Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине  

На правах  рукописи

Федоровская Анастасия Владимировна

Совершенствование методов дифференциальной диагностики эритродермической формы Т-клеточной лимфомы кожи

14.01.10-кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации  на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва 2012

Работа выполнена в государственном бюджетном  учреждении Здравоохранения Московской области Московском областном научно-исследовательском клиническом институте им. М.Ф. Владимирского

Научный руководитель: 

доктор медицинских наук, профессор  Молочков Антон Владимирович 

 

Научный консультант:

доктор биологических наук Ковригина Алла Михайловна

Официальные оппоненты: 

доктор медицинских наук, профессор

заведующий кафедрой клинической микологии

и дерматовенерологии ФПК МР РУДН

Министерства образования

Российской Федерации Баткаев Эдгем Абдуллахатович

 

доктор медицинских наук, профессор,

заведующая лабораторией физико-химических

и генетических основ кафедры

дерматологии Центра теоретических проблем

физико-химической фармакологии РАН  Корсунская Ирина Марковна

 

Ведущая организация: ГБОУ ВПО л Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится л17 декабря 2012 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.10 на базе ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан л15 ноября  2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессора  И.В.Хамаганова.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Т-клеточные лимфомы кожи (ТКЛК)- группа неопластических заболеваний, причиной развития которых является злокачественная моноклональная пролиферация лимфоидных клеток кожи. ТКЛК относятся к тяжелым онкологическим заболеваниям кожи, частота которых неуклонно возрастает (Галил-Оглы Г.А.,2005; Kaplan E.H., 1993; Mosmann T. R., 1986).

Диагностика Т-клеточных лимфом кожи нередко вызывает трудности, так как при использовании клинических и рутинных гистологических методов на ранних стадиях ТКЛК диагноз удается верифицировать лишь у 50% пациентов(Connors J.,2002). Особенно сложной является диагностика эритродермических форм Т-клеточных лимфом кожи (ТКЛК), при которых ранние клинические и морфологические проявления весьма сходны по клинической и гистологической картине со вторичными эритродермиями, осложняющими течение хронически протекающих доброкачественных дерматозов (Родионов А.Н.,2000; Friedmann D., 1995; Heald P.,1994).

В целом, заболеваемость эритродермией оценивается на уровне 1Ц2 случая на 100 тыс. населения. И лишь в одном наблюдении из Индии речь идет об уровне заболеваемости  в 35 на 100 тыс. населения. На тяжесть течения эритродермий  указывают данные V.Sigurdsson и соавт. (1996 г.), в соответствии с которыми  смертность при них достигает 43%, причем лишь в 18% смерть бывает непосредственно связана с эритродермией, а в  74% случаев она вызвана другими причинами, не связанными с эритродермией(Sehgal V.,1986).

Диагностика эритродермических состояний нередко сложна ввиду превалирования воспалительного компонента над специфическими изменениями, характерными для заболевания, как в клинической, так и в морфологической картине. Поэтому, в  30% случаев заболевание, вызвавшее развитие эритродермии, установить не удается даже при проведении гистологического исследования биоптата пораженной кожи (Казанцева И.А.,2000; Лезвинская Е.М.,1997).

  На сегодняшний день перспективным направлением совершенствования диагностики эритродермической формы ТКЛК представляется применение методов, позволяющих регистрировать клональную перестройку Т-клеточного рецептора лимфоидных клеток. Наиболее эффективным методом такой регистрации является молекулярно-генетический метод исследования, позволяющий определить моноклональную пролиферацию лимфоидных клеток очагов поражения на ранних сроках заболевания (Белоусова И.Э., 2006; Kaplan E.H., 1993).

При выявлении моноклонального типа пролиферации лимфоидных клеток высока вероятность злокачественного характера заболевания. Однако, в 5% случаях моноклональная перестройка лимфоцитов может выявляться при целом ряде доброкачественных дерматозов, таких как псориаз, экзема, атопический дерматит, инфекционных воспалительных процессах (инфекционный мононуклеоз), системных заболеваниях соединительной ткани (системная склеродермия, системная красная волчанка и т.д.), что определяет необходимость использования молекулярно-генетического метода в комплексе с традиционно применяющимися патоморфологическим и иммуногистохимическим методами исследований (Dippel E., 2002). При этом верифицированным считается диагноз, установленный на основании результатов гистологического исследования (Белоусова И.Э.,2007; Aray E.,1988;Pimpinelli N., 2005;Smith J.L.,1980).

Цель исследования

Повышение эффективности дифференциальной диагностики эритродермической формы Т-клеточной лимфомы кожи и эритродермий, развившихся на фоне псориаза, красного плоского лишая, атопического дерматита, болезни Девержи, на основе использования клинического, гистологического, иммуногистохимического и молекулярно-генетического методов исследования.

Задачи исследования

1.Оценить прогностическую ценность традиционно применяемых методов исследования у пациентов с эритродермическими поражениями кожи различной этиологии.

2.Разработать схему комплексной диагностики эритродермической формы ТКЛК.

3.Определить значение выявления перестройки генов Т-клеточного рецептора по -цепи в ранней дифференциальной диагностике эритродермической формы ТКЛК.

4. Изучить состав опухолевого пролиферата при помощи иммунофенотипического исследования у пациентов с эритродермической формой Т-клеточной лимфомы кожи в регионе Московской области.

Научная новизна

1.Впервые разработана схема комплексной диагностики эритродермических состояний, обусловленных злокачественными лимфопролиферативными процессами и широким спектром ненеопластических дерматозов на основе применения молекулярно-генетического метода исследования.

2.Разработана  методика формирования  групп риска пациентов по развитию эритродермической формы Т-клеточной лимфомы кожи  на основе детекции клональной перестройки Т-клеточного рецептора.

3.Впервые оценен иммунофенотипический состав  опухолевого  пролиферата у пациентов - жителей региона Московской области с установленным  диагнозом эритродермической формы Т-клеточной лимфомы кожи.

Научно-практическая значимость

1.Разработанная схема дифференциальной диагностики позволит увеличить частоту выявления ТКЛК при эритродермических поражениях кожи на ранних этапах заболевания.

2.Разработанная схема дифференциальной диагностики позволит сформировать группы риска больных по развитию Т-клеточных лимфом кожи с эритродермическими поражениями на основании данных молекулярно-генетического метода исследования.

3.Применяемые методы исследования могут проводиться на амбулаторном этапе диагностики, что позволяет сократить время пребывания больного в стационаре.

Положения, выносимые на защиту

1.Применение  традиционных  методов исследования в диффренциальной  диагностике эритродермической формы Т-клеточной лимфомы кожи и хронических доброкачественных дерматозов, осложненных вторичной эритродермией не позволяет в 100% случаев установить диагноз.

2.Включение  в комплекс диагностических  мероприятий  молекулярно-генетического и иммунофенотипического методов исследования значительно  повысит  точность дифференциальной  диагностики эритродермических состояний  при Т-клеточной лимфоме кожи.

3.Применение  молекулярно-генетического метода исследования позволит сформировать группы риска  пациентов  по развитию эритродермической формы Т-клеточной лимфомы кожи.

4.При иммунофенотипическом исследовании опухолевого пролиферата у пациентов с установленными диагнозами эритродермической формы Т-клеточной лимфомы кожи основное количество составляют  случаи с Т-хелперным характером пролиферации опухоли.

Внедрение в практику результатов исследования

  Разработанная схема дифференциальной диагностики эритродермических форм Т-клеточных лимфом кожи внедрена в практику в отделение дерматовенерологии и дерматоонкологии ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского, московского областного клинического кожно-венерологического диспансера.

Апробация диссертации

Основные материалы диссертации представлены и обсуждены на:

-заседании Московского городского общества дерматовенерологов ( Москва 2011 г).

- заседании Первого Московского форума Дерматовенерология  и косметология: синтез науки и практики (Москва 2011г).

- совместном заседании отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии ГБУЗ МО МОНИКИ им.М.Ф. Владимирского, кафедры дерматовенерологии и дерматоонкологии  ФУВ ГУ МОНИКИ им.М.Ф. Владимирского, кафедры кожных и венерических болезней Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (Москва, 13 июня 2012г).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ, из них 6- в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданийЕ, рекомендуемых ВАК Российской Федерации.

ичный вклад автора

Настоящее исследование выполнено на основании анализа результатов обследования 86 больных с эритродермической формой Т-клеточной лимфомы кожи и хроническими доброкачественными дерматозами, протекающими с развитием эритродермии. Все научные положения работы, выводы и рекомендации обоснованы и вытекают из анализа клинических и объективных данных. Все результаты, используемые в работе, получены автором  лично.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на  131  странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов. Работа иллюстрирована  27 таблицами, 7  рисунками и 13 фотографиями. Указатель литературы включает  32 отечественных и 141 зарубежных источника.

