Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по разное
На правах рукописи
ПАНАСЮК СЕРГЕЙ ДМИТРИЕВИЧ
Значение ассоциаций микроорганизмов в этиологии и профилактике инфекционных болезней конечностей крупного и мелкого рогатого скота
(некробактериоз, копытная гниль)
16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,
микология с микотоксикологией и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
доктора ветеринарных наук
Москва Ц 2007
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ ВГНКИ) и на ФГУП Ставропольская биофабрика
Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор,
ауреат премии Совета Министров СССР
А.А.Сидорчук
Официальные оппоненты:
Доктор ветеринарных наук, профессор Каврук Леонид Сергеевич
Доктор ветеринарных наук,
заслуженный ветеринарный врач РФ,
профессор Мельник Николай Васильевич
Доктор ветеринарных наук Гнездилова Лариса Александровна
Ведущее учреждение: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии (ВНИИЭВ) им. Я.Р.Коваленко
Защита диссертации состоится У 31 Ф мая 2007 г. в У_10_Ф часов У30Фминут на заседании Диссертационного совета Д 220.011.01 в Федеральном государственном учреждении Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ФГУ ВГНКИ)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ВГНКИ
Автореферат диссертации разослан У___Ф___________ 2007 г.
Учёный секретарь диссертационного совета,
кандидат ветеринарных наук,
заслуженный ветеринарный врач РФ Ю.А. Козырев
- ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Эпизоотологические данные последних лет подтверждают тот факт, что инфекционные болезни конечностей крупного рогатого скота (КРС) и овец занимают одно из ведущих мест в инфекционной патологии этих видов животных в Российской Федерации (РФ), где наибольшее значение имеют некробактериоз и копытная гниль (Архангельский И.И. и др., 1986; Лайшев А.Х. и др., 1966; Walker P.D. et al., 1981). При болезнях конечностей пораженный орган постоянно контактирует с почвой и другими объектами окружающей среды, что приводит к его обильному обсеменению различной бактериальной флорой, к тому же одной из характерных особенностей анаэробных инфекций является одновременное ассоциативное воздействие на организм двух, трех и более видов анаэробных и аэробных микроорганизмов (Балтрашевич А.К., 1979; Сидорчук А.А. и др., 2006; Katic R.V.et al., 1976).
Многочисленные исследования по изучению этиологии некробактериоза КРС, некробактериоза и копытной гнили овец подтверждают большую роль сопутствующей микрофлоры, которая существенно осложняет течение болезни, что подтверждается данными отечественных и зарубежных исследователей (Самоловов А.А., 1988; Сидорчук А.А. и др., 2004; Banting A. de L. et al., 1978).
Так, неоднократно было установлено, что помимо основных возбудителей(Fusobacterium necrophorum, Dichelobacter (Bacteroides) nodosus) в этиологии некробактериоза КРС, некробактериоза и копытной гнили овец определенную роль играет гнойно-раневая микрофлора: Clostridium perfringens тип A, Staphylococcus aureus, Actinomyces (Corynebacterium) pyogenes и другие, которые формируют микробные ассоциации в природе и организме животных, усиливая своими ферментативными системами действие основных возбудителей и тем самым увеличивая вирулентность последних в десятки раз (Сидорчук А.А. и др., 1996; Gorbach S.L., Bartlett J.S., 1974; Roberts D.S., 1967). Реальным подтверждением указанных фактов явилось создание в ряде зарубежных стран ассоциированных вакцин против инфекционных болезней конечностей сельскохозяйственных животных: Pietimam, Pietivac (Франция), Памавак (Югославия). В то же время, в связи с созданием крупных откормочных и молочных комплексов для КРС, закупкой и перемещением по стране большого количества племенного скота проблема некробактериоза встала особенно остро. Так, по данным Караваева Ю.Д. (1999; 2003), заболеваемость некробактериозом в 1991г. составила 13,5% от всех случаев инфекционной патологии у данного вида животных, а в последующие годы сохранялась устойчивая тенденция к росту заболеваемости КРС некробактериозом. Результаты исследования Архангельского И.И. и др. (1986), Кононова А.Н. (2001; 2004), Самоловова А.А. (1993; 1997; 1998), Сидорчука А.А. и др. (2002; 2003; 2006), Сукеева Ш.С. и др. (1980; 1984) указывают на тот факт, что, несмотря на резкое снижение поголовья овец, некробактериоз и копытная гниль, как и раньше, являются одной из основных проблем в инфекционной патологии данного вида. Так, в период с 1986 по 2003 гг. ежегодная заболеваемость копытной гнилью и некробактериозом овец составляла до 190 тыс. голов.
Применение отечественных моновалентных вакцин против некробактериоза КРС и копытной гнили овец не позволило полностью решить проблемы ликвидации некробактериоза и копытной гнили, хотя их использование позволяет значительно снизить заболеваемость животных. В связи с вышеизложенным, конструирование вакцин против инфекционных болезней конечностей КРС (некробактериоз) и овец (некробактериоз и копытная гниль) на основе ассоциации анаэробных микроорганизмов (Fusebacterium necrophorum и Dichelobacter nodosus) и гнойно-раневой микрофлоры позволит более надежно профилактировать указанные болезни.
Цель работы. Целью настоящих исследований было выяснение роли и значения ассоциаций анаэробных микроорганизмов F. necrophorum и D. nodosus и представителей гнойно-раневой микрофлоры в этиологии, патогенезе и профилактике инфекционных болезней конечностей КРС и овец, а также обоснование создания нового поколения средств специфической профилактики этих болезней.
Задачи исследований.
1. Изучить особенности эпизоотологии некробактериоза крупного рогатого скота, некробактериоза и копытной гнили овец в различных зонах Российской Федерации и Республики Киргизия;
2. Выяснить видовой спектр микроорганизмов при болезнях конечностей крупного рогатого скота и овец. 3. Изучить биологические свойства изолятотов и провести отбор штаммов для конструирования ассоциированных вакцин;
4. Экспериментальным путем подтвердить значение ассоциаций микроорганизмов в инфекционной патологии конечностей крупного рогатого скота и овец;
5. Изучить иммунный ответ при применении ассоциированных вакцин, определить возможность конкуренции антигенов в организме животных, привитых ассоциированными вакцинами и разработать схемы их применения;
6. Разработать методы контроля и промышленную технологию изготовления ассоциированных вакцин;
7. Испытать эффективность ассоциированных вакцин в лабораторных и производственных условиях.
Научная новизна. Установлены особенности эпизоотологии и клинического проявления инфекционных болезней конечностей КРС (некробактериоз) и овец (некробактериоз, копытная гниль) в различных природно-климатических зонах Российской Федерации и в Республике Киргизия. Определен видовой спектр микроорганизмов при инфекционных болезнях конечностей КРС и овец. Установлена и экспериментально подтверждена роль гнойно-раневой микрофлоры в ассоциации с анаэробными микроорганизмами F. necrophorum и D. nodosus в этиологии и патогенезе инфекционных болезней конечностей.
Впервые в Российской Федерации разработаны и испытаны с положительными результатами две инактивированные ассоциированные вакцины против некробактериоза конечностей КРС (запатентованные названия УНековакФ, УНековак-стимуФ, патент N 2098127 от 10.12.1997г.) и инактивированная ассоциированная вакцина против инфекционных заболеваний конечностей овец (запатентованное название УОвиконФ, патент N 2098128 от 10.12.1997г.). Вакцины зарегистрированы Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ. На препараты получены сертификаты соответствия.
Разработаны методы контроля вакцин, промышленная технология их изготовления, методы оценки иммунитета у вакцинированных животных и схемы применения вакцин в неблагополучных хозяйствах, а также система мер по борьбе с некробактериозом и копытной гнилью.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Впервые в Российской Федерации разработаны и внедрены в производство инактивированные ассоциированные вакцины: против некробактериоза конечностей КРС - УНековакФ и УНековак-стимуФ; и инфекционных заболеваний конечностей овец - УОвиконФ. Серийный выпуск препаратов с 1995г. налажен на Ставропольской биофабрике.
Материалы разработки вошли в УПравила по профилактике и ликвидации некробактериоза животныхФ, утвержденные Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ 11.07.2000 г. №ВП 13.4.1313-00.
Материалы диссертации вошли также в рекомендации УДиагностика, профилактика и меры борьбы при некробактериозе крупного рогатого скотаФ. Рекомендации одобрены Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ 21.02.2000 г., и в УМетодические рекомендации по профилактике и борьбе с копытной гнилью овецФ, утвержденные РАСХН 22 марта 2004 г.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на заседаниях: Ученого совета ВНИИЭВ им. Я.Р. Каваленко (1989-1991); заседаниях Ученого совета ФГУ ВГНКИ в 1992-2003 гг.; заседании пленума секции паразитоценологии АН СССР (г.Витебск,1988); на Всесоюзной научной конференции УСовершенствование методов государственного контроля ветеринарных препаратовФ (г.Москва, 1991); на заседании Государственной межведомственной комиссии по испытанию ветбиопрепаратов при Департаменте ветеринарии МСХ и П РФ в 1993 году; на заседании научно-проблемной методической комиссии по контролю и стандартизации биопрепаратов, применяемых при бактерийных и грибковых болезнях животных (ФГУ ВГНКИ,1995); на Всероссийской научной конференции, посвященной 70-летию факультета ветеринарной медицины Воронежского государственного аграрного университета им. К.Д. Глинки (г.Воронеж, 1996); на заседании Ветфармбиокомиссии при Департаменте ветеринарии МСХ и П РФ (1997); на Международной конфереции, посвящённой 30-летию Прикаспийского ЗНИВИ (г.Махачкала,1997), на методической и научной конференции МГАВМиБ ( г.Москва, 2001), на Международной конференции ветеринарных специалистов по борьбе с инфекционными заболеваниями с/х животных (Республика Болгария, г.Апрельцы, 2003).
Основные положения, выносимые на защиту:
- Результаты изучения особенностей эпизоотологии и клинического проявления инфекционных болезней конечностей КРС и овец в различных природно-климатических зонах Российской Федерации и Республики Киргизия.
- Результаты изучения видового спектра микроорганизмов при инфекционных болезнях конечностей крупного и мелкого рогатого скота и биологических свойств выделенных изолятов.
- Теоретическое обоснование разработки инактивированных ассоциированных вакцин против некробактериоза крупного рогатого скота УНековакФ и УНековак-стимуФ и против инфекционных заболеваний конечностей овец УОвиконФ.
- Промышленная технология изготовления ассоциированных вакцин УНековакФ и УОвиконФ.
- Практическая эффективность вакцинации крупного рогатого скота против некробактериоза и овец против инфекционных болезней конечностей при применении ассоциированных вакцин.
- Оценка некоторых факторов клеточного и гуморального иммунитета при применении ассоциированных вакцин.
- Система применения ассоциированных вакцин УНековакФ и УНековак-стимуФ и Овикон в неблагополучных хозяйствах.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано в печати 48 научных работ в различных изданиях, в которых изложены основные положения и выводы по изученным вопросам, в том числе 2 монографии ,2 патента РФ на изобретения и авторское свидетельство №1835295.
Объем и структура диссертации. Диссертация написана на 430 страницах компьюторного текста и состоит из следующих разделов: введения, литературного обзора, материалов и методов исследований, результатов исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и содержит 67 таблиц, 4 графика, 17 фотографий. Список литературы включает 517 отечественных и зарубежных источников. Приложение к диссертации в объеме 40 страниц содержит документацию, подтверждающую диссертационный материал.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы и методы исследований
Исследования выполнены в 1988Ц2004 годах в лаборатории по изучению болезней овец ВНИИЭВ, в лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии ВНИИЭВ им. Я.Р.Коваленко, на кафедре эпизоотологии МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, в лаборатории контроля и стандартизации препаратов против анаэробных инфекций ФГУ ВГНКИ, в неблагополучных по некробактериозу крупного рогатого скота и инфекционным болезням конечностей овец хозяйствах Российской Федерации и Республики Киргизия, на ФГУП Курская и ФГУП Ставропольская биофабрика. В работе были использованы данные ветеринарной отчетности областных ветеринарных лабораторий, краевого управления ветеринарии МСХ Ставропольского края и Киргизской республиканской ветеринарной лаборатории.
При проведении экспериментов были использованы лабораторные животные, овцы и крупный рогатый скот. Всего в исследованиях и экспериментах было использовано:1192 белых мыши, 60 морских свинок, 451 кролик, 24174 овцы, 18279 голов крупного рогатого скота.
Эпизоотологические исследования по заболеваемости крупного рогатого скота некробактериозом и его клиническому проявлению были проведены в 13 хозяйствах 5 областей Центральной России на 10082 головах КРС, в 4 хозяйствах 4 районов Ставропольского края на 1481 голове КРС, в 3 хозяйствах 2 районов Республики Киргизия на 2017 коровах. Эпизоотологические исследования по заболеваемости овец некробактериозом и копытной гнилью были проведены в 3 хозяйствах 3 областей Центральной России на поголовье 2190 овец, в 7 хозяйствах Ставропольского края на поголовье 10646 овец, в 3 хозяйствах Республики Киргизия на поголовье 3246 овец.
В экспериментальных исследованиях было использовано 213 проб патологического материала от крупного рогатого скота и 321 проба патологического материала от овец из указанных регионов России и Республики Киргизия. Выделение и идентификацию микроорганизмов из патологического материала, изучение биологических свойств выделенных и музейных культур проводили на базе лабораторий по изучению болезней овец и микробиологии ВНИИЭВ им. Я.Р.Коваленко, Ставропольской НИВС и КиргНПОЖ, лаборатории контроля и стандартизации препаратов против анаэробных инфекций ФГУ ВГНКИ. В исследованиях использовали методики Глотовой Е.В. (1935), Ваксмана З.А. (1942,1947), Каган Ф.И. (1937, 1938), определителя бактерий Берги (1974,1981,1986), Лабинской А.С. (1978), методические рекомендации Лабораторные методы диагностики некробактериоза сельскохозяйственных животных (1987), Архангельского И.И. и др. (1976, 1979, 1981, 1982, 1986, 1987, 1991), Бектимирова М.А. (1979, 1981), Сидорчука А.А. и др. (1980, 1987, 1994, 1996, 1998, 2001), Семеновой И.Н. (1981, 1988) и другие, а также, данные областных ветлабораторий центральной нечерноземной зоны РФ, Ставропольской краевой ветлаборатории, Киргизской республиканской ветеринарной лаборатории.
В работе исследовали культурально-морфологические , биохимические, токсигенные и патогенные свойства культур микроорганизмов. В результате были описаны свойства 17 штаммов F. necrophorum, 5 штаммов C. рerfringens т. А, 8 штаммов St. aureus, 15 штаммов A. pyogenes, 7 штаммов D. nodosus.
Изучение патогенных свойств указанных штаммов проводили на 1192 белых мышах, 60 морских свинках, 451 кролике и 21 овце. Для экспериментального подтверждения значения ассоциаций микроорганизмов в этиологии болезней конечностей было использовано 48 кроликов и 18 овец, при этом животных заражали как монокультурами, так и ассоциациями указанных микроорганизмов. С целью определения оптимальных соотношений антигенов для конструирования ассоциированных вакцин были приготовлены инактивированные формалином антигены F. necrophorum, S. aureus, A. pyogenes, D. nodosus в концентрациях 10, 20 и 40 млрд. микробных клеток в мл, которыми иммунизировали 36 овец. По уровню гуморальных антител подбирали оптимальные концентрации для составления опытных серий ассоциированных вакцин. Изучение конкуренции антигенов проводили на 30 овцах, которых привили моновакцинами из указанных штаммов, а так же из штамма C. рerfringens т. А на ГОА адъюванте и экспериментальной ассоциированной вакциной из тех же штаммов в той же подобранной ранее концентрации на ГОА адъюванте. О наличии или отсутствии конкуренции антигенов судили по величине титров специфических агглютининов привитых овец.
Постановку РА и учет её результатов с каждым из антигенов проводили в соответствии с методикой Определение уровня антител против копытной гнили в сыворотке крови овец с помощью реакции агглютинации, утвержденной ВАСХНИЛ 2.04.1984 г. С валентностью C. рerfringens т. А ставили реакцию нейтрализации.
Опытные образцы инактивированных ассоциированных вакцин против инфекционных заболеваний конечностей овец Овикон и некробактериоза конечностей КРС Нековак и Нековак-стимул готовили в лаборатории контроля и стандартизации анаэробных препаратов ФГУ ВГНКИ.
Опытные серии инактивированной ассоциированной вакцины Овикон были испытаны в 2 овцеводческих хозяйствах Центральной России на 956 овцах. Опытные серии ассоциированных Нековак и Нековак-стимул были испытаны в 3 хозяйствах Центральной России на 1760 головах КРС. Об эффективности препаратов судили по снижению заболеваемости животных и величине титров гуморальных антител.
Разработка методов контроля была проведена на 80 белых мышах, 72 кроликах, 20 овцах и 20 головах КРС.
Основные параметры иммунитета при применении инактивированных ассоциированных вакцин Нековак, Нековак-стимул, и Овикон изучали на опытно промышленных сериях этих препаратов. С этой целью на ФГУП Курская биофабрика после согласования вопросов технологии в 1994-1995 г.г. было изготовлено по одной опытно-промышленной серии вакцин Нековак и Овикон общим объёмом 45000 доз. В период 1994-1996 на ФГУП Ставропольская биофабрика было выпущено 3 опытно- промышленных серии вакцины Нековак, общим объемом 875 литров (175000 доз) и 4 серии вакцины Овикон общим объемом 1118,6 литра (223720 доз). Испытание опытно-промышленных серий вакцины Нековак, Нековак-стимул провели в 3 неблагополучных по некробактериозу КРС хозяйствах 2 областей Центральной России на 874 коровах, вакцины Овикон в ГПЗ Котовский Рязанской области на 1234 овцах. Во всех экспериментах определяли динамику заболеваемости инфекционными болезнями конечностей у привитых и контрольных животных. Показатели гуморального иммунитета оценивали в РА по накоплению специфических агглютининов у привитых животных.
Основные показатели клеточного иммунитета оценивали путем определения иммуноглобулинов классов М и G, Т- и В- лимфоцитов и фагоцитарной активности лейкоцитов. Уровень иммуноглобулинов классов М и G определяли по методу Манчини и др. (1963,1970) в модификации Фехей и Мак-Келви (1965, 1983). Популяции Т-лимфоцитов определяли в реакции спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана, В-лимфоцитов - комплементарного розетко-образования с эритроцитами, содержащими активированные компоненты комплемента согласно Методическим рекомендациям по биохимическим и иммунохимическим методам исследования клеток, их компонентов и других биологических субстратов (1980). Фагоцитарную активность лейкоцитов определяли по общепринятой методике постановкой опсоно-фагоцитарной реакции (ОФР) по следующим показателям: фагоцитарная активность (ФА), фагоцитарное число (ФЧ) и фагоцитарный индекс (ФИ) (Фримель Х.,1979).
Испытание промышленных серий инактивированных ассоциированных вакцин Нековак, Нековак-стимул провели в 4 неблагополучных по некробактериозу КРС хозяйствах 3 областей Центральной России на поголовье 2065 коров. Испытание эффективности промышленных серий вакцины Овикон провели в 3 овцеводческих хозяйствах Ставропольского края, неблагополучных по копытной гнили и некробактериозу на 5845 овцах.
У привитых животных оценивали динамику заболеваемости конечностей и уровень гуморальных антител в РА. Одновременно в 4 хозяйствах, из 6 указанных, вместе с вакцинацией применили комплекс организационно-хозяйственных и лечебно-профилактических мероприятий, направленных на полное оздоровление хозяйств от инфекционных болезней конечностей.
Результаты экспериментов подтвердили вариационно-статистической обработке по программе Primer of Biostatistics (Version 4.03). Результаты исследований так же были обработаны по методу Ашмарина И.П. и Воробьева А.А. (1962), при этом вычисляли среднеарифметические значения титров агглютининов и процентов заболевших вакцинированных и контрольных животных, достоверную разность Р по 2 между заболевшими животными в вакцинированных и контрольной группах, коэффициент корреляции ( r ) между средними титрами агглютининов и процентом заболевших животных, квадратичное отклонение () полученных экспериментальных данных.
2.2. Результаты исследований.
2.2. Эпизоотология и клиническое проявление некробактериоза крупного рогатого скота, некробактериоза и копытной гнили овец в различных природно-климатических зонах.
На основании результатов проведённых исследований, была описана клиническая картина болезней конечностей, условия распространения, пути передачи инфекций и влияние предрасполагающих факторов, а также установлены некоторые общие закономерности проявления инфекционных болезней конечностей у КРС и овец в различных природно-климатических зонах. Так, значительному распространению этих эпизоотий способствовала продажа племенных животных, среди которых имелись хронически больные животные, которые становились источником распространения инфекции. Хотя возбудитель некробактериоза анаэробный неспорообразующий микроорганизм Fusobacterium necrophorum является убиквитарным, случаев спонтанного возникновения некробактериоза в хозяйствах нами не отмечалось. При попадании в животноводческие хозяйства, ранее благополучные по некробактериозу и копытной гнили, хозяйства становились стационарно-неблагополучными по этим инфекциям, так как основные возбудители инфекций могут годами сохраняться в структурах копытного рога и обеспечивать случаи рецидивов болезни.
Инфекционным болезням конечностей были подвержены все половозрастные группы животных, однако наиболее тяжело болели быки и бараны-производители, овцематки старше трех лет, высокоудойные коровы и коровы после отела, что, вероятнее всего, связано с нарушением обменных процессов у животных, приводящим к структурным нарушениям копытного рога. Это делало животных более чувствительными к воздействию предрасполагающих факторов и приводило к травматизму копыт. Молодые животные до 3-4, реже 6-месячного возраста, мало восприимчивы к инфекционным болезням конечностей, что во многом определяется состоянием их копыт.
Заболеваемость КРС некробактериозом во всех хозяйствах колебалась в широких пределах. Наибольшей она была в хозяйствах Центральной России от 11,6 до 83,0%. Наименьшей в хозяйствах Ставропольского края от 1,0 до 17,6%. В хозяйствах Республики Киргизия заболеваемость некробактериозом КРС составила 6,5-20,3%.
У овец заболеваемость конечностей некробактериозом и копытной гнилью также варьировала в широких пределах. Наибольшей она была в хозяйствах Республики Киргизия от 8,0 до 86,0%, несколько меньшей в хозяйствах Центральной России от 30,0 - 52,0% и Ставрополья - от 3,6 до 38,1%.
Во всех природно-климатических зонах инфекционные болезни конечностей крупного и мелкого рогатого скота имели два сезонных пика распространения: зимне-весенний и летне-осенний, что связано с действием предрасполагающих факторов внешней среды.
Клиническое проявление инфекционных болезней конечностей у КРС и овец также зависело от условий содержания, кормления и факторов внешней среды и от состава складывающейся патогенетической ассоциации, вызывающей болезни конечностей.
Так, заболевание КРС некробактериозом в хозяйствах Центральной России имело подострое и хроническое течение. Поражения локализовались, в основном, в области межкопытной щели, при этом отмечали покраснение и отек кожи и окружающих тканей. На месте поражения отмечали наличие эрозий и язв с неровными краями в виде валика, покрытых экссудатом. Отмечали повышение местной температуры и болезненность конечностей. Животные были угнетены, опирались на зацеп больной конечности или держали её на весу. В отдельных случаях отмечали наличие абсцессов в области венчика, некроз связок и сухожилий, наличие свищей. Все это вызывало синдром хромоты. Реже наблюдали генерализованные формы некробактериоза с поражением связок, костей и наличием абсцессов в области суставов, а также некротических поражений и абсцессов во внутренних органах. У некоторых коров в колхозе лим. Ленина Ухоловского района Рязанской области регистрировали некротические поражения на вымени и коже нижней части тела. Такие животные не подлежали лечению и выбраковывались.
В условиях Ставропольского края заболевание КРС некробактериозом характеризовалось, в основном, поражением конечностей, при этом отмечали наличие язв в области пяточных частей межкопытной щели, реже абсцессы и свищи в области венчика. В отдельных случаях отмечали воспаление запястного и заплюсневого суставов, гнойные тендовагиниты и бурситы. Пораженные конечности были сильно отечными и болезненными. В покое больную конечность животные держали слегка приподнятой. При движении больных животных проявлялась прогрессирующая хромота.
Изучение клинического проявления некробактериоза КРС в хозяйствах Республики Киргизия позволило установить тот факт, что первичные поражения локализовались преимущественно на коже и подкожной клетчатке межкопытной щели, а также в области венчика и сгибательной поверхности пута в виде влажной эрозии с небольшим отеком и экссудатом с неприятным запахом. В начальной стадии болезни наблюдали эрозии кожи с ворсистой поверхностью в области межкопытной щели, а также гиперплазию тканей в виде валика, копытный рог был разросшимся, изъязвленным, рыхлым.
В некоторых случаях отмечали более глубокие поражения в области мягких тканей конечностей с наличием свищей и затоков под копытным рогом, а также абсцессов в области венчика копыта. В этот период животные были угнетены, у них повышалась температура тела до 400С и выше, терялся аппетит, резко снижались удои. Пораженные конечности были отечными, местная температура повышена, в области поражения наблюдалась сильная болезненность, развивался синдром хромоты.
Наблюдали также поражения суставов, гнойные тендовагиниты и бурситы, отслоение копытного рога, то есть подтверждается мнение многих исследователей, что заболевание некробактериозом КРС по клиническим признакам имеет насколько форм (стадий, степеней) проявления.
В хозяйствах Республики Киргизия отмечали также отдельные случаи некротических поражений (дифтеритических воспалений) слизистых оболочек ротовой полости телят. Заболевание, как правило, было связано с травматизмом слизистых оболочек ротовой полости грубыми кормами, протекало остро и характеризовалось повышением температуры тела до 400С, и выше, общим угнетением животных и отказом от приема корма, зловонным слюнотечением. В ротовой полости на слизистой оболочке, а также на языке и деснах, отмечались серо-белые и с желтым оттенком дифтеретические пленки, после снятия которых наблюдались кровоточащие изъязвления. У павших телят отмечали также некротические поражения внутренних органов.
При изучении инфекционных болезней конечностей овец в хозяйствах Центральной России у животных отмечалось поражение одной или значительно реже двух конечностей, чаще передних. У ягнят возрастом до 6 месяцев практически не наблюдалось клинических проявлений копытной гнили. Более выраженное, по сравнению с овцематками, проявление инфекции (чаще с поражением задних конечностей) отмечено у баранов-производителей. Заболевание имело ярко выраженный сезонный характер. Клиническая картина болезней конечностей у овец характеризовалась гнойным воспалением кожи свода межкопытной щели. Отмечали ее облысение, покраснение, наличие эрозий, покрытых серовато-белым ихорозным экссудатом. В отдельных (единичных) случаях отмечали поражение основы кожи пяточных частей внутренних стенок копытец и основы кожи подошвы с отслоением рогового башмака. Все это вызывало синдром хромоты.
В ГПЗ Котовский и совхозе Мир отмечали единичные случаи абсцессов в области венчика копыта и воспаление копытцевых и венечных суставов, чаще у баранов, то есть несколько клинических форм болезни.
В условиях Ставропольского края по нашим данным, чаще болеют овцы, чем бараны, однако, у баранов-производителей заболевание протекает более тяжело. Среди ягнят до 3-4 месячного возраста даже при совместном содержании с больными овцематками копытную гниль регистрировали в единичных случаях. По нашему мнению, этот факт связан с эластичностью копытного рога ягнят, отсутствием трещин и заломов копыт и отсюда меньшей подверженностью влияния предрасполагающих факторов внешней среды.
В двух маточных отарах ОПХ ВНИИОК Темнолесский и одной отаре колхоза лим. Войтика, отмечено очень тяжелое клиническое проявление болезней конечностей овец (злокачественная форма), которое характеризовалось поражениями не только в области копытец с отслоением рогового башмака, но и наличием язв и свищей в области венчика, путового сустава, наличием гнойных тендовагинитов и бурситов. Конечности животных с такими поражениями были отечными, местная температура повышена, животные на такие конечности не опирались, держали их на весу. В этих отарах у новорожденных и ягнят до 3-месячного возраста были отмечены случаи некротических поражений слизистой оболочки ротовой полости. Очевидно, в указанных хозяйствах имело место инфекционное заболевание конечностей овец, вызыванное ассоциацией микроорганизмов, что впоследствии подтвердилось микробиологическими исследованиями патматериала и постановкой биопробы на лабораторных животных.
В Республике Киргизия среди ягнят до 3-месячного возраста заболеваний конечностей не наблюдалось даже в период массовой заболеваемости маток, несмотря на круглосуточное совместное содержание ягнят с больными матерями. Минимальная заболеваемость конечностей наблюдалась у ярок и валухов старше десятимесячного возраста, что вероятнее всего связано с условиями содержания и кормления. У животных отмечали поражение одной, реже двух или трех конечностей, как и в хозяйствах Центральной России и Ставрополья, так и в хозяйствах Киргизии у овец чаще поражались передние конечности, а у баранов-производителей - задние. Инфекционные болезни конечностей имели хроническое течение, однако начало заболевания всегда было острым, а затем процесс принимал хронический характер.
У заболевших животных в Республике Киргизия отмечено несколько клинических форм проявления болезней конечностей. В начальной стадии животные беспокоились, поднимали и облизывали больные ноги, при движении животных отмечалась слабо выраженная хромота. При осмотре больных конечностей в области межкопытной щели наблюдали гиперемию кожи свода межкопытной щели, отечность и выпадение волос, повышение местной температуры. Это легкая форма проявления заболеваний конечностей.
При средней степени поражения конечностей животные были угнетены, выявлялась сильно выраженная хромота при движении, в покое овцы держали пораженные конечности на весу, ползали при поражении обеих передних ног на карпальных суставах или лежали. Больные конечности были отечны и болезненны, повышена местная температура. При осмотре в области пораженных конечностей отмечалась резко выраженная гиперемия, наличие эрозий, покрытых серовато-белым гнойным налетом со специфическим, неприятным запахом. При наблюдении за больными животными в некоторых случаях отмечался некроз внутренних стенок рогового башмака и подошвы. Отмечалось также неправильное разрастание и деформация копытного рога. При тяжелой степени поражения конечностей животные были сильно угнетены, чаще лежали, отмечали повышение общей температуры тела. При осмотре больных конечностей наблюдали сильную отечность, гиперемию, наличие эрозий и язв с гиперплазией тканей в виде валика, покрытым сероватым ихорозным экссудатом. Отмечали наличие свищей и язв в области венчика, в особо тяжелых случаях - поражение карпальных и скакательных суставов. При этом роговые ткани внутренних стенок копыта и подошвы были некротизированы и расплавлены, вызывали отслоение рогового башмака. Такую степень инфекционных поражений конечностей овец наблюдали более чем у 50% заболевших животных в маточных отарах в сезон массового распространения болезней конечностей при наличии предрасполагающих факторов внешней среды после выпаса этих отар на пастбищах, где ранее выпасали стада крупного рогатого скота, неблагополучные по некробактериозу.
В перечисленных хозяйствах Чуйской долины Республики Киргизия среди ягнят весной (март-май) и осенью (сентябрь-октябрь) наблюдали две вспышки некробактериоза лицевой части головы, слизистых оболочек губ и ротовой полости. Первая (весенняя) вспышка наблюдалась в период окота среди новорожденных ягнят, вторая (осенняя) - после отбивки ягнят при формировании новых отар из приплода текущего года. Заболевание ягнят было связано с травматизмом слизистых оболочек и кожных покровов лицевой части головы. Клинически заболевание проявлялось появлением на пораженных участках слизистой губ и рта везикул, наполненных жидкостью, которая выливалась, а затем подсыхала. Вокруг рта образовывалась серая корка, лицевая часть головы и губы сильно отекали, были очень болезненны, при отпадении корок обнажалась изъязвленная кровоточащая поверхность. При поражении слизистых оболочек рта, десен, языка отмечалось наличие серо-желтых бляшек, изо рта выделялась пенистая тягучая слюна с гнилостным запахом и крошковатыми массами, из носовых отверстий также выделялся зловонный секрет, содержащий грязно-желтые крошковатые массы. Животные были сильно угнетены, отставали от отары или лежали, у них повышалась температура тела и при отсутствии лечения наступала гибель. У павших ягнят при вскрытии отмечали некротические поражения гортани, трахеи, а также некротические поражения и абсцессы в легких и печени. Весьма примечательным обстоятельством в указанные сезоны года было одновременное появление вспышек у ягнят вирусной эктимы и некробактериоза, что подтверждалось исследованиями Республиканской ветлаборатории. Очевидно, что вирус эктимы лоткрывал ворота размножения возбудителя некробактериоза и других секундарных инфекций.
Проведенные клинико-эпизоотологические исследования позволили подтвердить общие закономерности развития эпизоотического процесса инфекционных болезней конечностей крупного и мелкого рогатого скота и отметить некоторые особенности его зонального проявления.
2.3. Выделение, изучение биологических свойств и идентификация микрофлоры из пораженных конечностей при некробактериозе крупного рогатого скота, некробактериозе и копытной гнили овец.
На втором этапе исследований был проанализирован видовой спектр микроорганизмов, участвующих в развитии патологического процесса инфекционных болезней конечностей КРС и овец. Патологический материал для исследований был получен из хозяйств Московской, Рязанской, Тверской, Тульской, Костромской и других областей Российской Федерации, Ставропольского края и Республики Киргизия.
Обобщенные результаты исследований всех проб патологического материала иллюстрируют табл. 1 и 2, где суммарно, по частоте их выделяемости, показаны все представители патогенной, условно-патогенной и сапрофитной микрофлоры, которые удалось идентифицировать в патологическом материале в процентном соотношении к общему числу исследованных проб.
Сравнительный анализ полученных результатов позволяет констатировать тот факт, что в указанных регионах из пораженных конечностей овец постоянно выделяли несколько групп микроорганизмов. В (69-82% случаев) изолировали споровый почвенный микроорганизм C. perfringens тип А (присутствующий в инфицированных ранах, один из основных возбудителей газовой гангрены человека и энтеротоксемии животных) и возбудитель копытной гнили овец D. nodosus (72-79%) случаев. В связи с трудностью его выделения в большинстве случаев для диагностики заболевания и идентификации D. nodosus использовали феномен Бевериджа. В эту группу также включили возбудитель некробактериоза F. necrophorum (9-39% случаев).
Вторую большую группу микроорганизмов, постоянно выделяемых при инфекционных болезнях конечностей, составили пиогенные кокки: Streptococcus pyogenes (31-43%случаев), Staphylococcus aureus (26-42% cлучаев), Actinomyces pyogenes (9-12% cлучаев), а также представители родов Peptococcus, Peptostreptococcus, Enterococcus.
В третью группу микроорганизмов, постоянно изолируемых из пораженных копыт, вошли условно-патогенные и сапрофитные бактерии, такие как Escherichia coli (28-38% случаев), Proteus vulgaris (20-33% случаев), Prevotella melaninogenicus (1-6% случаев) и микроорганизм Bacteroides fragillis, часто присутствующий в гнойных ранах человека и животных.
Остальные микроорганизмы, за исключением Clostridium septicum, выделялись непостоянно, при этом был отмечен тот факт, что из пораженных конечностей овец в Ставропольском крае и Республике Киргизия чаще выделяли споровые микроорганизмы, чем из патматериала от овец Центральной России. Поэтому постоянно выделяемый в небольших количествах Clostridium septicum, почвенный споровый микроорганизм, один из возбудителей газовой гангрены, брадзота и злокачественного отека (4 - 12 % случаев), а также спорадически выделяемые споровые микроорганизмы Clostridium perfringens типов С и D, Clostridium оedematiens и Bacillus cereus были условно отнесены в четвертую группу.
Подобный, во многом сопоставимый с результатами исследований патматериала от овец, видовой спектр микроорганизмов наблюдался и при некробактериозе КРС. Обобщенные результаты исследований пораженных конечностей КРС из тех же трех выше перечисленных регионов представлены в таблице 2.
Из данных таблицы 2, следует, что весь спектр микроорганизмов, выделенных из патматериала и идентифицированных при некробактериозе конечностей КРС, можно условно разделить на несколько групп.
В первую группу вошли наиболее часто выделяемые микроорганизмы Clostridium perfringens т. А (68Ц75% случаев) и возбудитель некробактериоза КРС Fusоbacterium necrophorum (63Ц71 % случаев).
Во вторую группу, как и при болезнях конечностей овец, вошли наиболее часто выделяемые пиогенные микроорганизмы Streptococcus pyogenes (24-42%случаев), Staphylococcus aureus (18-28% cлучаев), Actinomyces pyogenes (9-15% cлучаев), Pseudomonas aeruginosa (3-9% случаев).
Представителями третьей группы так же, как и при инфекционных заболеваниях конечностей овец, являлись условно-патогенные и сапрофитные микроорганизмы Escherichia coli (36-43% случаев), Proteus vulgaris (16-24% случаев). К этой группе могли быть отнесены непостоянно выделяемые представители родов Propionibacterium, Prevotella, Eubacterium, Flavobacterium, а также Bacteroides fragillis.
Четвертую группу составили споровые микроорганизмы: постоянно выделявшиеся в малых количествах Clostridium septicum (6 - 10 % случаев), непостоянно выделявшиеся Clostridium оedematiens, Bacillus cereus, Bacillus subtilis. При этом споровые микроорганизмы из патматериала от КРС и овец, чаще выделяли в Ставропольском крае и в Республике Киргизия. Проведенные исследования позволили констатировать факт наличия широкого спектра видов микроорганизмов, участвующих в патогенезе инфекционных болезней конечностей овец и КРС, что подтверждает данные многих ученых (Самоловов А.А., 1988; Балабанов В.А., 1971; Гришаев Н.Е., 1971; Сидорчук А.А. и др. 1999, 2006) о важной роли микробных ассоциаций в этиологии некробактериоза крупного рогатого скота, некробактериоза и копытной гнили овец. Они также позволяют несколько иначе посмотреть на этиологию и патогенез некробактериоза крупного и мелкого рогатого скота и копытной гнили овец.
Таблица 1
Результаты исследований патологического материала от овец, взятого из хозяйств Центральной России, Ставропольского края и Республики Киргизия
№ п/п | Идентифицированные микроорганизмы | % от числа исследованных проб |
1 | Clostridium perfringens т. А | 69 - 82 |
2 | Dichelobacter (Вacteroides) nodosus | 72 - 79 |
3 | Streptococcus pyogenes | 17 - 43 |
4 | Staphylococcus aureus | 36 - 42 |
5 | Escherichia coli | 28 - 38 |
6 | Fusebacterium necrophorum | 9 - 39 |
7 | Proteus vulgaris | 20 - 33 |
8 | Actinomyces (Corynebacterium) pyogenes | 10 - 12 |
9 | Klebsiella pneumoniae | 10 |
10 | Treponema spp. | 9 |
11 | Peptostreptococcus anaerobius | 8 |
12 | Enterococcus | 7 - 8 |
13 | Prevotella (Вacteroides) melaninogenicus | 1 - 6 |
14 | Clostridium perfringens т. С | 2 - 5 |
15 | Clostridium septicum | 4 |
16 | Clostridium oedematiens | 3 - 4 |
17 | Clostridium perfringens т. D | 3 |
18 | Вacteroides fragilis | 2 - 3 |
19 | Bacillus cereus | 2 - 3 |
20 | Arachnia propionicus | 2 |
21 | Flavobacterium spp. | 1 |
22 | Sarcina spp. | 1 |
Таблица 2
Результаты исследований 213 проб патологического материала от крупного рогатого скота, взятого из хозяйств Центральной России, Ставропольского края и Республики Киргизия
№ п/п | Идентифицированные микроорганизмы | % от числа исследованных проб |
1 | Clostridium perfringens т. А | 68- 75 |
2 | Fusebacterium necrophorum | 63 - 74 |
3 | Escherichia coli | 17 - 43 |
4 | Streptococcus pyogenes | 36 - 43 |
5 | Staphylococcus aureus | 18 - 28 |
6 | Proteus vulgaris | 16 - 24 |
7 | Dichelobacter (Вacteroides) nodosus | 21 |
8 | Actinomyces (Corynebacterium) pyogenes | 9 - 15 |
9 | Streptococcus pyogenes | 12 |
10 | Peptococcus spp. | 11 |
11 | Micrococcus luteus | 10 |
12 | Prevotella (Вacteroides) melaninogenicus | 7 - 10 |
13 | Clostridium septicum | 6 - 10 |
14 | Pseudomonas aeruginosa | 3 - 9 |
15 | Вacteroides fragilis | 3 - 8 |
16 | Propionibacterium spp. | 3 - 7 |
17 | Enterococcus faecalis | 4 - 6 |
18 | Clostridium oedematiens | 4 - 6 |
19 | Fusebacterium nucleatum | 4 |
20 | Bacillus cereus | 3 - 4 |
21 | Bifidobacterium bifidum | 3 |
22 | Bacillus subtilis | 3 |
23 | Veillonella spp. | 3 |
24 | Eubacterium spp. | 2 |
25 | Flavobacterium spp. | 2 |
26 | Pseudomonas putida | 1 |
27 | Micrococcus spp. | 1 |
Полученные результаты позволили сделать вывод, что представители гнойно-раневой микрофлоры (C. perfringens, S. aureus, A. pyogenes) в ассоциации с D. nodosus и F. necrophorum значительно усиливают вирулентность последних, позволяя им действием своих ферментов значительно быстрее преодолевать защитные барьеры организма животного и вызывать тяжелые поражения конечностей и внутренних органов, часто приводя к летальному исходу.
Поэтому, на другом этапе исследований были отобраны следующие микроорганизмы: F. necrophorum, D. nodosus, C. perfringens т. А, S. aureus, A. pyogenes для изучения их биологических свойств.
При этом учитывались как культурально-морфологические свойства штаммов F. necrophorum, D. nodosus, C. perfringens т. А, S. aureus, A. pyogenes, так и их биохимические показатели, включая протеолитические и гемолитические, токсигенные, вирулентные и антигенные свойства.
В результате проведенных исследований были описаны свойства: 17 штаммов F. necrophorum, в том числе 10 музейных и 7 вновь выделенных, проведена их типизация и отобраны 4 штамма биотипа А для дальнейших экспериментов; 5 штаммов С.perfringens т. А, в том числе 2 музейных и 3 вновь выделенных, из них отобраны 2 штамма; 8 штаммов S. aureus, в том числе 3 музейных и 5 вновь выделенных. Для последующих исследований отобрали 2 штамма; 15 штаммов А. pyogenes, в том числе 5-и музейных и 10-и вновь выделенных. Из этого количества отобрали 5 наиболее перспективных для дальнейших исследований штаммов; 7 штаммов D.nodosus. из которых были отобраны 4 штамма.
Изучение биологических свойств и отбор штаммов позволили перейти к экспериментам, подтверждающим значение ассоциаций указанных микроорганизмов в этиологии инфекционных боленей конечностей.
2.3.1. Экспериментальное подтверждение значения ассоциаций микроорганизмов в этиологии болезней конечностей.
С этой целью провели подтитровку культур F. necroforum, А. pyogenes, S. аureus на кроликах и определили LD50 для каждой культуры. После определения LD50 был поставлен основной опыт по подтверждению значения ассоциаций микроорганизмов на кроликах массой 2,0-2,5 кг, где животных заражали культурами F. necrophorum, А. pyogenes, S. aureus и различными вариантами смеси этих культур. Результаты исследований продемонстрировали, что при одинаковом количестве инфекционного материала, использованного для заражения животных, в дозе 4 LD50 кролики, зараженные ассоциациями микроорганизмов в различных вариациях, погибали значительно быстрее по сравнению с животными, зараженными монокультурами. Два кролика, зараженные монокультурами, на период наблюдения остались живыми. На вскрытии животных, зараженных ассоциациями, отмечали поражения, характерные для септического процесса: множественные кровоизлияния во внутренние органы, очаги некроза и абсцессы. Результаты повторного эксперимента, полностью совпали с результатами первого опыта.
На селективных средах из отдельных органов удалось реизолировать и идентифицировать исходные культуры микроорганизмов F. necrophorum, А. рyogenes, S. аureus. Заболевание у кроликов, зараженных ассоциациями, протекало остро, и через 2 - 3 дня животные погибали. На вскрытии отмечали поражения внутренних органов, характерные для сепсиса. Выделение и идентификация культур подтверждали чистоту экспериментов.
На втором этапе исследований для подтверждения значения ассоциаций микроорганизмов в этиологии заболеваний конечностей был поставлен опыт на овцах результаты которого отображает таблица 3.
Таблица 3
Степень проявления болезни в зависимости от состава микробной ассоциации
№ группы | Заражающая культура и штамм | Кол-во овец | Сроки наблюдения и характер поражения конечностей овец | |||
3-е суток | 7 суток | 11 суток | 15 суток | |||
1 | D. nodosus ПП 82/90 | 3 | - | 1/л | 1/л | 1/л |
2 | F. necrophorum шт. Тула шт. Кр-1 | 3 | 1/л* | 2/л | 2/л | 2/л |
3 | A. pyogenes шт. 4/2334 | 3 | - | 1/л | 2/л | 2/л |
4 | S. aureus шт. 7315 | 3 | - | - | 1/л | 1/л |
5 | D. nodosus, F. necrophorum (2 шт.) | 3 | 2/л 1/с | 3/с | 3/с | 3/с |
6 | D. nodosus, F.necrophorum, A. pyogenes S.aureus , C.perfringens т. А | 3 | 3/с | 1/с 2/т | 1/с 2/т | 1/с 2/т |
*-числитель - количество заболевших животных,
знаменатель - тяжесть поражений: л - легкая степень поражения копытец;
с - средняя степень поражения копытец;
т - тяжёлая степень поражения копытец.
Для постановки опыта использовали 12 овец и 6 баранов 1,5 - 2 летного возраста. Всех животных разделили на 6 групп по 3 овцы в каждой. Для заражения использовали 36 часовые культуры F. necrophorum, А. pyogenes, S. aureus в дозах, составляющих 20 LD50 для кроликов массой 2,5 - 3 кг. В опыте также использовали 12 часовую культуру C. рerfringens т. А штамма 28 в дозе 100 LD50 для морских свинок массой 250 г. Культуру D. nodosus штамм ПП82/90 использовали в дозе 50 млрд. м.т.
Заражение осуществляли путем втирания инфекционного материала в скарифицированный свод межкопытной щели с последующим наложением тампона, содержащего инфекционный материал и повязки.
Все животные на протяжении опыта содержались в клетках с сухими полами. За животными установили наблюдение в течение 15 дней. Через 3 дня после заражения у всех животных были сняты повязки с инфекцион- ным заражающим материалом и проведен первый осмотр конечностей всех зараженных овец. В последующем осмотры провели на 7, 11 и 15 дни после заражения. Результаты представлены в таб. 4. В опыте отмечали 3 степени поражения и характеризовали их как:
- легкая степень поражения; общее легкое угнетение, снижение аппетита, животные иногда поднимают больную конечность в покое, при движении - слабо выраженная хромота. При осмотре: выпадение волос в межкопытной щели, гиперемия и отечность кожи свода межкопытной щели, повышение местной температуры;
С - средняя степень поражения; общее легкое угнетение, гиподинамия, снижение аппетита, выраженная хромота при движении, в покое животное держит больную конечность приподнятой. При осмотре: в области свода межкопытной щели гиперемия, отечность, наличие эрозий и язв, покрытых сероватым экссудатом с ихорозным запахом, повышение местной температуры;
Т - тяжелое поражение; те же клинические признаки поражений, как и при средней тяжести (с), а также поражение основы кожи пяточных частей внутренних стенок копыт и гнойное воспаление основы кожи подошвы, отслоение рогового башмака. Из таблицы 4 видно, что заражение овец монокультурами микроорганизмов не всегда вызывало их заболевания или отмечали в основном легкую степень поражения. Животные, зараженные ассоциациями микроорганизмов, заболели уже на 3 - е сутки после заражения.
В этом случае отмечали среднюю степень поражения у всех зараженных, а у двух баранов отмечена впоследствии тяжелая степень поражения копыт и начато их досрочное лечение. Эксперименты, проведенные на кроликах и овцах, позволили сделать вывод о том, что избранная ассоциация микроорганизмов значительно сильнее угнетает защитные системы организма и в короткие сроки вызывает более тяжелые поражения конечностей животных по сравнению с воздействием монокультур тех же организмов, входящих в состав ассоциаций.
Эти эксперименты подтвердили правомочность концепции создания ассоциированных вакцин против инфекционных болезней конечностей копытных животных.
2.4. Определение оптимальных соотношений антигенов в ассоциированных вакцинах. Изучение конкуренции антигенов в организме животных, привитых ассоциированными вакцинами.
С целью определения оптимальных концентраций антигенов для конструирования ассоциированных вакцин были изготовлены инактивированные формалином антигены D.nodosus, F.necrophorum, C.perfringens т. A, S. aureus, A. pyogenes в концентрациях 10, 20, 40 млрд. микробных клеток в мл , которыми иммунизировали 36 овец 1,5 - 2 летнего возраста. По уровню гуморальных антител в РА подбирали оптимальные концентрации для составления опытных серий ассоциированных вакцин. В результате проведенных исследований были установлены следующие концентрации антигенов для составления опытных серий ассоциированных вакцин: F. necrophorum и D.nodosus 20 млрд. м.т./мл,S.aureus, C. perfringens т. А, A. рyogenes - 30 - 40 млрд. м.т./мл. Конкуренцию антигенов изучали также на овцах, которых прививали моновакцинами из указанных штаммов на ГОА адъюванте и экспериментальной ассоциированной вакциной с этим же адъювантом. Количество каждого антигена в ассоциированной вакцине и моновакцинах было одинаковым. О наличии или отсутствии конкуренции антигенов судили по титру специфических агглютининов и токсиннейтрализующих антител. Результаты исследований приведены в табл. 4.
Исследования позволили установить факт отсутствия конкуренции указанных антигенов в организме привитых овец. Уровни антител, стимулируемых каждой валентностью (антигеном) ассоциированной вакцины в сравнении с уровнем антител, стимулируемых моновакцинами, были примерно одинаковыми и даже несколько большими у ассоциированной вакцины по некоторым валентностям.
Проведенные исследования позволили перейти к изготовлению опытных серий ассоциированных вакцин против инфекционных болезней конечностей овец и некробактериоза КРС и их испытаниям в неблагополучных по этим болезням овцеводческих и животноводческих хозяйствах.
2.5. Испытания опытных образцов ассоциированных вакцин против инфекционных болезней конечностей овец и некробактериоза КРС. Разработка схемы применения ассоциированных вакцин.
Испытание опытной серии инактивированной ассоциированной вакцины против инфекционных заболеваний конечностей овец с масляным адъювантом, провели в сравнении с Югославской ассоциированной вакциной Памавак и отечественной моновакциной против копытной гнили овец в совхозе Кузнецовский Тверской области. В свою очередь, в совхозе Мир Рузаевского района Республики Мордовия испытывались несколько вариантов инактивированной вакцины против инфекционных заболеваний конечностей овец с различными адъювантами и антигенным составом. Аналогично в совхозе лим. Кирова Балашихин-
Таблица 4
Результаты сравнительного испытания ассоциированной вакцины и моновакцин
Сроки исследований | Средние титры в РА и РН | Средние титры в РА и РН | ||||||||
моновакцины. | ассоциированная вакцина | |||||||||
D. nodosus | F. necrophorum | S. aureus | A. pyogenes | C.perfringens т. А | D. nodosus | F. Necrophorum | S. aureus | A. pyogenes | C.perfringens т. А | |
До вакцинации, 1-я вакцинация | 1:60 5 | 1:80 5 | 1:70 5 | 1:50 0 | - | 1:80 5 | 1:80 5 | 1:70 5 | 1:50 0 | - |
Через 1 мес после 1-й вакцинации, 2-я вакцинация | 1:200 0 | 1:480 40 | 1:200 0 | 1:60 5 | 0,24 | 1:280 40 | 1:1920 200 | 1:240 20 | 1:60 5 | 0,88 |
Через 2 недели после 2-й вакцинации | 1:960 30 | 1:1660 0 | 1:360 20 | 1:160 10 | 0 | 1:1600 0 | 1:3840 800 | 1:480 40 | 1:240 10 | 1,72 |
Через 1 мес после 2-й вакцинации | 1:480 40 | 1:2240 300 | 1:400 0 | 1:360 20 | 0,5 | 1:1040 80 | 1:2240 300 | 1:480 4 | 1:480 40 | - |
Через 2 мес после 2-й вакцинации, | 1:400 0 | 1:1920 180 | 1:320 20 | 1:150 10 | - | 1:960 30 | 1:1920 200 | 1:360 20 | 1:200 0 | - |
Через 3 мес после 2-й вакцинации | 1:150 10 | 1:960 30 | 1:150 10 | 1:50 0 | - | 1:720 20 | 1:1600 0 | 1:280 40 | 1:80 5 | - |
ского района Московской области были испытаны несколько вариантов инактивированной ассоциированной вакцины против некробактериоза КРС с лечебной и профилактической целями, включая вариант вакцины с им- муномодулятором Гликопин (ГМДП), в сравнении с Югославской ассоциированной вакциной Памавак на 170 головах крупного рогатого скота. Впоследствии, лучшим вариантом вакцины против некробактериоза КРС было привито все поголовье (1347 коров) этого хозяйства. Другой вариант (эмульгированной) опытной серии инактивированной ассоциированной вакцины против некробактериоза КРС был испытан на 381 голове КРС в совхозе Луховский Октябрьского района г. Саранска. В дальнейшем в совхозе Барыбино опытно-промышленной серией инактивированной ассоциированной вакцины против некробактериоза КРС с ГОА адъювантом, было привито 32 коровы различными дозами этого препарата. В этом хозяйстве были исследованы также некоторые параметры иммунитета, стимулируемого этой вакциной.
В результате проведенных исследований было установлено, что вакцинация животных инактивированными ассоциированными вакцинами против инфекционных заболеваний конечностей овец и некробактериоза КРС является эффективным методом борьбы с этими болезнями. Их эффективность оказалась выше, чем у Югославской ассоциированной вакцины Памавак и эмульгированной моновакцины против копытной гнили овец. В итоге, в качестве адъюванта был выбран 3% ГОА как менее реактогенный по сравнению с масляным и дешевый. Наиболее эффективной оказалась двукратная иммунизация животных с интервалом 28 - 30 дней при подкожном введении в области коленной складки для КРС и в области нижней трети шеи для овец в дозах по 5 мл на 1 голову животного.
Срок иммунитета, стимулируемого этими вакцинами не превышал 6 месяцев, поэтому перспективной являлась однократная реиммунизация через 5-6 месяцев после второй вакцинации для поддержания иммунитета у привитых животных.
Инактивированная ассоциированная вакцина против инфекционных заболеваний конечностей овец получила название Овикон, а инактивированная ассоциированная вакцина против некробактериоза конечностей КРС - Нековак.
2.6. Разработка методов контроля ассоциированных вакцин.
За основу лабораторных методов контроля вакцин Овикон и Нековак брали существующие стандартные методики: отбор проб по ОСТ 10-07-001-93, определение внешнего вида визуально, определение стерильности согласно ГОСТ 28085-89 - Препараты биологические. Метод бактериологического контроля стерильности. При этом в питательных средах с посевами и пересевами не должно быть визуальных признаков роста микрофлоры. Определение безвредности проводили также по стандартной методике, используя 10 белых мышей и двух кроликов, при подкожном введении в соответствующих дозах. Вакцины считали безвредными, если животные в течение 10 суток оставались живы и клинически здоровы. Допускалось образование в местах введения вакцин припухлостей различной величины. Принципиально важным и сложным стал вопрос о разработке методов контроля антигенной и иммуногенной активности ассоциированных вакцин Овикон и Нековак ввиду большого количества антигенов и анатоксинов входящих в их состав. Ранее, нами в качестве лабораторного контроля антигенной активности вакцины против копытной гнили овец инактивированной эмульгированной был разработан метод определения антител в РА у вакцинированных кроликов. Предварительно нами были изучены вирулентные и иммуногенные свойства D. nodosus на лабораторных моделях. В результате исследований было установлено, что лабораторные животные (кролики, белые мыши, морские свинки и другие) не чувствительны к D. nodosus. При различных методах заражения и дозах культуры D. nodosus не вызывали заболевания и падежа лабораторных животных (Панасюк С.Д., 1982). Однако, нами было экспериментально установлено, что динамика накопления антител в крови вакцинированных кроликов в половинных дозах (от дозы овцы) повторяет динамику накопления агглютининов у привитых овец только на более низком уровне соответственно 1:720-1:880 и 1:2133-1:2533 на пике накопления. При этом коэффициент корреляции был в высокой степени положительным (r=+0,83-+ 0,99). Это позволило использовать кроликов в качестве лабораторной модели контроля антигенной активности вакцины против копытной гнили овец ВИЭВ инактивированной эмульгированной (Панасюк С.Д. 1982, 1983). Предложенный метод прошел проверку на Орской и Армавирской биофабриках и надежно обеспечивал качество указанной вакцины до момента снятия её с производства. Учитывая тот факт, что в состав вакцины Овикон входит антиген D. nodosus, мы использовали указанный метод контроля антигенной активности этой валентности на кроликах в тех же параметрах, как и у вакцины против копытной гнили овец. Более того, учитывая потерю вирулентных свойств культур F. necrophorum (быструю потерю вирулентных свойств культур при пересевах на жидких питательных средах и возможность образования L-форм). Нами были проведены сравнительные исследования по определению динамики антител у вакцинированных кроликов, овец и КРС. Результаты исследований показали, как для валентности D. nodosus, так и для валентности F. necrophorum имеется возможность использовать кроликов в качестве лабораторной модели для оценки антигенной активности вакцин. Корреляция титров агглютининов у вакцинированных кроликов и овец, а также у привитых кроликов и КРС была очень высокой и соответственно составляла r=+0,97 и r=+ 0,99,что показано в таблице 5. Полученные результаты позволили нам расширить эксперимент и продолжить использовать кроликов в качестве лабораторной модели антигенной активности вспомогательных валентностей S. aureus, C. perfringens т. А, A. pyogenes ассоциированных вакцин Овикон и Нековак.
Полученные результаты позволили установить тот факт, что привитые вакцинами Овикон и Нековак кролики могут быть лабораторной
Таблица 5
Сравнительное антителообразование у вакцинированных (валентность F.necrophorum)
кроликов, овец, КРС
| Вакцины, Животные, Дозы, Сроки исследований | Двукратная доза (мл) | Количество животных (гол.) | Сроки исследований | Коэффициент корреляции о | ||||
Средние титры агглютининов в РА | ||||||||
До 1-й вакцинации 1-я вакцинация | 1 месяц после 1-й вакцинации 2-я вакцинация | 2 недели после 2-й вакцинации | 1 месяц после 2-й вакцинации | 2 месяца после 2-й вакцинации | ||||
Вакцина Овикон, Кролики | 4 | 10 | 1:7010 | 1:56030 | 1:144040 | 1:136060 | 1:120030 | |
Вакцина Овикон, Овцы | 10 | 10 | 1:1000 | 1:152060 | 1:2560120 | 1:248080 | 1:224040 | +0.97 |
Вакцина Нековак Кролики | 4 | 10 | 1:955 | 1:96030 | 1:136090 | 1:144040 | 1:128060 | |
Вакцина Нековак, КРС | 10 | 10 | 1:12010 | 1:168080 | 1:3840210 | 1:3840210 | 1:3040180 | +0.99 |
моделью оценки антигенной активности валентностей S. aureus, C.perfringens т. А, А. pyogenes в реакции нейтрализации (РН), о чем убедительно свидетельствовали в высокой степени коэффициенты корреляции (r= +0,97 Ц +0,99).
Результаты проведенных экспериментов легли в основу создания временной нормативной документации (НД) на инактивированную ассоциированную вакцину против некробактериоза конечностей КРС Нековак и на инактивированную ассоциированную вакцину против инфекционных заболеваний конечностей овец Овикон, включающую временное наставление, временную инструкцию по изготовлению и контролю и временные технические условия (ТУ).
2.7. Изучение некоторых параметров иммунитета при применении инактивированных ассоциированных вакцин Нековак, Нековак-стимул и Овикон.
С целью изучения некоторых параметров иммунитета, стимулируемых ассоциированными вакцинами Овикон и Нековак с руководством и специалистами Курской биофабрики в 1994 году были согласованы вопросы технологии изготовления опытно-промышленной серии вакцин Овикон и Нековак, общим объемом 45000 доз. Одновременно, после согласования вопросов технологии изготовления, выпуск опытно-промышленных серий начался на Ставропольской биофабрике. В период с 1994 по 1996 годы Ставропольской биофабрикой было выпущено 3 опытно-промышленных серии вакцины Нековак общим объемом 850 литров (175000 доз) и 4 серии вакцины Овикон объемом 1118,6 л (223720 доз).
Изучение некоторых параметров иммунитета, стимулируемых ассоциированными вакцинами Нековак, Нековак-стимул (вакцина Нековак с иммуномодулятором ГМДП) и Овикон, провели по составленной программе исследований. Она предусматривала испытание вакцины Нековак-стимул в двух неблагополучных по некробактериозу КРС хозяйствах Ленинского района Тульской области: агрофирмах Иван-Озеро и Саженец - на всем поголовье КРС (635 голов) этих хозяйств и вакцин Нековак и Нековак-стимул с СХПК ПЗ Барыбино Домодедовского района Московской обл. на 221 корове. При этом вакциной Нековак-стимул привили 20 здоровых коров, для оценки некоторых параметров клеточного иммунитета и его сопоставления с аналогичными показателями иммунитета, стимулируемого вакциной Нековак.
Комиссионное испытание опытно-промышленной серии вакцины Овикон провели на 1234 головах мелкого рогатого скота в ГПЗ Котовский Пронского района Рязанской области, неблагополучного по копытной гнили и некробактериозу овец, в наиболее сильно пораженных отарах баранов-производителей и овцематок племъядра, где заболеваемость конечностей соответственно составляла до начала эксперимента 30,0 и 10,3%. Обе вакцинированные отары составили примерно половину всего поголовья овец хозяйства.
В хозяйствах, где испытывали опытно-промышленные серии вакцин Овикон и Нековак, контрольные и вакцинированные животные содержались в одинаковых условиях. Выпасались и выгуливались совместно.
Результаты представлены в таблицах 6, 7.
Итоги экспериментов по изучению некоторых параметров иммунитета, стимулируемых ассоциированными вакцинами Нековак, Нековак-стимул и Овикон показывают, что указанные препараты вызывали в организме привитых животных значительное повышение иммунного статуса, выражающегося выработкой как гуморального, так и клеточного иммунитета. Поствакцинальный иммунитет сопровождался значительны ростом титров специфических агглютининов, которые с достоверностью 99% (Р <0,01) в средней и высокой степени находятся в обратной коррелятивной связи с заболеваемостью конечностей у привитых животных. Пик выработки специфических гуморальных тел наблюдались через 2-3 недели после второй вакцинации.
Так, при применении вакцины Нековак-стимул агрофирме Иван-Озеро, титры специфических агглютининов увеличились с 1:200 в начале испытания, до 1:2240 через 3,5 месяца после второй вакцинации, т.е. увеличились в 11,2 раза. В этот период заболеваемость КРС резко снизилась с 58,4% в начале опыта до 4,4% в конце исследований, т.е. в 13,3 раза. Коэффициент корреляции (r) по результатам опыта составил с достоверной вероятностью 99% (Р <0,01) величину (-0,88). Это указывает на наличие высокой степени обратной коррелятивной связи между величиной титров специфических агглютининов и заболеваемостью конечностей животных.
Аналогичные результаты были получены при испытании вакцины Нековак-стимул в агрофирме Саженец, где при увеличении титров гуморальных антител в РА с 1:230 до 1:3680, т.е. в 16 раз, уровень заболеваемости животных некробактериозом снизился с 83% до 0,6% в 138,3 раза, т.е. хозяйство было практически оздоровлено от этой инфекции. Коэффициент корреляции (r) составил (-0,57), что подтверждает наличие обратной корреляционной связи между величиной титров агглютининов и заболеваемостью некробактериозом животных средней степени.
В тоже время, в СХПК ПЗ Барыбино во время испытания опытно-промышленной серии вакцины Нековак, при росте титров агглютининов в 10,4 раза (с 1:370 до 1:3840) заболеваемость некробактериозом снизилась с 31,7% до 3,0% т.е. в 10,6 раза, что с достоверной вероятностью 99% подтвердило наличие обратной коррелятивной связи между титрами агглютининов и заболеваемостью животных некробактериозом (r=-0,98) в высокой степени. В этом эксперименте, как и в предыдущих опытах, отмечали увеличение всего пула лимфоцитов. Несколько большее увеличение Т- и В- лимфоцитов констатировали у коров, привитых вакциной Нековак-стимул, соответственно на 7,13 и 5,09% по сравнению с первоначальным уровнем. У животных, привитых вакциной Нековак количество Т- и В- лимфоцитов увеличилось соответственно на 4,7 и 3,83%. В контрольной группе уровень Т- и В- лимфоцитов оставался в пределах физиологической нормы.
Результаты опыта, отображенные в табл. 7, свидетельствуют о нарастании интенсивности фагоцитоза в группах, где использовались вакцины Нековак и Нековак-стимул, в то время как в контрольной группе этого не произошло.
Данные табл. 7 свидетельствуют также об увеличении концентрации в крови вакцинированных животных иммуноглобулинов классов G и М. Максимальный рост иммуноглобулинов наблюдали через 1 месяц после второй вакцинации. В этот период Ig G у привитых вакциной Нековак-стимул составили величину 24,060,95 мг/мл, что на 10,6% больше первоначальной величины. У коров, иммунизированных вакциной Нековак, иммуноглобулины G увеличивалась на 8,4% и достигли величины 23,680,85 мг/мл. Анологично увеличивалась концентрация Ig M.
Результаты эксперимента убедительно показали, что вакцина Нековак стимулировала у привитых животных выработку первичного и вторичного напряженного поствакцинального гуморального и клеточного иммунитета и обладала лечебным действием. Применение вакцины Нековак в СХПК ПЗ Барыбино позволило в 10,6 раза снизить заболеваемость привитых животных некробактериозом и свести её до единичных случаев.
При испытании опытно-промышленной серии инактивированной ассоциированной вакцины Овикон в ГПЗ Котовский на группе баранов-производителей и овцематок, мы наблюдали теже закономерности, что и при испытании вакцин Нековак и Нековак-стимул на КРС.
Так, в группе барановЦпроизводителей, привитых вакциной Овикон, титры гуморальных антител увеличились по валентности D. nodosus с 1:120 до 1:2160, т.е. в 32,0 раза, а по валентности F. necrophorum с 1:120 до 1:3760, т.е. в 37,6 раза через месяц после второй вакцинации. В указанные сроки заболеваемость копытной гнилью и некробактериозом в группе баранов-производителей снизилась с 30,5 до 6%, т.е. в 5 раз.
В группе привитых овцематок племъядра титры специфических антител с начала испытания выросли по валентности D. nodosus с 1:120 до 1:2320, т.е. в 19,3 раза, а по валентности F. necrophorum с 1:110 до 1:3200, т.е. в 32,0 раза. Заболеваемость конечностей у привитых овцематок в те же периоды снизилась с 10,3% до 3,4%, т.е. в 3,0 раза. Результаты исследова-
Таблица 6
Результаты испытания вакцины против некробактериоза КРС (Нековак) в СХПК ПЗ Барыбино Домодедовского района, Московской области
Наименование препарата Группа | Сроки исследований | ||||||||||||
До вакцинации 1-я вакцинация | 1 месяц после 1-й вакцинации 2-я вакцинация | ||||||||||||
Количество больных животных | % | Количество здоровых животных | % | Всего животных | Средние титры антител в РА | Количество больных животных | % | Количество здоровых животных | % | Всего животных | Достовер-ность (Р) | Средние титры антител в РА | |
Ассоции-рованная вакцина (Нековак) | 32 | 31,7 | 69 | 68,3 | 101 | 1:37045 | 15 | 15,3 | 83 | 84,7 | 98 | P < 0,02 | 1:1920160 |
Непривитые Контроль | 38 | 31,7 | 82 | 68,3 | 120 | 1:37040 | 37 | 30,6 | 84 | 69,4 | 121 | 1:40065 | |
Таблица 6 (Продолжение)
Результаты испытания ассоциированной вакцины против некробактериоза КРС (Нековак) в СХПК ПЗ Барыбино Домодедовского района, Московской области
| Наименование препарата Группа | Сроки исследований | ||||||||||||||
1 месяц после 2-й вакцинации | 2 месяца после 2-й вакцинации | ||||||||||||||
Количество больных животных | % | Количество здоровых животных | % | Всего животных | Достоверность (Р) | Средние титры антител в РА | Количество больных животных | % | Количество здоровых животных | % | Всего животных | Достоверность (Р) | Средние титры антител в РА | Коэффициент корреляции | |
Ассоцииро-ванная вакцина (Нековак) | 3 | 3 | 98 | 97 | 101 | P < 0,01 | 1:3840 320 | 3 | 3,4 | 86 | 96,6 | 89 | P < 0,01 | 1:3680 260 | r = (-0,98) |
Непривитые Контроль | 32 | 28,8 | 79 | 71,2 | 111 | 1:400 40 | 35 | 30,7 | 79 | 69,3 | 114 | 1:40045 | |||
Таблица 7
Основные параметры иммунного статуса коров, привитых вакцинами против некробактериоза КРС Нековак и Нековак-стимул в СХПК ПЗ Барыбино Домодедовского района Московской области
Количество животных (n)=20, достоверность Р< 0,01
Препараты, сроки исследований Показатели | Вакцина Нековак | Вакцина Нековак-стимул | |||||
До вакцинации 1-я вакцинация | 1 месяц после 1-й вакцинации 2-я вакцинация | 1 месяц после 2-й вакцинации | До вакцинации 1-я вакцинация | 1 месяц после 1-й вакцинации 2-я вакцинация | 1 месяц после 2-й вакцинации | ||
Иммуно-глобулины | Ig G | 21,84±1,06 | 22,25±0,95 | 23,68±0,85 | 21,75±0,84 | 23,82±1,48 | 24,06±1,53 |
Ig M | 2,18±0,21 | 2,23±0,34 | 2,78±0,2 | 2,12±0,02 | 2,63±0,3 | 3,12±0,32 | |
Популяции имфоцитов (%) | B- | 42,65±8,17 | 45,63±8,45 | 47,36±5,17 | 41,95±6,14 | 47,13±5,36 | 49,08±9,42 |
T- | 20,74±2,04 | 22,09±2,36 | 24,57±3,85 | 20,34±3,28 | 24,21±2,13 | 25,43±2,85 | |
Фагоцитарная активность ФА (%) | 49,35±7,05 | 51,53±6,75 | 54,08±7,04 | 49,74±6,36 | 52,88±5,35 | 56,17±8,14 | |
Фагоцитарное число ФЧ (м.т.) | 6,87±2,23 | 7,75±1,44 | 9,17±2,15 | 6,74±1,34 | 8,16±1,05 | 10,34±1,26 | |
| Фагоцитарный индекс ФИ (м.т.) | 3,82±0,95 | 4,17±0,98 | 6,26±0,94 | 3,79±1,14 | 6,68±1,15 | 7,64±1,75 | |
ний подтвердили наличие обратной коррелятивной связи с достоверностью 99% между уровнем титров специфических агглютининов и заболеваемостью копытной гнилью и некробактериозом в группе баранов-производителей высокой степени по валентности D. nodosus (r=-0.82), а по валентности F. Necrophorum (r=-0.90).
У привитых овцематок племъядра наблюдалась обратная коррелятивная связь между этими показателями средней степени по валентности D. nodosus (r=-0,57), а по валентности F. necrophorum коэффициент корреляции r был равен (- 0,66).
При изучении некоторых параметров клеточного иммунитета у животных, привитых указанными препаратами, максимально увеличивалась концентрация иммуноглобулинов классов G и М. У привитых животных отмечали увеличение всего пула лимфоцитов, как тимусзависимых, так и бурсазависимых. Особенно значительным оно было на 14 - 30 день после второй вакцинации. Иммунизация указанными препаратами также стимулировала у вакцинированных животных интенсивность фагоцитоза нейтрофилов. Основные показатели фагоцитоза: фагоцитарная активность, фагоцитарное число и фагоцитарный индекс - достигли максимума на 14 день после вакцинации. На этом фоне все показатели иммунного статуса контрольных животных оставалась в пределах физиологической нормы.
Иммунизация вакцинами Нековак, Нековак-стимул и Овикон сопровождалась выраженным лечебным эффектом, проявляющимся в легком переболевании привитых животных, их быстром выздоровлении и отсутствии случаев рецидивов заболевания.
Доказательство иммуногенности указанных вакцин позволило поставить вопрос об их промышленном выпуске и создании промышленной технологии изготовления.
2.8. Промышленная технология изготовления ассоциированных вакцин Нековак и Овикон.
Успешное испытание опытно-промышленных серий вакцин Нековак, Нековак-стимул и Овикон в неблагополучных по инфекционным болезням конечностей хозяйствах, позволило перейти на серийное примышленное производство указанных препаратов.
Общая схема технологического процесса изготовления указанных вакцин состоит из следующих стадий, представленных в табл. 10.
Технология, разработанная при создании опытно-промышленных серий вакцин Нековак и Овикон в 1994-1996 гг., предусматривала культивирование анаэробных штаммов F. necrophorum, D. nodosus, C. perfringens т. А на жидких питательных средах из натурального сырья. Аэробные культуры S. aureus и A. pyogenes выращивали на плотных питательных средах - 2,5% агаре Хоттингера в 1,5 л. матрасах.
Технология изготовления последних двух валентностей вакцин являлась весьма трудоемкой, с высокими материальными затратами и низким выходом бактериальной массы. По нормативно-технической документации
Таблица 8
Испытание опытно-промышленной серии ассоциированной вакцины против инфекционных заболеваний конечностей овец Овикон в ГПЗ Котовский Пронского района Рязанской области
Сроки иссле дований Группы | До вакцинации | 1 месяц после 1-й вакцинации 2-я вакцинация | 1 месяц после 2-й вакцинации | ||||||||||||||||||||||
Количество больных | % | Количество здоровых | % | Всего овец | Титры в PA D.nodosus | Титры в РА F.necrophorum | Количество больных | % | Количество здоровых | % | Всего овец | Титры в PA D.nodosus | Титры в РА F.necrophorum | Достоверность (Р) | Количество больных | % | Количество здоровых | % | Всего овец | Титры в PA D.nodosus | Титры в РА F.necrophorum | Достоверность (Р) | Коэффици- ент корреляции (r) | ||
D.nodosus | F.necro-phorum | ||||||||||||||||||||||||
Привитые бараны-производители | 15 | 30 | 35 | 70 | 50 | 1:120 | 1:100 | 15 | 30 | 35 | 70 | 50 | 1:1280 | 1:1680 | P<0,01 | 3 | 6 | 47 | 94 | 50 | 1:2160 | 1:3760 | P<0,01 | -0,82 | -0,9 |
Привитые овцематки племъядра | 55 | 10,3 | 477 | 89 | 532 | 1:120 | 1:100 | 70 | 14 | 410 | 86 | 480 | 1:1360 | 1:1520 | P<0,01 | 18 | 3,4 | 499 | 96,4 | 517 | 1:2320 | 1:3200 | P<0,01 | -0,57 | 0,66 |
Контроль Непривитые | 23 | 3,5 | 629 | 96,5 | 652 | 1:120 | 1:100 | 44 | 7 | 608 | 93 | 652 | 1:150 | 1:125 | 114 | 19 | 488 | 81 | 602 | 1:115 | 1:130 | ||||
Таблица 9
Основные параметры иммунного статуса овец, привитых ассоциированной вакциной против инфекционных заболеваний конечностей Овикон в ГПЗ Котовский Пронского района Рязанской области
Достоверность Р<0,01
Сроки исследований Показатели | Вакцина Овикон | Контроль (Непривитые) | |||||
До вакцинации | 1 месяц после 1-й вакцинации 2-я вакцинация | 1 месяц после 2-й вакцинации | До начала опыта | 1 месяц после начала опыта | 1 месяц после начала опыта | ||
Иммуно-глобулины Jg (мг/мл) | Ig G | 17,24±1,15 | 18,24±1,34 | 19,63±2,05 | 16,98±1,05 | 17,08±1,20 | 17,06±1,05 |
| Ig M | 1,57±0,40 | 1,98±0,18 | 2,27±0,21 | 1,52±0,35 | 1,61±0,09 | 1,61±0,46 | |
Популяции имфоцитов (%) | B- | 23,73±0,96 | 26,15±1,17 | 28,93±1,68 | 23,85±1,17 | 23,92±1,05 | 23,87±1,05 |
| T- | 12,04±0,85 | 14,58±1,15 | 17,12±2,04 | 12,36±0,75 | 12,74±0,98 | 12,45±0,95 | |
Фагоцитарная активность ФА (%) | 26,22±1,29 | 31,44±2,15 | 32,75±2,05 | 26,43±1,15 | 26,72±0,85 | 27,15±0,98 | |
Фагоцитарное число ФЧ (м.т.) | 4,85±1,75 | 5,87±0,97 | 6,14±1,24 | 4,88±1,05 | 5,91±0,95 | 5,92±1,05 | |
Фагоцитарный индекс ФИ (м.т.) | 4,38±0,98 | 5,73±1,15 | 6,52±1,05 | 4,39±0,95 | 4,51±0,85 | 4,48±1,05 | |
Таблица 10
Технологическая схема производства инактивированных ассоциированных вакцин: против некробактериоза
конечностей крупного рогатого скота НЕКОВАК и против инфекционных заболеваний конечностей овец ОВИКОН
Ампулы с производственными штаммами | ||||||||
Наработка посевного материала D. nodosus | Наработка посевного материала A. pyogenes | Наработка посевного материала S. aureus | Наработка посевного материала F. necrophorum | Наработка посевного материала C. Perfringens т.А | ||||
Приготовление антигена, включая культивирование в реакторе, концентрирование и инактивацию | Приготовление анатоксина включая культивирование в реакторе, концентрирование и инактивацию | |||||||
Промежуточный контроль антигена и анатоксина F. necrophorum, антигена D. nodosus, окончательный контроль антигена A. Pyogenes, антигенов и анатоксинов S. Aureus, F. necroforum, C. perfringens | ||||||||
Составление серии вакцины | ||||||||
Расфасовка, укупорка, маркировка | Этикетировка | Складирование | Взятие образцов для контроля | |||||
F. necrophorum и D. nodosus выращивалась на питательной среде, состоящей из смеси печеночного экстракта и одного из переваров мяса (ферментативного или казеинового) в соотношении 1:3. Это очень дорогостоящая среда.
В исследованиях, проведенных сотрудниками ФГУП Ставропольская биофабрика вместе с авторами препаратов, модифицировали питательные среды с целью экономии дорогостоящих инградиентов, а также получения максимального накопления микробных клеток.
Работу провели в двух направлениях: разработка промышленных способов культивирования аэробных микроорганизмов Staphylococcus aureus, Actinomyces pyogenes, при этом нами ставилась задача перейти от культивирования этих микроорганизмов на плотных питательных средах к глубинному - в ферментерах на жидких питательных средах. С этой целью, в сравнительном аспекте были исследованы следующие питательные среды: бульон Хоттингера и сложно-компонентная питательная среда, состоящая из основного перевара Хоттингера, ферментного гидролизата кровяных сгустков (отходов от производства нормальной сыворотки КРС и овец), ферментативного гидролизата казеина и гидролизата печени КРС. В испытываемых средах устанавливали рН 7,6-7,8, аминный азот 170-180 мг%. Во время культивирования в реакторах культур Staphylococcus aureus и Actinomyces pyogenes в питательную среду дробно добавляли 40% раствор глюкозы с периодической корректировкой рН до 7,2-7,4. Время культивирования 18 часов.
Были получены следующие результаты культивирования по накоплению бактериальной массы на сложно компонентной питательной среде: S. aureus - 20108 м.т./мл., A. pyogenes - 9108 м.т./мл.
В тоже время, при культивировании указанных микроорганизмов в матрасах с 2,5% агаром Хоттингера, накопление A. pyogenes составило 4 млрд.м.т. в мл. Такое количество антигенов по старой технологии культивировании в матрасах с 2,5% агаром Хоттингера мы могли получать с 1000 - 2000 матрасов (5 - 10 культивирований по 250 матрасов).
На втором этапе при изыскании питательных сред для культивирования анаэробных микроорганизмов F. necrophorum и D. nodosus, перевар Хоттингера из состава питательной среды был исключен. Вместо экстракта печени использовался её гидролизат. Согласно инструкции по изготовлению, на 100 л экстракта печени необходимо 100 кг печени КРС, а для изготовления 20 л гидролизата печени - всего 15 кг. Гидролизат печени добавляли в количестве 2% к основному объему питательной среды. В конструировании питательной среды также использовали гидролизаты казеина: кислотный и ферментативный, ферментативный гидролизат кровяных сгустков.
Готовая питательная среда имела следующие биохимические показатели: рН - 7,8 -8,0, аминного азота 150-180 мг%.
В результате проведенных исследований сравнительного культивирования анаэробных микроорганизмов на экспериментальной (сложно компонентной питательной среде) и контрольной среде (среда МППБ на основе перевара Хоттингера), нами было установлено, что накопление бактериальной массы на экспериментальной среде в 1,5 раза превышало этот показатель контрольной среды. Замена основного перевара Хоттингера гидролизатом печени в сложно компонентной среде позволила снизить в 6 раз затраты на производство ростовых сред.
Успешное испытание опытно-промышленной серий ассоциированных вакцин Нековак, Нековак-стимул и Овикон в неблагополучных по инфекционным болезням конечностей крупного и мелкого рогатого скота животноводческих хозяйствах РФ, а также разработка и усовершенствование промышленной технологии изготовления указанных препаратов позволили:
1. Оформить патенты на ассоциированную вакцину Овикон против инфекционных заболеваний конечностей овец, и на ассоциированную вакцину Нековак против некробактериоза КРС;
2. Утвердить постоянную действующую нормативную документацию на указанные препараты;
3. Зарегистрировать в РФ указанные препараты;
4. Продолжить серийное производство указанных вакцин на ФГУП Ставропольская биофабрика.
5. Сертифицировать выпуск этих препаратов;
6. Провести испытания эффективности промышленных серий ассоциированных вакцин Нековак, Нековак-стимул и Овикон в неблагополучных по инфекционным болезням конечностей крупного и мелкого рогатого скота животноводческих хозяйствах РФ.
2.9. Испытание эффективности промышленных серий ассоциированных вакцин Нековак, Нековак-стимул Овикон. Разработка системы мероприятий по борьбе с инфекционными заболеваниями конечностей крупного и мелкого рогатого скота.
Утверждение Нормативной Документации на ассоциированные вакцины Нековак, Нековак-стимул и Овикон и начавшееся на ФГУП Ставропольская биофабрика промышленное производство указанных препаратов позволили перейти к испытанию эффективности промышленных серий этих вакцин в неблагополучных по некробактериозу и копытной гнили животноводческих и овцеводческих хозяйствах Российской Федерации.
Результаты исследований представлены в таблицах 11 и 12. Так, применение промышленной серии вакцины Нековак в ГПЗ Зыбино Тульской области позволило снизить заболеваемость коров некробактериозом с 65,0% до 4,6%, т.е. в 14,1 раза. В этот период титры специфических агглютининов возросли с 1:90 до 1:3840, т.е. увеличились в 42,7 раза (r=-0,98, P<0,01), что подтверждает наличие обратной коррелятивной связи высокой степени между величиной титров агглютининов и заболеваемостью некробактериозом. В двух хозяйствах Добринского района Липецкой области промышленные серии вакцины Нековак испытывали в колхозе лим. Крупской и в колхозе лим. Ильича. Вакцину использовали в соответствии с наставлением, но комплекс организационно-хозяйственных и лечебно-профилактических мероприятий, который применяли вместе с вакцинацией, был в этих хозяйствах различным. Так, в колхозе лим. Крупской, помимо вакцинации всего поголовья КРС, провели обрезку и расчистку копытец, в рацион животных была введена минерально-витаминная подкормка, в пастбищный период был проведен ремонт полов и дезинфекция помещений. В колхозе лим. Ильича, наряду с вакцинацией, всех животных один раз в 5 дней пропускали через ножные дезинфицирующие ванны с 10% раствором медного купороса. В рацион животных помимо минерально-витаминной подкормки были введены добавки серы и метионина, в пастбищный период был проведен ремонт полов в стойлах, дезинфекция животноводческих помещений и выгульных дворов, инвентаря. В пастбищный период все больные животные были отделены от основного стада и подвергнуты лечению антибиотиками широкого спектра.
От животных в период наблюдений брали кровь и исследовали сыворотку в РА на наличие специфических аггютининов. В этих хозяйствах через два месяца после второй вакцинации отмечался высокий уровень подъёма средних титров агглютининов у привитых животных до 1:3200 в колхозе лим. Крупской и до 1:3680 в колхозе лим. Ильича, что соответственно более первоначального уровня в 32 и 36,2 раза. В указанный период отмечали (с достоверной вероятностью 99%) резкий спад уровня заболеваемости коров некробактериозом соответственно в колхозе лим. Крупской в 36,2 раза, в колхозе лим. Ильича в 21,4 раза, до единичных случаев (0,8% и 0,7%). Через 6 месяцев после второй вакцинации к моменту окончания сроков иммунитета и резкого снижения титров агглютининов заболеваемость животных некробактериозом (с достоверной вероятностью 99%) в колхозе лим. Крупской несколько выросла до 2,6%. В колхозе лим. Ильича несмотря на окончание сроков иммунитета больных некробактериозом коров не отмечено, что, вероятно, связано с правильным использованием описанной системы мероприятий по борьбе с этой инфекцией. Результаты исследований (с достоверной вероятностью 99%) подтверждают наличие обратной коррелятивной связи между титрами агглютининов и заболеваемостью животных некробактериозом. В обоих хозяйствах обратная коррелятивная связь между титрами и заболеваемостью животных была средней степени в колхозе лим. Крупской величина r составила (-0,68), в колхозе лим. Ильича (r=-0,64; P<0,01).
Аналогичные испытания были проведены в АО Сафоновское Раменского района Московской области, где в двух животноводческих фермах хозяйствах привили коров вакцинами Нековак и Нековак-стимул, где в качестве имуномодулятора использовали препарат Беталин, представляющий собой очищенный рекомбинантный лимфотоксин (фактор некроза опухолей бета) человека.
Результаты испытаний убедительно продемонстрировали тот факт, что применение вакцин Нековак и Нековак-стимул в системе организационно-хозяйственных и ветеринарно-санитарных мероприятий позволяет уменьшить заболеваемость привитых животных до единичных случаев и практически оздоровить хозяйство от этой инфекции.
Испытание промышленных серий ассоциированной вакцины Овикон проводили в трех овцеводческих хозяйствах Ставропольского края: СХП Новомарьевское Шпаковского района, СХП Каменнобалковское Благодарненского района, подсобном хозяйстве ФГУП Ставропольская биофабрика.
Во всех хозяйствах перед вакцинацией проводили расчистку и обрезку копытец, в рацион животных вводили монокальций фосфат для восполнения недостатка кальция и фосфора и добавки серы. В пастбищный период проводили дезинфекцию кошар, выгульных базов и инвентаря. В СХП Каменнобалковское и подсобном хозяйстве Ставропольской биофабрики наряду с выше перечисленными организационно-хозяйственными и ветеринарно-санитарными мероприятиями всех животных пропускали один раз в 5-6 дней через ножные ванны с 10% раствором препарата Цинкосол. По окончании срока иммунитета (5-6 месяцев после второй вакцинации) больным баранам-производителям в этих хозяйствах провели курс лечения антибиотиками широкого срока действия. Животные, не поддававшихся лечению, сдавали на убой. Вакцину Овикон применяли в соответствии с наставлением. В результате проведенных исследований были получены следующие результаты:
1. В СХП Новомарьевское применение вакцины Овикон на 2406 овцах позволило снизить заболеваемость инфекционными заболеваниями конечностей с 9,1% до 2,0%, т.е. в 4,55 раза. В контрольной непривитой отаре в этот период заболеваемость выросла с 4,55 до 10,3%, т.е. 2,3 раза.
2. В СХП Каменнобалковское, где применяли систему мероприятий вместе с вакцинацией на 879 овцах пораженность инфекционными заболеваниями конечностей снизилась к концу испытаний с 9,1% до 0,0%. В контрольной не привитой отаре заболеваемость выросла в течение наблюдений с 7,8% до 10,4%.
3. В подсобном хозяйстве Ставропольской биофабрики промышленные серии вакцины Овикон испытывали на поголовье 1720 овец. В результате осмотра установили 371 животное с поражениями конечностей (21,6%). Помимо вакцинации в хозяйстве провели весь комплекс организационно-хозяйственных и ветеринарно-санитарных мероприятий по ликвидации инфекционных болезней конечностей, включая расчистку и обрезку копытец, ножные дезинфицирующие ванны с 10% раствором препарата Цинкосол, введение в рацион минерально-витаминных добавок, лечение антибиотиками широкого спектра действия больных баранов-производителей и других, применённых в СХП Каменнобалковское.
Таблица 11
Результаты испытания вакцины Нековак в колхозах лимени Крупской
и лим. Ильича Добринского района Липецкой области
Сроки иссле дований и показатели | Сроки исследований | ||||||||||||||||||||
До вакцинации, 1-я вакцинация | 2 месяца после 2-й вакцинации | 6 месяцев после 2-й вакцинации | |||||||||||||||||||
| Хозяйства | Количество больных животных | % | Количество здоровых животных | % | Всего животных | Средние титры антитле в РА | Количество больных животных | % | Количество здоровых животных | % | Всего животных | Достоверность (Р) | Средние титр ы антитле в РА | Количество больных животных | % | Количество здоровых животных | % | Всего животных | Достоверность (Р) | Средние титр ы антитле в РА | Коэффициент корреляции (r) |
| Колхоз лимени Крупской | 186 | 29 | 454 | 71 | 640 | 1:1005 | 5 | 0,8 | 620 | 99,2 | 625 | Р Л 0,01 | 1:3200260 | 17 | 2,6 | 637 | 97,4 | 591 | Р Л 0,01 | 1:38030 | r = (-0,68) |
| Колхоз лимени Ильича | 65 | 15 | 365 | 430 | 3 | 0,7 | 426 | 99,3 | 429 | Р Л 0,01 | 1:3680350 | 0 | 0 | 422 | 100 | 591 | Р Л 0,01 | 1:42040 | r = (-0,64) | ||
Таблица 12
Результаты испытания вакцины Нековак и Нековак-Стимул
в АО Сафоновское Раменского района Московской области
Сроки исследований и показатели №№ ферм, препарат | Сроки исследований | |||||||||||||||||||||||||||
До вакцинации, 1-я вакцинация | 1 месяц после вакцинации, 2-я вакцинация | 1 месяц после 2-й вакцинации | 3 месяца после 2-й вакцинации | |||||||||||||||||||||||||
Количество больных животных | % | Количество здоровых животных | % | Всего животных | Средние титр ы антитле в РА | Количество больных животных | % | Количество здоровых животных | % | Всего животных | Достоверность (Р) | Средние титр ы антитле в РА | Количество больных животных | % | Количество здоровых животных | % | Всего животных | Достоверность (Р) | Средние титр ы антитле в РА | Количество больных животных | % | Количество здоровых животных | % | Всего животных | Достоверность (Р) | Средние титр ы антитле в РА | Коэффиционт корреляции (r) | |
№ 1 вакцина Нековак | 28 | 15,4 | 154 | 84,6 | 182 | 1:13030 | 20 | 11,1 | 159 | 88,9 | 179 | Р Ы 0,05 | 1:2400220 | 4 | 2,2 | 175 | 97,8 | 179 | Р Л 0,01 | 1:4160 | 3 | 2,1 | 155 | 97,9 | 158 | Р Л 0,01 | 1:3680300 | (-0,96) |
№ 2 вакцина Нековак-Стимул | 34 | 16,6 | 170 | 83,4 | 204 | 12 | 6 | 189 | 94 | 201 | Р Л 0,01 | 1:2720240 | 0 | 0 | 200 | 100 | 200 | Р Л 0,01 | 1:4800 | 2 | 1,1 | 181 | 98,9 | 183 | Р Л 0,01 | 1:4480360 | (-0,96) | |
До иммунизации средние титры специфических аггютининов по валентности Dichelobacter nodosus составили 1:100, по валентности Fusebacterium necrophorum -1:95. Через один месяц после второй вакцинации средние титры антител составили по валентности Dichelobacter nodosus составили 1:2880, по валентности Fusоbacterium necrophorum -1:2720. Через 5,5 месяцев после второй вакцинации к окончанию сроков иммунитета средние титры антител по валентности Dichelobacter nodosus находились в пределах 1:260, а по валентности Fusоbacterium necrophorum -1:280. в указанный период был проведен так же заключительный осмотр всех животных 1740 овец на наличие клинических признаков инфекционных заболеваний конечностей. В результате осмотра было установлено 4 больных овцы (0,23%).
Таким образом, к концу проведенных испытаний промышленных серий ассоциированной вакцины Овикон в системе организационно-хозяйственных и ветеринарно-санитарных мероприятий с достоверной вероятностью 99% (Р<0,01) заболеваемость животных копытной гнилью и некробактериозом снизилась в 94 раза, т.е. практически хозяйство было оздоровлено.
Основываясь на успешных результатах испытаний промышленных серий ассоциированных вакцин Нековак, Нековак-стимул и Овиконв неблагополучных хозяйствах, особенно там, где применялась система организационно-хозяйственных и ветеринарно-санитарных мероприятий, нами в соавторстве была предложена система мероприятий по борьбе с инфекционными болезнями конечностей КРС и овец, представленная в рекомендациях: Диагностика, профилактика и меры борьбы при некробактериозе крупного рогатого скота, Москва, 2000 год и Методических рекомендациях по профилактике и борьбе с копытной гнилью овец, Москва, 2004 год.
Итоговые многолетние результаты испытаний инактивированных ассоциированных вакцин Нековак, Нековак-стимули Овикон, в том числе в системе лечебно-оздоровительных мероприятий, показаны в таблице 13. Данные этой таблицы убедительно иллюстрируют тот факт, что использование вакцин Нековак, Нековак-стимул Овикон в системе лечебно-оздоровительных мероприятий по борьбе с инфекционными болезнями конечностей позволило оздоровить 5 животноводческих и 2 овцеводческих хозяйства.
Это подтверждает её эффективность и необходимость использования в ликвидации некробактериоза и копытной гнили жвачных, что также иллюстроирует таблица 14.
Таблица 13
Результаты испытаний ассоциированных вакцин Нековак,
Нековак-Стимул и Овикон и системы мероприятий против
некробактериоза крупного рогатого скота и копытной гнили овец
Хозяйство, область | Вакцины | Система мероприятий | Кол-во вакцинированных животных | Пораженность, % | снижение заболеваемости, раз | |
До вакцинации | После вакцинации | |||||
Крупный рогатый скот вакцина Нековак | ||||||
Колхоз им. Кирова, МО | - | + | 1347 | 28 | Един. случаи | оздоровлено |
ППО Истра-Сенежское, МО | - | + | 1200 | 14,1 | 0,5 | оздоровлено |
К-з им. Ленина, Тульская обл. | + | - | 2750 | 32,5 | 4,0 | 8,1 |
ГПЗ Зыбино, Тульская обл | + | - | 609 | 65 | 4,4 | 14,7 |
К-з Иван-озеро, Тульская обл. | + | - | 329 | 58,4 | 4,4 | 13,2 |
Агрофирма Саженец Тульская обл. | - | + | 324 | 83 | 0,6 | оздоровлено |
АО Сафоновское МО | - | + | 386 | 16 | Един. случаи | оздоровлено |
К-з им. Крупской, Липецкая обл. | + | - | 640 | 29 | 1,7 | 17 |
К-з им. Ильича, Липецкая обл. | - | + | 430 | 15 | Един. случаи | оздоровлено |
Мелкий рогатый скот вакцина Овикон | ||||||
ГПЗ Котовский, Рязанская обл. | + | - | 567 | 20,2 | 4,5 | 4,5 |
СПХ Новомарьевское, Ставропольский край | + | - | 2406 | 9,1 | 2,0 | 4,55 |
СПХ Каменнобалковское, Ставропольский край | - | + | 879 | 9,1 | 0 | оздоровлено |
Подхоз Ставропольской биофабрики | - | + | 1720 | 21,6 | 0,23 | оздоровлено |
Всего | ||||||
Крупного рогатого скота | 8015 | |||||
Овец | 5031 | |||||
Таблица 14
Схема оздоровительных мероприятий при инфекционных
болезнях конечностей КРС и овец
| Клинический осмотр, расчистка копыт | ||
| Установление диагноза, наложение ограничений | ||
| Клинически здоровые животные | Вакцинация | Больные животные |
Профилактические обработки | Изоляция | |
ечение | ||
| Контроль оздоровления | Выздоровление | Убой неподдающихся лечению животных |
| Снятие ограничений |
ВЫВОДЫ
1. Инфекционные болезни конечностей крупного и мелкого рогатого скота широко распространены в различных природно-климатических зонах Российской Федерации и Республике Киргизия. Заболеваемость конечностей КРС некробактериозом варьирует в широких пределах в хозяйствах Центральной России от 11,6 до 83,0%, в хозяйствах Ставропольского края от 1 до 17,6%, в хозяйствах Республики Киргизия от 6,5 до 20,3% поголовья животных хозяйства. Заболеваемость конечностей овец копытной гнилью и некробактериозом так же варьирует в широких пределах в хозяйствах Центральной России от 3,5 до 52%, в хозяйствах Ставропольского края от 3,6 до 38,1%, в хозяйствах Республики Киргизия от 8,0 до 86,0% поголовья животных . Уровень заболеваемости также зависит от условий содержания, кормления, внешней среды и складывающейся патогенетической ассоциации микроорганизмов.
2. Источником возбудителей инфекционных болезней конечностей КРС и овец являются больные животные. Во всех природно-климатических зонах инфекционные болезни конечностей крупного и мелкого рогатого скота имеют два сезонных пика наибольшего распространения: зимне-весенний и летне-осенний, что связано с действием предрасполагающих факторов внешней среды.
3. Клиническое проявление инфекционных болезней конечностей крупного и мелкого рогатого скота зависит от условий содержания и кормления, а также от факторов внешней среды и состава складывающейся патогенетической ассоциации. Наиболее тяжело некробактериоз конечностей КРС проявляется у быков на откорме и высокопродуктивных молочных коров в период непосредственно перед отёлом или сразу после него. Копытная гниль и некробактериоз (инфекционные болезни конечностей) у овец часто протекают совместно. Наиболее тяжело инфекционные болезни конечностей проявляются у баранов-производителей и взрослых овцематок.
4. В этиологии и патогенезе инфекционных болезней конечностей крупного рогатого скота (некробактериоз) и овец (некробактериоз и копытная гниль) помимо основных возбудителей этих болезней F. necrophorum и D. nodosus важную роль играют представители сапрофитной, условно-патогенной и патогенной микрофлоры, формирующие экопаразитарные патогенетические ассоциации синергетического типа.
5. Гнойно-раневая микрофлора: C. perfringens т. А, A. pyogenes и S. aureus в ассоциации с D. nodosus и F. necrophorum усиливает вирулентность последних, позволяя действием своих ферментов значительно быстрее преодолевать защитные барьеры организма животного и вызывать тяжелые поражения конечностей и внутренних органов, часто приводя к летальному исходу.
6. Подобран видовой состав микрофлоры для создания ассоциированных вакцин против инфекционных болезней конечнестей КРС и овец. Определены оптимальные концентрации антигенов D. nodosus, F. necrophorum, C. perfringens т. А, A. pyogenes, S. aureus в составе ассоциированных вакцин, не вызывающие их конкуренции в организме привитых животных и стимулирующие иммунологическую перестройку организма.
7. Поствакцинальный иммунитет, стимулируемый инактивированными ассоциированными вакцинами Нековак, Нековак-стимул и Овикон, сопровождается существенным ростом титров специфических агглютининов (в 10-100 раз), которые с достоверной вероятностью 99% находятся в обратной коррелятивной связи в средней и высокой степени с заболеваемостью конечностей привитых животных. Пик выработки специфических гуморальных антител наблюдается через 2-4 недели после 2-й вакцинации. Заболеваемость конечностей у привитых животных на пике иммунитета была минимальной и снижалась в десятки раз. Через 2-4 недели после 2-й иммунизации у вакцинированных животных максимально увеличиваются показатели клеточного иммунитета: значительно возрастает концентрация иммуноглобулинов классов G и M и происходит увеличение всего пула (Т-) и (В-), лимфоцитов, одновременно возрастает интенсивность фагоцитоза нейтрофилов.
8.Разработаны методы контроля инактивированных ассоциированных вакцин Нековак и Овикон.Кролики массой 2,5-3 кг. привитые в дозе 2,5 мл могут быть лабораторной моделью оценки антигенной активности указанных препаратов. Титры специфических агглютининов и токсин-нейтрализующих антител у привитых овец, КРС и кроликов с достоверной вероятностью 99% коррелируют между собой в высокой степени (r=+0,97-+0,99).
9. Вакцинация животных инактивированными ассоциированными вакцинами: против некробактериоза КРС ( Нековак и Нековак-стимул), против некобактериоза и копытной гнили овец (Овикон) является эффективным средством в борьбе с указанными болезнями. Оптимальной является двукратная подкожная иммунизация животных указанными препаратами в дозах 5 мл с интервалом 28-30 дней за 2 недели перед ожидаемым пиком подъема заболеваемости. Длительность иммунитета, стимулируемого этими вакцинами, составляет 6 месяцев. Для поддержания активного иммунитета у привитых животных перспективной является однократная ревакцинация в дозе 5 мл за 1 месяц до окончания срока иммунитета.
10. Использование инактивированных ассоциированных вакцин Нековак, Нековак-стимул и Овикон в системе организационно-хозяйственных и лечебно-профилактических мероприятий против инфекционных болезней конечностей КРС и овец позволяет существенно снизить или полностью ликвидировать указанные инфекции в животноводческих и овцеводческих хозяйствах.
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Разработаны и зарегистрированы в РФ инактивированные ассоциированные вакцины против некробактериоза крупного рогатого скота Нековак и Нековак-стимул. Промышленное производство указанных препаратов освоено и сертифицировано на ФГУП Ставропольская биофабрика согласно нормативной документации, утвержденной Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ. Препараты применяются в неблагополучных по некробактериозу крс хозяйствах в соответствии с наставлением по их применению.
2. Разработана и зарегистрирована в Российской Федерации инактивированная ассоциированная вакцина против инфекционных болезней конечностей овец (копытная гниль и некробактериоз) Овикон. Промышленное производство вакцины освоено и сертифицировано на ФГУП Ставропольская биофабрика согласно нормативной документации, утвержденной Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ. Препарат применяются в неблагополучных по некробактериозу и копытной гнили овец хозяйствах в соответствии с наставлением по применению.
3. Разработана и внедрена в ветеринарную практику система организационно-хозяйственных и лечебно-профилактических мероприятий по борьбе с некробактериозом КРС и инфекционными болезнями конечностей овец, вошедшая в Инструкцию о мероприятиях по профилактике и борьбе с некробактериозом животных, утвержденную Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ в 2000 г., а также изложенная в рекомендациях Диагностика, профилактика и меры борьбы при некробактериозе крупного рогатого скота, одобренных Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ в 2000 г. и в Методических рекомендациях по профилактике и борьбе с копытной гнилью овец, утвержденных РАСХН в 2004 г.
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации:
- Панасюк С.Д. Иммунологическая оценка антигена B.nodosus, применяемого с различными адъювантами / Панасюк С.Д. // Бюллетень ВИЭВ - 1982 - Вып.48, С.29-32.
- Панасюк С.Д. Изучение вирулентных и иммуногенных свойств Bacteroides nodosus на лабораторных моделях / Панасюк С.Д. // Тр. ВИЭВ - 1983 - т. 57, С.69-73.
- Архангельский И.И. "Некоторые вопросы иммунитета при копытной гнили овец" / Архангельский И.И., Караваев Ю.Д., Сидорчук А.А., Семенова И.Н., Панасюк С.Д. // Тр. ВИЭВ - 1983 - т.57 - С.81-86.
- Артюшина И.А. Выделение гена пилина - основного белка пилей B.nodosus "./ Артюшина И.А., Панасюк С.Д., Артюшин С.К.// "Новые направления биотехнологии" Тез. докл. конф. - Пущино Моск. обл.- 1986 - 13-15 октября - С.48.
- Панасюк Д.И. Гельминты как резервуарные хозяева и инокуляторы возбудителей инфекционных и инвазионных заболеваний человека и животных / Панасюк Д.И., Панасюк С.Д. // Тр. лаборатории гельминтологии АН СССР - 1986 - №36 - С.212-221.
- Панасюк С.Д. Эффективность ассоциированных вакцин против копытной гнили овец. / Панасюк С.Д., Сидорчук А.А., Караваев Ю.Д. // Мат. пленума секции паразитоценологии АН СССР - Витебск, 1988 - С. 19-21.
- Сидорчук А.А. Роль ассоциаций анаэробных бактерий в патологии с с/х животных / Сидорчук А.А., Панасюк С.Д. // Мат. пленума секции паразитоценологии АН СССР - Витебск, 1988 - С 21-24.
- Сидорчук А.А. Оценка иммунологической эффективности различных адъювантов при изготовлении бактериальных вакцин. / Сидорчук А.А. Панасюк С.Д. Федоров Ю.Н. / Тр. ВИЭВ - 1989 - т.67,С.3-10.
- Панасюк С.Д. Значение ассоциаций микроорганизмов в этиологии болезней конечностей овец и КРС / Панасюк С.Д., Сидорчук А.А.,Караваев Ю.Д., и др.// Совершенствование методов государственного контроля ветеринарных препаратов ЦТез. докл. Всесоюзной научной конференции Совершенствование методов государственного контроля ветеринарных препаратов - М., 1991 - С.179-180.
- Караваев Ю.Д. Специфическая профилактика копытной гнили овец / Караваев Ю.Д., Панасюк С.Д.,Сидорчук А.А. и др. // Тр. ВИЭВ - т.69 - стр.33-43.
- Авторское свидетельство № 1835295 - Вакцина для профилактики некробактериоза крупного рогатого / Коромыслов Г.Ф., Панасюк С.Д., Сидорчук А.А. и др. Гос. реестр изобретений СССР - 13.10. 1992.
- Сидорчук А.А. Система мероприятий по борьбе с некробактериозом КРС / Сидорчук А.А., Панасюк С.Д., Устинова Г.И. // Ветеринария - 1994 - № 1 - С.12-14.
- Панасюк С.Д. Некоторые аспекты иммунопрофилактики некробактериоза конечностей КРС с использованием ассоциированной вакцины "Нековак" / Панасюк С.Д., Кружнов Н.Н., Сидорчук А.А., Устинова Г.И. // Вопросы ветеринарной микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Сб. науч. тр. Ульяновского СХИ - Ульяновск - 1995 - Часть 2 - 1995 - С. 42-46.
- Гельминты и простейшие, резервуарные хозяева и возбудители гиперпаразитаных сочетанных инфекционных и инвазионных болезней / Панасюк Д.И., Панасюк С.Д., Ятусевич А.И., Ерхан Д.К. - Кишинев - "Штиинца", 1995 - 335 с.
- Сидорчук А.А. Некоторые аспекты иммунопрофилактики некробактериоза конечностей КРС с использованием ассоциированной вакцины "Нековак" / Сидорчук А.А., Панасюк С.Д., Устинова Г.И. и др. // Актуальные вопросы инфекционных и инвазионных болезней животных. - Сб. науч. тр. МГАВМиБ - 1995 - С. 142-146.
- Панасюк С.Д. Специфическая профилактика инфекционных болезней конечностей крупного рогатого скота и овец / Панасюк С.Д., Кружнов Н.Н., Кириллов Л.В. и др. // Сб. науч. тр. ВГНКИ - 1996 - Т. 59 - С.76 - 82.
- Панасюк С.Д. Перспективы специфической профилактики инфекционных болезней конечностей. Научные аспекты профилактики и терапии болезней сельскохозяйственных животных. Мат. науч. конф. Воронежского гос. аграрного университета им. К.Д. Глинки - Воронеж, 1996. - Часть 1 - С.192-193.
- Панасюк С.Д. Новые препараты для профилактики конечностей у крупного и мелкого рогатого скота / Панасюк С.Д., Кружнов Н.Н., Кириллов Л.В. и др. // Диагностика, лечение и профилактика заболеваний с/х животных. Сб. науч. тр. Ставропольской гос. с/х академии - Ставрополь, 1996 - С.24-26.
- Проблемы симбиоценологии / Д.И. Панасюк, Панасюк С.Д., Максина Т.П. и др. - Нальчик, изд. Кабардино-Балкарской гос. с/х академии, 1997 - 304 с.
- Патент №2098127. Ассоциированная вакцина "Нековак" против некробактериоза крупного рогатого скота / Сидорчук А.А., Панасюк С.Д., Устинова Г.И., Кружнов Н.Н., Коромыслов Г.Ф. - Гос. Реестр изобретений Российской Федерации - 10 декабря 1997.
- Патент № 2098128. Ассоциированная вакцина "Овикон" против инфекционных заболеваний конечностей овец. / Панасюк С.Д., Кириллов Л.В., Кружнов Н.Н. и др. - Гос. Реестр изобретений Российской Федерации - 10 декабря, 1997.
- Сидорчук А.А. Перспективы применения цинко-содержащих препаратов при инфекционных болезнях конечностей жвачных. / Сидорчук А.А., Панасюк С.Д., Кононов А.Н. // Вестник ветеринарии - Ставрополь, 1997 - №5 - т.3 - С. 78-81.
- Панасюк С.Д. Иммунопрофилактика и терапия некробактериоза крупного рогатого скота и копытной гнили овец с использованием ассоциированных вакцин "Нековак" и "Овикон" / Панасюк С.Д., Кружнов Н.Н., Кириллов Л.В., Сидорчук А.А. и др. // Современное состояние и перспективы интеграции ветеринарной науки и практики в условиях реформирования сельскохозяйственного производства. Тез. докл. международной конф. Прикаспийского ЗНИВИ - Махачкала, 1997г., С.77-79.
- Геладзе В.Ш. Усовершенствование технологии изготовления ассоциированных вакцин против инфекционных заболеваний конечностей крупного рогатого скота "Нековак" и "Овикон". / Геладзе В.Ш., Панасюк С.Д., Сидорчук А.А. и др. // Диагностика, лечение и профилактика заболеваний с/х животных. Сб. научных трудов Ставропольской гос. с/х академии - Ставрополь, 1998 - С.25-26.
- Сидорчук А.А. Состояние изученности и проблемы борьбы с некробактериозом КРС / Сидорчук А.А., Панасюк С.Д., Кружнов Н.Н., Устинова Г.И. // Мат. международного симпозиума зав. кафедрами эпизоотологией и инфекционных болезней - Кишинев, 1998 - С.70-73.
- Коромыслов Г.Ф. Применение ликопида в качестве адъюванта при конструировании вакцин для профилактики инфекций / Коромыслов Г.Ф., Устинова Г.И., Панасюк С.Д. и др. // Современная вакцинология. Тез. докл. 2-й международной конференции, посвященной 100-летию Пермского НПО "Биомед". 1998 - С.45.
- Сидорчук А.А. Некробактериоз КРС: применение вакцины "Нековак" в системе мероприятий по профилактике и борьбе с болезнью / Сидорчук А.А., Панасюк С.Д., Кружнов Н.Н. и др. // Тр. ВИЭВ - 1998 - т.78 - С.33-38.
- Сидорчук А.А. Система мероприятий по борьбе с некробактериозом КРС и копытной гнилью овец / Сидорчук А.А., Панасюк С.Д., Кружнов Н.Н. и др. // Ветеринария - 1999 - №6 - С.23-27.
- Панасюк С.Д. Значение ассоциаций анаэробных микроорганизмов в норме и патологии с/х животных / Панасюк С.Д. // Сб. науч. тр.ВГНКИ - 1999 - т.61 - С. 64-73.
- Диагностика, профилактика и меры борьбы при некробактериозе КРС. Рекомендации. Изд. 1-е / А.А. Сидорчук, Д.П. Аголори, Панасюк С.Д. и др. - М. 2000 - 14с.
- Сидорчук А.А. Специфическая профилактика копытной гнили овец / Сидорчук А.А., Кононов А.Н., Панасюк С. // Диагностика, лечение и профилактика заболеваний с/х животных. Сб. науч. тр. Ставропольской гос. с/х академии - Ставрополь, 2001 - С. 34-36.
- Сидорчук А.А. Применение вакцины "Нековак" в системе мероприятий по профилактике и борьбе с некробактериозом крупного рогатого скота / Сидорчук А.А., Панасюк С.Д., Кружнов Н.Н. и др. // Сб. науч. тр. ВГНКИ - 2001 - т.62 - С.108-113.
- Кононов А.Н. Эпизоотология и специфическая профилактика копытной гнили овец в Ставропольском крае / Кононов А.Н., Панасюк С.Д., Кружнов Н.Н. и др. // Сб. науч. тр. ВГНКИ - 2001 - т.62, стр.113-117.
- Геладзе В.Ш. Совершенствование промышленной технологии изготовления ассоциированных вакцин "Овикон" и "Нековак" / Геладзе В.Ш., Сидорчук А.А., Панасюк С.Д. и др. // Совершенствование методов контроля, стандартизации ветеринарных препаратов. Тез. докл. Всероссийской науч. конф. - М., 2001. - С. 64-66.
- Сидорчук А.А. Некробактериоз КРС: эффективность альтернативных методов лечения / Сидорчук А.А., Панасюк С.Д., Кружнов Н.Н. и др. // Новые фармакологические средства для животноводства и ветеринарии. Материалы научно-практической конф. посвященной 55-летию ГУ Краснодарской НИВС - Краснодар, 2001 - т. 11 - С. 213-214.
- Сидорчук А.А. Состояние и перспективы профилактики и ликвидации некробактериоза в России / Сидорчук А.А., Панасюк С.Д., Зубкова А.Ю., Аголори Д.П. // Мат. методической и науч. конф. Сб. науч. тр. - М., 2001 - С. 135-136.
- Правила по профилактике и ликвидации некробактериоза животных. / Сидорчук А.А., Караваев Ю.Д., Кириллоа Л.В., Соломаха О.И., Панасюк С.Д., Семёнова И.Н. - МСХ и П России, Департамент ветеринарии №13.41313-00 от 11.07.2000г.-М., 2001 - 9 с.
- Диагностика, профилактика и меры борьбы при некробактериозе КРС. Рекомендации Изд. 2-е / Сидорчук А.А., Аголори Д.П., Панасюк С.Д. и др. -М., -2001 - 14 с.
- Сидорчук А.А. Некробактериоз: прошлое, настоящее и будующее / Сидорчук А.А., Панасюк С.Д., Устинова Г.И. // Ветеринарная медицина - М. - 2002 С. 3 - 4.
- Диагностика, профилактика и меры борьбы при некробактериозе КРС. Рекомендации. Изд. 3-е / Сидорчук А.А., Аголори Д.П., Панасюк С.Д., и др. - М. - 2003 -14 с.
- Сидорчук А.А. Некробактериоз КРС: применение вакцины Нековак в системе мероприятий по профилактике и борьбе с ним. / Сидорчук А.А., Панасюк С.Д., Устинова Г.И. и др. // Инфекционные и протозойные болезни с/х животных рыб и пчёл - Тр. ВИЭВ. .-2003 - Т.73.- С.187-192.
- Панасюк С.Д. Специфична профилактика на инфекциозните копитни заболявания при едрия рогат добитьк и при овцете в Руската Федерация / Панасюк С.Д. // Ветеринаро-медицински новини.- София, 2003 - №6 - С.10-13.
- Методические рекомендации по профилактике и борьбе с копытной гнилью овец / Кононов А.Н., Дмитриев А.Ф., Заерко В.И., Сидорчук А.А., Панасюк С.Д. и др. - М., -2004 - 19 С.
- Сидорчук А.А. Проблемы борьбы с некробактериозом КРС в России / Сидорчук А.А., Панасюк С.Д. // Актуальные проблемы ветеринарной хирургии - Троицк, 2004 - С.149-150.
- Панасюк С.Д. Экспериментальное подтверждение значения ассоциаций микроорганизмов в этиологии инфекционных заболеваний конечностей с/х животных / Панасюк С.Д., Сидорчук А.А., Баусина В.Л., Устинова Г.И. //Сб. науч. тр. ВГНКИ - 2005 -Т.65 - С.205-212.
- Сидорчук А.А. Специфическая профилактика инфекционных заболеваний конечностей крупного рогатого скота и овец в Российской Федерации / Сидорчук А.А., Панасюк С.Д., Устинова Г.И. и др. // Ветертнарная служба Ставрополья.- 2005 - №3 -С.5-10.
- ПанасюкС.Д. Специфическая профилактика инфекционных заболеваний конечностей КРС и овец в Российской Федерации / Панасюк С.Д., Кириллов Л.В.,Сидорчук А.А. и др. //Сб. науч. тр. ВГНКИ - 2005 - Т.66 - С.265-279.
48. Сидорчук А.А. Проблемы борьбы с некробактериозом: заблуждения и реальность / Сидорчук А., Кириллов Л.В., Панасюк С.Д. и др. // Ветеринария - 2006 -№2-С.5-6.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по разное