Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
АХМАДЕЕВ АЗАТ ВАЛЕРЬЕВИЧ
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПАЛЕОАМИГДАЛЫ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ
03.00.25 Ц гистология, цитология и клеточная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
САРАНСК 2009
Работа выполнена в ГОУ ВПО Башкирский государственный университет
Научный консультант: Академик РАМН, д.б.н.
проф. Акмаев Ильдар Ганиевич
Официальные оппоненты: Доктор биологических наук,
профессор Кругляков Павел Павлович
Доктор медицинских наук,
профессор Данилов Ревхать Канстантинович
Доктор медицинских наук,
профессор Мурзабаев Хасан Хамзович.
Ведущая организация: Учреждение РАН Институт цитологии РАН
Защита диссертации состоится л20 ноября 2009 г. в л_____ час на заседании диссертационного совета Д 212.117.01 при ГОУ ВПО Мордовский государственный университет им. Н.П.Огарева по адресу: 430005, г. Саранск, ул. Большевистская, д.68.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета
Автореферат разослан л_____ ___________________2009 года
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор биологических наук, профессорЕЕЕЕЕЕЕЕ..Балашов В.П.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Миндалевидный комплекс мозга (МК) вовлечён в центральные механизмы регуляции широкого круга физиологических процессов, начиная от деятельности отдельных органов и систем до целостных поведенческих актов, определяющих адаптацию организмов, их половое, пищевое и агрессивно-оборонительное поведение (Бериташвили, 1968, Чепурнов, Чепурнова, 1981, Акмаев, Калимуллина, 1993, Романова, 2005, Шаляпина, 2005, Любашина, 2008). Многообразие функций МК есть следствие длительной истории его становления, т.к. появляясь на самых ранних стадиях развития мозга хордовых, т.е. у круглоротых, он становится участником широкомасштабных перестроек мозга, происходящих в процессе его эволюции. Формирование МК проходит параллельно с процессами кортикализации головного мозга позвоночных и происходит поэтапно. Основные этапы исторического становления МК связаны с появлением интегративных центров высшего порядка, к которым относятся древняя, старая и новая кора (Карамян, 1976). Это обосновывает правомерность выделения в составе МК древней амигдалы (палеоамигдалы), старой амигдалы (архиамигдалы) и новой амигдалы (неоамигдалы, Акмаев, Калимуллина, 1993, Ахмадеев, Калимуллина, 2003, 2004).
Место МК в лимбической системе определяется ключевой ролью в анализе полисенсорной информации, поступающей из внешней и внутренней среды организма с последующим переключением её на висцеральные и нейроэндокринные центры ствола головного мозга (Любашина, 2001, Пруцкова, 2006, Aslan et al., 1997, Cox et al., 1986) и его высшие отделы - зрительный бугор, неокортекс (Любашина, 2008, Сlugent, Prise, 1996, Zald et al., 1998).
Велика роль МК в определении личностных характеристик человека в связи с его участием в формировании эмоций, кратковременной и долговременной памяти, процессах обучения (Симонов, 1987, Шуваев, Суворов, 2001; Шульговский, 2003). МК занимает ведущее место в регуляции нейроэндокринных процессов (Акмаев, Калимуллина, 1993, Veinante, Freund-Mercier, 1997, Feldman et al., 1998, Шаляпина, 2005) и модуляции деятельности иммунной системы (Dorofteiu et al., 1995, Raber, Koob, 1995, Raber, Bloom, 1996, Raber et al., 1997, Ramhres-Amaya et al., 1998). Это указывает на его значение в обеспечении взаимосвязей между нервной, эндокринной и иммунной системами. В силу указанного, исследования МК приобретают актуальность в рамках новой интегративной дисциплины - нейроиммунноэндокринологии (Акмаев, 1996, 1999, 2000).
МК как нейроэндокринный центр, который участвует в организации полового поведения, регуляции секреции и выделения гонадотропинов, полового созревания организмов, при осуществлении всех этих функций тесно взаимодействует с гипоталамической областью мозга, включаясь в регуляцию ее репродуктивных центров (Акмаев, Калимуллина, 1993). Обрабатывая и интегрируя поступающую к нему информацию (ведущую роль, среди которой играют химические сигналы) из внешней и внутренней среды организма, МК передает ее на центры преоптической области и медиобазального гипоталамуса, осуществляя их настройку в соответствии с поступившей информацией, определяя режим их функционирования, адекватный особенностям момента. Однако, тонкие механизмы взаимосвязей МК и гипоталамической области мозга остаются до сих пор невыясненными. Эволюционно-морфологический подход при их расшифровке представляется весьма перспективным.
Известно, что МК формируется в периоде половой дифференциации мозга (Резников и соавт., 1990, Акмаев, Калимуллина, 1993). Однако, его конкретные структуры, принимающие в этом процессе участие, и происходящие в них под морфогенетическим влиянием половых стероидов перестройки нейронной организации, остаются неизвестными. Нет сведений литературы, характеризующих морфогенез МК в препубертатном периоде крыс, в течение которого происходит формирование положительной обратной связи (Docke et al., 1980, Docke et al., 1983). Ранее не исследовались ультраструктурные характеристики нейроэндокринных нейронов палеоамигдалы и показатели модулирующего влияния на них половых стероидов. Не рассматривался вопрос о половых различиях и динамических перестройках во взаимовлияниях половых стероидов и моноаминов в палеоамигдале в динамике эстрального цикла и в процессе проведения феромонального сигнала в мозг.
Участие МК в регуляции широкого круга физиологических процессов объясняет его вовлечение в патогенез многих психоневрологических заболеваний. Изменение объёмных характеристик МК, выявленное с помощью новейших методов исследования мозга - компьютерной томографии и ядерно-магнитного резонанса - является ранним диагностическим признаком болезни Альцгеймера, шизофрении и височной эпилепсии (Jack et al., 1997, Ка1viainen еt а1., 1997, Hirayasu et al., 1998, Bremner et al., 2000, Goncalves-Pereira et al., 2006).
Клинические и экспериментальные данные свидетельствуют о важной роли МК в патогенезе эпилепсии человека (Чепурнов, Чепурнова, 1981, Бикбаев, 2000, Cain, 1992, Loscher et al., 1998, Pitkanen et al., 2000 и др.), однако, до сих пор остаются невыясненными причины низкого порога его судорожной активности, локализация мест инициации эпиактивности и механизмы ее генерализации. По мнению эпилептологов существует вероятность, что манифестации первичной генерализованной эпилепсии предшествует формирование очага в медиобазальных отделах височной доли мозга (Карлов, 1990, Chassagnon et al., 2005), где, согласно полученным в работе данным, локализуются структуры палеоамигдалы. В литературе полностью отсутствуют сведения о функциональном состоянии нейронов палеоамигдалы при абсансной генерализованной (неконвульсивной) эпилепсии и развивающихся в ней патогистологических процессах при конвульсивной эпилепсии.
Наибольшее внимание привлекают при разработке проблем наркомании структуры мезо-кортико-лимбической системы, при этом в МК изучают только его отдельные ядра: базолатеральное (Ledford et al., 2003, Fuchs et al., 2006, Floresco, Tse, 2007) и центральное (Covington et al., 2005, Dandekar et al., 2007). Между тем, МК сложное, гетерогенное образование, претендующее на роль ключевой структуры в функциональной системе наркозависимости. Ранее не проводились экспериментальные исследования по изучению механизмов формирования наркотической зависимости с использованием молекулярно-генетических моделей, посвященные выяснению роли в этом процессе палеоамигдалы и аллельной структуры локуса TAG 1A гена рецептора дофамина второго типа (DRD2).
Эволюционный подход в исследованиях структурно-функциональной организации мозга, выявляя ее фундаментальные закономерности и этапы становления в историческом развитии, позволяет понять патогенетические механизмы неврологических заболеваний. Происходящее в условиях патологии нарушение сложившейся в эволюции мозга иерархии функциональных систем, как правило, затрагивает филогенетически более поздние, а потому, более сложные по конструктивным решениям его аппараты. В этих условиях клиническая симптоматика может отражать функциональную настройку базисных механизмов, являясь лотголоском эволюционного процесса, с возвращением к тем функциональным отношениям, которые характерны для более ранних периодов развития (Орбели, 1958).
Цель и задачи исследования. Целью работы является комплексное исследование фундаментальных закономерностей (эволюционно-морфологический анализ цитоархитектоники, нейронной организации, механизмов формирования в период половой дифференциации мозга и препубертатный период, модулирующего влияния половых стероидов на ультраструктурные и цитохимические характеристики нейроэндокринных нейронов) и прикладных аспектов структурно-функциональной организации палеоамигдалы (показателей вовлечения в патогенез эпилепсии и наркомании).
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие основные задачи исследования:
1. на основании результатов цитоархитектонического анализа структур заднего отдела МК, учета их ядерно-палеокортикальных взаимоотношений и особенностей нейронной организации определить субстрат палеоамигдалы;
2. выяснить с помощью модельного эксперимента происходит ли в палеоамигдале реализация морфогенетического действия половых стероидов в процессе половой дифференциации мозга, опираясь на результаты количественной оценки характеристик дендритов ее нейронов. Сопоставить направленность и выраженность выявившихся изменений с результатами исследования половых различий у половозрелых крыс.
3. провести количественный цитоархитектонический и иммуноцитохимический анализ этапов формирования полового диморфизма структур палеоамигдалы в ранний ювенильный период развития крысы и путем сопоставления темпов морфогенеза со сроками нейрогенеза основной и добавочной обонятельных луковиц получить данные о роли афферентного притока как фактора онтогенеза палеоамигдалы;
4. изучить цитологические характеристики нейронов палеоамигдалы на светооптическом и электронно-микроскопическом уровнях, разработать их классификацию и выявить региональные особенности представительства их основных типов;
5. разработать структурно-функциональную классификацию нейроэндокринных нейронов палеоамигдалы у самцов и самок крыс на разных стадиях эстрального цикла на основании результатов ультраструктурного анализа, выполненного с использованием комплексной оценки показателей транскрипционной активности ядра, структурной организации ядрышка, характеристик состояния ядерных мембран, белок-синтезирующего аппарата цитоплазмы, митохондриума, вакуолярной системы и явлений секреторной активности;
6. провести анализ половых различий содержания и метаболизма моноаминов в палеоамигдале и исследовать механизмы динамических структурно-функциональных перестроек в динамике эстрального цикла путем оценки интенсивности включения 3Н-уридина в ее нейроны и глию, моноаминов и уровней экспрессии эстрогенного рецептора ER, а также регистрации нейрохимических сдвигов в процессе проведения в мозг феромонального сигнала;
7. исследовать участие палеоамигдалы в механизмах формирования наркотической зависимости путем определения локализации CART(cocaine-amphetamine-regulated transcript)- пептид иммунореактивных нейронов и уровней экспрессии CART- пептида, изучения в эксперименте темпов развития наркотической зависимости у крыс с различиями генотипа по локусу TAG 1A DRD2 и последующего сравнительного структурно-количественного анализа палеоамигдалы у двух групп крыс (А1/А1 и А2/А2), различающихся по темпам формирования толерантности и психической зависимости;
8. изучить у крыс линии WAG/Rij (модель абсансной генерализованной неконвульсивной эпилепсии) структурно-функциональные характеристики палеоамигдалы с помощью морфометрии и регистрации функционального состояния ее нейронов, а также состав эпилептической системы у крыс с экспериментально созданной смешанной конвульсивной эпилепсией путем анализа результатов патогистологического и ультраструктурного исследования.
Научная новизна. Впервые на основании результатов комплексного исследования дано целостное представление о структурно-функциональной организации палеоамигдалы как нейроэндокринного центра, формирование и деятельность которого осуществляется под морфогенетическим и модулирующим влиянием половых стероидов при участии биогенных аминов. Исследование цитоархитектоники структур заднего отдела МК с позиций учения о ядерных и экранных центрах нервной системы и их нейронной организации позволило впервые установить локализацию на его территории редковетвистой нервной системы, составляющей субстрат палеоамигдалы. Впервые в модельном эксперименте установлен морфогенетический эффект тестостерон-пропионата, приводящий к изменениям в дендроархитектонике нейронов и обуславливающий формирование половых различий. Впервые выполненное исследование морфогенеза палеоамигдалы в ранний ювенильный период развития мозга крысы показало этапность формирования в ее структурах полового диморфизма, а сопоставление его темпов со сроками нейрогенеза основной и добавочной обонятельных луковиц позволило выявить роль афферентного притока как фактора онтогенеза палеоамигдалы. Проведен детальный анализ цитологических характеристик нейронов палеоамигдалы, позволивший впервые выявить нейроэндокринные нейроны с секреторной активностью. Впервые на основании результатов ультраструктурного анализа разработана структурно-функциональная классификация нейроэндокринных нейронов палеоамигдалы у самцов и самок крыс на разных стадиях эстрального цикла, отражающая модулирующее влияние половых стероидов. Впервые выявлены основные функциональные состояния, характеристики которых отражают явления гормон-зависимой функциональной реверсии в нейронах палеоамигдалы, предопределяемой колебаниями уровней половых стероидов. Впервые в палеоамигдале выявлены половые различия метаболизма моноаминов и установлена зависимость их содержания от колебаний уровня половых стероидов в динамике эстрального цикла. Впервые установлено модулирующее влияние половых стероидов на интенсивность включения 3Н-уридина в нейроны и глию палеоамигдалы, а также на уровни экспрессии эстрогенного рецептора ER. Впервые выявлена синхронность изменений содержания катехоламинов в обонятельных луковицах и палеоамигдале в процессе проведения в мозг феромонального сигнала. Впервые установлено участие палеоамигдалы в формировании механизмов наркотической зависимости, и это является теоретическим базисом для разработки новых технологий ее коррекции путем интраназального введения лечебных препаратов. Впервые показано вовлечение палеоамигдалы в процессы эпилептогенеза при абсансной генерализованной (неконвульсивной) и смешанной (конвульсивной) эпилепсии.
Практическое и теоретическое значение работы. Полученные в работе результаты, раскрывающие фундаментальные закономерности структурно-функциональной организации палеоамигдалы, формируют теоретический базис для разработки научно-обоснованных рекомендаций по коррекции нарушений деятельности нейроэндокринных репродуктивных центров с использованием интраназального введения медикаментозных препаратов. Выявленное в работе явление гормонзависимой функциональной реверсии в нейронах палеоамигдалы свидетельствует о зависимости когнитивных способностей от уровней половых стероидов и является основой для разработки профилактических и лечебных мероприятий с их использованием. Результаты работы составляют основу концепции о палеоамигдале - нейроэндокринном центре мозга, формирование которого произошло на самых ранних этапах исторического развития позвоночных и имело значение в формировании адаптивного поведения (основу которого составляют репродуктивное, пищевое и агрессивно-оборонительное), формируемого на основе анализа сигналов (хеморецепции) из окружающей среды. Полученные в работе экспериментальные данные о роли генотипа А1/А1 локуса TAG 1A DRD2 в формировании наркотической зависимости согласуются с результатами медико-генетических исследований и создают основу для разработки мероприятий, позволяющих выявлять группы риска. Асимметрия МК, выявленная у крыс, показавших ускоренные темпы формирования толерантности и психической зависимости, акцентирует внимание на возможность разработки ранних диагностических критериев при наркомании с использованием компьютерной томографии мозга. Результаты работы, свидетельствующие о вовлечении палеоамигдалы в процессы эпилептогенеза, акцентируют внимание невропатологов и психиатров на ее роли в патогенезе различных форм эпилепсии, показывая на важность регистрации ее состояния для ранней диагностики этого заболевания.
Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры гистологии с курсом эмбриологии Башкирского государственного медицинского университета и кафедры морфологии и физиологии человека и животных Башкирского государственного университета, где используются при чтении лекций по Общей гистологии и специальных курсов Морфология миндалевидного комплекса мозга, Нейроанатомия, Нейрогистология, Эволюция и морфология мозга. Изданы учебные пособия: Нейрогистология миндалевидного комплекса для начинающих (Уфа, БашГУ, 2005) с Грифом УМО МГУ и Нейроморфология (Уфа, БашГУ, 2006). Получена приоритетная справка о регистрации заявки на патент РФ на изобретение Способ приготовления переживающих срезов пириформной доли мозга № 2008149137 от 10 января 2008 года. Удостоверение на рационализаторское предложение Устройство для измерения линейных размеров ультраструктур при электронной микроскопии № 1 от 16 октября 2007 года.
Положения, выносимые на защиту
1.Палеоамигдала представляет собой комплекс трех структур заднего отдела МК, расположенных на медиобазальной поверхности полушария конечного мозга под нижним рогом бокового желудочка и образованных длинноаксонными редковетвистыми нейронами. Дорсомедиальное и заднее медиальное ядро представляют собой ядерные центры, заднее кортикальное ядро является межуточной формацией.
2.Формирование палеоамигдалы как нейроэндокринного центра происходит в периоде половой дифференциации мозга под морфогенетическим влиянием половых стероидов, что предопределяет наличие половых различий в дендроархитектонике ее нейронов.
3.Модулирующее влияние половых стероидов на нейроны палеоамигдалы приводит к изменению их функционального состояния, совокупность которых отражает явление функциональной гормонзависимой реверсии. На основании учета основных функциональных состояний нейронов разработана структурно-функциональная классификация нейроэндокринных нейронов палеоамигдалы.