Краткое содержание работы

Настоящее исследование проводилось в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского, патоморфологическом отделении МОНИКИ, лаборатории молекулярной гематологии Гематологического научного центра РАМН, иммунологической лаборатории РОН - им. Н.Н.Блохина за период с 2009 по 2011гг.

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на основании обследования 86 больных с диагнозом Т-клеточная лимфома кожи, протекающая с развитием эритродермии и хронических доброкачественных дерматозов, осложненных вторичной эритродермией. Среди 86 больных мужчин было 54(62,8%), женщин 32 (37,2%). Соотношение мужчин и женщин - 1,7:1. Возраст пациентов варьировал от 19 до 82 лет, средний возраст 56,7 лет. При появлении первых признаков заболевания к дерматологу обратились 73 (85%) больных, остальные 13 (15%) - в сроки от 1 до 6 месяцев от начала болезни. У 34 больных ранее были диагностированы хронические доброкачественные дерматозы (21-псориаз,6-экзема, 4-атопический дерматит, 2-болезнь Девержи,1-красный плоский лишай), у 6-ТКЛК, грибовидный микоз. У 62 (72%) пациентов состояние эритродермии развивалось постепенно, у 24 (28%)-имело место внезапное начало заболевания. 

При поступлении в отделение всем больным было проведено комплексное обследование, включавшее исследование периферической крови, общий анализ мочи, биохимические анализы плазмы крови, ЭКГ. При наличии показаний проводилась рентгеноскопия органов грудной клетки, ультразвуковое исследование органов брюшной полости, консультации смежных специалистов. 

Для постановки диагноза в каждом случае оценивали данные анамнеза, клинической картины, результата морфологического исследования, а также иммуногистохимического исследования биоптата и молекулярно-генетического метода (ПЦР) для определения Т-клеточной клональности биоптатов кожи очагов поражения.

Гистологическое исследование биоптатов кожи из очагов поражения.

Для осуществления патоморфологического исследования кожи проводилась биопсия пораженного участка ткани с области плеча и живота пациента под местной анестезией лидокаином 2% и обработка ее стандартными методами. Биоптат пораженной кожи фиксировали в 10% растворе формалина, забуференном по Лилли при рН - 7,4, затем заливали в парафин по обычной методике, серийные срезы толщиной 3-5 мкм депарафинировали по стандартной схеме, затем окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологические препараты просматривались в светооптическом микроскопе при увеличении 10,40, где оценивались общая структура ткани и морфологические изменения. Фиксация материала проводилась в 10% растворе нейтрального забуференного формалина (pH 7,2-7,4) и длилась не более суток. Более продолжительная фиксация могла приводить к ухудшению качества препаратов, снижению антигенной сохранности при последующем иммуногистохимическом исследовании. Каждый биоптат пораженной кожи заливался в отдельный парафиновый блок с использованием легкоплавких парафинов (с температурой плавления 56-58 С). В дальнейшем изготавливались гистологические срезы (не менее 4-6 с каждого блока), которые окрашивались гематоксилином и эозином, а для проведения иммуногистохимического исследования срезы наносились на специальные предметные стекла, например, покрытые полилизином.

Иммуногистохимический (ИГХ) метод исследования.

1. Нанесенные на предметные стекла со специальным адгезивным покрытием парафиновые срезы нагревали в течение 30 секунд до температуры, несколько превышающей температуру плавления парафина, выдерживали в термостате при температуре 37 С в течение 24 часов, затем погружали в ксилол для растворения парафина, после чего проводили по батарее 100, 95 и 80% спиртов. После депарафинизации срезы переносили в дистиллированную воду, затем - в ТРИС- или фосфатный буфер ( pH - 7,4-7,6).

2. Для подавления эндогенной пероксидазной активности клеток срезы в течение 20 минут обрабатывали 3% раствором перекиси водорода в метаноле, после чего стекла отмывали в ТРИС- или фосфатном буфере. Далее проводили демелирование антигенов при нагревании в водяной бане (температура 98С) (рН - 6,0 или рН - 9,0) 2 раза при использовании F1 или обработке протеолитическими ферментами в течение 30 мин при температуре 37 С, после чего стекла также промывали в ТРИС-буфере.

3. Затем на срезы наносили первичные антитела, с которыми они инкубировались 30 минут  при 37С, после чего их тщательно промывали в нескольких порциях буфера. Для визуализации использовали высокочувствительную полимерную систему BioGenex

4. Далее срезы докрашивали гематоксилином Майера и дифференцировали в щелочном растворе до получения голубого окрашивания.

5. По стандартной методике стекла обезвоживали и заключали в бальзам для последующего исследования.

6. Результаты иммуногистохимического исследования оценивали и ставили окончательный диагноз.

Молекулярно-генетический метод для определения перестройки Т-клеточного рецептора (ТCR).

Материально-техническое обеспечение требует оснащения стандартным оборудованием для лаборатории, занимающейся ПЦР-диагностикой, для метода капиллярного электорфореза необходимо наличие секвенатора ABI PRISM 3130.

Описание метода ПЦР для определения клональности Т-лимфоцитов по реарранжировке -цепи Т-клеточного рецептора (ТCR).

1.Выделение ДНК из биоптата пораженной кожи

2.Этап ПЦР.

3. Фрагментный анализ на секвенаторе ABI PRISM 3130.

Взятие образцов проводилось из наиболее инфильтрированной области пораженного участка кожи живота и плеча под местной анестезией лидокаином 2%. Биопсийный материал размером 22 мм помещался в чистую пробирку с физиологическим раствором. До проведения анализа материал находился при температуре 0-5С не более 3-х часов. Из биопсийного материала ДНК выделяли методом лизиса в аммиаке и высаливания белков в уксусной кислоте. Фрагмент ткани 2х 2х2мм помещали в пробирку с закручивающейся крышкой, добавляли 900 мкл NH4OH 25% и 100 мкл 10% SDS. Инкубировали при 55-57С в течение 1-2 суток при постоянном помешивании. Жидкую часть (900 мкл) переносили в новую пробирку. К жидкой части добавляли 300 мкл 17% уксусной кислоты, перемешивали 10 минут, центрифугировали 10 минут при 13000 g. К супернатанту добавляли 3 объема этанола. Центрифугировали при 13000 g 10 минут. Осадок ДНК дважды промывали 70% этиловым спиртом, высушивали на воздухе, растворяли в 50 мкл воды. При выделении из парафинового блока ткань предварительно депарафинизировали. Для этого 3 среза по 10 микрон помещали в пробирку, нагревали 10 мин при 95С в буфере STEx1. Центрифугировали 30 секунд при 5000g, оставляли на льду на 10 минут. Удаляли скальпелем парафиновый диск. Кусочки депарафинизированной ткани переносили в чистую пробирку. Определение Т-клеточной клональности проводили на основе анализа перестроек вариабельного региона -цепи TCR. Для мультиплексной ПЦР определения клональности по реарранжировкам генов -цепи ТCR применяли два набора праймеров:

1) смесь праймеров T, последовательности которых опубликованы в протоколе Biomed-2

2) смесь праймеров T, последовательности которых опубликованы в работе Greiner

Оба набора праймеров представляют собой смесь из четырех прямых праймеров к четырем семействам V регионов -цепи TCR и трех меченных флуоресцентной краской (FAM) обратных праймеров к J регионам генов -цепи TCR.

Нуклеотидные последовательности праймеров для анализа реарранжировок гамма цепи Т-клеточного рецептора.

Таблица 1

Название	Прямые праймеры	Обратные праймеры
TCR	V1f 5'-ggaaggccccacagcrtctt-3' (R = A or G) V9 5'-CGGCACTGTCAGAAAGGAATC-3' V10 5'-AGCATGGGTAAGACAAGCAA-3' V11 5'-CTTCCACTTCCACTTTGAAA-3'	J1.3/2.3 5'-FAM-GTGTTGTTCCACTGCCAAAGAG-3' J1.1/2.1 5'-FAM-TTACCAGGCGAAGTTACTATGAGC-3'
TCR	V 2 5'-TACATCCACTGGTACCTACACCAG-3' V 9 5'GAAAGGAATCTGGCATTCCGTCAG-3' V 10 5'-AAGCAACAAAGTGGAGGCAAGAAAG-3' V 11 5'-AGTAAAAATGCTCACACTTCCACTTC-3'	J1/2 5'-FAM-TACCTGTGACAACAAGTGTTGTTC-3' Jp 5'-FAM-AAGCTTTGTTCCGGGACCAAATAC-3' Jp1/2 5'-FAM-GAAGTTACTATGAGCYTAGTCCCTT-3'

ПЦР проводили на автоматическом термоциклере (Perkin Elmer Cetus). Реакционная смесь в конечном объеме 20 мкл включала: 200 нг ДНК, 10 мкл 2х смеси для ПЦР (PCR Master Mix Promega), 5 пмоль каждого праймера.

Условия ПЦР: для генов -цепи ТCR - предварительная денатурация при 95С (5 мин), 35 циклов ПЦР - 92С (35 сек), 60С (35 сек), 72С (35 сек), окончательная пролонгация - 72С (10 мин). Размеры ПЦР продуктов для праймеров T составляли - 80 - 255 п.н., T - 90 - 280 п.н. Результаты реакции выявляли в 2% агарозном геле, окрашенным бромистым этидием. При успешной ПЦР проводили очистку ПЦР продуктов и фрагментный анализ.

Для очистки ПЦР-продуктов в каждую пробирку добавляли по 100 мкл смеси для осаждения ДНК (ацетат аммония, этиловый спирт, вода), инкубировали 20 минут при комнатной температуре, центрифугировали 20 минут при 13000g. Осадок ДНК дважды отмывался 70% этиловым спиртом, высушивался при комнатной температуре, разбавлялся дистиллированной водой 30 мкл. Концентрация очищенных продуктов проверялась в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. В зависимости от интенсивности свечения ПЦР-продукты разводились в 10-40 раз. Разведенные продукты смешивались с формамидом (2 мкл продукта, 10 мкл формамида, 0,05 мкл внутреннего стандарта Genescan 500LIS (Applied Biosystems)). Денатурировались при 95С в течение 2 мин и помещались в лед на 10 мин. 10 мкл денатурированного продукта наносилось в плашку автоматического секвенатора. Для фрагментного анализа использовали автоматический анализатор нуклеиновых кислот ABI Prism 3130 (Applied Biosystems) и компьютерное обеспечение GeneMapper 4.0 (Applied Biosystems).

Критерии интерпретации результатов.

Отрицательный (поликлональный) результат определяли при наличии множества пиков ПЦР-продукта. Результат считался положительным (моноклональным) при наличии одного или двух четких доминантных пиков ПЦР-продукта (в случае биаллельной реарранжировки). При этом пики ПЦР-продукта должны были преобладать и превышать поликлональный фон более чем в 3 раза. Если имелось более 3-х четких пиков, то результат оценивался как олигоклональный. При наличии одного или двух четких пиков, которые превышали поликлональный фон в 2-3 раза, результат оценивался как сомнительный моноклональный.

Анализ клональности лимфоидных клеток по реарранжировкам TCR основан на соединительном разнообразии, т.е. различиях по длине и нуклеотидному составу области соединения V и J сегментов, которая соответствует CDR3 области TCR. В поликлональном образце фиксируются амплификаты различные по длине и составу CDR3 области, и, наоборот, в моноклоновой популяции лимфоцитов - одинаковые.  Результат фрагментного анализа виден как набор пиков в области амплификации T - 80 - 255 п.н., T - 90 - 280 п.н.

В качестве положительного (моноклонального) контроля использовали клеточную линию Jurkat (линия клеток Т - лимфобластного острого лейкоза), имеющую биаллельную перестройку гамма-цепи Т-клеточного рецептора, которая выявляется с V1-8 и V11 праймерами. В качестве поликлонального контроля использовали мононуклеары периферической крови здоровых доноров и образцы кожи, полученные у здоровых людей.

Рисунок 1. Выявление моноклональной пролиферации лимфоидных клеток  по генам TCR методом фрагментного анализа. В биоптате кожи выявляется моноклональный пик (указан стрелкой).

Рисунок 2. Поликлональная картина.

Для оценки диагностических критериев гистологического и молекулярно-генетического методов исследований проводилось их сравнение с золотым стандартом, в качестве которого был выбран метод динамического наблюдения с периодическим гистологическим контролем.

Статистическая обработка результатов проводилась по общепринятым методикам на персональном компьютере под управлением операционной системы с использованием ППП Statistica 8.0 for Windows.

Результаты исследования и их обсуждение

Для постановки диагноза в каждом случае мы использовали данные анамнеза пациента, клинической картины, результата патоморфологического исследования, а также (при установлении диагноза ТКЛК для верификции формы и стадии ТКЛК) иммуногистохимического исследования биоптата пораженной кожи и молекулярно-генетического метода (ПЦР) для определения Т-клеточной клональности биоптатов кожи очагов поражения.

На первом этапе диагностики оценивались клинические данные обследуемых больных. У обследованных больных выявлен ряд клинических признаков, позволяющих заподозрить развитие эритродермической формы Т-клеточной лимфомы кожи.

Клинические признаки, выявленные у обследованных больных

Таблица 2

Клинические признаки, выявленные у обследованных больных	Частота обнаружения клинических признаков %
Инфильтрация, гиперемия кожи	100%
Застойно-синюшный оттенок кожи	42.5%
Шелушение кожи	100%
Сухость, напряжение, чувство стянутости кожи	100%
Наличие участков атрофии кожи	7.5%
Наличие явлений пойкилодермии	7.5%
Увеличение лимфатических узлов	100%
Потеря массы тела	11.2%
Нарушение роста волос	100%
Нарушение общего самочувствия	76.2%
Повышение температуры тела, озноб	80%

У всех пациентов клинически установлено состояние эритродермии, но достоверно верифицировать диагноз по клинико-анамнестическим данным больных не представлялось возможным.

На втором этапе диагностического поиска проводилось патоморфологическое исследование двух биоптатов пораженной кожи взятых с наиболее инфильтрированных участков из области плеча и живота у всех обследованных пациентов. На основании гистологического исследования у 27 пациентов в биоптате пораженной кожи обнаружены специфические признаки, характерные для ТКЛК, из них у 21 выявлена совокупность патогномоничных для ТКЛК критериев. После проведения гистологического исследования 86 больным в состоянии эритродермии, диагноз установлен 72(83,7%) пациентам, у 10(11,3%) диагноз не был верифицирован. 27(31,3%) пациентам установлен диагноз ТКЛК, 49(57%)-ХДД.

Рисунок 3.

На третьем этапе диагностики для оценки эффективности молекулярно-генетического метода в дифференциальной диагностике больных с ТКЛК и ХДД в состоянии эритродермии нами исследовано 172 биоптатов пораженной кожи пациентов (по 2 биоптата пораженной кожи с мест наибольшей инфильтрации с области живота и плеча). Мы сформировали 3 группы: I - не вызывала сомнений в диагнозе ТКЛК, II Цустановлен диагноз ХДД, III - гистологически установлены признаки неспецифического воспалительного заболевания, диагноз не верифицирован. На основании молекулярно-генетического метода проведено определение клональности лимфоидных клеток по реарранжировкам генов гамма и бета цепи TCR. Из 27 пациентов I группы с гистологическим диагнозом ТКЛК моноклональная пролиферация лимфоидных клеток по и -цепи ТСR была обнаружена у 27(100%). Во II группе больных, имеющих гистологические признаки ХДД, у 4 из 49 была выявлена моноклональная пролиферация лимфоидных клеток. Мы обозначили данных пациентов как группу риска. После выявления группы с моноклональным характером процесса (лгруппы риска) мы провели динамический мониторинг на протяжении двух лет с проведением повторных гистологических исследований не реже, чем 1 раз в 3 месяца. У 4-х пациентов с установленной моноклональной пролиферацией лимфоидных клеток гистологическая картина стала соответствовать ТКЛК Iст. ГМ (в 2х случаях через 3 месяца и в 2-х случаях через 6 месяцев после последнего гистологического исследования), что подтвердило предполагаемый нами диагноз и позволило начать специфическое лечение. В III группе у пациентов с неустановленным диагнозом у 8 выявлена моноклональная пролиферация лимфоидных клеток. Данные больные также были включены в группу риска по развитию ТКЛК. При проведении повторного гистологического исследования диагноз ТКЛК выявлен у 2 пациентов через 3 месяца, у 3 через 9 месяцев, у 1-го через 12 месяцев, у 2 через 18 месяцев. 2-им пациентам на сегодняшний день диагноз установить не удалось, больным проводится неспецифическая терапия, наблюдения продолжаются. Далее проводилось сравнение диагностических критериев гистологического и молекулярно-генетического методов исследования.

Рисунок 4.

На четвертом этапе всем больным с верифицированным диагнозом Т-клеточной лимфомы кожи необходимо было установить форму и стадию ТКЛК выработки тактики лечения. Для определения фенотипа опухолевых клеток использовалось ИГХ-исследование 35 пациенту с гистологически установленным диагнозом ТКЛК.

В течение года гистологические диагнозы у этих больных остаются неизменны. ИГХ-исследование позволило идентифицировать пролиферирующие лимфоидные клетки по их принадлежности к определенной популяции лимфоцитов, что позволило установить точную форму и стадию ТКЛК. При иммунофенотипическом исследовании опухолевого пролиферата биоптата пораженной кожи у пациентов с установленными диагнозами эритродермической формы Т-клеточной лимфомы кожи наибольшее количество случаев- 31 (88,6%) составляли больные эритродермической формой грибовидного микоза, в 3(8.5%) случаях выявлен синдром Сезари, в 1 (2.9%) случае зарегистрирована первичная анапластическая крупноклеточная лимфома кожи.

Распределение больных Т-клеточной лимфомой кожи по нозологическим формам.

Рисунок 5.

У всех 31 больных грибовидным микозом наблюдалась следующая экспрессия: CD3+,CD4+,CD5+,CD8-,CD7-,CD30-, что подтверждает Т-хелперный характер пролиферации опухоли, при СС также превалировали Т-хелперные маркеры: CD3+,CD4+,CD5+,CD8-,CD7-,CD20-. При первичной крупноклеточной анапластической лимфоме кожи пролифераты мономорфного типа представлены следующими маркерами: CD3+,CD4+,CD5+,bF1,СD30+,TIA-1+, 30-40% клеток Ki-67(антигена пролиферативной активности) позитивны. CD56+, CD7+ клетки единичны. В ходе работы 15 пациентам установлена IA стадия заболевания, IВ-4, IIA-6, IIВ-3, IIIA-1, IIIВ-1, IV-1.Таким образом, проведенные методы исследовании позволяют уточнить иммунофенотип опухолевого пролиферата у каждого из обследованных пациентов, что позволяет разработать индивидуальные подходы к лечению больных с разными формами и стадиями эритродермической формы Т-клеточной лимфомы кожи.

На основании проведенного исследования разработана схема комплексной диагностики эритродермической формы Т-клеточной лимфомы кожи.

ГГГГ

       

 

Рисунок 7. Схема комплексной диагностики.

ВЫВОДЫ

1. При использовании традиционно применяемых диагностических мероприятий, включающих клинические и гистологический методы исследования окончательный диагноз эритродермической формы Т-клеточной лимфомы кожи или доброкачественных дерматозов удалось установить у 76 (88,7%) пациентов в состоянии эритродермии.
2. Разработана схема комплексной диагностики эритродермической формы Т-клеточной лимфомы кожи на основе изучения совокупности клинико-морфологических данных, результатов молекулярно-генетического и иммуногистохимического методов исследования. Применение разработанной схемы позволило верифицировать диагноз у 84 (97,6%) пациентов и повысить точность диагностики на 9% (Х2=6,125>3,84 при заданном уровне значимости 0,05). Из полученных данных следует, что диагностическая эффективность предложенного комплексного метода диагностики эритродермической формы Т-клеточной лимфомы кожи  статистически достоверно выше, чем традиционно применяемого метода динамического клинико-морфологического контроля.
3. Разработан метод формирования группы риска пациентов по вероятности развития эритродермической формы Т-клеточных лимфом кожи на основе выявления перестройки гамма-цепей Т-клеточного рецептора.
4. При иммунофенотипическом исследовании опухолевого пролиферата биоптата пораженной кожи у 35 пациентов с установленными диагнозами эритродермической формы Т-клеточной лимфомы кожи при грибовидном микозе и синдроме Сезари наблюдался Т-хелперный характер пролиферации опухолевых клеток. При первичной кожной крупноклеточной анапластической лимфоме кожи выявлен цитотоксический иммунофенотип опухолевых  клеток.

Практические рекомендации

1.Разработана схема дифференциальной диагностики эритродермической формы ТКЛК, позволяющая повысить точность диагностики  на 9%. Схема может рекомендоваться для применения в клинической и амбулаторной практике врачей дерматологов и дерматоонкологов.

2.Применение молекулярно-генетического метода исследования с выявлением перестройки -цепи Т-клеточного рецептора позволяет повысить точность ранней диагностики эритродермической формы Т-клеточной лимфомы кожи и может рекомендоваться для использования  в клинической и амбулаторной практике врачей дерматологов и дерматоонкологов.

3.Разработан метод формирования группы риска по развитию эритродермических форм Т-клеточных лимфом кожи, позволяющий проводить мониторинг и профилактику развития заболевания.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Федоровская А.В. К диагностике особых форм Т-клеточных лимфом кожи / В.А. Молочков, А.М. Ковригина, А.В.Федоровская и др., - //Материалы конференции л Герпес и инфекции передаваемые половым путем.- 2009.-С.96-101.
2. Федоровская А.В. Опыт лечения больных ранней стадией Т-клеточной лимфомы кожи/ В.А. Молочков, М.С. Гордиевская, А.В. Федоровская.//Материалы конференции л Герпес и инфекции передаваемые половым путем. -2009.-С.110-113.
3. Федоровская А.В.Анапластическая крупноклеточная CD30+лимфома кожи/ Г.ВОвсянникова, А.А.Грознова, А.В.Федоровская //Материалы конференции Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии.-2010.-С.13-17.
4. Федоровская А.В. К дифференциальной диагностике эритродермии при псориазе и грибовидном микозе/ В.А. Молочков, Г.В. Овсянникова, А.В.Федоровская и др.//Материалы конференции л Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии. -2010.-С.59-62.
5. Федоровская А.В. Трудности  диагностики Т-клеточных лимфом кожи на ранних стадиях заболевания/В.А.Молочков, А.В. Федоровская //Материалы конференцил Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии.- 2010.-С.163-165.
6. Федоровская А.В. Эритродермия при токсокарозе./В.А. Молочков, Г.В. Овсянникова, А.В.Федоровская и др.// Российский журнал кожных и венерических болезней.  - 2010.-№5.-С.25-30.
7. Федоровская А.В. Лимфоматоидный гранулематоз./ В.А. Молочков, А.М. Ковригина, А.В.Федоровская и др. //Российский журнал кожных и венерических болезней.- 2011.-№1.-С.4-6.
8. Федоровская А.В. Методы определения клональности опухолевого пролиферата в диагностике лимфоматоидного грануломатоза./ В.А. Молочков, А.В. Молочков, А.В.Федоровская и др. //Материалы конференциил Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии.- 2011г.-С.75-78.
9. Федоровская А.В. Эффективность молекулярно-генетических методов определения клональности в диагностике злокачественных лимфом кожи./ А.В. Федоровская, А.В. Молочков, А.А. Грознова и др.//Материалы конференции л Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии. -2011.-С.155-158.
10. Федоровская А.В. К дифференциальной диагностике вторичных эритродермий./ В.А. Молочков, А.В. Молочков,  А.В.Федоровская и др.// Материалы конференции.  1 Московский форум Дерматовенерология и косметология: синтез науки и практики.- 2011.-С.71.

11. Федоровская А.В. Применение молекулярно-генетического метода при определении Т- и В-клеточной клональности в диагностике злокачественных лимфом кожи./ В.А. Молочков, А.В.Молочков, А.В.Федоровская и др.// Материалы конференции.1 Московский форум Дерматовенерология и косметология: синтез науки и практики. -2011.-С.72.
12. Федоровская А.В. К вопросу о трудностях диагностики эритродермических вариантов Т-клеточных лимфом кожи. // В.А.Молочков, А.М. Ковригина, А.В.Федоровская и др. //Российский журнал кожных и венерических болезней.- 2011.-№3.-С.4-6.
13. Федоровская А.В. К дифференциальной диагностике вторичных эритродермий./ А.В.Молочков, А.М. Ковригина, А.В.Федоровская и др.// Российский журнал кожных и венерических болезней.- 2011.-№6.-С.41-43.
14. Федоровская А.В. Случай сочетания саркомы Капоши и Т-клеточной лимфомы./ М.Г. Карташова, В.А.Молочков, А.В.Федоровская  и др. // Российский журнал кожных и венерических болезней.- 2011.-№6.-С.8-9.
15. Федоровская А.В. Роль молекулярно-генетических методов определения Т- и В-клеточной клональности в диагностике злокачественных лимфом кожи./ В.А.Молочков, А.В. Молочков, А.В.Федоровская и др.-//  Вестник дерматологии и венерологии, 2011.-N 3.-С.52-57.

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине