацетилхолин(Ach)-управляемые, глутамат -управляемые (NMDA и AMPA/Каинат типы) и
пуринорецепторы (10,18,49,34). Кроме кальциевых каналов плазмалеммы,
управляемых внешними воздействиями, в эукариотических клетках было открыто
также несколько типов кальциевых каналов, контролируемых внутриклеточными
вторичными посредниками. В частности, IP3-управляемые кальциевые
каналы были обнаружены в нейронах Пуркинье мозжечка (34), а IP4
-управляемые кальциевые каналы - в клетках эндотелия (35).
Третий, недавно обнаруженный, особый тип Са2+ каналов, который
контролируется заполненностью внутриклеточных кальциевых депо, осуществляя
таким образом прямую связь между освобождением Са2+ в цитоплазму из
депо и вход в нее Са2+ через плазмалемму.
2.1.2 Кальциевые буферы
Большая часть ионов Са2+, входящих в клетку, практически немедленно
связывается цитоплазматическими местами связывания кальция. Показано, что
только менее 1% ионов кальция, которые проникают в цитозоль, остается в
несвязанном состоянии (11). Цитозольные кальциевые буферы представлены главным
образом Са2+-связывающими белками, такими как парвальбумин,
кальмодулин, тропонин-С, кальретинин, кальциунеурин, белок S-100 (25). Кроме
того, цитозольная буферная емкость может быть опосредована АТФ, которая
способна связывать значительное количество Са2+ (64). 20-50%
цитозольных кальциевых буферов могут быть удалены из цитоплазмы при
перфузировании клетки, что показывает их мобильность, в то время как оставшаяся
часть Са2+-связывающей емкости относится к фиксированным буферам.
Мобильные кальциевые буферы могут играть важную функциональную роль,
способствуя диффузии ионов Са2+ в цитоплазме и распространению Са
2+ сигнала по клетке. Внутриклеточное введение эндогенных Са2+
буферов (кальбиндина D28k и парвальбумина) через микропипетку
приводило к увеличению скорости нарастания [Ca2+]i на
несколько порядков и существенно влияло на кинетику изменения [Ca2+]
i, что подтверждает роль мобильных Са2+ буферов с низким
молекулярным весом в эффективном регулировании внутриклеточной концентрации
кальция.
2.1.3 Кальциевые каналы эндоплазматического ретикулума
Са2+ каналы ЭР являются олигометрическими протеинами, встроенными в
мембрану ЭР. Эти каналы можно относительно легко выделить из клетки для
дальнейшего структурного анализа благодаря тому, что белки канала связываются
специфически и с высоким сродством с IP3 (для IP3
-управляемых каналов) и с рианодином (для Са2+-управляемых каналов).
Са2+-управляемые Са2+ каналы ЭР. Эти кальциевые
каналы были впервые выделены из скелетных и сердечных мышц. Оказалось, что Са
2+ каналы ЭР в этих мышечных тканях имеют молекулярные различия и
закодированы различными генами. Са2+ каналы ЭР в сердечных мышцах
непосредственно связаны с высокопороговыми Са2+ каналами плазмалеммы
(L-тип) через кальцийсвязывающие белки, образуя, таким образом, функционально
активную структуру - лтриаду. В скелетных мышцах деполяризация плазмалеммы
прямо активирует освобождение Са2+ из саркоплазматического
ретикулума благодаря тому, что Са2+ каналы плазмалеммы служат
потенциал - чувствительными передатчиками активирующего сигнала непосредственно
Са2+ каналам ЭР через связывающие белки (44). Таким образом, Са
2+ депо скелетных мышц обладают механизмом освобождения Са2+,
вызываемым деполяризацией (RyR1-тип). В отличие от скелетных мышц,
саркоплазматические Са2+ каналы кардиомиоцитов не связаны с
плазмалеммой, и для стимуляции освобождения Са2+ из депо требуется
увеличение концентрации цитозольного кальция (RyR2-тип). ДНК, кодирующая белки
двух типов каналов Са2+ освобождения, была клонирована из тканей
человека и кролика, что дало возможность экспрессировать Са2+
-управляемые Са2+ каналы в модельные клеточные системы. Белки,
встроенные в липидный бислой, формируют чувствительные к рианодину каналы,
активируемые ионами Са2+ (50 нмоль/л) в присутствии АТФ (29). Кроме
этих двух типов Са2+-активируемых Са2+ каналов, недавно
был идентифицирован третий тип Са2+ каналов ЭР (RyR3-тип), который
является продуктом другого гена. Этот третий тип Са2+ каналов ЭР,
как было показано, не чувствителен к кофеину (21). Эксперименты, проведенные на
нервных тканях, продемонстрировали присутствие всех трех типов Са2+
-управляемых Са2+ каналов ЭР в мозге млекопитающих, однако RyR2-тип
является доминантным (38). Са2+-управляемые Са2+ каналы
ЭР являются гомотетрамерами, состоящими из мономеров с молекулярным весом 500
КД (39)
IP3-управляемые Са2+ каналы ЭР. Существование IP
3-управляемых Са2+ каналов впервые было обнаружено в нейронах
Пуркинье. Позже было показано, что они встроены в мембрану эндоплазматического
ретикулума. Структура IP3-управляемых Са2+ каналов сходна
со структурой Са2+-управляемых Са2+ каналов ЭР. Они также
являются гомотетрамерами с молекулярным весом мономера 260 КД. 50% этих каналов
активируется 15 мкмоль/л IP3 и блокируется рутением красным и La
3+. IP3-управляемые Са2+ каналы были выделены из
мозга млекопитающих, и их аминокислотная последовательность была расшифрована.
Было показано, что семейство генов, экспрессирующих IP3-управляемые
Са2+ каналы, состоит из трех или четырех различных генов; они
характеризуются различной чувствительностью к IP3 и по-разному
распределены в мозге млекопитающих (45). Порог активации этих каналов варьирует
между 0.2 - 0.5 мкмоль/л в нейронах Пуркинье мозжечка и возрастает до 9
мкмоль/л в астроцитах.
2.1.4 Кальциевые насосы
Существует два семейства Са2+ насосов, ответственных за устранение
ионов Са2+ из цитоплазмы: Са2+ насосы плазмалеммы и Са
2+ насосы эндоплазматического ретикулума. Хотя они относятся к одному
семейству белков (так называемому P-классу АТФ-аз), эти насосы обнаруживают
некоторые различия в строении, функциональной активности и фармакологии.
Кальциевый насос плазмалеммы. Са2+ насос плазмалеммы, который
удаляет ионы Са2+ из цитоплазмы в межклеточное пространство, был
открыт в 1966 году. Молекулярные свойства Са2+ насосов плазмалеммы
описаны в нескольких обзорах (18), однако достоверных данных о скорости вывода
Са2+ и регуляции Са2+ насосов в нервных клетках немного.
Недавно был разработан двухфлуоресцентный микрокапельный метод (58),
позволяющий одновременно измерять [Ca2+]i и выход Са
2+ наружу на одиночных клетках. Исследования, проведенные с помощью
данного метода на нейронах моллюска и секреторных клетках, показали, что
активность Са2+ насоса плазмалеммы контролируется непосредственно
[Ca2+]i: увеличение концентрации цитоплазматического
кальция активирует Са2+ насос (58). В нейронах моллюска около 40%
ионов кальция, входящих в клетку в ответ на деполяризацию мембраны, выводится
из нейрона уже во время фазы нарастания [Ca2+]i, отражая
таким образом активацию кальциевого насоса плазмалеммы увеличением концентрации
цитозольного Са2+ (58).
Кальциевый насос эндоплазматического ретикулума. Во многих
эукариотических клетках, наряду с Са2+ насосом плазмалеммы,
существует кальциевый насос сарко(эндо)плазматического ретикулума (SERCA). В
настоящее время описано по крайней мере 3 различных изоформы SERCA-насосов в
клетках млекопитающих. SERCA1-подтип сосредоточен исключительно в быстрых
скелетных мышцах, SERCA2-насосы широко распространены в других тканях.
Значимость SERCA3-насосов менее ясна (13). Белки SERCA2-насосов разделяются на
две различные изоформы: SERCA2а, характерные для кардиомиоцитов и гладких мышц,
и SERCA2b, характерные для тканей мозга. Предполагается, что насосы SERCA
различными способами регулируются цитоплазматической и интралюминальной
концентрациями Са2+: Увеличение [Ca2+]i
активирует захват ионов кальция в ЭР, в то время как увеличение свободного
кальция внутри ЭР ингибирует насосы SERCA (12). Насосы SERCA эффективно и
селективно блокируются тапсигаргином в наномолярных концентрациях (37) и
микромолярными концентрациями циклопиазоновой кислоты. Однако, тапсигаргин
вызывает также блокаду потенциал - управляемых кальциевых каналов плазмалеммы,
как это показано на клетках коркового слоя надпочечников и на сенсорных
нейронах (Shmigol et al., 1995), поэтому его следует использовать с
некоторой осторожностью.
2.1.5 Кальциевые обменники
Дополнительным механизмом, ответственным за вывод ионов кальция из цитоплазмы,
является натрий-кальциевый обменник, который выводит Са2+, используя
энергию натриевого электрохимического градиента. Наличие Na+- Са
2+ обменника было показано в различных типах возбудимых и невозбудимых
клеток; в клетках нервной системы он был обнаружен в конце 60-х годов (9). В
нейронах моллюска, помещенных в среду с пониженным натрием (т.е. с обратным
натриевым градиентом), наблюдалось увеличение [Ca2+]i,
что является результатом работы обменника в инвертированной форме. Однако,
вклад Na+- Са2+ обменника в регуляцию [Ca2+]
i в нейронах млекопитающих до сих пор не оценен. В некоторых работах было
показано, что обменник принимает незначительное участие в удалении
цитоплазматического Са2+, в то время как в других работах
представлены данные о том, что обменник играет существенную роль в переносе Са
2+ через мембрану (57).
2.1.6 Са2+-связывающие органеллы
Кроме быстрого связывания цитозольного Са2+ внутриклеточными Са
2+-связывающими белками, ионы кальция, попадающие в цитозоль, могут
аккумулироваться аппаратом Гольджи или клеточным ядром, захватываться
митохондриальными Са2+ депо, имеющими достаточно невысокое сродство
к Са2+, или быстрыми депо, связанными с ЭР или СР, имеющими высокое
сродство к Са2+. Однако если [Ca2+]i превышает
0,5 мкмоль/л, наблюдается существенное перераспределение [Ca2+]
i в область митохондрий. Буферные системы митохондрий принимают участие в
удалении избыточного Са2+ из цитоплазмы в клетках кишечника,
некоторых типах нервных клеток (59) и в секреторных клетках после повышения [Ca
2+]i, стимулированного агонистами. Связывание кальция
митохондриями обеспечивается активностью систем, расположенных на внутренней
митохондриальной мембране. Са2+ поступает в митохондрии по
электрохимическому градиенту; разность потенциалов, обеспечивающая транспорт
кальция, создается переносом электронов во время клеточного дыхания и
связанного с ним переносом протонов. Перенос электронов по дыхательной цепи
является основным механизмом, обеспечивающим энергетику транспорта кальция.
Подавление дыхательной цепи карбонил-цианид-м-хлорофенил-гидразоном (СССР)
эффективно блокирует аккумуляцию кальция митохондриями (41).
2.2 Влияние АТФ на кальциевый гомеостаз
Последние исследования показали, что АТФ занимает прочное место в ряду
нейромедиаторов центральной и периферической нервной систем (Burnstock 1990).
Не вызывает сомнения, что АТФ является не только важнейшим внутриклеточным
метаболитом, но и служит важным объектом межклеточного взаимодействия.
2.2.1 Строение и свойства АТФ
Рисунок 1. Строение молекулы АТФ
АТФ (см. рис.1) представляет собой нуклеотид и как всякий нуклеотид состоит
из трех компонентов: азотистого основания, сахара пентозы и фосфата. В
качестве азотистого основания в нуклеотидах присутствуют производные пурина и
пиримидина. Фосфаты соединены в полифосфатную цепь, количество которых в
естественных нуклеотидах не превышает трех. Однако синтезированы нуклеотиды,
содержащие линейные цепи из более чем 3-х фосфатов, к примеру аденозинтетра-
и аденозинпентафосфаты.
Названия нуклеотидов, содержащих в качестве сахара рибозу, складываются из
названия соответствующего нуклеозида, приставки, обозначающей количество
фосфатных групп в нуклеотиде и слова фосфат. Для наиболее распространенных
нуклеотидов приняты сокращенные названия, например АТФ для
аденозинтрифосфата, ГТФ - для гуанозинтрифосфата, ИМФ - инозинмонофосфата.
В области нейтральных значений pH нуклеиновые основания и рибоза в растворе не
заряжены (Мартин, Мариам, 1982). Нуклеотиды, из-за наличия фосфатов,
представляют собой сильные кислоты. АТФ содержит четыре ОН группы, способные к
ионизации, три из которых имеют pKa ниже 3, а pKa четвертой - 6,5 (Ленинджер,
1976). Таким образом, при pH 7,4 подавляющее большинство молекул АТФ
представляют собой четырехзарядные анионы АТФ4- , кроме того, в
растворе присутствует небольшое количество АТФ3-.
2.2.2 Номенклатура и субклассификация пуринорецепторов.
Первое разделение пуринорецепторов на Р1 и Р2 типы
основывалось на следующем критерии: нуклеозиды такие как аденозин активировали
Р1 пуринорецепторы, в то время как АТФ стимулировала Р2
пуринорецепторы, а метилксантины (кофеин, теофиллин) являются селективными
антагонистами Р1 пуринорецепторов. Также Р1
пуринорецепторы связаны с аденилатциклазой, а активация Р2
пуринорецепторов может приводить к выработке простогландинов (Burnstock 1978).
2.2.3 Р1 пуринорецепторы.
В 1979 году (Van Calker et al 1979) показали, что аденозиновые, Ð1
- пуринорецепторы можно подразделить на две группы. Рецепторы одной из них
обладали очень высоким сродством к аденозину (константа диссоциации Кd
= 3 - 10 нМ). При взаимодействии аденозина с этой группой рецепторов наблюдалось
ингибирование аденилатциклазы и, следовательно, уменьшался уровень
внутриклеточного цАМФ. Этот класс рецепторов был назван А1
-рецепторами (Ri рецепторы по (Londos et al 1980)). Аденозиновые
рецепторы, относящиеся ко второй группе, имели более низкое сродство к
аденозину (Кd комплекса аденозина с рецептором 5-10 мкМ). Активация
этого типа рецепторов приводила к стимуляции аценилатциклазы. Эти рецепторы Ван
Колкер назвал А2-рецепторами (Ra рецепторы по (Londos et
al 1980)). Были обнаружены также и мощные антагонисты для А1 - R-N
6-Фенилизопропиладенозин (R-PIA). Для А2 более сильным
антагонистом был 5Т-N-этилкарбоксамидаденозин (NЕСА). Также существуют работы,
в которых описываются аденозиновые рецепторы, не связанные с аденилатциклазой
эти пуринорецепторы было предложено назвать А3 (Ribeiro and
Sebastiao 1986). Предпосылкой к разделению А2 пуринорецепторов на А
2а и А2b подтипы стало открытие разного сродства
NECA к Р1 пуринорецептору, - высокого в стриатуме (А2а) и
низкого в фибробластах (А2b) (Bruns et al 1986).
2.2.4 Р2 пуринорецепторы
Накопленные фармакологические доказательства, как-то: тип ответа, порядок
активности агонистов, десенситизация, вызываемая АТФ и ее структурными
аналогами, послужили основой для первого субделения Р2
пуринорецепторов. В 1985 году Бернсток и Кеннеди (10) указали на неоднородность
популяции Р2-пуринорецепторов. Этот вывод был сделан исходя из того,
что в некоторых тканях (например продольная мышца слепой кишки) АТФ вызывал
расслабление гладких мышц, а в других (мышечная стенка мочевого пузыря) -
сокращение. Первый подтип рецепторов был обозначен как Р2у, а второй
- Р2х. Для Р2х пуринорецепторов наиболее активным
агонистом был a, b - метилен АТФ (a,b-мАТФ), а для Р2у - 2 -
метилтио АТФ (2-МеSАТP). Так как порядок активности лигандов может зависеть от
скорости их гидролиза до неактивных соединений, которая может значительно
различаться в зависимости от ткани, более четким доказательством для
подразделения Р2 - рецепторов на подтипы служит наличие селективных
блокаторов. Сейчас известны селективные антагонисты как для Р2х, так
и Р2у-рецепторов для Р2х - a,b-мАТФ (десенситизирующее
действие), арилазидаминопропионил АТФ (АНАПП3),
пиридоксалфосфат-6-азофенил-2Т,4Т-дисульфидная кислота (PPADS), сурамин и
другие; для Р2у пуринорецепторов - реактив голубой 2, сурамин. В
1986 году Гордон (23) предложил выделить из класса Р2
пуринорецепторов еще два подтипа Р2t и Р2z.
Первый рецептор располагается в тромбоцитах и управляет их агрегацией. Он, в
отличие от всех остальных подтипов P2 - рецепторов, активируется
АДФ, и блокируется АТФ. Р2z рецепторы расположены в
тучных клетках. В них АТФ в очень больших концентрациях (> 100 мкМ), а
точнее четырехзарядный анион АТФ4-, вызывал кальцийзависимую
секрецию гистамина. Другие пуриновые нуклеотиды, включая негидролизуемые
аналоги АТФ, не активировали рецептор. Также был обнаружен неселективный
антагонист данного типа рецепторов DIDS - аналог PPADS (Soltoff et al 1993). В
1991 году OТConnor предложил так называемый нуклеотидный рецептор одинаково
чувствительный как к АТФ, так и к УТФ, но не чувствительный к 2 - MeSATP. Этот
рецептор получил обозначение Р2u. Возможным антагонистом
данного рецептора является сурамин. Также было обнаружено, что аденин
динуклеотид полифосфаты также присутствуют в фармакологической периферии (Hoyle
1990). Hildermann (1991) индентифицировал сайт связывания для диаденозин
тетрафосфата ( Ap4A) в мозге крысы, который получил название
дипуринергического рецептора, а позднее Р2d (Pintor et al
1993). Антагонисты данного вида пуринорецепторов пока не обнаружены.
пуринорецепторы
Р1 - пуринорецепторы
Р2 - пуринорецепторы
A1
A2a
A2b
A3
P2x
P2y
P2t
P2z
P2u
P2d
Таблица 1. Классическая схема субклассификации пурино-рецепторов.
2.2.5 Реклассификация пуринорецепторов.
Из - за всевозрастающих трудностей и несогласований в классической схеме
классификации Ð2 пуринорецепторов и увеличивающемся числе
подтипов рецепторов, стало очевидным, что классическая схема требует
пересмотра. В 1994 году Abbracchio and Burnstock предложили новую схему
классификации Р2 - пуринорецепторов. Из всех Р2 -
пуринорецепторов они вычленили три основных семейства: Р2Х семейство, связанное
с ионотропными каналами, которое включало четыре подтипа; Р2У - связанное с
активацией G - белков, включающее семь подтипов и семейство Р2Z - семейство
неселективных пор. Их гипотеза основывалась в основном на изучении литературных
источников и анализе фармакологического профиля новообнаруженныж агонистов. В
дальнейшем теория подтвердилась клонированием различных подтипов Р2
- пуринорецепторов. В настоящее время семейство Р2Х насчитывает шесть, а Р2У -
семь подклассов. Благодаря интенсивным исследованиям, практически не остается
сомнений в том, что данные семейства будут расти и дальше (Collo et al 1996).
Р2 - пуринорецепторы
P2Z - неселективные поры Р2Х - семейство
ионотропных
рецепторов
Р2У - семейство
метаботропных
рецепторов
Р2Х1
Р2Х2
Р2Х3
Р2Х4
Р2Х5
Р2Х6
Р2У1
Р2У2
Р2У3
Р2У4
Р2У5
Р2У6
Р2У7
Таблица 2. Современная классификация Р2 типа пуринорецепторов.
3. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Подготовка препарата
Исследования проводились на пирамидальных нейронах моторной области новой коры в
тонких срезах мозга, выделенного из 14 дневных крыс. После декапитации мозг
помещался в холодный солевой раствор (0 - 40С). Процедура от начала
декапитации до выделения мозга длилась не более 60-90 секунд. Затем мозг
закреплялся полиакриламидным клеем на подложке вибротома (Campden, Campden
Instruments LTD, U.K.); камера вибротома заливалась холодным солевым раствором.
Срезы нарезались сагитально толщиной 250 - 300 мкм; скорость подачи лезвия - 1
см/с с частотой 10 Гц. После приготовления срезы помещались в раствор постоянно
насыщаемый карбогеном (5% СО2 + 95% О2). Перед загрузкой
флуоресцентным красителем срезы инкубировались в постоянно оксигенируемом
растворе 30 минут при температуре 32 градуса. Окраска среза осуществлялась в
течении 30 - 35 минут в СО2 насыщенном термостате при температуре 35
градусов. После окраски срезы отмывались 1 - 1,5 часа в постоянно
оксигенируемом растворе при комнатной температуре. Все эксперименты проводились
при температуре 32 градуса.
3.2 Характеристики кальциевого зонда
Для количественного определения концентрации кальция в пирамидальных нейронах
моторной области новой коры использовался краситель Фура-2 AM (рисунок 2)
(16).
На рисунке 3 представлен спектр зонда Фура -2 AM. При связывании с кальцием
происходит характерное изменение спектра возбуждения этого красителя: при
возбуждении светом с длиной волны 390 нм происходит уменьшение флуоресценции, а
при возбуждении светом, с длиной волны 340 нм - увеличение. Однако, 340 нм
является уже ультрафиолетовым светом, и для ее использования необходим
микроскоп с кварцевыми линзами. Поскольку в нашем случае был использован
обычный микроскоп, то вторая волна была выбрана длиной 390 нм. 360 нм - это
изобестическая точка зонда Фура -2, т.е. флуоресцентный сигнал при возбуждении
светом этой длины волны не зависит от концентрации Ca2+ и есть
функция лишь концентрации зонда.
Измерение флуоресценции при возбуждении двумя длинами волн позволяет легко
рассчитать [Ca2+]i в клетке по формуле (24):
[Ca2+]i= Kd * b * (R - Rmin)/(Rmax-R)
где Кd - константа диссоциации комплекса Фура -2 с кальцием, R=F
360/F390 - текущее отношение флуоресцентных сигналов, Rmin
= F360/F390|Ca0 - то же отношение в растворе с низкой
концентрацией Ca2+, Rmax = F360/F390
|Caе - то же отношение в растворе с высокой концентрацией Ca2+
, b = F390|Ca0/F390|Caе - отношение
флуоресцентных сигналов в низкой и высокой концентрации Ca2+ при
возбуждении длиной волны 390 нм. Параметры Rmin, Rmax и b
определяли экспериментально. Для этого были приготовлены базовый раствор (в
ммоль/л) : KCl - 100, Tris-Cl - 10 (pH=7.2), Фура -2 - 0.005; раствор с низкой
концентрацией Ca2+ готовился без добавления Ca2+ с
добавкой EGTA - 10; раствор с высокой концентрацией Ca2+ - с
добавкой CaСl2 - 10. Отношение величин флуоресценции определялось в
каплях приведенных выше растворов, помещенных на дно экспериментальной камеры.
В результате для нашей системы Rmin= 0.33, Rmax= 8.9 и
b=12.8. Параметр Кd был взял из работы [Grinkiewicz et al, 1985] и
равнялся 224 нмоль/л.
3.3 Окраска срезов флуоресцентным красителем
Для введения кальций - чувствительного зонда в клетку, срезы инкубировались в
растворе Тироде, содержащим эстерифицированную незаряженную форму красителя
Фура-2 ацетоксиметилэстер в концентрации 5 мкмоль/л, растворенную в
диметилсульфоксиде с добавлением детергента Плуроник F-127 (0.02%). В такой
форме краситель проникает в клетку, затем эндогенными эстеразами эфирные группы
отщепляются, зонд становится заряженным и покинуть клетку не может. Окраска
производилась 20 минут при температуре 35оС. Концентрация зонда в
клетке определялась путем титрования окрашенных клеток раствором красителя,
который добавлялся во внеклеточный раствор. Оцененная таким способом
концентрация зонда в клетке была в диапазоне 30 - 70 мкмоль/л.
3.4 Структура экспериментальной установки для двух-волнового измерения
концентрации кальция
Принципиальная схема установки представлена на рисунке 4. Основными
элементами ее являются: источник света, система смены фильтров, микроскоп,
ФЭУ, модуль предварительной обработки сигнала и компьютер.
Источником возбуждающего света служит ртутная лампа мощностью 50 ватт. Поскольку
в качестве кальций - чувствительного зонда использовали индикатор Фура -2 АМ,
являющийся по возбуждению двухволновым (см. выше), то для количественного
определения [Ca2+]i необходимо было одновременно
индуцировать флуоресценцию обеими длинами волн. В нашей конфигурации
периодическая смена фильтров возбуждения была реализована при помощи вращения
колеса с вмонтированными в него двумя интерференционными фильтрами 360 и 390
нм. Частота вращения была 5 Гц. Управление системой смены фильтров
осуществлялось при помощи кальций - измерительного модуля фирмы Luigs und
Neumann, Германия. Этот же модуль являлся интерфейсом предварительной
обработки.
Оптическая часть установки была смонтирована на базе микроскопа Axioskop,
Zeiss. Разделение потоков возбуждающего света и флуоресценции производилось
при помощи дихроического зеркала. Свет, прошедший через фильтр для
возбуждения флуоресценции, отклонялся дихроическим зеркалом и при помощи
высокоаппертурного иммерсионного объектива (40*, апертура 0.75) фокусировался
на объекте. Флуоресцентный свет проходил через соответствующий
интерференционный фильтр и подавался на фотоэлектронный умножитель (ФЭУ). Для
уменьшения уровня шумов фиксированная диафрагма (1 мм) была расположена перед
ФЭУ. В результате флуоресцентный сигнал собирался с фокальной плоскости
диаметром 50 мкм, что позволило значительно улучшить соотношение сигнал/шум.
Модуль предварительной обработки позволял производить компенсацию
автофлуоресценции и, при необходимости, усиливать сигнал, после чего он
оцифровывался при помощи цифрового интерфейса TIDA и обрабатывался
компьютером при помощи программ Tida 5.0 и Wintida, разработанных в
Гейдельберге, Германия.
Рисунок 4. Принципиальная схема экспериментальной установки для двухволнового
измерения кальция.
3.5 Растворы и смена растворов
При работе со срезами все растворы готовились на основе раствора Тироде (в
ммоль/л): NaCl - 125, KCl - 5.4, MgCl2 - 1, CaCl2 - 2.5,
NaHCO3 - 26, KH2PO4 - 1.6, глюкоза - 10,
постоянно аэрировавшийся газовой смесью 95% О2 + 5% СО2
(pH=7.4). Бескальциевый раствор готовился эквимолярной заменой CaCl2
на MgCl2 и добавкой 1 ммоль/л EGTA, растворы с повышенным содержанием
калия или кофеина - заменой NaCl на соответствующее количество KСl или кофеина.
Смена растворов производилась протоком, скорость которого можно было
варьировать от 10 до 20 мл/мин. Объем экспериментальной камеры составлял 0.5
мл. Все эксперименты были проведены при температуре (32