4.Палеоамигдала вовлечена в патогенетические механизмы формирования наркотической зависимости, а также абсансной генерализованной и смешанной конвульсивной эпилепсии.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Республиканском молодежном форуме Интеллектуальный потенциал Башкортостана - в ХХI век (Уфа, 1996), на конференции студентов и молодых ученых биофака БашГУ, 1997, на Ш,V Международной конференциях Колосовские чтения (СПб, 1997, 2006), на V Международном конгрессе по нейронаукам, (Jerusalem, Israel, 1999), на Всеросс. конференции с межд. участием Достижения биологической функциологии и их место в практике образования (Самара, 2003), на съезде Российских морфологов с международным участием (2004), на конгрессах Международной ассоциации морфологов (1998, 2002-2008), на Всероссийской конференции Нейроэндокринология (СПб, 2003), на Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей УЧеловек и его здоровьеФ (СПб, 2004-2008), на Всероссийской научной конференции Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии. Гистогенез и регенерация тканей (СПб, 2004, 2006), на Х1Х и ХХ съездах Физиологического общества им. И.П.Павлова (2004-2007), на Всероссийских конференциях молодых исследователей Физиология и медицина (СПб, 2004, 2005), на II-IV Международных междисциплинарных конгрессах Нейронаука для медицины и психологии (Украина, 2006, 2008), на Всероссийской конференции с международным участием Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга (Москва, 2006), на Международной конференции Ломоносов (Москва, МГУ,2007,2009), на V-ой Всероссийской научно-практической конференции Медико-биологические и психолого-педагогические аспекты адаптации и социализации человека (Волгоград, 2008), на Всероссийской конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Д.А.Жданова, (М., 2008), на Международной научной конференции Европейская интеграция высшего образования (Черногория, 2008), на заседании Башкирского отделения Всероссийского общества анатомов, гистологов, и эмбриологов (Уфа, 2009) и опубликованы в ведущих российских и зарубежных морфологических и физиологических журналах.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 73 научные работы в отечественной и зарубежной печати, из них 22 cтатьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования (4-я глава), результатов исследований (7 глав), обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Указатель литературы содержит сведения о 596 источниках, 108 из которых на русском и 488 на иностранных языках. Иллюстрации представлены 67 рисунками (из них 61 микрофотография), цифровой материал сгруппирован в 35 таблиц.
Материал и методы исследования.
В работе использованы крысы линии Wistar в возрасте трех и шести месяцев, половозрелые крысы линии WAG/Rij, выращенные от родительских особей, предоставленных профессором Г.Д.Кузнецовой (Институт ВНД, г.Москва) с любезного согласия проф. J.van Luijtelaar и проф. А. Coenen (Dept. of Comparative and Physiological Psychology, NICI, KUN, Nijmigen, The Netherlands) и крысы инбредной линии Wistar с генотипом А1/А1 и А2/А2 по локусу TAG 1A гена рецептора второго типа (DRD2). Пищу и питьё животные получали ad libitum, продолжительность светового дня составляла 12-14 часов. Всех использованных в работе половозрелых крыс содержали в стандартных условиях вивария, характеризующихся постоянством комнатной температуры (200-220)С и уровнем влажности.
Нейрогистологические методы. Цитоархитектонические и цитологические характеристики структур заднего отдела миндалевидного комплекса (МК) изучены на 10 крысах (5 самцов и 5 самок). Животных умерщвляли декапитацией с соблюдением основных требований к эвтаназии, изложенных в Приложении №4 к "Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных". Головной мозг извлекали из полости черепа и фиксировали в 10% нейтральном формалине. Прошедший фиксацию головной мозг промывали и проводили по спиртам возрастающей концентрации, хлороформ и заливали в парафин. Готовили серии фронтальных срезов мозга толщиной 20 мкм и 10 мкм, которые окрашивали по методу Ниссля (Меркулов, 1969). Особенности нейронной организации структур исследованы на фронтальных срезах мозга толщиной 100 мкм обработанных по методу Гольджи (30 крыс линии Wistar половозрелого возраста, 15 самок и 15 самцов). Нейроны зарисовывали с помощью рисовального аппарата (РА-4) при увеличении 200х. Принадлежность нейронов к I или II типу по Гольджи, их подтип и класс определяли на основании классификационных признаков, разработанных Т.А.Леонтович (1978) для подкорковых и Г.И.Поляковым (1973) для корковых нейронов.
Морфометрические методы. Планиметрирование структур палеоамигдалы и МК (40 крыс линии Вистар на разных сроках раннего ювенильного периода, половозрелые 20 крыс линии WAG/Rij с массой тела 250-320 г. с абсансной и смешанной эпилепсией, 28 крыс с генотипами А1/А1 и А2/А2 DRD2) позволило измерить их абсолютные и удельные площади. Использовали цитоархитектонические препараты, представлявшие собой фронтальные срезы толщиной 20 мкм и окрашенные по Нисслю. Препараты изучали с помощью триокулярного светового микроскопа серии МС-300 (Австрия), пользуясь объективами 10 и 40. Микрофото получали с использованием цифрового фотоаппарата Nicon CoolPix 4500. Полученные изображения экспортировали в компьютер и анализировали с помощью программы JmageJ 1.38 (USA). Математическую обработку численных показателей, характеризующих абсолютные площади структур, проводили в условных единицах. Сравнение значений удельной площади проводили по методу , обеспечивающему нормальное распределение в получаемых вариационных рядах.
Количественные характеристики дендритов нейронов изучали по методике Т.А. Леонтович (1978). Измерены и подсчитаны следующие параметры дендритного дерева: число первичных дендритов (d), число свободных концов дендритов (Bd), число всех точек ветвления дендритов вне зависимости от их характера (Gd), площадь дендритного поля (Sd), общая длина дендритов (Ld). Использовали два производных параметра - соотношение числа свободных концов дендритов нейронов к числу первичных дендритов (Bd/d) и соотношение общей длины дендритов к их числу (Ld/d). При анализе морфогенетического действия андрогена в периоде половой дифференциации мозга (40 крыс) для более полного описания происходящих перестроек в структуре дендритов, кроме параметров рекомендованных Леонтович (1978), измеряли длину самого длинного дендрита (C) и подсчитывали на нем число свободных концов и число точек ветвления (Bdc, Gc). Также измеряли длину самого разветвленного дендрита (Cr) и подсчитывали число свободных его концов и число точек ветвления (Bdr, Cr). У всех нейронов определяли суммарную величину длины всех концевых веточек дендритов (Ldt). Величины выражали в условных единицах, полученные при работе с курвиметром и планиметром.
Подсчет количества нейронов, содержащих ядрышки, и глии (40 крыс при изучении морфогенеза палеоамигдалы, материал для исследования брали на 21-й, 24-й, 28-й и 31 дни жизни) проводили в поле зрения микроскопа МБИ-11 (ЛОМО, Россия) на 10 микронных срезах при увеличении в 600 раз (объектив 40, окуляр 15), площадь поля зрения при этом составляла 0,035 мм2. На основании полученных данных определяли величину глиального индекса. Подсчет апоптического индекса (АИ) производили по формуле предложенной (Rakic, Zecevic, 2000), вводя в нее суммарное количество клеток, содержащихся в трех следующих друг за другом срезах.
Идентификацию структур палеоамигдалы при выполнении иммуноцитохимических реакций проводили в срезах, окрашенных толуидиновым синим, по Нисслю, на основании критериев, разработанных для высокоинформативных срезов этого образования мозга (Акмаев, Калимуллина, 1993). Подсчет количества нейронов в цитоархитектонических (окрашенных по Нисслю) и иммуноцитохимических препаратах (с положительной реакцией), проводили с объективом 40 в поле зрения микроскопа, площадь которого составляла 35000 мкм2. В дорсомедиальном ядре, имевшем площадь 218600 мкм2, количество нейронов подсчитывали в шести полях зрения, в заднем медиальном ядре - 5107x102 - в семи полях зрения, в медиальной части заднего кортикального ядра (8164 x102) и в латеральной части заднего кортикального ядра (12242 x102) число нейронов подсчитывали в одиннадцати полях зрения.
Гистохимические методы. Изучение содержания нуклеиновых кислот проведено на 20 (5 самцов, по 5 самок на стадиях метэструс, диэструс, эструс) половозрелых крысах линии Вистар с массой тела 200-250 г. Мозг фиксировали в 10% -ном формалине, заливали в парафин и готовили 7-10 мкм фронтальные срезы, которые окрашивали галлоцианином с хромовыми квасцами по Эйнарсону (Луппа, 1980). Число темных и светлых клеток в структурах палеоамигдалы подсчитывали в пяти полях зрения у каждого животного. Активность сукцинат-дегидрогеназы определяли визуально в приготовленных в криостате срезах толщиной 5 мкм, приготовленных по общепринятой методике (Луппа, 1980) у 15 половозрелых крыс (5 самцов, по 5 самок на стадиях эструса и метэструса).
Авторадиография с 3Н-уридином. 3Н-уридин (удельная радиоактивность 28 Ки/мМ) вводили внутрибрюшинно в дозе 160 МБк/г (20 крыс, 5 самцов и по 5 крыс на стадиях эструса, метэструса и диэструса) за один час до фиксации материала, которую проводили 12 ч в смеси формалин-спирт-ледяная уксусная кислота в холодильнике. Готовили парафиновые срезы толщиной 5 мкм, депарафинировали их и покрывали фотоэмульсией типа ПР-2М с экспозицией 1 месяц. После проявления и фиксации автографов препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Интенсивность включения изотопа оценивали по числу зерен восстановленного серебра на единицу площади объекта (100 2) в десяти полях зрения с учетом фона вне среза.
Электронная микроскопия. Материал для электронно-микроскопического исследования модулирующего действия половых стероидов был взят у 12 крыс (по 3 самки на стадиях эструс, метэструс и диэструс, а также у 3 самцов). Стадии эстрального цикла определяли по цитологической картине влагалищных мазков. Кусочки ткани, содержащие структуры палеоамигдалы, извлекали из головного мозга под контролем микроскопа с помощью специального устройства, описанного в патенте РФ № 1679246. Материал фиксировали погружением в охлажденный 2,5%-ный раствор глютаральдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) и постфиксировали в 2%-ном растворе OsO4, обезвоживали в этаноле и заливали в эпон-812. Срезы готовили на ультратоме LKB III, контрастировали цитратом свинца (Reynolds, 1963) и анализировали в электронном микроскопе JEM 200 ЕХ (75 кВ). 12 особей было использовано для исследования палеоамигдалы у крыс с абсансной эпилепсией (по три самца линии WAG/Rij и Wistar половозрелого возраста) и смешанной конвульсивной эпилепсией (по три самца линии WAG/Rij до- и после аудиогенной стимуляции).
Иммуноцитохимические методы. Выявление CART-пептида проводили на приготовленных в криостате фронтальных срезах мозга толщиной 30 микрон, после перфузии его 1М фосфатным буфером (PBS, рН=7,4) и 4% раствором параформальдегида на 0,1 М PBS. Исследования проведены на белых половозрелых крысах линии Вистар (7 самок на стадии эструс, 7 самок на стадии метэструс, 7 самцов). Использовали первичные поликлональные rabbit-anti-CART (55-102) антитела (H-003-62, Phoeniх Pharm., Incorp, Belmont, CA, США) и вторичные goat-anti-rabbit антитела, конъюгированные с авединовым комплексом (ABC-kit 689321, ICN Biomedicals Inc., США). Визуализацию прореагировавших первичных антител производили при помощи диаминобензидинового хромогена (DAB, Sigma, США). Срезы закрепляли на стеклах с полилизиновым покрытием и высушивали при комнатной температуре. После обработки в спиртах и ксилоле срезы заключали под покровное стекло с помощью канадского бальзама.
Исследование экспрессии ER beta в нейронах палеоамигдалы на стадиях эстрального цикла - проэструс и метэструс проведены на 14 крысах линии Вистар в возрасте шести месяцев. Головной мозг фиксировали в 4% параформальдегиде на 0,1 M фосфатном буфере (PBS, pH 7,3-7,4), заливали в парафин и готовили фронтальные срезы толщиной 5 мкм, которые помещали на предметные стекла, покрытые L-лизином. Для проведения иммуноцитохимической реакции применяли первичные антитела к ER (polyclonal rabbit, Upstate) в разведении 1:100 в 1% растворе нормальной козьей сыворотки при температуре 40С во влажной камере. Связывание первичных антител определяли путем инкубации срезов со вторичными антителами в течение двух часов при комнатной температуре (goat antirabbit IgG,Vector Elite kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) в разведении 1:500 in 1% растворе нормальной козьей сыворотки и авидин-биотиновым комплексом (Vector Laboratories, CA). Для визуализации реакции использовали DAB (Sigma, USA).
Апоптозные клетки выявляли методом TUNEL. Головной мозг фиксировали в 4% параформальдегиде на 0,1 M фосфатном буфере (PBS, pH 7,3-7,4), заливали в парафин и готовили фронтальные срезы толщиной 5 мкм, которые помещали на предметные стекла, покрытые L-лизином. Для выявления TUNEL-окрашенных структур использовали набор реактивов ApopTag In Situ Apoptosis Detection Kit (фирма Chemicon).
Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) определяли содержание моноаминов (норадреналина, дофамина и серотонина) и их метаболитов - 3,4-диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) и 5-оксииндолуксусной кислоты (5-ГИУК) в палеоамигдале и обонятельных луковицах Общее количество использованных крыс линии Вистар половозрелого возраста составило 70 (30 самцов и 40 самок).
Материал для исследования брали от 3-4 крыс, умерщвленных передозировкой эфирного наркоза. После декапитации извлекали из черепа головной мозг и под контролем микроскопа на толстом фронтальном срезе (1-1,5 мм) из нативного мозга на льду выделяли область палеоамигдалы, а также основную обонятельную луковицу вместе с добавочной. Образцы, взятые из правого и левого полушария у 3-4 крыс, взвешивали (в среднем, вес навески был 25-30мг) и анализировали в одной пробе.
После взвешивания, изъятые из мозга кусочки, гомогенизировали в 20 объемах холодной 0,1М перхлорной кислоты (Sigma, USA) и 1пг/50 мкл дигидроксибензиламина гидробромида (ДГБА, Sigma, USA) в качестве внутреннего стандарта путем механического растирания в гомогенизаторе с тефлоным пестиком в течение пяти минут. Гомогенизат микропипеткой переносили в эпендорф и центрифугировали (при -200С) в течение десяти минут при 6000 оборотов в минуту. Образовавшийся супернатант переносили микропипеткой в эпендорфы, снабженные специальными насадками (наборы для микрофильтрации фирмы Биохром, Россия). Диафрагма насадки, отделяющая ее полость от эпендорфа, имела отверстия, которые мы закрывали при анализе каждой пробы сменяющимися фильтрами с величиной пор 0,02 мкм. После этого проводили повторное центрифугирование в течение трех минут. Очищенные, таким образом, супернатанты в эпендорфах помещали в специально сконструированные боксы со льдом и сразу же анализировали. Количественно содержание определяемых моноаминов и их метаболитов определяли на основании зависимости площади пика соединения от концентрации стандартного образца. Расчет содержания моноаминов в пробах осуществляли в пикограмм на мг ткани, при математической обработке их переводили в нг на мг ткани. Вычисляли и величины катаболических коэффициентов ДФ/ДОФУК и 5-ГИУК/С.
Поведенческие методики. При изучении механизмов развития наркотической зависимости регистрировали поведение двух групп крыс инбредной линии Вистар, имеющих модификацию аллельной структуры локуса TAG 1 A DRD2. Одна группа крыс была гомозиготна по аллелю А1, (А1/А1), другая по аллелю А2 в этом же локусе - А2/А2. До начала эксперимента с принудительной наркотизацией с целью выявления различий между экспериментальными группами крыс (А1/А1 и А2/А2) в питьевом режиме и ориентировочно-исследовательской деятельности регистрировали среднесуточное потребления воды на протяжении одной недели, а также изучали их поведение в тесте лоткрытое поле.
Открытое поле представляло собой квадратную освещенную в центре арену, разделенную на 16 равных частей. Крысу в начале тестирования в открытом поле помещали в один из периферических квадратов и наблюдали за ее поведением в течение пяти минут. На протяжении сеанса тестирования определяли время, затрачиваемое крысой на груминг (чесательный рефлекс), пребывание в состоянии неподвижности, а также регистрировали латентный период до пересечения первого квадрата (амбуляции). Также подсчитывали количество эпизодов груминга, число пересеченных квадратов поля в центре и на его периферии, сумма которых характеризовала общую двигательную (горизонтальную) активность крысы. Исследовательскую деятельность крыс определяли подсчетом количества вертикальных стоек, которые крысы совершали в центре и на периферии поля. Сумма совершаемых крысой стоек на периферии и в центре поля характеризовала общую исследовательскую деятельность. Вегетативные реакции крыс регистрировали на основании учета числа уринаций и болюсов.
Экспериментальные модели. Неонатальная андрогенизация. Морфогенетическое действие андрогена изучено на 40 половозрелых крысах линии Вистар, содержавшихся в идентичных условиях вивария при свободном доступе к еде и воде. 10 самкам на 5-е сутки после рождения однократно был введен тестостерон-пропионат в дозе 1250 мкг. Все животные (15 самок, 15 самцов и 10 неонатально андрогенизированных самок) были умерщвлены в возрасте 3 месяцев при соблюдении всех правил работы с лабораторными животными. Головной мозг был обработан по методу Гольджи.
Двухпоилковый метод формирования наркотической зависимости (Борисова и соавторы, 1992). В эксперименте с принудительной алкоголизацией крысы двух экспериментальных групп (А1/А1 и А2/А2) в качестве единственного источника жидкости получали ad libitum в течение первой недели 6% водный раствор этилового спирта и 8% водный раствор этилового спирта - в течение второй недели. С 15-х по 21-е сутки (третья неделя) животным предоставляли выбор между раствором этилового спирта (8% раствор) и чистой водой. Регистрировали потребление воды и водного раствора наркотика в течение суток на протяжении пяти дней, а также поведение крыс в открытом поле.
Модель смешанной эпилепсии была создана по методике Кузнецовой и соавт. (Kuznetsova et al., 2000) путем аудиогенной стимуляции. Предварительно определяли аудиогенную чувствительность крыс в специальной камере (60x60x60см), используя звон ключей (лkeys ringing). Звуковой сигнал имел диапозон 13-85 kHz (максимум спектра 20-40 kHz) и среднюю интенсивность 50-60 ДБ с величиной пиков до 80-90 ДБ. Стимульный раздражитель включал в себя ультразвуковую часть (20 кГц и выше) и был более эффективным для вызова большого судорожного припадка, чем звук звонка (Kuznetsova et al., 2000). Чувствительных к звуку крыс подвергали ежедневной в течение девяти дней аудиогенной стимуляции с продолжительностью воздействия 1,5 минуты. После завершения эксперимента пять крыс, показавших ежедневные большие судороги, были использованы для патогистологического исследования.
Статистическую обработку выполняли с использованием пакета программ Statistica 5.5. Для оценки значимости цифровых данных использовали параметрические и непараметрические методы.
Результаты исследования и их обсуждение.
Исследование цитоархитектоники структур заднего отдела МК показало, что входящие в его состав компоненты серого вещества характеризуются гетероморфностью. Это указывало на необходимость их классификации, которая проведена нами на основании учения А.А.Заварзина (1986) о ядерных и экранных центрах нервной системы. При этом при оценке принадлежности экранных структур к формациям древней коры были учтены критерии, разработанные Pigache (1971) и Л.Б.Калимуллиной (1987).
Ядерными центрами на территории заднего отдела являются дорсомедиальное ядро, заднее медиальное ядро, латеральное ядро, базолатеральное ядро, эндопириформные ядра, добавочное базолатеральное и перивентрикулярные ядра. Палеокортикальные формации представлены пириформной и периамигдалярной корой. В этих структурах четко определяются слои: плексиформный, густок леточный, глубокой к леточный и полиморфноклеточный. Промежуточное полож ение между ядерными и палеокортикальными структурами занимает заднее кортикальное ядро (Сор). Оно представляет собой межуточную фо рмацию. С ядрами Сор роднит то, что оно имеет характер очагового скопления нейронов. Но в отличие от ядер в нём присутствует тенденция к расслоению, так как в его составе есть поверхностная бесклеточная зона, которая гомологична плексиформному слою палеокортикальных формаций. В каудальной части этого лядра латеральная часть клеточной зоны формирует полоску клеток, по густоте расположения нейронов которая, дифференцируется от глубоких клеточных масс.
Исследование интенсивности нуклеиново-кислого обмена в ядерных, межуточных и палеокортикальных формациях выявило достоверные различия в интенсивности включения 3Н-уридина в нейроны пириформной коры по сравнению с нейронами медиальной части заднего кортикального ядра (p<0,05). Это показывает, что в процессе эволюции мозга появление палеокортекса отражает прогрессивные изменения не только с точки зрения пространственных перестроек элементов серого вещества нервной системы (появление упорядоченности в расположении нейронов), но и инновации в ключевых звеньях клеточного метаболизма, проявляющиеся нарастанием интенсивности обмена нуклеиновых кислот.
Исследование нейронной организации выявило в составе ядер, межуточной формации и палеокортекса наличие большого разнообразия нейронов, основными типами среди которых были длинноаксонные густоветвистые и редковетвистые нейроны. При этом было обнаружено, что длинноаксонные редковетвистые нейроны концентрируются в структурах, занимающих медиобазальную поверхность заднего отдела МК, в то время как в составе структур базолатерального отдела преобладали длинноаксонные густоветвистые нейроны. Это наблюдение послужило отправной точкой в рассуждениях о субстрате древней части МК - палеоамигдале. Возник вопрос - не следует ли всю медиобазальную область заднего отдела МК, а не только дорсомедиальное ядро, в отношении которой был предложен этот термин (Акмаев, Калимуллина, 1993), рассматривать как древную часть МК?
Основанием для постановки такого вопроса послужил признанный в науке факт, установленный Т.А.Леонтович (1978), что в филогенетически древних отделах нервной системы преобладают длинноаксонные редковетвистые нейроны, а в отделах, формирование которых происходит на более поздних этапах, вследствие возрастания интегративных свойств нейронов, превалирующим типом нейронов становятся густоветвистые.
Цитоархитектонический анализ интересующей нас области показал, что на территории, занятой длинноаксонными редковетвистыми нейронами, занимающей медиобазальный угол полушария конечного мозга, находятся три структуры заднего отдела МК - дорсомедиальное (Med), заднее медиальное (Mep) и заднее кортикальное ядро (Cop).
Результаты цитоархитектонического анализа Med, Mep и Cop показали, что они топографически тесно связаны, располагаясь, друг над другом. Med является типичным ядерным центром, для которого характерна высокая плотность расположения нейронов. В Mep плотность расположения нервных клеток снижается, а разнообразие по форме тела и его размерам возрастает. Самое крупное по площади Cop имеет более сложное по сравнению с двумя другими ядрами устройство, и на основании существующих критериев должно рассматриваться как межуточная формация.
Сравнение цитоархитектоники Med, Mep и Cop показало, что на их общей территории существует дорсо-вентральный вектор усложнения структурной организации. Он проявляется в наличии плавного перехода от ядерного принципа организации серого вещества в экранный. Напрашивается аналогия со сведениями, по филогенезу МК, указывающими, что прототип МК представлен небольшой, плохо дифференцированной клеточной массой, ограниченной примордальной пириформной корой (Koikigami, 1963, Richardson, 1973, Карамян, 1976).
Тесная связь между тремя рассматриваемыми структурами имеет место в онтогенезе. Согласно данным Bayer (1980), изучавшего нейрогенез МК у крыс с 12 по 22 день эмбриогенеза с помощью 3Н-тимидина, основным местом генерации нейронов в медиальных зонах заднего отдела является область, где в последующем формируется Med. На 16 день в этой области имели метки 88 % клеток. Число клеток с метками в этот же день в области, где в последующем формируется заднее кортикальное ядро, составляло всего 7 %, указывая на существование дорсо-вентрального вектора выраженности пролиферативных процессов на территории медиальной поверхности полушария мозга. Уместно отметить, что в онтогенезе у человека МК начинает формироваться с его заднего отдела (Либерзон, 1937), что также является одним из показателей формирования заднего отдела МК на более ранних этапах исторического развития организмов, чем его центральный и передний отделы.
Другим весомым критерием для суждения о филогенетическом возрасте структур медиобазальной части заднего отдела МК является их локализация в перивентрикулярной зоне. Известно, что в процессе исторического развития мозга именно в этой зоне происходит генерация нейронов, которые, затем, мигрируя к поверхности нервной трубки, дают начало формированию различных структур мозга. Наиболее ярко этот процесс проявляется в мозге амфибий при формировании конечного мозга (Карамян, 1976).
На ростральном уровне заднего отдела ближе всего к стенке нижнего рога бокового желудочка прилежит Med, на каудальном уровне заднего отдела существует контакт со стенкой желудочка у Mep и Cop. Больше нигде на территории как центрального, так и переднего отдела МК его структуры не имеют контакта с желудочковой системой мозга.
Следующим аргументом в пользу древности рассматриваемых структур медиобазальной части заднего отдела МК является наличие в их перивентрикулярных зонах нейробластоформных нейронов, которые получили свое название от термина нейробласты, т.к. очень похожи на них по своим характеристикам (Леонтович, 1978). Эти нейроны чаще всего встречались в Med. Они имели два - три тонких, слабоветвящихся дендрита, которые отходили от округлых тел, располагаясь, под углом друг к другу. Характеристики этих нейронов позволяют предполагать, что они являются эквивалентами прогениторных клеток.
На правомерность такого предположения указывают результаты исследований Yachnis et al. (2000), выявивших наличие частично коммитированных клеток-предшественниц нейронов в перивентрикулярной зоне заднего отдела МК человека в материале, взятом для анализа при аутопсиях. Эти авторы охарактеризовали выявленные группы клеток как обладающие малыми размерами, имеющими округлые тела с двумя-тремя отростками, с интенсивно окрашивающимся ядром, содержащим базофильное ядрышко. Иммуноцитохимически в этих клетках выявлялись MAP-2 и тубулин -III, Bcl-2, т.е. маркеры, позволяющие идентифицировать предшественники нейронов (Сосунов и соавторы, 2002).
На наличие тесного взаимодействия Med, Mep и Cop указывают данные об их связях. Показано, что существуют интенсивные связи Med с Cop (Canteras et al., 1992, 1995). А это означает, что указанные ядра связаны друг с другом не только топографически, но и функционально. Выявлены и важные детали связей рассматриваемых нами ядер с гипоталамической областью мозга, указывающие на время формирования в филогенезе. Так показано, что Cop дает проекции к каудальной (филогенетически новой) части медиального преоптического ядра, в то время как Med связано с передне-вентральной частью этого ядра (филогенетически старой).
Итак, исходя из приведенных выше данных, свидетельствующих о принадлежности дорсомедиального, заднего медиального и заднего кортикального ядер к редковетвистой нейронной системе, их локализации в перивентрикулярной зоне нижнего рога бокового желудочка, сведений литературы о характере их анатомических взаимосвязей и единого источника формирования в эмбриогенезе, можно заключить, что рассматриваемый комплекс ядер представляет собой единую по структурной организации и механизмам развития область МК, формирование которой проходило на самых ранних этапах его становления. Адекватным термином, отражающим эти представления, является термин палеоамигдала.
Половой диморфизм в Med установлен на основании морфометрических показателей и данных гистофизиологического исследования (Акмаев, Калимуллина, 1982, Hines et al., 1992). При этом вопрос о механизме и сроках его формирования оставался открытым. Это послужило основанием для проведения экспериментальных исследований с неонатальной андрогенизацией самок крыс в критическом периоде половой дифференциации мозга (ПДМ).
Изучение результатов модельного эксперимента с введением тестостерон-пропионата самкам крыс на пятый день после рождения показало, что в палеоамигдале реализуется морфогенетическое действие андрогена и возникающие перестройки в дендроархитектонике нейронов происходят как в длинноаксонных редковетвистых, так и в длинноаксонных густоветвистых нейронах.
В Med у неонатально андрогенизированных крыс дендриты нейробластоформных нейронов становились не только более разветвленными (Bd, p<0,01), что было отмечено при изучении половых различий у взрослых особей, но увеличивалась и их общая длина (Ld, p<0,001). В короткодендритных нейронах имело место не только увеличение числа свободных концов дендритов (Bd, p<0,05), но нарастание числа точек ветвления дендритов (Gd, p<0,05). В ретикулярных нейронах изменения количественных характеристик отражали увеличение длины дендритов (Ld, p<0,05).
В Mep морфогенетический эффект андрогена проявляется увеличением ветвления дендритов у нейробластоформных (Bd, p<0,05) и короткодендритных нейронов, а также удлинением дендритов ретикулярных нейронов (Ld, p<0,01, Ldt, p<0,05, Sda, p<0,05) и длинноаксонных густоветвистых нейронов (Ld, p<0,01, Ldt, p<0,01). Установлено, что нарастание длины дендритов происходит за счет их концевых ветвей (Ldt), что подтверждает участием в реализации генотропного влияния половых стероидов белков цитоскелета клетки, в частности микротубулин ассоциированного белка - MАР-2 (Iwata et al., 2005). Наибольшая выраженность половых различий обнаружена среди короткодендритных нейронов Mep, у которых из семи исследованных параметров значимо отличались четыре (Bd, Sda, Gd, Ld, все при p<0,05).
В Cop популяция длинноаксонных редковетвистых нейронов у самок включала в себя все основные типы клеток: нейробластоформные, короткодендритные и ретикулярные. Результаты анализа длинноаксонных редковетвистых нейронов показали, что влияние тестостерон - пропионата приводит к увеличению числа первичных дендритов (d, p<0,001) и свободных концов дендритов (Bd, p<0,05).
Подавляющее большинство длинноаксонных густоветвистых нейронов, выявлявшихся в этом ядре, были подкорковыми кустовидными, для которых характерно ветвление дендритов на небольшом расстоянии от тела клетки. У неоандрогенизированных самок отмечены особенности в дендроархитектонике нейронов, состоящие либо в наличии диспропорций между увеличением длины дендритов при сохраняющейся их слабой разветвленности, либо в резком удлинении одного из дендритов мультиполярного нейрона (при этом чаще всего длинный дендрит был направлен в сторону поверхностной зоны заднего кортикального ядра). Результаты показали, что влияние андрогена проявляется через изменение ряда параметров: возрастает их общая длина (Ld, p<0,01), суммарная длина всех концевых веточек дендритов нейрона (Ldt, p<0,01), что приводит к значимому увеличению площади дендритного поля (Sda, p<0,05). Следует отметить, что у неоандрогенизированных самок самый длинный (С) и самый разветвленный (Cr) дендриты неодинаково различались по характеру увеличения числа точек ветвления. Если на самом длинном дендрите имело место увеличение числа точек ветвления (Gc, p<0,05) и числа свободных концов (Bdc, p<0,05), то на самом разветвленном дендрите при увеличении числа точек ветвления (Gr, p<0,05) количество свободных концов (Bdr, p>0,05) не возрастало. Это, вероятно, можно объяснить нарушением правила дихотомического ветвления дендритов (Косицын, 1976). Результаты сравнительного анализа количественных характеристик длинноаксонных редковетвистых нейронов у контрольных и неоандрогенизированных самок крыс показали, что морфотропический эффект тестостерон- пропионата, проявляется увеличением у нейронов Cop числа первичных дендритов вдвое. Такой же эффект отмечен у крыс в нейронах вентромедиального ядра гипоталамуса при введении тестостерон пропионата на второй день их жизни (Mong et al., 1999).
Морфогенетический эффект тестостерон пропионата проявляется формированием изменений дендроархитектоники нейронов, основная направленность которых совпадает с выявленными нами при изучении половых различий. Однако, андрогенизация самок в периоде ПДМ приводит к формированию различий в дендроархитектонике нейронов по своим количественным характеристикам, превышающим половые различия - так у густоветвистых нейронов Cop определяется не только увеличение общей длины дендритов, но и увеличение площади дендритного поля. Столь значительные изменения указывают на высокую чувствительность нервной системы в периоде ПДМ к влиянию половых стероидов (Акмаев,1979).
Особого внимания заслуживают различия, отчетливо проявившиеся в реакции дендритов двух типов длинноаксонных нейронов. У длинноаксонных густоветвистых нейронов меняются количественные характеристики дендритов, у длинноаксонных редковетвистых - качественные, так как увеличивается число первичных дендритов, сопровождаемое изменением поверхности клетки. Можно высказать предположение, что два типа длинноаксонных нейронов - длинноаксонные густоветвистые и длинноаксонные редковетвистые нейроны - могут иметь различные генетические программы, определяющие формирование дендритов. Если встать на эту позицию, то легко объяснить и имеющиеся у них особенности функций, а также то, что на протяжении эволюции нервной системы, когда необходимость в повышении интегративных способностей нейронов в связи с усложнением организмов возрастает, имеет место сохранение редковетвистых нейронов.
В реализации морфогенетического действия половых стероидов (ПС) большую роль играют метаболические перестройки андрогена, осуществляемые с участием 5-редуктазы и ароматазным ферментным комплексом. Эти ферментные системы служат маркерами структур, на которые воздействуют ПС в периоде ПДМ. Наибольшая активность ароматазного ферментного комплекса выявлена в гипоталамусе, за которым по степени активности этих ферментов следует МК (Naftolin et al., 1975). При изучении особенностей метаболизма тестостерона в ростральных и каудальных частях МК у плодов на 21 день развития отмечено, что в каудальной порции МК преобладающим метаболитом является 3-диол (5-андростан-3, 17-диол), образование которого происходит при участии 3-окси-редуктазы стероидов (Резников и соавт., 1990, Акмаев, Калимуллина, 1993).
В последние годы интенсивно исследуется механизм влияния ПС на нейрогенез. Показано, что в культуре ткани эстрадиол ускоряет интенсивность роста нейронов и темпы формирования аксона, дендритов, их число и разветвленность (Audesirk et al., 2003). При этом 17-эстрадиол оказывает свое влияние через ER, экспрессия которого в нейронах происходит параллельно с экспрессией маркеров пролиферирующих нейронов Ki-67 и мигрирующих и дифференциирующихся клеток - даблкортина (Isgor,Watson, 2005). Известно, что экспрессия эстрогенных рецепторов в преоптической области, гипоталамусе и медиальном ядре МК осуществляется во время внутриутробного развития крыс (Mann, Babb, 2005).
Приведенные выше данные по морфогенетическому действию половых стероидов в раннем постнатальном периоде развития крысы указывают на то, что палеоамигдала вовлечена в процессы ПДМ и в периоде ПДМ происходит программирование ее структурно-функциональной организации как нейроэндокринного центра мозга.
Детерминация программы развития МК в периоде ПДМ реализуется в ходе развития организма через ряд последовательных этапов, одним из которых является половое созревание организма.
Отсутствие сведений в литературе о морфогенезе структур МК в раннем ювенильном периоде развития мозга крысы (с 21-28 дни жизни) указало на необходимость его исследования. Важность изучения этого вопроса была продиктована также тем, что в этот период происходит формирование механизма положительной обратной связи (Вундер, 1980, Docke et al., 1978). Большую роль играет в этот период созревание эстрадиол - связывающей системы мозга: в нейронах гипоталамуса и МК число ядерных эстрогенных рецепторов к 26 дню постнатального периода (ПП) возрастает вдвое (Резников, 1982, Perez et al., 2003).
Результаты проведенного исследования показали, что в раннем ювенильном периоде в структурах палеоамигдалы происходят напряженные пластические перестройки. На 21-й день ПП крысы среди структур палеоамигдалы хорошо дифференцируется только Med, на 28-й день распознается Mep, а Cop приобретает характерную для него цитоархитектонику только на 28-31 день ПП, с которого у крысы начинается поздний ювенильный период (Резников, 1982). Гетерохронное созревание структур палеоамигдалы, несомненно, связано с неодинаковой сложностью их структурно-функциональной организации.
Med представляет собой ядерный центр и является местом формирования конечной полоски (КП), одной из первых систем волокон мозга (Krieg, 1942). КП присутствует в мозге низших позвоночных (круглоротых и рыб), обеспечивая связь обонятельной луковицы с МК и последней с преоптической областью мозга (de Olmos, 1972). КП является путем, через который феромоны достигают гипоталамической области, включение которой обеспечивает процесс вымета гамет в водную среду.
Начиная с 24 дня, в этом ядре происходят перестройки, приводящие к появлению половых различий, которые сводятся к уменьшению его площади у самок крыс (p=0,054 на 24 день и p<0,05 на 28) при одновременном увеличении плотности расположения в нем нейронов (p<0,01 на 24 день). Это согласуется с цитоархитектоническими особенностями полового диморфизма этого ядра у взрослых крыс (Акмаев, Калимуллина, 1993). Половой диморфизм в Med указывает на особенности его функционирования у самок и самцов крыс, а именно: на причастность этого ядра у самцов к регуляции копулятивного поведения (Dominguez et al., 2001, Cooke et al., 2003, , Portillo et al., 2006), а у самок - к модуляции активности циклического центра секреции гонадотропинов (Docke et al., 1977, Beltramino, Taleisnik, 1983, Meredith, 1991, Hosokawa, Chiba, 2007).
По-видимому, тесное прилегание нейронов Med у самок друг к другу (о чем свидетельствует высокая плотность нейронов, отмеченная также и у взрослых животных) и формируемые при этом межнейрональные контакты способствуют синхронизации деятельности нейроэндокринных нейронов этого ядра (Калимуллина и соавторы, 1999). Известно, что ПС влияют на экспрессию коннексина 43 (CX43), участвующего в создании и функционировании щелевидных контактов в преоптической области мозга, обеспечивающих синхронизацию возбуждения нейронов, вовлекаемых в регуляцию эстрального цикла (Gulinello, Etgen, 2005)
Cop имеет сложную структурно-функциональную организацию. Медиальная часть ядра имеет прямые связи с добавочной обонятельной, а латеральная - с основной обонятельной луковицей (Scalia, Winans, 1975). На территории этого ядра происходит интеграция обонятельной информации, поступающей из обеих обонятельных луковиц, которая затем передается в другие структуры МК и мозга (Pro-Sistiaga et al., 2007). Эфферентные волокна из Cop достигают Med, вентромедиального ядра гипоталамуса (центр женского полового поведения) и структур гиппокампальной формации (Olmos, 1972, Coolen, Wood, 1998, Kemppainen et al., 2002). Сложностью структурно-функциональной организации этого ядра, очевидно, можно объяснить тот факт, что оно лоформляется только на 28-31 день ПП. При этом, несомненно, играет роль и длительный морфогенез основной обонятельной луковицы, которая в отличие от добавочной обонятельной луковицы (5 день ПП) происходит до 30 дня ПП (Rosselli-Austin, Altman, 1979, Salazar et al., 2006). Половые различия в плотности нейронов, выявленные в Mep и в медиальной части Cop на 21 день ПП, отражают, вероятно, половой диморфизм добавочной обонятельной луковицы, с которой они имеют прямые связи (Segovia S et al., 2006).
Величины апоптического индекса, рассчитанные в структурах палеоамигдалы, указывают на то, что запрограммированная клеточная гибель в раннем ювенильном периоде развития крысы не является решающим событием в формировании перестроек этого периода. По всей видимости, апоптоз обусловлен специализацией синаптических мишеней и отражает процесс формирования нервных связей структур палеоамигдалы с обонятельными луковицами, а также гипоталамическими репродуктивными центрами (Калиниченко, Матвеева, 2007, Scalia, Winans, 1975, Coolen, 1998).
Полученные в работе данные согласуются с результатами экспериментальных исследований, выполненных на препубертатных крысах (Docke et al., 1977) и показавших, что на четвертой - пятой неделе ПП развития крыс в каудальном части кортико-медиального отдела МК формируется район, вовлеченный в функциональную систему мозга, принимающую участие в процессах реализации положительной обратной связи. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что только к 28-31 дню постнатального периода в заднем отделе МК происходит полный морфогенез всех структур палеоамигдалы, и они по своим цитоархитектоническим и структурно-количественным характеристикам приближаются тождественным показателям, характерным для структур палеоамигдалы в организме взрослых крыс (Акмаев, Калимуллина, 1993).
Полученные в нашей работе данные указывают на то, что в раннем ювенильном периоде развития крысы формирование полового диморфизма в палеоамигдале происходит поэтапно, начиная с дорсомедиального ядра, и завершается к концу этого периода морфогенезом заднего кортикального ядра. Выявленный дорсо-вентральный вектор отражает сложность структурно-функциональной организации, входящих в состав палеоамигдалы структур, а также роль афферентного притока из обонятельных луковиц.
Исследование цитологических характеристик нейронов, глии и сосудов структур палеоамигдалы на светооптическом уровне показало, что в составе Med, Mep и Cop выявляются кариохромные, светлые и цитохромные нейроны. При этом в составе Med, Mep преобладали кариохромные и светлые нейроны. Cop является самой полиморфной зоной палеоамигдалы, где представлены все выше названные типы нейронов, имеет место разнообразие их размеров и формы перикарионов.
Изучение ультраструктуры нейронов позволило углубить наши представления об их структурной организации. Было выявлено, что тёмные нейроны представляют собой эквивалент кариохромных нейронов. Но если в световом микроскопе тёмное, базофильное ядро казалось богатым гетерохроматином, электронная микроскопия позволила убедиться, что высокая электронная плотность ядра во многих нейронах предопределяется наличием большого числа интерхроматиновых гранул (ИХГ), которых больше по сравнению с глыбками гетерохроматина. А мелкая базофильная (пылевидная) зернистость в цитоплазме кариохромных нейронов представлена скоплениями свободных рибосом и полисом. Признаки высокой транскрипционной активности ядра сочетаются с гипертрофией комплекса Гольджи, морфологическими показателями его секреторной активности и многочисленностью митохондрий. Всё это свидетельствовало о том, что среди кариохромных нейронов, которые в электронном микроскопе носят характер темных, могут быть нейроны, как с показателями высокой, так и низкой функциональной активности, что требовало более детального исследования. Весьма важной находкой было обнаружение секреторной активности нейронов, что указывало на наличие у них характеристик нейроэндокринных нейронов.
Наряду с кариохромными нейронами мы видели и светлые нейроны. На уровне светового микроскопа для светлых нейронов было характерно наличие богатого эухроматином ядра и светлой, умеренно базофильной, цитоплазмы, в которой определялись мелкие глыбки хроматофильной субстанции. В электронном микроскопе в этих нейронах определялось наличие ровного контура поверхности ядра (в то время как в тёмных нейронах отмечены множественные выбухания и инвагинации) с присутствием в нуклеоплазме характерных нежных хроматиновых нитей со скудностью гранулярного компонента, компактное ядрышко. В цитоплазме узкие канальцы гранулярной эндоплазматической сети (ЭС) сочетались с расширенными цистернами гладкой ЭС. Расположение мембран ЭС носило нерегулярный характер. Немногочисленные митохондрии имели уплотненный матрикс. В цитоплазме светлых клеток мы видели везикулы с плотным центром. Число свободных рибосом в светлых нейронах было уменьшено по сравнению с тёмными нейронами. Однако, между тёмными и светлыми нейронами были и переходные формы, когда светлое, богатое эухроматином ядро, обладающее признаками сглаживания "деформированной" поверхности было окружено цитоплазмой, которое, в целом, имела характеристики цитоплазмы тёмных нейронов.
Светлые нейроны с хорошо развитой гранулярной ЭС были наиболее часто представлены в Cop и характеризовали ультраструктуру цитохромных нейронов. Светлое крупное, богатое эухроматином клеточное ядро в них сочеталось с наличием хорошо развитой гранулярной ЭС, канальцы которой в ряде клеток располагались в виде параллельных рядов, имеющих значительную протяженность и несущих на своей поверхности рибосомы. Эта картина соответствует ультраструктуре телец Ниссля, а именно они были отмечены нами в цитоплазме этих нейронов в виде крупных глыбок базофильной субстанции.
В отдельных зонах палеоамигдалы нам удалось отметить тесное прилежание перикариона нейронов к стенке сосудов и выявить сеть периэндотелиальных пространств. На поверхности эндотелия имелось большое количество микроворсинок, т. е. присутствовали те черты, которые характерны для сосудов нейросекреторных центров (Войткевич, Дедов, 1972). Приведенные данные свидетельствуют о наличии у нейронов трансдукционных функций (Немечек и соавт., 1978). Выявлены в составе нейропиля палеоамигдалы и определенные особенности аксонов. Они проявлялись в том, что образовывали большое количество коллатералей и по ходу имели варикозные расширения, диаметр которых достигал 2 мкм. Внутри варикозных расширений определяются группы митохондрий и везикулы с плотным центром, размером до 220 нм. Некоторые аксоны не имели миелиновой оболочки, что характерно для нейросекреторных клеток. Можно думать, что они приходили в палеоамигдалу из гипоталамической области и принадлежали ЛГ-РФ-продуцирующим нейронам (Reichlin, 1985, Reubi et al., 1987). Глия была представлена олигодендроцитами и астроцитами, которые часто располагались в тестом контакте с телами нейронов.
Выполненный анализ цитологических характеристик нейронов палеоамигдалы показал, что в составе ее структур присутствуют кариохромные, цитохромные и светлые нейроны, электронно-микроскопическими эквивалентами которых являются темные и светлые нейроны, обладающие признаками секреторной активности. Большая вариация их представительства у самок крыс по сравнению с самцами поставил вопрос о зависимости их функционального состояния от уровней половых стероидов (ПС), и указал на необходимость более детального анализа их структурно-функциональной организации.
Изучение цитологических характеристик нейронов палеоамигдалы в препаратах, окрашенных на нуклеиновые кислоты по Эйнарсону, и подсчет количества темных и светлых клеток в стадии эструс и метэструс показали, что при смене стадий эстрального цикла изменяется их соотношение. Уточнению этого наблюдения способствовал метод авторадиографии с 3Н-уридином.
В автографах Med белых крыс, которым был введен 3Н-уридин, зерна восстановленного серебра обнаруживали преимущественно в ядрах нейронов и реже (иногда) - в цитоплазме. Большую интенсивность имела метка в эндотелии сосудов и прилежащих к ним нейронах. Подсчет зерен серебра на единицу площади объекта с учетом фона вне среза показал, что у крыс на стадии эструс он равен 10,45+0,89, метэструс - 8.29+0,27. Сравнение вариационных рядов групповых средних, отражающих интенсивность включения изотопа в двух исследованных группах показало, что выявившиеся различия являются статистически значимыми (р<0,01).
Анализ результатов исследования активности сукцинатдегидрогеназы в нейронах этого ядра в различные стадии эстрального цикла (ЭЦ) свидетельствует о том, что гранулы диформазана распределяются в ткани этого ядра практически диффузно с некоторой концентрацией в отдельных клетках и свидетельствуют о высокой активности митохондрий в ткани Med.
Электронно-микроскопический анализ функционального состояния нейронов палеоамигдалы на четырех группах крыс (по 3 самки на стадиях эструс, метэструс и диэструс, а также у 3 самцов), позволил разработать классификацию нейроэндокринных нейронов этого ядра. Нейроэндокринные нейроны как у самок, так и у самцов крыс могут находиться в состоянии покоя, отражающего режим спокойного функционирования нейронов, лумеренной активности, повышенной активности, пика активности или напряжения, снижения активности по первому типу, снижения активности по второму типу и возврата к исходному состоянию.
Состояние покоя отражает режим спокойного функционирования нейронов. Светлое, богатое эухроматином клеточное ядро находится в центре перикариона и содержит компактное ядрышко. Эухроматин представлен равномерно распределенными тонкими нитчатыми структурами. Перинуклерное пространство узкое (50 нм). В кариоплазме выявляются отдельные мелкие гранулы - интерхроматиновые (ИХГ, 20 нм) и перихроматиновые (от 40 до 60 нм). Ядрышко имеет четкие контуры, в нем выявляются крупные светлые фибриллярные центры. Небольшие глыбки конденсированного хроматина располагаются равномерно в различных зонах кариоплазмы, около ядрышка и под внутренней ядерной мембраной.
В цитоплазме представлены узкие канальцы гранулярной эндоплазматической сети (ЭС), небольшие скопления полисом и умеренное количество митохондрий округлой или овальной формы с поперечно расположенными кристами. Матрикс митохондрий обладает умеренной осмиофилией. Комплакс Гольджи (КГ) представлен стопками уплощенных цистерн, имеющих различную протяженность, располагается в перинуклеарной зоне. К боковым поверхностям цистерн прилежит незначительное количество микропузырьков и отдельные вакуоли. Вблизи от КГ или около плазматической мембраны можно найти отдельные везикулы с плотным центром, диаметр которых варьирует от 60 до 275 нм. В цитоплазме клеток выявляются первичные лизосомы и отдельные липофусциновые гранулы.
Состояние лумеренной активности характеризуется наличием в ядрах признаков транскрипционной активности, увеличением и разрыхлением ядрышка. Ядрышко смещено к ядерной мембране, на его поверхности есть неровности, формируемые гранулами. В ядрышке увеличено число малого размера фибриллярных центров, обрамленных зоной выраженной осмиофилии - плотным фибриллярным компонентом. Количество краевого хроматина под внутренней ядерной мембраной снижено. Перинуклерное пространство местами расширено и переходит в расширенные канальцы гранулярной ЭС. Число ядерных пор увеличено. Поверхность клеточного ядра волнистая. В кариоплазме находятся небольшие очаговые скопления интерхроматиновых гранул (ИХГ). Они различаются по величине занимаемой площади. Выявляются пучки перихроматиновых фибрилл, они имеют вид либо параллельно расположенных фибрилл, либо их концы расходятся веерообразно.
При этом ядро светлое, в то время как цитоплазма за счет увеличенного числа канальцев гранулярной ЭС, большого числа прикрепленных и свободных рибосом, полисом, гипертрофии и гиперплазии темных митохондрий умеренно электронно-плотная. Продольный размер митохондрий увеличен, между ними определяются контакты. Определяется изменение ориентации крист, их неравномерное расположение. Умеренная гипертрофия КГ проявляется расширением просвета цистерн и увеличением числа транспортных пузырьков, а также появлением мелких и крупных осмиофильных гранул секрета. В цитоплазме определяется увеличенное число первичных лизосом. Выявляемые везикулы с плотным центром имеют размер от 60 до 275 нм.
Состояние повышенной активности характеризуется содержанием большого количества гранулярного материала в кариоплазме. Но в зонах, свободных от гранулярного материала, кариоплазма остается светлой, т.е. проницаемой для электронов. В этих, светлых участках удается видеть отдельные фибриллы, характерные для эухроматина. Гранулярный материал в кариоплазме представлен скоплениями ИХГ, которые формируют очаги в различных ее зонах. Около очагов краевого гетерохроматина присутствуют перихроматиновые гранулы. Ядро и ядрышко увеличены в размерах. В ядрышке, которое располагается эксцентрично, выявляются небольших размеров фибриллярные центры с плотным фибриллярным компонентом. Перинуклеарное пространство в отдельных участках расширено, размеры ядерных пор увеличены. Ядерная мембрана формирует складки, в участки инвагинаций поверхности ядра проникают язычки цитоплазмы.
В перинуклерной зоне цитоплазмы определяется пояс из митохондрий, количество и размеры которых увеличены. Митохондрии имеют темный матрикс, число крист увеличено, между митохондриями выявляются контакты. Наблюдается очаговое расширение канальцев гранулярной ЭС, которые преобразуются в цистерны. Просвет расширенных канальцев гранулярной ЭС свободен от содержимого. Число прикрепленных рибосом на поверхности их мембран уменьшается, а число свободных рибосом и полисом в цитоплазме возрастает. Полисомы в цитоплазме распределены неравномерно. Заметна гипертрофия КГ (можно видеть несколько его комплексов с расширенными цистернами, хорошо развитым вакуолярным компонентом и множеством транспортных пузырьков). Определяются мультивезикулярные, а также мультиламинарные тельца. Везикулы с плотным центром находятся около КГ или около плазматической мембраны в субповерхностных зонах, их количество увеличивается по сравнению со стадией лумеренной активности.
Состояние пика активности или напряжения характеризуется высокой электронной плотностью увеличенного в размерах ядра, в котором определяется не только большое количество гранулярного материала, но и присутствует осмиофильная мелкозернистая субстанция.
Ядрышко рыхлое, увеличенное в размерах, с хорошо различимым гранулярным компонентом, большим числом фибриллярных центров, имеющих плотный фибриллярный компонент. В осмиофильной кариоплазме определяются как в центральных, так и краевых зонах большие по занимаемой площади скопления ИХГ гранул, для которых в отличие от остального гранулярного материала, представленного в ядре, характерна выраженная осмиофилия, четкость контуров. ИХГ располагаются рыхло и имеют диаметр 20 - 25 нм. Количество перихроматиновых гранул (ПХГ) увеличено. В центральных зонах кариоплазмы выявляются различные по величине и плотности участки гетерохроматина, около которых находятся ПХГ, количество которых может достигать от трех до шести. Перинуклерное пространство равномерно расширено, размеры ядерных пор увеличены. Поверхность ядра складчатая.
Канальцы гранулярной ЭС расширены, на поверхности ее мембран число прикрепленных рибосом снижено, между цистернами лежат скопления полисом. КГ достигает высокого уровня развития: определяется три-четыре комплекса с хорошо развитым мембранным компонентом. Локализуется он в перинуклеарной зоне, около него определяется формирование секреторных везикул. Много гипертрофированных митохондрий, среди которых могут быть и со светлым матриксом. Определяется тесный контакт митохондрий с цитомембранами - гранулярной ЭС, КГ, наружной ядерной мембраной. Могут быть выявлены и явления блеббинга ядерной мембраны в мембраны КГ. Часто встречаются мульвезикулярные и мультиламинарные тельца.
Структурная организация нейронов указывает на высокую интенсивность протекающих в них транскрипционных процессов. Осмиофилия кариоплазмы, возможно, свидетельствует об увеличении содержания в клеточном ядре белков, принимающих участие, как в транспорте создаваемых РНК в цитоплазму, так и включающихся в процессы конденсации хроматина. В таких клетках, вероятно, происходят усиленно и процессы внутриклеточной регенерации, на что указывает наличие мультиламинарных телец.
Состояние снижения активности по первому типу характеризуется увеличением содержания гетерохроматина, как в краевых, так и центральных зонах ядра. При этом ИХГ или не выявляются, или их количество резко уменьшено. Размер фибриллярных центров в ядрышке увеличен, а их количество уменьшено. Кариоплазма осмиофильна за счет мелкозернистой и пылевидной субстанции. Плотное, уменьшенное в размерах ядрышко, располагается в таких нейронах эксцентрично, имея контакт с хорошо выраженным краевым хроматином. ПХГ около него или не выявляются, или единичны. Перинуклерное пространство равномерно расширено. На поверхности ядра встречаются складки.
Цитоплазма, прилежащая к ядру содержит полисомы, светлые митохондрии и липофусциновые гранулы. КГ имеет вакуолярный компонент, просвет вакуолей свободен от содержимого. Канальцы гранулярной ЭС расширены, на поверхности ее мембран определяются редкие рибосомы. Митохондрии многочисленны, размер некоторых из них увеличен. Везикулы с плотным центром немногочисленны.
Данные нейроны, имеющие плотное ядрышко и увеличенные количества конденсированного хроматина в кариоплазме, могут быть расценены как завершившие транскрипционные процессы. Однако обилие полисом в цитоплазме показывает, что в них активно происходят процессы трансляции. Снижение активности по охарактеризованному варианту следует, очевидно, за стадией напряжения.
Снижение активности по второму типу определяется в других нейронах, которые носят характер переходных (светлое ядро и темная цитоплазма), в них определяется увеличенное в размерах ретикулярное ядрышко. В составе ядрышка выявляются пять - шесть крупных фибриллярных центра и несколько мелких. Плотный фибриллярный компонент в них не определяется. Содержание гранулярного компонента в ядрышке снижено. Кариоплазма таких нейронов менее осмиофильна, чем в нейронах, находящихся в состоянии повышенной активности или напряжения. Но она имеет место и обусловлена наличием пылевидной субстанции, равномерно заполняющей клеточное ядро. Содержание краевого хроматина снижено, а гетерохроматин в центральных зонах ядра носит характер рыхло расположенных небольших по размеру осмиофильных скоплений, около которых определяются ПХГ.
Перинуклеарное пространство расширено в отдельных участках до 150 нм. В этих зонах определяются увеличенные в размерах ядерные поры, хотя число их не увеличено. В просвете перинуклеарного пространства определяется пылевидная осмиофильная субстанция, в прилежащих зонах цитоплазмы много полисом и свободных рибосом. Внутри таких зон лежат митохондрии с темным матриксом, с плохо различимыми кристами. В матриксе могут встречаться небольшие очаги просветления. Мембраны митохондрий, как наружная, так и внутренняя, хорошо структурированы. В наружных, субповерхностных зонах цитоплазмы определяются длинные узкие канальцы гранулярной ЭС с редкими рибосомами. Местами канальцы расширяются, в прослойках цитоплазмы, прилежащих к канальцам, видны группы окаймленных пузырьков. Просвет канальцев свободен от содержимого. Цистерны КГ расширены, определяется формирование вакуолей. Вблизи от КГ определяются везикулы с плотным центром.
Эти нейроны, вероятно, отражают снижение функциональной активности тех из них, которые не проходили стадии напряжения, а образовались из нейронов в состоянии лумеренной или повышенной активности. Это, вероятно, отражает тот факт, что нейроны могут работать с разной функциональной нагрузкой. Возможно, подобные нейроны могут быть обозначены как снижающие свою функциональную активность путем ускоренной реверсии.
Состояние возврата к исходному состоянию. Характерной особенностью этих нейронов являются картины сегрегации гранулярного компонента ядрышка, проявляющиеся их разобщением. Эти явления указывают на блокаду синтеза РНК в ядрышке. Содержание перихроматиновых гранул может быть различным. Ширина перинуклерного пространства уменьшается (60 нм). Поверхность ядра может сохранять складки, однако, в язычках цитоплазмы, которые проникают в ядро, отмечается уменьшение плотности расположения полисом. Нейроны, в состоянии возврата к исходному состоянию, вновь приобретают характер светлых клеток. В клеточном ядре определяются умеренные скопления краевого хроматина, эухроматин представлен нежными фибриллярными структурами. В кариоплазме ряда клеточных ядер четко определялось одно крупное, имеющее вид сетевидной структуры, тельце Кахала.
Снижается и число митохондрий, которые равномерно распределяются по цитоплазме. Они имеют округлую или овальную форму, небольшие размеры, четкие мембраны, умеренной осмиофилии матрикс. Канальцы гранулярной ЭС узкие, просвет свободен от содержимого. Они располагаются в различных зонах цитоплазмы, некоторые из них находятся в контакте с митохондриями. КГ представлен различными по протяженности стопками уплощенных цистерн, около которых определяется небольшое число микропузырьков. В цитоплазме обнаруживаются отдельные мультивезикулярные тельца. Лизосомы единичны и носят характер гранул накопления или липофусциновых телец. В отдельных зонах цитоплазмы выявляются окаймленные пузырьки и везикулы с плотным центром.
При изучении ультраструктуры нейронов на различных стадиях эструсного цикла (ЭЦ), мы не встретили у самок крыс ни одной клетки с признаками дегенерации (пикноморфных нейронов). Это позволяет предполагать, что нейроны способны возвращаться в исходное состояние для того, чтобы вновь активизироваться в следующую фазу ЭЦ. Полученные результаты позволили прийти к выводу, что в нейроэндокринных нейронах палеоамигдалы имеет место функциональная гормон-зависимая реверсия, происходящая в динамике Э - под влиянием меняющихся уровней ПС.
У самцов встречались единичные пикноморфные клетки. Для них была характерна выраженная почти гомогенная осмиофилия ядра и цитоплазмы, уменьшение размеров перикариона, сморщивание. Клеточное ядро было деформировано, имело извилистый рельеф поверхности из-за многочисленных глубоких выбуханий и инвагинаций. Под внутренней ядерной мембраной определялись скопления гетерохроматина. Ядрышко было гомогенным, плотным, находилось в центре ядра, или подвергалось фрагментации, при этом его части выявлялись около внутренней ядерной мембраны. Перинуклеарное пространство было узким, местами плохо различимым. В прилежащих к ядру зонах цитоплазмы находились многочисленные, увеличенные в размерах, митохондрии, с просветленным матриксом и разрушенными кристами. Канальцы ЭС были плохо различимы. Между канальцами ЭС располагаются отдельные свободные рибосомы или участки гомогенной цитоплазмы. Цистерны КГ были резко расширены или, наоборот, находились в спавшемся состоянии, формируя стопки с расширениями на концах. Просвет их был пустым. Можно полагать, что в подобных случаях происходит гибель клетки путем апоптоза.
На различных стадиях Э - можно найти все перечисленные разновидности, но количество нейронов того или иного состояния различается в зависимости от стадии ЭЦ.
Полученные результаты показали, что активизирующее влияние ПС проявляется во всех структурах палеоамигдалы, механизм которого можно объяснить на основании следующих данных.
Известно, что нейроны Med способны экспрессировать обе формы эстрогенных рецепторов - ER и ER, и обе формы прогестиновых рецепторов - PRA и PRB, при этом в одной и той же клетке может иметь место коэкспрессия этих рецепторов (Greco et al., 2001). Показано, что 17- эстрадиол, пиковая концентрация которого имеет место на стадии проэструс, усиливает экспрессию ER и оказывает свое влияние через этот рецептор (Audesirk et al., 2003, Marin et al., 2003). Также известно, что ER активизирует транскрипционные процессы в нейронах, воздействуя через AP-1 чувствительный элемент (Pasterkamp et al., 1996, Paech et al., 1997, Бабичев, 2005). Исследование модулирующего влияния ПС на нейроны Med в динамике Э - показало, что повышение уровня эстрогенов на стадии эструса приводит к увеличению количества нейронов в состоянии повышенной активности и пика активности (соответственно 40 и 26%), при этом общий процент этих нейронов составляет 66%.
На стадии метэструс самый большой процент нейронов (37%) находится в состоянии снижения активности. Этот эффект можно объяснить экспрессией рецепторов ER и PR под совместным влиянием 17 эстрадиола и прогестерона (Shugbrue et al., 1997, Moffatt et al.,1998, Isgor et al., 2002, Guerra-Araiza et al., 2003). Известно, что экспрессия ER индуцируется совместно повышенными уровнями эстрадиола и прогестерона и оказывает тормозный эффект на транскрипционные процессы в клетке (Matthews et al., 2006). Полученные нами данные о повышенном уровне экспрессии ER в структурах палеоамигдалы на стадии метэструс (доля иммунореактивных нейронов в Med на стадии метэструс была равна 65,03+3,03, на стадии проэструс 39,21 +3,56, p<0,001; в Mep 50,29+3,06 по сравнению со стадией проэструс 33,27+3,58, p<0,01); в медиальной части Cop на стадии метэструс 46,46+0,62, проэструс 31,16+1,39, p<0,001) хорошо согласуются с приведенными сведениями литературы.
Также показано, что торможение активации транскрипции ER осуществляется ER через формирование гетеродимеров обоих рецепторов (Petersson et al., 1997, Saji et al., 2005). В снижении функциональной активности нейронов на стадии метэструса, вероятно, играет роль и изменение состояния митохондрий, т.к. известно, что они являются местом локализации ER (Solakidi et al., 2005).
Можно предполагать, что высокие уровни ПС могут изменять состояния ядерного матрикса, зная что биосинтез РНК происходит в непосредственной связи с ним (Ciejek et al., 1973, Jackson et al., 1985), а также способствовать амплификации рДНК, позволяющей объяснить быстрое нарастание числа рибосом в цитоплазме (Бельков, 1982). Все это обеспечивает интенсивный синтез белка в клетке, идущего на создание пула цитозольных рецепторов; веществ, обладающих свойствами секретов - нейропептидов.
Общепризнанно, что синтезируемая в ядре гяРНК выявляется в виде перихроматиновых фибрилл (Ченцов, 2004). До недавнего времени считалось, что главной функцией интерхроматиновых гранул (ИХГ) является обеспечение работы факторов сплайсинга (Fu, Maniatis,1990, Spector 1991, Misteli, 2000). Но новые данные показывают, что ИХГ не являются пассивными элементами, а принимают активное участие в регуляции взаимодействия транскрипционных и сплайсинговых агентов(Johnson et al., 2000). С их участием при гормональных воздействиях может усиливаться сигнал на экспрессию генов, инициируя транскрипцию, элонгацию и процессинг РНК (Nunez et al., 2008).
Все формы ядерных транскриптов обнаружены нами в ядрах нейронов палеоамигдалы. Их качественные и количественные характеристики стали основанием для суждения о функциональной активности нейронов. Особое внимание мы уделили изучению ядрышка, т.к. известно, что оно раньше других компонентов ядра реагирует на активизирующее влияние ПС созданием рибосомной РНК (Мейнуоринг, 1979), а также согласно последним данным может являться местом локализации ER (Solakidi et al., 2005).
Следует отметить также, что выявившиеся в ядрышке явления сегрегации его компонентов, отражающие блокаду синтеза РНК (Ченцов, 2004), способствовали распознанию нейронов, возвращающихся к своему исходному состоянию после снижения функциональной активности. В нейронах, возвращающихся к исходному состоянию определялись и тельца Кахала, основную роль которых связывают с участием в биогенезе малых ядерных РНК (Matera, 1999). Их обнаружение в нейронах снижающих свою функциональную активность можно объяснить изменением его модульной организации, сопровождающейся дезинтеграцией комплексов телец Кахала с кластерами ИХГ. То, что такая дезинтеграция возможна, показывают результаты экспериментальной блокады транскрипции в ооцитах Achera, проявляющиеся перераспределением факторов сплайсинга в их составе (Боголюбов, 2008).
Следует отметить и осмиофилию кариоплазмы темных нейронов в состоянии напряжения. Вероятно, она связана с накоплением в ядре большого количества белков, поступающих в него из цитоплазмы, которые играют роль регуляторов процессов транскрипции. В настоящее время выявлено много таких групп белковых молекул - коактиваторы, корепроссоры, коинтеграторы и т.д. (Смирнов, 2005, Кулинский, Колесниченко, 2005).
Исследование структуры темных нейронов выявило гипертрофию и гиперплазию многих органоидов, но особенно она была выражена в митохондриях. Этот факт можно объяснить наличием в цитомембранах рецепторов стероидных гормонов. С их участием в митохондриях обеспечивается увеличение синтеза ферментов дыхательной цепи за счет усиления экспрессии митохондриальных генов, а также митохондриогенез. ПС способны оказывать влияние и на мембраны клетки, вызывая их пролиферацию, а также влиять на процессы трансляции через ключевые активаторы - две протеинкиназы и фактор инициации трансляции 4Е (Кулинский, Колесниченко, 2005).
На стадии метэструс, для которой характерны низкие уровни эстрадиола, преобладают нейроны в состоянии снижения активности. Показателем снижения активности нейронов было увеличение содержания в ядре конденсированного хроматина. Процесс конденсации хроматина, по-видимому, инициировался увеличением уровня прогестерона и повышением экспресcии ER, которое было установлено нами при использовании иммуноцитохимической реакции. Эти данные согласуются с имеющимися в литературе (Смирнов, 2005, Isgor et al., 2002).
Полученные результаты указывают на наличие функциональной гормон-зависимой реверсии в структурно-функциональной организации нейронов палеоамигдалы, происходящей под влиянием половых стероидов. Впервые термин функциональная реверсия для характеристики пластических перестроек нейросекреторных клеток, введен Гарловым (2002). Мы посчитали его адекватным и для обозначения всей совокупности структурно-функциональных перестроек, происходящих в популяции нейронов палеоамигдалы, предопределяемых изменяющимися уровнями половых стероидов.
Известно, что модулирующее влияние ПС на нейроны осуществляется при участии моноаминов. Это предопределено механизмом ПДМ, реализация которого происходит при тесном партнерстве ПС и моноаминов (Резников и соавторы, 2004). Нами проведено исследование вовлечения катехоламинов и серотонина (С) в регуляцию Э - путем определения их содержания в палеоамигдале методом ВЭЖХ. Поскольку содержание биогенных аминов в мозге имеет ограниченную информативную ценность, т.к. представляет интегральную величину их синтеза, освобождения и деградации, было решено выявить содержание основных метаболитов дофамина - 3,4-диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) и серотонина - 5-гидрооксииндолуксусной кислоты (5-ГИУК) с последующим расчетом катаболических коэффициентов (ДОФУК/ДФ) и 5-ГИУК/С.
Полученные результаты показали, что при отсутствии половых особенностей в содержании норадреналина, дофамина и серотонина, существуют значимые различия в метаболизме дофамина и серотонина, интенсивность которого больше у самцов крыс. Отражением различий были значимо большие значения катаболических коэффициентов ДОФУК/ДФ (0,44+0,11 у самцов, 0,24+0,04 у самок, p<0,05) и 5-ГИУК/С (1,52+0,18 у самцов, 0,92+0,03 у самок, p<0,01). Выявленные особенности позволяют предполагать, что в их основе могут лежать различия в активности основных ферментных систем - моноаминоксидазы и катехол-О-метилтрансферазы, которые формируются под влиянием ПС в периоде ПДМ (Casiri, Ladosky, 1973, Ladosky, Schneiber,1981, Резников, 1982, Reznikov, Nosenco, 1983).
Сравнительный анализ содержания норадреналина, дофамина и серотонина и их метаболитов на стадиях проэструса и метэструса показал наличие повышения содержания норадреналина на стадии проэструса(p<0,01) при отсутствии значимых различий со стороны других показателей. Повышение содержания норадреналина, наряду с активизирующим влиянием ПС на транскрипционные процессы в клетке, могло так же выступать в качестве фактора, вызывающего дестабилизацию хроматина, т.к. известно, что катехоламины способны проникать в нервные клетки и непосредственно взаимодействовать с хроматином (Божко, 1985).
Механизм локального повышения содержания НА в палеоамигдале на стадии проэструса можно было бы объяснить действием эстрогена через свои рецепторы на норадренэргических терминалях, однако, до сих пор отсутствуют прямые доказательства наличия на них эстрагенсвязывающих мест (Резников и соавт., 2004). Можно предполагать, что в палеоамигдале может иметь место тот же механизм, который показан в отношении медиального субъядра центрального ядра и базолатерального ядра МК (Asan, 1998, Hatfield et al.,1999, Aroniadou-Anderjaska et al., 2007), а именно: ПС могут влиять на выделение НА из терминалей через стероид-связывающий сайт ГАМКА-рецепторов. Также известно, что нейроны НАэргических центров ствола мозга, дающие проекции в МК, имеют эстрогенные (ER и ER) и прогестиновые (PRA и PRB) рецепторы (Ostlund et al., 2003, Rincavage et al., 2003, Wang et al., 2006, Milner et al., 2008). Это указывает на то, что уровни ПС способны оказывать влияние на НА-продуцирующие нейроны в местах их локализации, влияния на синтез, транспортировку медиатора, а также регулируя выделение и скорость метаболизма в целевых регионах мозга.
Полученные нами данные о повышении содержания НА в палеоамигдале на стадии проэструс согласуются с ранее полученными данными Crowley et al. (1978), которые определяли содержание катехоламинов в медиальном ядре МК, не дифференцируя его на субъядра. Также следует отметить, что НА является одним из важных участников нейрохимической системы преоптической области регулирующей выделение ЛГ (Hiemke et al., 1985, Dobson et al., 2003). В преоптической области изменение содержания НА регулируется через тормозные ГАМК-ергические синапсы на НА-ергических аксонах (Mansky et al., 1982).
Палеоамигдала является интегративным обонятельным центром мозга: Med связано с добавочной обонятельной луковицей (Scalia, Winans, 1975, Hosokawa, Chiba, 2005), медиальная часть Cop имеет прямые связи с добавочной обонятельной луковицей, латеральная - с основной обонятельной луковицей (Olmos, 1972, 1978, Broadwell, 1975, Scalia, Winans, 1975, Olmos et al., 1982, Reyher, Kaulen, 1984). На территории палеоамигдалы происходит интеграция обонятельной информации, поступающей из обеих обонятельных луковиц, которая затем передается в другие структуры МК и мозга.
Показано, что специфические обонятельные стимулы (феромоны самца крысы или самки на стадии эструса) у половозрелых крыс вызывают экспрессию ранних генов (c-Fos) в вомероназальной системе мозга, включающей и Med, что сопровождается выделением лютеинизирующего гормона (Beltramino et Talesnik, 1983, Hosokawa, Chiba, 2005). Роль структур палеоамигдалы в реализации обонятельных стимулов на репродуктивные центры гипоталамуса при этом представляется чрезвычайно важной, ибо они являются единственными обонятельными центрами мозга (кроме обонятельных луковиц), с помощью которых специфическая химическая сигнализация доставляется в гипоталамус.
Какими перестройками в метаболизме катехоламинов в обонятельных луковицах и в палеоамигдале сопровождается проведение феромонального сигнала в мозг, мы решили выяснить с помощью эксперимента с сенсорной стимуляцией по методике Амстиславской (2006). После 20-ти минут экспозиции самца рядом с клеткой, в которой находилась рецептивная самка, результаты ВЭЖХ супернатантов, полученных из ткани палеоамигдалы самца, показали, что в обонятельных луковицах увеличивается содержание НА (p<0,01) и ДФ (p<0,01). В палеоамигдале повышение содержания норадреналина (p<0,05) сопровождается снижением содержания дофамина (p<0,01). Коэфициент катаболизма дофамина при этом не изменялся. Эти данные свидетельствуют о том, что при половом возбуждении самца палеоамигдала вовлекается в систему структур, опосредующих влияние запаховых раздражителей с помощью катехоламинов. Метаболизм биогенных аминов изменяется уже через 10 минут после пребывания самца рядом с рецептивной самкой (поведенческая стадия) полового возбуждения, в то время как повышение уровня тестостерона имеет место через 20 минут после сенсорного контакта (Амстиславская, 2006).
Снижение содержания ДФ в палеоамигдале при половом возбуждении объяснить на сегодняшний день трудно из-за отсутствия соответствующих сведений по взаимовлиянию в ней всего спектра нейромедиаторов. Можно предполагать наличие двух механизмов. Первый из них основывается на данных, свидетельствующих о наличии адренорецепторов на терминалях ДФэргических волокон, через которые повышение содержания НА может изменять выделение ДФ (Darracg et al., 1998, Marien et al., 2004). Второе предположение опирается на данные, свидетельствующие о конкурентных отношениях между ДФ и глутаматом, который обнаружен в Med (Dominguez et al., 2001, Sesack et al., 2003). Предполагается, что ввод глутамата из Med в гипоталамус определяет усиление выделения ДФ в медиальной преоптической области, где ДФ выступает в качестве возбуждающего нейромедиатора при организации мужского полового поведения (Dominguez et al., 2001). Уместно при этом заметить, что в деятельности циклического центра регуляции секреции гонадотропинов ведущую роль играет НА (Dobson et al., 2003). Возможно, роль различных катехоламинов (НА или ДФ) имеет значение в активизации различных репродуктивных центров - циклического у самок или полового у самцов. Оба этих центра локализуются в преоптической области гипоталамуса.
Палеоамигдала - интегративный центр мозга, формирование которого произошло на ранних этапах исторического развития позвоночных организмов, в выживании которых ведущее значение имели, кроме полового, пищевое и агрессивно-оборонительное поведение. Имеющиеся в литературе сведения показывают, что задний отдел МК причастен к регуляции пищевого поведения, а также состояния широкого круга гомеостатических систем (Ахмадеев и соавторы, 1998, Калимуллина и соавторы, 2002, King et al, 1994, 1996, 1998, 1999, Coscina et al, 2000). Это указывает на то, что палеоамигдала должна играть важную роль в системе подкрепления (вознаграждения), которая имеет ведущее значение в патогенезе наркомании.
Важность исследований МК, и, прежде всего, его древней части палеоамигдалы в аспекте проблем наркомании продиктована и перспективными возможностями использования этих знаний для разработки качественно новых стратегий в лечении наркозависимости.
Проведенное исследование экспрессии CART(cocaine-amphetamine-regulated transcript)-пептида в МК позволило выявить его в нейронах всех структур палеоамигдалы, как у самцов, так и самок крыс. Известно, что этот пептид играет роль в развитии анксиогенных реакций при употреблении наркотиков (Dandekar et al., 2007), участвует в формировании наркотической зависимости (Salinas et al., 2006). Он принимает участие в регуляции пищевого поведения и полового поведения (Dominguez et al., 2002, Dayas et al., 2008), вовлечен в нейроэндокринные взаимосвязи (Hunter et al., 2005, Xu et al., 2006, Roubos et al., 2008, Sen et al., 2008).
Формирование палеоамигдалы в онтогенезе происходит под морфогенетическим действием половых стероидов, а ее деятельность во взрослом организме осуществляется под их активизирующим влиянием. Поэтому естественно было предположить наличие модулирующего влияния ПС на экспрессию CART- пептида в палеоамигдале. Полученные результаты показали, что в дорсомедиальном и заднем кортикальном ядрах изменение уровней половых стероидов значимо влияет на число иммунореактивных нейронов, а также уровни экспрессии CART-пептида. Данные о влиянии ПС на экспрессию CART-пептида в палеоамигдале получены впервые.
Известно, что палеоамигдала имеет прямые связи с рецепторными и проводниковыми центрами обонятельного анализатора, что может быть использовано для интраназального - неинвазивного и быстрого введения лекарственных веществ. Показано, что аппликация WGA, конъюгированного с пероксидазой хрена (WGAЦHR), на обонятельный эпителий приводит к аксональному транспорту этого комплекса в ядерные и экранные структуры МК (Itaya, 1987). Интраназальный путь может быть использован для введения в мозг отдельных генов при помощи вирусных векторов-носителей (Draghia et al., 1995, Williams et al., 2005). Данный подход позволяет осуществлять эффективную генную терапию, приводя к синтезу в отдельных областях мозга белков, недостаток которых вызвал патологию.
Согласно имеющимся в литературе данным, наибольшее значение в механизмах развития наркозависимости имеет дофаминовый рецептор второго типа (DRD2, Barrett et al., 2004, Koeltzow, Vezina, 2005, Edwards et al., 2007). Исследованиями по медицинской генетике выявлена ассоциация полиморфизма различных локусов генов, определяющих дофаминэргическую трансмиссию, с предрасположенностью к наркомании. Одним из интенсивно изучаемых локусов DRD2 является локус TAG 1A. Показано, что аллельная структура этого локуса играет роль в развитии алкоголизма, кокаиновой, героиновой зависимости (Blum et al., 1996, Noble, 1998, 2000, Elovainio et al., 2007, Perez et al., 2007, Munafo et al., 2007) и асоциального поведения, часто приводящего к суициду (Гайсина и др., 2004). Однако, существуют противоречия в том, какой из аллелей А1 или А2 в этом локусе является ведущим в развитии наркозависимости. Для их устранения мы провели экспериментальное исследование механизмов формирования алкогольной зависимости на крысах с модификацией аллельной структуры локуса TAG 1A DRD2.
Изучение поведения до начала принудительной алкоголизации двух групп крыс (с генотипами по указанному локусу DRD2 А1/А1 и А2/А2) в тесте лоткрытое поле, позволяющем объективно оценить с помощью ряда параметров ориентировочно-исследовательскую активность животных в условиях новизны обстановки, обнаружило характерные для каждой группы особенности поведенческих реакций. Крысы с генотипом А1/А1 обладали значимо большей локомоторной активностью (p<0,05), в то время как крысы с генотипом А2/А2 в два раза дольше пребывали в состоянии неподвижности, у них был значимо больше латентный период до первой амбуляции (p<0,05). Эти данные согласуются с имеющимися в литературе сведениями о наличии особенностей поведения, реакций на стрессорные ситуации, в личностных характеристиках людей с генотипами А1/А1 и А2/А2 в локусе TAG 1A DRD2 (Noble, 1998, 2000, Koeltzow, Vezina, 2005).
Регистрация темпов нарастания потребления 6% и 8% спирта крысами в течение первой и второй недели принудительной алкоголизации, а также 8% спирта после установки двух поилок позволила выявить различия, свидетельствующие о прогрессивном увеличении количеств потребляемого этанола крысами с генотипом А1/А1. Этот факт указывает на быстрое формирование у них толерантности к алкоголю.
Повторное тестирование поведения крыс в лоткрытом поле, выполненное на третьей неделе эксперимента после установки двух поилок, позволило обнаружить только у крыс с генотипом А1/А1 значимые изменения со стороны ряда параметров. Повышение горизонтальной активности, свидетельствующее о преобладании возбуждения над торможением, по-видимому, можно объяснить более выраженными у этой группы крыс сдвигами в обмене дофамина. Известно, что острая алкоголизация вызывает сильное ускорение обмена дофамина в мозге животных, предпочитающих этанол, при этом предполагается, что эти животные (отдающие предпочтение алкоголю) имеют генетически детерминированные изменения дофаминэргической системы (Ещенко, 2004). Увеличение числа стоек, совершаемых крысами c генотипом А1/А1 не только по периферии поля, но и при участившихся выходах в его центр на фоне алкоголизации, несомненно, является отражением уменьшения эмоционального напряжения и тревожности. Формирование этого состояния после приема алкоголя связывают с повышением концентрации катехоламинов в нервной ткани, выступающих как фактор внутреннего вознаграждения (Ещенко, 2004). Обнаруженные сдвиги в поведении, отражающие изменения функционального состояния нервной системы, могут быть интерпретированы как показатель развития психической зависимости.
В работе также приведены данные, указывающие на влияние фактора пола на механизмы формирования наркотической зависимости у крыс с генотипом А1/А1 по локусу TAG 1A DRD2.
Быстрое развитие толерантности и психической зависимости у крыс А1/А1 позволяет объяснить результаты медико - генетических исследований, указывающих на ассоциацию аллеля А1 локуса TAG 1A DRD2 с тяжелым течением алкоголизма (Noble, 2000) и наркоманий (Анохина, Москаленко, 2002).
Изучение структурно-количественных характеристик ядер палеоамигдалы у самцов и самок крыс с генотипом А1/А1 и А2А2 по локусу TAG 1A DRD2 позволило выявить сходные половые различия внутри групп экспериментальных животных, а также обнаружить асимметрию МК и структур палеоамигдалы, которая имела место только у крыс с генотипом А1/А1. Сравнение количественных характеристик ядер МК внутри группы самцов и самок крыс с генотипом А2/А2 показало отсутствие значимых различий в их величинах в левом и правом полушариях мозга, т.е. выявило отсутствие асимметрии структур МК.
Известно, что изменение объёмных характеристик МК, выявленное с помощью новейших методов исследования мозга - компьютерной томографии и ядерно-магнитного резонанса - является ранним диагностическим признаком ряда психоневрологических заболеваний. Значительная часть этих работ посвящена болезни Альцгеймера и Паркинсона, шизофрении, височной эпилепсии (Jack et al., 1997, Ка1viainen еt а1., 1997, Hirayasu et al., 1998, Franklin, Druhan, 2000) и лишь в единичных работах проведена регистрация изменений при наркозависимости и у лиц, входящих в группу риска.
Исследования, проведенные с помощью ядерно-магнитного резонанса, показали, что в норме асимметрии в объеме МК не существует (Goncalves-Pereira et al., 2006). Анализ объемных характеристик МК у людей с высоким риском развития алкоголизма (семьи алкоголиков) по сравнению с группой низкого риска показал, что риск проявляется уменьшением объема МК в правом полушарии (Hill et al., 2001, Benegal et al., 2007). Анализ с использованием компьютерной томографии длительного и интенсивного использования канабиоидов (производных конопли - марихуаны, гашиша), а также лиц с кокаиновой зависимостью выявил уменьшение объема МК (Markis et al., 2004, Yucel et al., 2008). Полученные нами результаты согласуются с приведенными данными литературы. У крыс с генотипом А1/А1, показавших в эксперименте с принудительной алкоголизацией ускоренные темпы формирования толерантности и психической зависимости по сравнению с крысами А2/А2, имеет место асимметрия в объемных характеристиках МК.
Исследование участия палеоамигдалы в процессах эпилептогенеза важно не только с точки зрения выяснения этиопатогенеза эпилепсии, но и для понимания фундаментальных закономерностей деятельности нейронных сетей мозга, его структурно-функциональной организации, механизмов интегративной деятельности.
Принимает ли участие МК (и палеоамигдала) в механизмах абсансной генерализованной (неконвульсивной) эпилепсии неизвестно. Мы провели исследование палеоамигдалы у крыс линии WAG/Rij, которые являются признанной моделью абсансной эпилепсии человека (Coenen, van Luijtelaar, 1987), и у крыс линии Вистар с использованием двух подходов. Первый из них позволил определить морфометрические характеристики палеоамигдалы и МК у крыс эпилептической и неэпилептической группы, а второй - оценить функциональное состояние нейронов Med и Mep на основании их ультраструктурных характеристик.
Данные морфометрического исследования показали, что крысы линии WAG/Rij имеют значимо большую удельная площадь МК (p<0,05), но удельная площадь структур палеоамигдалы при этом не различается. Полученные нами результаты подтверждаются данными исследования, проведенными на крысах линии GAERS (Genetic Absence Epilepsy Rats from Strasbourg). Авторы также обнаружили у этих крыс увеличение площади МК по сравнению с неэпилептическими крысами (Bouilleret et al., 2008).
Согласно новой гипотезе абсансная эпилепсия является кортико-таламическим типом эпилепсии (Меерен и др, 2004). В ее формировании принимают участие такие структуры, как кора больших полушарий с эпилептогенной зоной (находящейся во вторичной соматосенсорной коре), вентробазальное и ретикулярное ядро таламуса.
Исследователи, изучавшие изменения в различных отделах мозга у больных с абсансной эпилепсией, не видели патогистологических изменений в структурах мозга и МК (Midzyanovskaya, 2006). Исследование состояние нейронов Med и Mep у крыс линии WAG/Rij по сравнению с крысами линии Вистар, в препаратах окрашенных по Нисслю, показало увеличение числа хроматофильных нейронов у крыс с абсансной эпилепсией при отсутствии каких-либо деструктивных процессов. Результаты электронно-микроскопического исследования выявили, что у крыс с абсансной эпилепсией по сравнению с крысами линии Вистар в дорсомедиальном и заднем медиальном ядрах изменяется соотношение функциональных состояний нейронов. Изменения проявляются уменьшением числа нейронов, характеризующихся состоянием лумеренной активности, повышенной активности и пика активности при значительном увеличении (вдвое) количества нейронов в состоянии снижения активности. Кроме того, обращает на себя внимание, что увеличивается число пикноморфных нейронов, увеличение количества которых свидетельствует о нарушении правила функциональной реверсии.
Исследование ультраструктурных особенностей митохондрий в нейронах крыс с абсансной эпилепсией позволило также отметить явления их полиморфизма и большую вариацию осмиофилии матрикса, которые могут быть расценены как показатель напряженности деятельности этих органоидов, функция которых связана с энергообеспечением нейрона (Сапрунова, 2008). Важную роль при этом играют и биоэлектрические процессы, формируемые с участием митохондрий и цитоплазматических мембран нейронов (Погодаев, 1986, Семьянов, Годухин, 2001), в которых Са2+ рассматривается как внутриклеточный регулятор нейрональной возбудимости в механизмах инициации, поддержания и терминации эпилептиформных пачечных разрядов. Известно, что депо Са2+ в клетке являются митохондрии и эндоплазматическая сеть.
Выявленные различия свидетельствуют о том, что у крыс линии WAG/Rij с абсансной эпилепсией по сравнению с крысами линии Вистар картина функциональных состояний нейронов отражает их меньшую транскрипционную, а, следовательно, и функциональную активность. Возможно, выявленные ультраструктурные особенности популяции нейронов палеоамигдалы у крыс линии WAG/Rij можно трактовать как состояние охранительного торможения. Известно, что при активации мозга возбуждение популяции нейронов часто сопровождается периодом торможения их разрядов. Наблюдается феномен торможение торможения, описанный при регистрации активности отдельных нейронов (Скребицкий, 1980, Кратин, Сотниченко, 1987). Возможно, изменение функционального состояния нейронов в Med и Mep крыс с абсансной эпилепсией отражает активацию NMDA-рецепторов нейронов, что приводит к повышению их возбудимости и усиливает ГАМКергическое торможение (Mody, Otis, 1992).
Актуальность изучения патогенеза смешанной эпилепсии продиктована большими трудностями, которые возникают при разработке лечебных мероприятий при этой форме эпилепсии. Хирургическое лечение при наличии множественных локусов эпиактивности оказывается неэффективным, а фармакологические средства, подавляя активность одних очагов, часто провоцируют манифестацию других.
Адекватную модель для изучения этой формы эпилепсии легко получить аудиогенной стимуляцией крыс линии WAG/Rij, методика которой разработана Кузнецовой (2000). Аудиогенные крысы этой линии на стимуляцию дают большой судорожный припадок, который проявляется клоническими и тоническими судорогами.
Поведенческие особенности и нейромедиаторный обмен в различных структурах мозга крыс со смешанной эпилепсией плодотворно изучаются (Midzyanovskaya, 2006). Тревожность в поведении крыс линии WAG/Rij прямо пропорциональна выраженности SWD (по индексу SWD) и указывает на вовлеченность в патогенез этой формы эпилепсии лимбической системы.
Целью проведенных нами исследований у крыс со смешанной формой эпилепсии (после девяти больших судорожных припадков) являлась оценка состояния палеоамигдалы и стволовых центров мозга при этой форме патологии.
Результаты изучения состояния вестибуло-кохлеарных центров у крыс линии WAG/Rij после аудиогенной стимуляции показало, что в них имеет место развитие сосудистых, дистрофических и некробиотических процессов. В имеющихся в литературе сведениях указывается, что даже единичные судороги приводят к экспрессии c-Fos белка в слуховых ядрах (Hirsch et al., 1997). Анализ реактивных изменений показал, что они были наиболее выраженными в вентральном кохлеарном и латеральном вестибулярном ядрах.
В ретикулярном таламическом ядре после девяти судорожных припадков происходило развитие гидропических изменений и сморщивания нейронов, которые завершались развитием их деструкции и атрофией; наблюдалось формирование очагов глиоза. Афферентация из вестибулярных ядер (при раздражении лабиринта аудиогенной стимуляцией) в условиях повышенной функциональной нагрузки на ретикулярное таламическое ядро у крыс с абсансной эпилепсией оказалась достаточной, чтобы предъявляемые мозгом требования к этому ядру стали чрезмерными и привели к формированию в нем деструктивных процессов.
В палеоамигдале по сравнению с ретикулярным ядром таламуса при гистологическом исследовании препаратов деструктивные процессы были менее выражены. Ультраструктурный анализ у крыс с повторными аудиогенными припадками выявил в составе Cop темные (с признаками транскрипционной активности), светлые (с показателями истощения белок-синтезирующего аппарата) и темные в состоянии некробиоза нейроны.
Темные нейроны с признаками транскрипционной активности обладали осмиофилией цитоплазмы за счет наличия больших скоплений полисом и рибосом, имели светлое богатое эухроматином ядро с очаговыми скоплениями ИХГ и перихроматиновых гранул, показатели интенсивных ядерно-цитоплазматических взаимоотношений, сопровождавшихся явлениями ядерного фагоцитоза. Светлые нейроны имели светлое ядро с наличием отдельных перихроматиновых гранул, очаговыми скоплениями гранулярного материала под внутренней ядерной мембраной, плотное ядрышко, явления отека в кариоплазме. В цитоплазме плотность полисом и канальцев гранулярной ЭС была невысокой, полости мембранных компонентов расширены с формированием вакуолей. Отмечалось просветление матрикса митохондрий и деструкция их крист. Для темных нейронов в состоянии некробиоза было характерно наличие интенсивной осмиофилии клеточного ядра и выраженных скоплений краевого хроматина, резкое расширение просвета мембранных компонентов клетки, скоплений свободных рибосом в цитоплазме и плотность гиалоплазмы.
Проведенные исследования показали, что большие судорожные припадки, приводят к формированию дистрофических и деструктивных изменений, как в структурах ствола мозга, так и в палеоамигдале. Таким образом, эпилептическая система, которая при абсансной эпилепсии сформирована кортико-таламическими нейронными сетями (вторичная соматосенсорная кора, ретикулярное ядро и вентробазальный комплекс ядер таламуса) расширяется за счет структур ствола мозга и лимбической системы, приводя к формированию эпилептического мозга.
В палеоамигдале формирующиеся деструктивные процессы имеют наибольшую выраженность в каудальных частях Cop. Такая же топика развивающихся при височной эпилепсии деструктивных процессов в медиобазальной части МК отмечена у человека и у экспериментальных крыс Pitkanen et al.(1998). При электрическом киндлинге МК показано, что стимуляция Cop быстро приводит к развитию лимбических стадий припадка (I-II стадий по Racine, 1972), а после манифестации первой генерализованной стадии до завершения киндлинга проходит незначительное время (Калимуллина и соавторы, 2002). Это, на наш взгляд, свидетельствует об устойчивости вновь сформированных перестроек, которые происходят как внутриклеточно, так и на уровне клеточных популяций этого ядра, составляя суть эпилептогенного очага. Возможно, в наблюдаемом эффекте (генерализации эпиактивности) играет роль и редковетвистая нейронная система, особо богато представленная в медиальных зонах этого ядра. Также определенную роль играют и связи Cop. Показано, что это ядро имеет связи с элементами гиппокампальной формации - субикулумом и полем CA1 гиппокампа, а также энторинальной корой (Canteras et al., 1992, Kemppainen et al., 2002). Все перечисленные структуры являются экранными центрами мозга, в отношении которых показано, что они участвуют в генерализации эпилептической активности.
Приведенные выше сведения литературы и полученные нами данные при изучении палеоамигдалы у крыс линии WAG/Rij позволяют предполагать, что при абсансной эпилепсии, которая является генерализованной, имеющая место гипервозбудимость неокортекса, несомненно, изменяет функциональное состояние стволовых центров мозга, включая и структуры лимбической системы. Это измененное функциональное состояние можно охарактеризовать как состояние судорожной готовности, которая может проявиться формированием эпилептического очага в той или иной части мозга, приводя к манифестации смешанной конвульсивной эпилепсии.
Разработка положений концепции о субстрате палеоамигдалы имеет значение как для исследования фундаментальных закономерностей деятельности мозга, так и клинической медицины. Так в этиопатогенезе височной эпилепсии, которая является наиболее распространенным психоневрологическим заболеванием, ведущую роль отводят активности медиобазальных отделов височной доли, а в случаях с первичной генерализованной эпилепсией предполагают, что ее генерализация может происходить именно из этой области мозга (Карлов, 1990, Chassagnon et al., 2005). Именно в этой области находится палеоамигдала.
Современная концепция о клеточных механизмах эпилептогенеза предполагает, что формирование эпилептического фокуса может происходить лишь в определенных структурах мозга, нейроны которых обладают способностью к развитию пароксизмальных деполяризационных сдвигов, а нейрональная сеть позволяет синхронизировать пачечную активность этих нейронов (Семьянов, Годухин, 2001). На правомерность высказанного предположения указывают и данные работы Chassagnon et al. (2005), в которой показано быстрое билатеральное вовлечение в эпилептогенез при стимуляции медиальной миндалины многих структур лимбической системы, кортикальных и субкортикальных структур. Авторы акцентируют внимание на роли медиальной амигдалы как региона инициации судорог, и гиппокампа как важной экранной структуры в ее генерализации при лимбической эпилепсии.
Выводы
1.Задний отдел миндалевидного комплекса мозга представляет собой ядерно-палеокортикальный компонент мозга, в состав которого входят ядерные, палеокортикальные и межуточные формации. На его территории представлены редковетвистая и густоветвистая нейронные системы. Наибольшая концентрация длинноаксонных редковетвистых нейронов имеет место в медио-базальных частях отдела, которая занята дорсомедиальным, задним медиальным и задним кортикальным ядрами, совокупность которых составляет субстрат палеоамигдалы.
2.Морфогенетический эффект тестостерон - пропионата, введенного в периоде половой дифференциации мозга, проявляется формированием изменений дендроархитектоники нейронов, основная направленность которых совпадает с выявленными при изучении половых различий. Выраженность формирующихся после неонатальной андрогенизации изменений дендритов превышает половые различия:
а) в длинноаксонных редковетвистых нейронах отмечается не только увеличение ветвистости дендритов, но и возрастание их длины,
б) в длинноаксонных густоветвистых нейронах нарастание длины дендритов приводит к увеличению площади дендритного поля, отражая повышение их интегративных возможностей.
3.Исследование морфогенеза палеоамигдалы в ранний ювенильный период постнатального развития крыс позволило выявить общие закономерности и половые различия, которые проявлялись:
а) наличием дорсо-вентрального вектора дифференциации структур, направленного от дорсомедиального ядра (определяется на 21 день постнатального периода) к заднему медиальному ядру (четко определяется на 28 день постнатального периода) и заднему кортикальному ядру (приобретает характерные для него цитоархитектонические характеристики на 31 день постнатального периода);
б) в половом диморфизме удельной площади дорсомедиального ядра на 28 день постнатального периода, суммарной удельной площади заднего медиального и заднего кортикального ядер на 31 день постнатального периода;
в) в формировании с 24 дня постнатального периода асимметрии мозга у самцов крыс за счет большей удельной площади миндалевидного комплекса в правом полушарии;
г) наличием половых различий в показателях плотности нейронов, глии, величинах глиального индекса на различных сроках раннего ювенильного периода.
4.Нейроны палеоамигдалы на основании цитологических характеристик могут быть классифицированы:
а) светооптическом уровне на кариохромные нейроны, для которых характерны малые и средние размеры, интенсивно окрашенное ядро и узкий ободок базофильной цитоплазмы; светлые нейроны с малыми и средними размерами перикарионов, содержащие светлое, богатым эухроматином ядро и незначительные количества базофильной субстанции; цитохромные нейроны, обладающие светлым крупным ядром, хорошо различимая цитоплазма которых содержит тельца Ниссля;
б) на основании ультрамикроскопических особенностей в составе палеоамигдалы выявлены нейроны с показателями секреторной активности, которые могут быть классифицированы на тёмные нейроны, характерный облик которых предопределяется осмиофилией как ядра, так и цитоплазмы, являющиеся эквивалентом кариохромных нейронов; светлые нейроны, и светлые нейроны с развитой гранулярной эндоплазматической сетью - эквивалент цитохромных нейронов.
5.В нейроэндокринных нейронах палеоамигдалы происходят структурно-функциональные перестройки, которые отражают явление гормон-зависимой функциональной реверсии, предопределяемой колебаниями уровней половых стероидов. При этом на основании ультраструктурных характеристик в палеоамигдале дифференцируются следующие состояния нейронов: лумеренная активность, повышенная активность, пик активности, снижение активности, возврат к исходному состоянию и покой.
6. Анализ содержания и метаболизма моноаминов в палеоамигдале и исследование механизмов структурно-функциональных перестроек в динамике эстрального цикла показали, что:
а) на фоне повышения уровней половых стероидов (стадии проэструса и эструса) в палеоамигдале нарастает интенсивность нуклеиново-кислого обмена, увеличивается содержание норадреналина и на стадии метэструс снижается уровень экспрессии ER;
б) существуют половые различия в интенсивности метаболизма дофамина и серотонина;
в) сенсорный контакт самца с рецептивной самкой приводит к увеличению содержания норадреналина в обонятельных луковицах и палеоамигдале, а также к увеличению содержания дофамина в обонятельных луковицах и снижению его содержания в палеоамигдале.
7.Палеоамигдала - важное звено вовлечения миндалевидного комплекса в патогенетические механизмы наркомании. Это подтверждается:
а) наличием в составе дорсомедиального, заднего медиального и заднего кортикального ядер CART-позитивных нейронов; уровень экспрессии CART Цпептида зависит от уровня половых гормонов;
б) асимметрией в объемных характеристиках миндалевидного комплекса и структур палеоамигдалы у крыс с генотипом А1/А1 по локусу TAG 1A DRD2 , показавших в эксперименте с принудительной алкоголизацией ускоренные темпы формирования толерантности и психической зависимости по сравнению с крысами А2/А2.
8.Палеоамигдала в составе миндалевидного комплекса вовлечена в патогенетические механизмы абсансной генерализованной (неконвульсивной) и смешанной (конвульсивной) эпилепсии, показателем чего являются:
а) увеличение удельной площади миндалевидного комплекса у крыс линии WAG/Rij (модель абсансной эпилепсии) по сравнению с крысами линии Wistar, а также изменение функционального состояния нейронов структур палеоамигдалы у крыс линии WAG/Rij с абсансной эпилепсией, выявленное на основании регистрации их ультраструктурых характеристик;
б) включение палеоамигдалы в состав формирующейся эпилептической системы мозга при смешанной эпилепсии, приводящее к развитию реактивных изменений, перерастающих в дистрофические и деструктивные процессы.
Практические рекомендации:
1.Полученные в работе данные о гормон-зависимой функциональной реверсии нейроэндокринных нейронов палеоамигдалы могут быть использованы для диагностики ранних стадий реактивных изменений в состоянии ее нейронов при оценке результатов экспериментальных исследований, посвященных выяснению участия палеоамигдалы в патогенезе заболеваний.
2.Прямые связи палеоамигдалы с добавочной и основной обонятельными луковицами делают ее доступной мишенью для лекарственных препаратов при лечебных мероприятиях с их интраназальным введением.
3.Асимметрия миндалевидного комплекса мозга экспериментальных крыс с быстро формирующейся наркотической зависимостью указывает на целесообразность регистрации этого феномена при проведении компьютерной томографии и ядерно-магнитного резонанса мозга с целью разработки ранних диагностических критериев для выявления групп риска.
4.Аудиогенная стимуляция крыс линии WAG/Rij, сопровождающаяся развитием судорожных припадков, является удобной моделью для исследования динамики развития патоморфологических изменений в эпилептическом очаге.
Работа выполнена при финансовой поддержке Грантов Министерства образования и науки РФ (PD 02-1.4-93, Е02-6.0-14, программы Развитие научного потенциала высшей школы за 2005 г., № 4022) и Грантов Президента РФ для молодых кандидатов наук (МК-1643.2005.4, МК-865.2008.4).
СПИСОК РАБОТ,
ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
(выделены публикации в журналах, рекомендованных ВАК)
1.Ахмадеев А.В., Нагаева Д.В. Структурно-функциональная организация зон полового диморфизма миндалевидного комплекса мозга в норме и при аллоксановом диабете. //Республиканский молодежный форум Интеллектуальный потенциал Башкортостана - в ХХI век. Уфа, 1996, С.18.
2.Ахмадеев А.В., Нагаева Д.В., Минибаева З.Р. Распределение сукцинатдегидрогеназы в ядерных и экранных структурах амигдалы. //Мат-лы конф. студентов и молодых ученых биофака. Уфа, БашГУ, 1997, С.56.
3.Калимуллина Л.Б., Ахмадеев А.В, Нагаева Д.В. Структурно-функциональная организация зон полового диморфизма миндалевидного комплекса в норме и при аллоксановом диабете. //Мат-лы Ш Международной конференции Колосовские чтения-97. СПб, 1997, С.17.
4.Калимуллина Л.Б., Ахмадеев А.В., Нагаева Д.В. Миндалевидное тело мозга: один или два нейроэндокринных центра? //Мат-лы IV конгресса Международной ассоциации морфологов. Морфология, 1998, т. 113, № 12, С.56.
5.Ахмадеев А.В, Калимуллина Л.Б., Нагаева Д.В., Каюмов Ф.А. Структурно-функциональная организация зон полового диморфизма миндалевидного комплекса мозга в норме и при аллоксановом диабете. //Морфология, 1998,т.113, № 1, С.68-72.
6. Akhmadeev A.V., Minibaeva Z.R., Nagaeva D.V., Kalimullina L.B. Amygdala: new data about sex dimorphism zones. //Fifth World Congress of Neuroscience, Jerusalem, Israel, 1999, P.63.
7.Ахмадеев А.В. Представительство густо- и редковетвистой нейронной систем в заднем отделе миндалевидного тела. //Мат-лы VI конгресса Международной ассоциации морфологов. Морфология, 2002, т.121, C.14.
8.Калимуллина Л.Б., Ахмадеев А.В. Основные закономерности в нейронной организации заднего отдела миндалевидного комплекса мозга. //Вестник Башгосуниверситета, 2002, №2, C.62-66.
9.Калимуллина Л.Б., Ахмадеев А.В. Палеоамигдала в системе регуляции висцеральных процессов. //Мат-лы Всеросс. конф. с междун. участием Достижения биологической функциологии и их место в практике образования, Самара, 2003, С.106-107.
10.Калимуллина Л.Б, Ахмадеев А.В. Влияние андрогенов на рост и развитие дендритов нейронов заднего кортикального ядра миндалевидного комплекса мозга крысы. //Мат-лы Всеросс. конф. с междунар. участием УНейроэндокринология-2003Ф. СПб, 2003, C.9-10.
11.Калимуллина Л.Б., Ахмадеев А.В., Минибаева З.Р., Муталова Л.Р. Структурная организация миндалевидного комплекса мозга крысы. //Росс. физиол. ж. им. И.М.Сеченова, 2003, т.89, №1, C.8-14.
12.Калимуллина Л.Б., Ахмадеев А.В. Структурная и количественная характеристика дендритов нейронов заднего отдела миндалевидного тела мозга крысы. //Морфология, 2003, т.123, №3, C.36-39.
13.Ахмадеев А.В. Интенсивность включения 3Н-уридина в нейроны миндалевидного комплекса мозга в динамике эстрального цикла. //В сб. научных работ Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии. Томск, 2004, № 1-3, С.100.
14.Ахмадеев А.В. Цитохимические характеристики нейронов заднего отдела миндалевидного тела мозга. //Морфология, 2004, т.125, № 3, C.98-99
15.Калимуллина Л.Б., Ахмадеев А.В., Гуркова Я.О., Минибаева З.Р., Шарипова Л.А. Ростро-каудальный градиент в структурно-функциональной организации миндалевидного тела мозга. //Морфология, 2004, т.125, № 1, C.7-11.
16.Калимуллина Л.Б., Ахмадеев А.В. Темные и светлые клетки миндалевидного комплекса в динамике эстрального цикла. //Цитология, 2004, т. 46, № 5, C.45-49.
17.Kalimullina L.B., Akhmadeev A.V., Z.Minibaeva, L.Mutalova. Structural Organization of the Amygdaloid Complex of the rat Brain. //Neuroscience and Physiology Behavior, 2004, V.34, N 6, P. 551-555.
18.Kalimullina L.B., Akhmadeev A.V Structural and Quantitative Characteristics of the Dendrites of Neurons in the Posterior Zone of the Amygdaloid Body in the Rat Brain. //Neuroscience and Physiology Behavior, 2004, V.34, № 7, P.683-686.
19.Калимуллина Л.Б., Ахмадеев А.В. Морфофункциональная классификация нейроэндокринных нейронов дорсомедиального ядра миндалевидного тела мозга. //Мат-лы VII Межд.конгресса ассоциации морфологов. Морфология, 2004, т.126, №4, C.11.
20.Ахмадеев А.В. Авторадиографический анализ представительства нуклеиновых кислот в нейронах различных по филогенетическому возрасту структур миндалевидного комплекса. //Мат-лы Всеросс. конф. Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии. Гистогенез и регенерация тканей, СПб, ВМА, 2004, C.19-20.
21.Ахмадеев А. В. Что такое древняя амигдала? //Мат-лы Х1Х съезда физиологического общества им. И.П.Павлова, Екатеринбург, 2004, C.30-31.
22.Калимуллина Л.Б., Ахмадеев А.В. Дендроархитектоника нейронов заднего кортикального ядра миндалевидного тела мозга крысы под влиянием фактора пола и неонатальной андрогенизации. //Морфология, 2004, т.125, N.2, C.22-25.
23.Ахмадеев А.В. Структурная организация и показатели нуклеиново-кислого обмена в нейронах заднего отдела миндалевидного комплекса мозга в различные фазы эстрального цикла. //Фундаментальные исследования, 2004, №4, C.24-28.
24.Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б. Древняя амигдала: цитоархитектоника, организация и цитологические характеристики нейронов. //Морфология, 2004, т.126, №5, C.15-19.
25.Калимуллина Л.Б., Ахмадеев А.В. Сравнительный анализ формирования в онтогенезе древних и новых структур амигдалы. //Мат-лы Всеросс.съезда морфологов. Морфологические ведомости, Москва-Берлин, 2004, С.46.
26.Ахмадеев А.В. Включение 3Н-уридина в нейроны заднего кортикального ядра и палеокортекса миндалевидного комплекса в эстральном цикле. //Мат-лы Всеросс. съезда морфологов. Морфологические ведомости, Москва-Берлин, 2004, С.8.
27.Ахмадеев А.В. Цитоархитектоника древней амигдалы. //Мат-лы Седьмой Всеросс. конф. молодых исследователей. СПБ, 2004, С.15.
28.Ахмадеев А.В. Короткодендритные нейроны архиамигдалы - элементы нейронных сетей? //Мат-лы Всеросс. конф. молодых исследователей Физиология и медицина, СПб, 2005. Вестник молодых ученых, 2005, C. 10.
29.Нагаева Д.В., Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б. Характеристика мелких нейронов ретикулярного ядра таламуса крыс линии WAG/Rij . //Морфология, 2005, т. 127, № 1, C.55-57.
30.Нагаева Д.В., Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б. Характеристика межклеточных контактов в ретикулярном ядре таламуса крыс линии WAG/Rij. //Росс. Физиол. журнал, 2005, т.91, № 6, C.707-709.
31.Нагаева Д.В., Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б. Характеристика ультраструктуры нейронов ретикулярного ядра таламуса крыс линии WAG/Rij. //Цитология, 2005, т.47, № 6, C.487-493.
32.Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б. Нейросекреторные клетки миндалевидного комплекса в динамике эстрального цикла. //Бюлл. эксп. биол. и мед,. 2005, № 2, C. 231-233.
33.Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б. Неонатальная андрогенизация самок крыс в периоде половой дифференциации мозга изменяет нейронную организацию миндалевидного комплекса мозга. //Онтогенез, 2005, т.36, №1, C.64-67.
34.Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б. Структурно-функциональная характеристика нейроэндокринных нейронов миндалевидного комплекса на стадии диэструс. //Успехи современного естествознания, 2005, №9, C.17- 19.
35.Akhmadeev A.V., Kalimullina L.B. Dendroarchitectonics of neurons in the posterior cortical nucleus of the amygdaloid body of the rat brain as influenced by gender and neonatal androgenization. //Neuroscience and Behavioral Physiology, 2005, V.35, N.2, P.123-124.
36.Akhmadeev A.V., Kalimullina L.B. The Paleoamygdala: Cytoarchitectonics, Organization, and the Cytological Characteristics of Its Neurons// Neuroscience and Behavioral Physiology, 2005.V. 35, N. 8, P.799-804.
37.Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б. Электронно-микроскопическая характеристика нейроэндокринных нейронов миндалевидного комплекса мозга у самцов и самок крыс на различных стадиях эстрального цикла. //Морфология, 2006, т.130, №6, C. 25-29.
38.Nagaeva D.V., Akhmadeev A.V. Strucrural organization, neurochemical characteristics and connections of the reticular nucleus of the thalamus// Neuroscience and Behavioral Physiology, 2006, V.36, N 9, P. 987-995.
39.Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б. Показатели модулирующего влияния половых стероидов на ультраструктурные характеристики нейронов дорсомедиального ядра миндалевидного комплекса мозга. //Цитология, 2006, т.48, № 12, C.971-979.
40.Ахмадеев А.В. Миндалевидный комплекс мозга: показатели транскрипционной активности в нейроэндокринных нейронах дорсомедиального ядра у самцов крыс. //Мат-лы научного совещания Актуальные проблемы учения о тканях, СПб, 2006, C.10-12.
41.Ахмадеев А.В. Ультраструктура нейроэндокринных нейронов миндалевидного тела самок крыс. //Мат-лы V Международной конференции по функциональной нейроморфологии Колосовские чтения - 2006. Морфология, 2006, т.129, № 2, C.16.
42.Ахмадеев А.В. Половые стероиды и пластичность нейроэндокринных нейронов миндалевидного комплекса мозга. //Мат-лы 2-го Международного междисциплинарного конгресса Нейронаука для медицины и психологии. Судак, Крым, Украина, 2006, C.51-52.
43.Akhmadeev A.V. Sexual steroids and plasticity of neuroendocrine neurons of Amygdala. //2nd International Congress УNeuroscience for Medicine and PsychologyФ, Sudak, Crimea, Ukraine, 2006. Abstract. P.52-53.
44.Ахмадеев А.В. Влияние половых стероидов на пластичность нейроэндокринных нейронов миндалевидного комплекса мозга. //Мат-лы Всеросс. Медико-биол. конф. молодых исследователей Человек и его здоровье. СПб, 2006, C.24-25.
45.Ахмадеев А.В. Особенности количественных характеристик дендритов нейронов миндалевидного тела, предопределенные фактором пола. //Мат-лы VIII Конгресса Международной ассоциации морфологов. Морфология, 2006, т.129, № 4, C.11-12.
46.Ахмадеев А.В. Влияние фактора пола и неонатальной андрогенизации на дендроархитектонику нейронов дорсомедиального ядра миндалевидного тела мозга. //Морфология, 2006.т. 129, №3, C. 30-33.
47.Ахмадеев А.В. Влияние половых стероидов на пластичность нейроэндокринных нейронов миндалевидного комплекса мозга. //Мат-лы Всеросс. Медико-биол. конф. молодых исследователей Человек и его здоровье. СПб, 2006, С.24-25.
48.Нагаева Д.В., Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б. Характеристика реактивных изменений нейронов улитковых и вестибулярных ядер крыс линии WAG/Rij после аудиогенной стимуляции. //Мат-лы Всеросс. конф. с международным участием Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга - 2006, Москва, РАМН, 2006, с.196-198.
49.Ахмадеев А.В. Половые стероиды и пластичность нейроэндокринных нейронов дорсомедиального ядра миндалевидного комплекса мозга. //Мат-лы Международная конф. Ломоносов 2007, М. МГУ, 2007, C.142.
50.Ахмадеев А.В. Заднее медиальное ядро миндалевидного комплекса мозга: половые различия дендроархитектоники ретикулярных нейронов. //Мат-лы Всеросс. конф. Человек и его здоровье, 2007, СПб, C.16-17.
51.Ахмадеев А.В. Функциональная гормон-зависимая реверсия в нейронах миндалевидного комплекса мозга. //Мат-лы ХХ съезда Физиологического общества им. И.П.Павлова. Москва, 2007, C.131.
52.Akhmadeev A.V. Effects of gender and neonatal androgenization on the dendroarchitectonics of neurons in the dorsomedial nucleus of the amygdaloid body of the brain. //Neuroscience and Behavioral Physiology, 2007, V.37, N.5, P. 531-534.
53.Ахмадеев А.В., Цитоархитектоника, нейронная организация и влияние фактора пола на дендроархитектонику нейронов заднего медиального ядра миндалевидного тела мозга крыс. //Морфология, 2007, т.132, , №6, C.17-21.
54.Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б. Структурно-функциональная характеристика дорсомедиального ядра миндалевидного комплекса мозга у самцов крыс. //Бюлл. эксп. биол. и мед., 2007, т.144, №4, C.467-469.
55.Ахмадеев А.В. Половые различия в морфогенезе дорсомедиального ядра миндалевидного тела мозга в раннем ювенильном периоде развития крысы. //Мат-лы конф., посвященной 100-летию со дня рождения Д.А.Жданова. М., 2008. Морфология, 2008, т.133, № 4, С.56.
56.Ахмадеев А.В. Влияние фактора пола на структурно-количественные характеристики миндалевидного комплекса крыс с модификацией DRD2. //Мат-лы Всеросс. медико-биологической конф. молодых исследователей Человек и его здоровье СПб. 2008, с.18-19.
57.Akhmadeev A.V. Cytoarchitectonics, Neuron Organization, and the Effects of Gender on the Dendroarchitectonics of Neurons in the Posterior Medial Nucleus of the Amygdaloid Body in Rats. //Neuroscience and Behavioral Physiology, 2008, V.38, N.9, P.901-905.
58.Ахмадеев А.В Организующее влияние андрогена на нейроны заднего медиального ядра миндалевидного комплекса мозга крысы. Онтогенез, 2008, т.39, № 5, C.374-378.
59.Akhmadeev A.V. Organizing Effect of Androgenization on Neurons in Posterior Medial Nucleus of Amygdala in Rats. //Russian J. of Developmental Biology, 2008, Vol.38, N.5, P.303-306.
60.Ахмадеев А.В. Экспрессия CART-пептида в миндалевидном комплексе мозга. //Мат-лы Четвертого Международного Междисциплинарного Конгресса Нейронаука для медицины и психологии. Судак, Крым, Украина, 2008, C.56-57.
61.Akhmadeev A.V. CART-peptide expression in Amygdala. //Fourth International Interdisciolinary Congress УNeuroscience for Medicine and PsychologyФ, 2008, Sudak, Crimea, Ukraine, P.57.
62.Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б. Морфогенез палеоамигдалы крысы в раннем ювенильном периоде. //Морфология, 2008, т.134, № 6, С.23-27.
63.Akhmadeev A.V., Kalimullina L.B. Morphogenesis of the Dorsomedial Nucleus of the Amygdaloid Complex in Early Juvenile Period in Rats. //Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2008, Vol. 146, N.3, P.372-375.
64.Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б. Морфогенез дорсомедиального ядра миндалевидного комплекса в ранний ювенильный период крысы. //Бюлл. эксп. биол. и мед., 2008, т.146, № 9, С. 347-349.
65.Ахмадеев А.В. Молекулярно-генетические модели для изучения механизмов наркотической зависимости. //Фундаментальные исследования, 2008, № 8, C.30-34.
66.Ахмадеев А.В. Разработка новых перспективных методов лечения наркотической зависимости на основе исследования фундаментальных закономерностей структурно-функциональной организации мозга. //Всеросс. заочная конф., 15-20 мая 2008 г. РАЕ. Современные наукоемкие технологии, 2008, № 6, C.41.
67.Ахмадеев А.В. Палеоамигдала в патогенезе наркомании. //Мат-лы Международной научной конференции Европейская интеграция высшего образования. Черногория, 11-18 июля 2008 года. Фундаментальные исследования, 2008, № 7, C. 79.
68.Ахмадеев А.В. Экспрессия CART-пептида как маркер структур мозга, вовлеченных в патогенез наркомании. //Мат-лы 5-ой Всероссийской научно-практической конференции Медико-биологические и психолого-педагогические аспекты адаптации и социализации человека. Волгоград, 2008, C.353.
69.Ахмадеев А.В. Морфогенез структур палеоамигдалы в раннем ювенильном периоде онтогенеза крысы. //Мат-лы докладов Конгресса Международной Ассоциации Морфологов. Морфология, 2008, т.133, № 2, C.13.
70.Ахмадеев А.В. Миндалевидное тело мозга: локализация CART-позитивных нейронов и зависимость их иммунореактивности от уровней половых стероидов. //Морфология, 2009, т.134, № 2, C.12-16.
71.Ахмадеев А.В. Исследование механизмов развития наркозависимости на молекулярно-генетических моделях. //Материалы Международного молодежного форума Ломоносов-2009, секция Фундаментальная медицина, М., МГУ, 2009, с.2.
72.Ахмадеев А.В. Асимметрия миндалевидного комплекса и риск развития наркомании. //Современные наукоемкие технологии, 2009, № 2, 20-24.
73.Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б Экспрессия CART-пептида в нейронах палеоамигдалы и ее зависимость от уровней половых стероидов. //Бюлл. эксп. биол. и мед., 2009, т.147, № 4, С. 374-378.
Учебные пособия
Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б. Нейрогистология миндалевидного комплекса мозга для начинающих. Уфа, БашГУ, 2005. Гриф УМО МГУ.
Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б. Нейроморфология. Уфа, БашГУ, 2006.
Патенты, рационализаторские предложения.
Получена приоритетная справка о регистрации заявки патент РФ на изобретение Способ приготовления переживающих срезов пириформной доли мозга № 2008149137 от 10 января 2008 года. Авторы: Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б.
Удостоверение на рационализаторское предложение № 1 от 16 октября 2007 года Устройство для измерения линейных размеров ультраструктур при электронной микроскопии Авторы: Ахмадеев А.В., Нагаева Д.В., Калимуллина Л.Б.
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
ДФ - дофамин
ИХГ - интерхроматиновые гранулы
КГ - комплекс Гольджи
КП - конечная полоска (stria terminalis)
МК - миндалевидный комплекс мозга
НА - норадреналин
ПДМ - половая дифференциация мозга
ПП - постнатальный период
ПС - половые стероиды
ПХГ - перихроматиновые гранулы
С - серотонин
ЭС - эндоплазматическая сеть
Э - - эстральный цикл
Bd - число свободных концов у всех дендритов
Bdc - число свободных концов на самом длинном дендрите
Bdr - число свободных концов на самом разветвленном дендрите
C - длина самого длинного дендрита
Cop - заднее кортикальное ядро МК
Cr - длина самого разветвленного дендрита
ER - эстрогенный рецептор типа (альфа)
ER - эстрогенный рецептор типа (бета)
Gc - число точек ветвления на самом длинном дендрите
Gd - число всех точек ветвления дендритов
Ld - общая длина дендритов
Ldt- общая длина концевых веточек дендритов
Med - дорсомедиальное ядро МК
Mep - заднее медиальное ядро МК
Sda - площадь дендритного поля.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии