РОЛЬ И МЕСТО МЕЛАТОНИНА В ПАТОГЕНЕЗЕ И ЛЕЧЕНИИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КИШЕЧНИКА И РАКА ТОЛСТОЙ КИШКИ 14.01.04 - внутренние болезни 14.01.12 - онкология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по медицине

На правах рукописи

РАХИМОВА ОЛЬГА ЮРЬЕВНА

РОЛЬ И МЕСТО МЕЛАТОНИНА В ПАТОГЕНЕЗЕ

И ЛЕЧЕНИИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КИШЕЧНИКА И РАКА ТОЛСТОЙ КИШКИ

14.01.04 Ц внутренние болезни

14.01.12 Ц онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва - 2010 г.

Работа выполнена в Государственном институте усовершенствования врачей Министерства обороны Российской Федерации

Научный консультанты:

доктор медицинских наук профессор Рапопорт Семен Исаакович

доктор медицинских наук Александров Владимир Борисович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Коньков Александр Викторович

доктор медицинских наук, профессор Царьков Петр Владимирович

доктор медицинских наук, профессор Парфенов Асфольд Иванович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова Федерального агенства здравоохранения и социального развития

Защита диссертации состоится л23 ноября 2010 г. в 14.00 часов

на заседании диссертационного совета Д 215.009.02 в Государственном институте усовершенствования врачей МО РФ по адресу: 107392, Москва, ул. Малая Черкизовская, д. 7.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Автореферат разослан л____________________2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор И. Бакунин

ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В ТЕКСТЕ СОКРАЩЕНИЙ

АЛТ - аланиновая аминотрасфераза

АСТ - аспарагиновая аминотрасфераза

БК - болезнь Крона

ВЗК - воспалительные заболевания кишечника

ДЭНС - диффузная нейроэндокринная система

ДМГ-1,2, диметилгидразин

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

КРР - колоректальный рак

КТ - компьютерная томография

МПК - мелатонин-продуцирующие клетки

ОП - оптическая плотность

ПКОЭ - показатели клеточного обновления эпителиоцитов

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПЭ - площадь экспрессии

СОТК - слизистая оболочка толстой кишки

СОЭ - скорость оседания эритроцитов

СПК - серотонин- продуцирующие клетки

УЗИ - ультразвуковое исследование

ЦНС - центральная нервная система

ЭГДС - эзофагогастродуоденоскопия

ЭКГ электрокардиография

ЯК - язвенный колит

ДНЭС диффузная нейроэндокринная система

PCNA - пролиферирующий клеточный ядерный антиген

Hb- гемоглобин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Актуальность диссертационного исследования обусловлена увеличением частоты заболеваемости, распространенностью воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК) и колоректального рака (КРР). Современные эпидемиологические исследования свидетельствуют о значительном увеличении заболеваемости ВЗК. 20 лет назад распространенность болезни Крона (БК) варьировала в пределах от 20Ч40 случаев, а язвенного колита (ЯК) Ч от 35 до 70 на 100 000 населения, в настоящее время она возросла вдвое. Так, например, ежегодно в США, где статистика носит весьма достоверный характер, регистрируется от 15 000 до 30 000 новых случаев ВЗК. Пик заболеваемости приходится на возраст 20-40 лет, т.е. на молодых людей трудоспособного возраста.

Не меньшее внимание сегодня привлекает состояние заболеваемости КРР в общей популяции, неуклонное увеличение роста которого зарегистрировано последние десятилетия. В Европе и США ежегодно выявляется от 50 до 75 вновь заболевших КРР на 100 000 населения. Ныне во многих странах КРР занимает 2 Ц3 место среди других локализаций рака. Такое же место занимает КРР и в России, где ежегодно регистрируется более 40 000 новых первичных процессов.

Хорошо известно, что течение ЯК более 10 лет является критической точкой озлокачествления процесса и развития КРР. По мировым статистическим данным КРР возникает у больных с 5-летним анамнезом ЯК в 2-3% случаев, при 10-летнем анамнезе - в 7%, при 15-летнем - в 12%, при 20-летнем - в 23%, при продолжительности болезни более 25 лет - в 42%, при 35-40-летней продолжительности болезни ЯК увеличивает кумулятивный риск возникновения рака до 56%. Так, относительный кумулятивный риск (relative risk - RR) возникновения КРР при ЯК, по данным разных авторов, колеблется в интервале 3,1-5,7, что в 7-8 раз выше, чем в общей популяции, где частота КРР в разных странах колеблется от 0,5 до 3%.

Установлено, что воздействие света ночью напрямую связано с проблемами поведения, а также состоянием здоровья, приводящими к развитию рака. В 2008г. Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) признала достоверным фактором риска развития опухолей ночную освещенность. Воздействие светом подавляет ночной пик секреции мелатонина гормона ночи. Последние эпидемиологические исследования установили значительное увеличение риска развития рака молочной железы у женщин, часто работающих в ночную смену особенно в 1 час 30 минут, когда уровень мелатонина особенно высок [Davis et al., 2001, Schernhammer et al., 2001,гл.15]. У женщин, работавших более 30 лет в переменном рабочем режиме с частыми ночными сменами (медицинские сестры, стюардессы и др.), риск развития рака молочной железы был на 36% больше, чем у тех женщин, которые никогда не работали ночью [Pukkala et al.,1995, Tynes et al., 1996, Hansen et al., 2001, Rafnsson et al., 2001,гл.15]. Изучено влияние мелатонина на канцерогенез толстой кишки у крыс, индуцируемый 1,2-диметилгидразином (ДМГ) [В.Н. Анисимов 1997 г.]. В результате достоверно выявлен ингибирующий эффект мелатонина на канцерогенез кишечника у крыс, который проявлялся снижением частоты и множественности опухолей, в основном толстой кишки, а также в снижении степени инвазии и размеров опухолей и в повышении их дифференцировки. Механизмы свободнорадикального окисления, участвующие в процессе канцерогенеза, также находились под действием мелатонина.

Известно, что апоптоз принимает участие не только в программируемой гибели клеток, но и в удалении некоторых клеток при пролиферации клеточной популяции, гибели отдельных клеток в опухолях, в основном при ее регрессии, но также и в активно растущей опухоли и др. Путем программированной клеточной гибели происходит удаление клеток, выживание которых нежелательно для организма, например мутантных клеток или клеток, зараженных вирусом. В последнем случае этот процесс имеет важное биологическое значение, поскольку фрагментация ДНК предупреждает перенос генетического материала в другие клетки [Jacquelyn J. et al., 1998]. Регуляция апоптоза организмом представляет собой сложный многофакторный процесс. Регуляция апоптоза осуществляется на генном уровне по антагонистическому принципу. Проапоптозному гену р53 принадлежит важнейшая роль в противоопухолевой защите организма, что обусловлено его способностью предотвращать фиксацию генетических повреждений [Bella-my Ch., 1997; Long X. et al., 2002]. Ген р53 принимает активное участие в регуляции клеточного обновления. Однако, в условиях патологии ген р53 сам может подвергаться мутации, приобретая при этом противоположные свойства - оказание ингибирующего влияния на апоптоз. Активация р53 приводит к задержке клеточного цикла, что позволяет осуществить репарацию ДНК перед делением клетки или запустить апоптоз. В результате апоптоза происходит элиминация клеток с нерепарируемыми участками ДНК. Повышенная экспрессия р53 протеина или повреждение его негативного регулятора MDM2, приводящее к аккумуляции р53 внутри ядра, инициирует апоптоз в различных типах клеток, даже при отсутствии повреждений ДНК.

Таким образом, апоптоз является широко распространенным общебиологическим механизмом, ответственным за поддержание постоянства численности клеток, формообразование, выбраковку дефектных клеток [Evan G., Littlewood T., 1998].

В связи с установленным участием гормона мелатонина в регуляции функций ЖКТ представляет интерес исследование уровня мелатонина в СОТК при ВЗК и КРР, уровня перекисного окисления липидов, степени клеточной пролиферации и апоптоза. Кроме того, некоторые аспекты патогенетической терапии ВЗК требуют детализации. Изучение возможности использования мелатонина в лечении ВЗК представляет практический интерес.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЦЕЛЬ: определить роль и место мелатонина в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника - болезни Крона и язвенного колита, а также рака толстой кишки.

ЗАДАЧИ:

Оценить нейроэндокринный статус кишечника по экспрессии основных локально синтезируемых гормонов - мелатонина и его предшественника серотонина у больных БК, ЯК и КРР.
Оценить степень выраженности процессов перекисного окисления липидов и накопления свободных радикалов по экспрессии основного фермента их синтеза - NO-синтазы в СОТК у больных БК,ЯК и КРР.
Определить степень процессов клеточного обновления эпителиоцитов СОТК по экспрессии маркера пролиферации PCNA и программируемой гибели клеток по экспрессии маркера апоптоза р53 у больных БК, ЯК и КРР.
Изучить влияние мелатонина на лечение больных БК и ЯК в составе комплексной терапии, в сравнении с аналогичными группами больных, получавших патогенетическую терапию без добавления мелатонина, путем исследования биопсий слизистой толстой кишки с помощью электронной микроскопии до начала лечения и после проведенной терапии.
Разработать рекомендации по применению мелатонина для лечения воспалительных заболеваний кишечника.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА заключается в том, что впервые у больных с ВЗК и КРР изучены изменения нейроэндокринного статуса путем исследования экспрессии гормонов - серотонина и мелатонина; процессов накопления свободных радикалов по площади экспрессии и уровня оптической плотности NО-синтазы; определение показателей клеточного обновления и программируемой гибели эпителиоцитов по площади экспрессии и уровня оптической плотности PCNA и маркера апоптоза р53.

Впервые проведен сравнительный анализ клинико-морфологических и иммуногистохимических особенностей, отражающих функциональное состояние нейроэндокринных клеток ДНЭС СОТК при БК, ЯК и КРР. В ходе проведенного исследования доказано, что состояние функциональной морфологии клеток APUD-системы тесно связано с процессами клеточного обновления, лежащими в основе формирования органической патологии толстой кишки.

Результаты нашего исследования выявили, что нейроэндокринные сдвиги при ЯК, при котором преимущественно поражается только слизистая оболочка кишечника, характеризуются значительным преобладанием (в 2 раза) мелатонин-продуцирующих клеток (МПК) над серотонин-продуцируюшими клетками (СПК), что свидетельствуют об активном синтезе мелатонина из его основного предшественника - серотонина в изучаемых отделах кишечника. Показатель площади экспрессии МПК в группе больных ЯК был достоверно (p<0,05) выше и по сравнению с контрольной группой.

В то время как при БК, при котором поражение захватывает практически всю толщину стенки кишечника, выявлено снижение синтеза мелатонина и накопление основного предшественника мелатонина - серотонина в нейроэндокринных клетках (апудоцитах). Однако, оба показателя и для МПК, и для СПК были достоверно (p<0,05) выше по сравнению с контрольной группой, что может свидетельствовать не только о вовлечении компенсаторных и защитных процессов в организме (в виде увеличения количества МПК и СПК по сравнению с контрольной группой), но и об истощении компенсаторных защитных резервов. Все это в свою очередь обусловливает особенности патогенеза болезни Крона, связанной с нейроиммуноэндокринными нарушениями моторики кишечника и другими каскадными биохимическими реакциями, в регуляции которых биогенные амины принимают активное участие.

При оценке свободнорадикальных процессов в СОТК при ЯК установлено снижение уровня свободных радикалов по ПЭ NO-синтазы, в то время как при БК отмечена тенденция к усилению накопления свободных радикалов.

Исследование показателей клеточного обновления эпителиоцитов (ПКОЭ) при ЯК установили преобладание процессов апоптоза над пролиферацией клеток, что отражает усиление гибели клеток при развитии ЯК. ПКОЭ при БК демонстрировали слабое преобладание процессов пролиферации клеток над процессами апоптоза.

В области макроскопически интактной слизистой оболочки вне расположения опухоли выявлено преобладание МПК при КРР, при этом отмечено снижение свободнорадикальных процессов в слизистой. ПКОЭ вне зоны расположения опухолей демонстрировали достоверное снижение пролиферации клеток по сравнению с процессом их программированной гибели - апоптоза.

Впервые проведен сравнительный анализ биопсий СОТК методом электронной микроскопии больных ЯК и БК, получавших в течение 30 дней только патогенетическую терапию и получавших комплексную терапию с дополнительным приемом мелатонина 3 мг. Выявлено достоверно значительно лучшее восстановление ультраструктуры слизистой толстой кишки у больных, получавших комбинированную терапию с применением мелатонина.

НАУЧНО- ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Использование мелатонина для лечения ВЗК позволяет достичь в более короткие сроки ремиссии заболевания и практически полного восстановления ультраструктуры слизистой оболочки толстой кишки.

Проведенное исследование ультраструктурных особенностей СОТК при ЯК и БК показывает, что при использовании в терапии мелатонина достигаются лучшие результаты, так как быстрее исчезают воспалительные изменения, дистрофические процессы в эпителиальных клетках, нормализуется их активность и система кровоснабжения, лучше восстанавливаются имевшие место дистрофические изменения в бокаловидных и цилиндрических клетках.

Таким образом, результаты позволяют заключить, что может быть рекомендовано включение мелатонина в общий блок патогенетического консервативного лечения. Использование мелатонина в комплексной терапии ВЗК позволяет в те же сроки добиться лучших результатов по сравнению с обычной схемой лечения.

Используя показатели экспрессии МПК, пролиферативной активности и апоптозной гибели эпителиоцитов, возможны попытки оценивать течение репаративных процессов в стенке кишечника и риск развития малигнизации клеток. По-видимому, механизмы апоптоза и некроза являются ведущими в формировании эрозивно-язвенных дефектов СОТК и могут преобладать на разных стадиях течения заболевания, что подтверждается нарастанием процессов апоптоза по мере утяжеления течения ВЗК с последующим доминированием некровоспалительных изменений колоноцитов. Поэтому практическое значение имеют данные о том, что все факторы, инициирующие апоптоз, при увеличении своей интенсивности вызывают некроз.

При ВЗК возрастает общее количество эндокринных клеток, превышает соответствующие показатели в контрольной группе. Количество и функциональная активность апудоцитов, продуцирующих мелатонин, также значительно повышается. По всей видимости, мелатонин обладает протективным эффектом, защищая СОТК от факторов альтерации, увеличение количества МПК в СОТК при ВЗК имеет компенсаторное значение.

Таким образом, при ЯК, когда преимущественно поражается только слизистая кишечника, отмечается повышение синтеза мелатонина, который обладая антиоксидантным действием, снижает накопление свободных радикалов в слизистой кишки, уменьшая их повреждающее действие. Преобладание апоптоза над пролиферацией объясняется антипролиферативным и антиканцерогенным свойством мелатонина.

При БК, когда отмечается более глубокое (не только слизистой) повреждение стенки кишки, компенсаторные механизмы организма истощаются быстрее - синтез мелатонина снижен и выявляется накопление свободных радикалов в слизистой кишечника.

Следовательно, выявленные единые патогенетические механизмы при ЯК и БК, степень выраженности которых зависти от глубины поражения, могут свидетельствовать о единстве патогенетических механизмов этих заболеваний.

При КРР достоверно выявлено увеличение МПК и синтеза мелатонина в СОТК на расстоянии 1 см от опухоли, а также снижение активности свободнорадикального повреждения и усиление апоптоза в этой зоне, что обусловлено антиоксидантнм и анипролиферативным свойствами мелатонина.

Кроме того, следует признать, что теория окислительного стресса является универсальной. Окислительный стресс является фактором усугубления течения кишечной патологии и фактором риска развития кишечной патологии при других соматических расстройствах. В связи с этим целесообразным и перспективным является при выборе тактики лечения у этих пациентов воздействие на механизмы развития окислительного стресса. Больных ВЗК с высокими показателями p53, PCNA и оксидативного стресса как без дисплазии кишечного эпителия, так и с дисплазией, целесообразно выделять в особую группу риска по развитию рака толстой кишки для проведения индивидуальной диспансеризации, ранней диагностики онкологической патологии.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. При ВЗК происходит изменение функциональной активности ДНЭС.

2. При БК имеются изменения нейроэндокринного статуса снижение количества мелатонин продуцирующих клеток, накопление свободных радикалов и незначительное преобладание пролиферации эпителиоцитов слизистой кишки над процессом апоптоза в сравнении с контрольной группой.

3. При ЯК, когда преимущественно поражается только слизистая кишечника, отмечается повышение количества МПК и синтеза мелатонина, который обладая антиоксидантным действием, снижает накопление свободных радикалов в слизистой кишки, уменьшая их повреждающее действие. Преобладание апоптоза над пролиферацией, объясняется антипролиферативным и антиканцерогенным свойством мелатонина.

4. При КРР увеличивается количество МПК и синтез мелатонина в СОТК, а также отмечается снижение активности свободнорадикального повреждения и усиление апоптоза в этой зоне.

5. Использование 3 мг мелатонина в комплексной терапии БК и ЯК позволяет в более короткие сроки добиться клинико-эндоскопической ремиссии заболевания и восстановления ультраструктурного строения СОТК.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ В КЛИНИЧЕСКУЮ ПРАКТИКУ

Методы и результаты исследования внедрены в лечебно-диагностическую работу ГБУЗ Городской клинической больницы №24 Департамента здравоохранения города Москвы. Отдельные фрагменты работы используются в учебном процессе на кафедрах военно-полевой терапии Государственного института усовершенствования врачей Министерства обороны РФ, лаборатории Хрономедицина и новые технологии в клинике внутренних болезней Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова.

По результатам докторского диссертационного исследования получен патент на изобретение № 2394571 от 20 июля 2010 года.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на XVI Российском национальном конгрессе Человек и лекарство (Москва, 2009), научно-практической конференции колопроктологов (Москва, 2008, 2009, 2010), на Ассамблее Здоровье столицы (Москва, 2009), XVII Российском национальном конгрессе Человек и лекарство (Москва, 2010)

Всего по теме диссертации опубликовано 27 печатных работ, в том числе, 10 статей в реферируемых журналах.

Структура работы. Диссертация изложена на 257 страницах машинописного текста, состоит из введения, 2-х глав обзора литературы, главы материалы и методы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографии. Работа иллюстрирована 16 таблицами, 112 рисунками, 4 клиническими примерами. В библиографическом указателе 470- источник, из них 44 - отечественных и 426 - иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В соответствии с поставленными целями и задачами на базе городской клинической больнице №24 Департамента здравоохранения города Москвы за период с 2007 года по 2009 год проведено обследование 190 больных, из которых 70 больных БК толстой кишки (n=70), 80 больных ЯК (n=80), 20 больных КРР (n=20) и 20 больных контрольной группы (n=20) (без патологии толстой кишки) в возрасте от 19 до 60 лет. Средний возраст обследуемых больных ВЗК составил 46,015,1 года, из которых 42,6% мужчины и 57,4% женщины. Средний возраст больных КРР 49,86,6 лет, из них 50% мужчины и 50% женщины. Контрольную группу составили 20 человек (10 мужчин и 10 женщин), средний возраст которых составил 47,611,4 лет.

I этап

Иммуногистохимическое исследование площади экспрессии и уровня оптической плотности МПК и СПК в СОТК больных ВЗК и КРР
Иммуногистохимическое исследование площади экспрессии и уровня оптической плотности NO-синтазы СОТК больных ВЗК и КРР
Иммуногистохимическое исследование показателей клеточного обновления и программируемой гибели эпителиоцитов по площади экспрессии и уровня оптической плотности PCNA и маркера апоптоза р53 в СОТК больных ВЗК и КРР

Критерии включения:

-больные БК толстой кишки,

больные ЯК (за период 2007-2008гг.) в возрасте до 60 лет

- больные раком толстой кишки (за период 2007-2008гг.) в возрасте до 60 лет

Критерии исключения:

-больные БК и ЯК, раком толстой кишки старше 60 лет

-больные БК с локализацией воспалительного процесса вне толстой кишки

Группы исследования:

I группа больные БК толстой кишки, n= 20

II группа больные ЯК, n=20

III группа больные раком толстой кишки, n=20

IV группа - контрольная (больные без кишечной патологии) , n=20

II этап

Морфологическое (электронная микроскопия) исследование СОТК до начала лечения и через 30 дней лечения с использованием мелатонина

Критерии включения:

-больные БК толстой кишки,

больные ЯК (за период 2007-2008гг.) в возрасте до 60 лет

Критерии исключения:

-больные БК и ЯК старше 60 лет

-больные БК с локализацией воспалительного процесса вне толстой кишки

- больные с тяжелым поражением печени или почек

Группы исследования:

I группа больные БК толстой кишки, получавшие комплексную терапию с мелатонином, n= 10

II группа больные БК толстой кишки, получавшие только патогенетическую терапию,n= 10

III группа больные ЯК, получавшие комплексную терапию с мелатонином, n= 10

IV группа больные ЯК , получавшие только патогенетическую терапию, n= 10

IIIэтап

Оценка эффективности предложенных мероприятий, разработка практических рекомендаций

В исследование были включены пациенты с острой, хронической рецидивирующей, хронической непрерывной формой течения ЯК и БК толстой кишки в форме терминального илеита, проктита, проктосигмоидита, левостороннего и субтотального поражения кишечника. Обследуемые группы по полу и возрасту, характеру течения и длительностью анамнеза были репрезентативны. Все больные дали письменное согласие на участие в исследовании и использовании обезличенных персональных данных.

Всем больным проводилось общеклиническое исследование: клинический анализ крови (гематологическом анализаторе 11193 МЕК 6410К (Япония)) и биохимический анализ крови (на анализаторе 1001272 Vitalit 1000 (Италия)), общий анализ мочи, копрограмма и анализ кала на скрытую кровь, рентгенография грудной клетки, ЭКГ, УЗИ органов брюшной полости и почек. А также эндоскопические исследования: эзофагогастродуоденоскопия (видеогастроскопом Olympus CF- Q160L), ректороманоскопия (Ре-ВС- 01-КМТ с механизмом фиксации ЕАSY LOSK производства НПК КРАСМЕДТЕХ) и (или) колоноскопия (видеоколоноскопом типа Olympus CF- Q160L), биопсия слизистой оболочки толстой кишки, гистологическое исследование (традиционным методом парафиновой заливки с окраской гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизону).

Все пациенты дали письменное согласие на проведение биопсии. Исследование одобрено решением локального этического комитета.

Иммуногистохимические методы исследования: гормонов - мелатонина и его предшественника серотонина, маркера пролиферации PCNA и маркера апоптоза р53; маркера накопления свободных радикалов в слизистой оболочке кишечника - NO-синтазы. Иммуногистохимические исследования проводили с применением моноклональных антител к следующим молекулам: цитоплазматическим маркерам - серотонину (Novocastra, 1:250), мелатонину (CIDtech Res. Inc., 1:200), основному ферменту, регулирующему накопление в тканях свободных радикалов - NO-синтазе (Novocastra, 1:200); ядерным маркерам - ключевым регуляторным белкам пролиферации и апоптоза - PCNA и p53 (оба Dako, 1:150). Использовали авидин-биотиновый и авидин-стрептавидин-биотиновый методы. Для иммуноокрашивания продуктов реакции использовали систему визуализации ready to use (Dako).

Цифровую микроскопию и морфометрическое исследование срезов СОТК проводили с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Nikon Eclipse E400, цифровой камеры Nikon DXM1200, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4 и программного обеспечения Видеотест-Морфология 4.0.

В каждом случае анализировали 10 полей зрения при увеличении х400. Оптическую плотность измеряли в условных единицах. Также определяли ПЭ, которая представляла собой отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками к общей площади клеток в поле зрения, выражаемое в процентах. Указанные параметры отражают интенсивность синтеза или накопления исследуемых гормонов и сигнальных молекул в клетках и тканях.

Во второй части исследования были сформированы две группы больных ВЗК из них 20 больных БК (n=20), средний возраст которых 33,8 лет и 20 больных ЯК (n=20), средний возраст составил 51 год. В обеих группах было 8 (40%) мужчин и 12(60%) женщин. Каждая группа была разделена на две равные подгруппы. Все больные в обеих подгруппах получали терапию: сульфасалазин 3 г/сут, метрогил 500мг х2 раза в/в -10 дней, затем трихопол 25мг х 4 раза в сут, нистатин 500 тыс. ЕД х 4 раза, кроме того, больные 1- подгруппы каждой из групп получали 3 мг мелатонина на ночь. В процессе исследования не было выявлено каких-либо побочных эффектов на применение мелатонина.

Всем больным были исследованы биопсии СОТК с помощью электронной микроскопии до начала лечения и через 30 дней лечения. Ультратонкие срезы, изготовленные на ультрамикротоме LKB-III, после окраски толуидиновым синим и обработки уранилацетатом и нитратом серебра, просматривали и фотографировали в электронном микроскопе JEOL-1200-EX(II).

Для проведения статистической обработки предложена карта обследования больного, включавшая жалобы, данные анамнеза заболевания и жизни, результаты проведенного лабораторного, инструментального и морфологического обследования.

Статистическая обработка результатов исследований проведена с использованием пакета программ Statistica 6.0 (Stat Soft Inc).

Собственные результаты и их обсуждение.

Иммуногистохимические показатели морфо-функционального состояния слизистой оболочки толстой кишки у пациентов контрольной группы

При изучении образцов СОТК у пациентов контрольной группы выявлено, что в слизистой оболочке интактной сигмовидной и прямой кишки крипты располагались упорядоченно, эпителий кишечника был представлен обычным соотношением каемчатых или бескаемчатых призматических энтероцитов, бокаловидных клеток и отдельных эндокринных клеток (апудоцитов). Каемчатые призматические (всасывательные) энтероциты были наиболее многочисленными и составляли около 90% общего числа клеток в популяции этого отдела кишечника. Среди каемчатых энтероцитов располагались бокаловидные клетки, в цитоплазме которых обнаруживалось большое количество муцинов - основных компонентов кишечной слизи. Клетки Панета в норме практически не встречаются. Эндокринные клетки (апудоциты) округлой или многоугольной формы, дающие иммунопозитивную реакцию с антителами к серотонину и мелатонину, располагаются, как правило, поодиночке или небольшими группами из 2-3 клеток в СОТК.

ПЭ МПК превышала такой же показатель для СПК (p <0,05), тогда как по показателям ОП обе популяции нейроэндокринных клеток практически не отличались друг от друга. Эти данные свидетельствуют об активном синтезе мелатонина из его основного предшественника - серотонина в изучаемых отделах кишечника.

При оценке свободнорадикальных процессов в СОТК установлено, что показатели ПЭ основного фермента образования свободных радикалов - NO-синтазы отражали невысокий уровень ее синтеза как по ПЭ, так и по ОП.

ПКОЭ демонстрировали преобладание процессов пролиферации клеток над процессами их программированной гибели - апоптоза (р<0,05), что отражает достаточно высокий уровень клеточного обновления в СОТК в норме.

Таким образом, в контрольной группе, в СОТК при нормальном уровне синтеза мелатонина, отмечается преобладание процессов пролиферации клеток над апоптозом и невысокий уровень образования свободных радикалов.

Иммуногистохимические показатели морфо-функционального состояния СОТК при БК.

Средний возраст в группе больных БК 43,8+17,4 лет. Средняя длительность заболевания составила 6,5 + 6,1 лет. Средняя длительность заболевания составила 6,5 + 7,1 лет.Распределение по полу мужчины 40% (n=8), женщины 60% (n=12). В клиническом статусе: у 70% больных состояние расценено как удовлетворительное, у 30% средней тяжести. Локализация поражения в терминальном отделе подвздошной кишки выявлена у 20%, толстой кишке у 70%, прямой - 10%. По течению БК: острое у 10%, рецидивирующее 70%, непрерывно рецидивирующее 20%. Среднее количество обострений в год составило 2 + 1,5. Индекс Беста < 150 у 50% больных, индекс Беста > 150 у 50% больных. Кишечные осложнения в анамнезе (в виде свищей, стриктур и т.д.) отмечены у 25% больных, внекишечные 20%.

Изучение полученных образцов СОТК показало, что БК представляет собой неспецифический воспалительный рецидивирующий процесс. Воспаление при БК носит гранулематозный характер. Признаки воспалительного процесса обнаруживались во всех слоях стенки кишки, но в отличие от ЯК, как раз в СОТК они были менее выражены.

Эпителиоциты были уплощены, иногда отмечались аплазированые участки слизистой оболочки (в зоне язв щелевидной формы, поверхность которых была покрыта фибрином). В воспалительном инфильтрате преобладали лимфоциты, скопления которых формировали гранулематозные саркоидоподобные образования, но без гигантских клеток Пирогова-Ланганса. Такие гранулемы выявлялись преимущественно в периваскулярной и периневральной соединительной ткани во всех слоях кишечной стенки.

Рис. 6. Экспрессия мелатонина в СОТК при БК Рис. 7. Экспрессия PCNA в СОТК при БК. Иммуногистохимический метод. х200. х200

ПЭ МПК (Рис. 6) была незначительно меньше такого же показателя для СПК, так же как и по показателям ОП оба типа клеток практически не отличались друг от друга. Однако, оба показателя и для МПК, и для СПК были достоверно (p<0,05) выше по сравнению с контрольной группой, что может свидетельствовать не только о вовлечении компенсаторных и защитных процессов в организме (в виде увеличения количества МПК и СПК по сравнению с контрольной группой), но и об истощении компенсаторных защитных резервов, проявляющееся в снижении МПК и синтеза мелатонина по сравнении с СПК у данной группы больных БК с повреждением всей глубины стенки кишки.

При БК отмечена тенденция к усилению накопления свободных радикалов по показателю ПЭ NO-синтазы (критерий Манна-Уитни). Усиление свободнорадикального повреждения вероятно обусловлено истощением компенсаторных механизмов снижением синтеза мелатонина, обладающего выраженным антиоксидантным действием.

ПКОЭ демонстрировали слабое преобладание процессов пролиферации клеток (Рис. 7) над процессами апоптоза (р<0,05).

Таким образом, при БК имеются изменения нейроэндокринного статуса не только количества, но и функциональной активности апудоцитов, по изучаемым показателям в сравнении с контрольной группой, проявившееся в снижении синтеза мелатонина, накоплении свободных радикалов и незначительном преобладании пролиферации эпителиоцитов слизистой кишки над процессом апоптоза.

Иммуногистохимические показатели морфо-функционального состояния СОТК при ЯК.

Средний возраст в группе больных ЯК составил 46,1+15,7 лет, из них мужчины 40% (n=8), женщины 60% (n=12). В клиническом статусе: у 70% больных состояние расценено как удовлетворительное (легкое течение), у 30% средней тяжести (среднетяжелое течение). Локализация поражения в толстой кишке у 70%, прямой - 30%. По течению ЯК: острое у 10%, рецидивирующее 70%, непрерывно рецидивирующее 20%. Среднее количество обострений в год составило 2+1,5. Средняя длительность заболевания составила 7,1+ 7,9 лет.

В результате исследования выявлено, что изменения СОТК при ЯК характеризуется геморрагически-гнойным воспалительным процессом различной степени выраженности. При легком течении отмечается утолщение СОТК с многочисленными геморрагиями, эрозиями и мелкими изъязвлениями, в то время как при более тяжелом течении наблюдалась гипоплазия СОТК, вплоть почти до полной ее аплазии. В эпителии обнаруживаются дистрофические изменения различной степени выраженности, часто встречаются язвы, размеры и глубина которых зависят от распространенности некробиотического процесса. Границы между эпителиоцитами не всегда четко контурируются. Отмечается отек собственного слоя СОТК, которая обильно инфильтрирована лимфоцитами, эозинофильными лейкоцитами и плазматическими клетками. Отмечается гиперплазия бокаловидных клеток с гиперсекрецией слизи, которая выражается в большом количестве слизистых вакуолей в цитоплазме бокаловидных клеток.

В основании язв выявляются скопления некротической ткани, в зоне которой и рядом с ней отмечается фибриноидное набухание и некроз стенок сосудов, васкулиты, тромбозы. Сохранившиеся островки СОТК были набухшими и полнокровными. Часто они формировали полиповидные образования различной величины без четкой дифференциации на тело и ножку полипа. Одновременно с поражением стенки отмечались явления регенерации СОТК в виде гипертрофии и формирования железистых комплексов в УнаползающейФ на язвы слизистой оболочке. Часто участки регенерации сочетались с участками фиброза, деформировавшего структуру стенки кишки. При этом отмечалось развитие грубоволокнистой соединительной ткани и образование грануляций в дне язв. Во всех случаях ЯК в слизистой оболочке обнаруживались клетки Панета. В некоторых случаях при изменениях слизистой оболочки, аналогичным вышеописанным, в участках компенсаторной гиперплазии и аденоматоза слизистой оболочки отмечался атипизм клеток, гиперхромия ядер, разрывы базальной мембраны желез, что способствовало процессам малигнизации по типу формирования участков карциноматозного строения.

ПЭ МПК значительно превышала (Рис. 9) такой же показатель для СПК (по критерию Вилкоксона), тогда как по показателям ОП оба типа нейроэндокринных клеток не отличались друг от друга.

Рис. 9. Мелатонин-продуцирующие клетки Рис. 10. Экспрессия NO-синтазы в

в СОТК при ЯК. х400. СОТК при ЯК. х200.

Кроме того, при ЯК отмечено достоверное увеличение количества МПК, по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует об активном синтезе мелатонина из его основного предшественника - серотонина в изучаемых отделах кишечника.

ПЭ NO-синтазы снижается при ЯК (Рис. 10) как по показателю ПЭ (р<0,05) так и по ОП по сравнению с контрольной группой, что вероятно обусловлено повышением синтеза мелатонина, обладающего выраженным антиоксидантным действием.

ПКОЭ при ЯК демонстрировали преобладание процессов апоптоза над пролиферацией клеток, что отражает усиление гибели клеток при развитии ЯК (Рис. 11). Выявлено нарастание апоптоза (р53) по сравнению с контрольной группой, при этом (PCNA) ниже, чем в контрольной группе.

Рис. 11. Выраженная экспрессия протеина р53 при в СОТК при ЯК. х400.

Анализ полученных данных достоверно показал, что по сравнению с контрольной группой, при ЯК, когда преимущественно поражается только слизистая кишечника, отмечается повышение синтеза мелатонина, который обладая антиоксидантным действием, снижает накопление свободных радикалов в слизистой кишки, уменьшая их повреждающее действие. Преобладание апоптоза над пролиферацией, объясняется антипролиферативным и антиканцерогенным свойством мелатонина.

При БК, когда отмечается более глубокое повреждение стенки кишки, компенсаторные механизмы организма истощаются быстрее - синтез мелатонина снижен, выявляется накопление свободных радикалов в слизистой кишечника и слабое преобладание процессов пролиферации клеток над процессами апоптоза.

Следовательно, ВЗК можно рассматривать как апудопатии, когда происходит изменение, как количества нейроэндокринных клеток, так и их функциональной активности.

Иммуногистохимические показатели морфо-функционального состояния СОТК при КРР.

В исследование были включены 20 больных КРР (n=20) в возрасте 49,8+6,6 лет. Диагноз КРР установлен на основании данных анамнеза, жалоб, объективного обследования, проведения колоноскопии с биопсией слизистой кишки и морфологического исследования полученных образцов.

Проведено иммуногистохимическое изучение функциональной морфологии образцов СОТК на расстоянии 1 см от опухоли по вышеуказанным трем патогенетическим направлениям. Все исследуемые злокачественные опухоли представляли собой КРР и во всех случаях гистологически верифицировалась аденокарцинома различной степени дифференцировки

ПЭ МПК при КРР незначительно превышала такой же показатель для СПК (1,610,91% и 1,210,53% соответственно), по показателям ОП оба типа нейроэндокринных клеток сохраняли подобный баланс (1,440,29 у.е. и 1,450,2 у.е. соответственно) при этом ПЭ МПК клеток была ниже, чем в контрольной группе.

Установлено снижение ПЭ NO-синтазы по сравнению с контрольной группой (Рис.13) (различие с параметром Nos-3(контроль) достоверно (р<0,05 по критерию Манна-Уитни)).

ПКОЭ вне зоны расположения опухоли демонстрировали достоверное снижение пролиферации (PCNA=1,21) клеток по сравнению с апоптозом (р53=2,09) (по критерию Вилкоксона).

Рис. 13. Экспрессия NO-синтазы в Рис. 14. Экспрессия протеина р53 в

СОТК при КРР. х200. СОТК при КРР. х 400

Показатели динамики изученных маркеров, отражающих функциональное состояние СОТК представлены в Таблице 4.

Таблица 4

Анализ иммуногистохимических показателей при БК, ЯК и КРР

группа	N	а	Опт. плотн. (у.е.)	S экспр. %	Опт. плотн. (у.е.)	S экспр. %	Опт. плотн. (у.е.)	S экспр. %	Опт. плотн. (у.е.)	S экспр. %	Опт. плотн. (у.е.)	S экспр. %
группа	N	а	Nos-3	Nos-3	МТ	МТ	СТ	СТ	PCNA	PCNA	р53	р53
БК	20	M	1,21 *	2,32	1,20	1,27	1,33	2,70	1,27	2,27	1,26	2,03
БК	20	s	0,219	1,309	0,240	1,296	0,280	1,094	0,250	1,140	0,330	0,902
ЯК	20	M	1,45	1,19	1,44	2,32	1,50	1,13 **	1,57	1,65	1,55	1,89
ЯК	20	s	0,273	0,567	0,182	1,172	0,258	0,673	0,301	0,627	0,257	0,836
Рак	20	M	1,31 *	1,26	1,44	1,62	1,47	1,22	1,46	1,21	1,38	2,09^
Рак	20	s	0,215	1,023	0,292	0,889	0,200	0,485	0,204	0,682	0,374	1,090
контроль	20	M	1,62	1,53	1,36	1,88	1,40	1,69	1,38	1,79	1,36	1,58
контроль	20	s	0,768	0,987	0,251	1,091	0,189	0,713	0,234	1,316	0,245	1,013

*- различие достоверно р<0,05 (по критерию Манна-Уитни)

**- различие достоверно р<0,05 (по критерию Вилкоксона)

^- различие достоверно р<0,05 (по критерию Вилкоксона)

Таким образом, достоверно выявлено увеличение МПК в СОТК при КРР на расстоянии 1 см от опухоли, а также снижение активности свободнорадикального повреждения и усиление апоптоза в этой зоне.

Известно, что прогноз течения ВЗК во многом определяется соотношением клеточной пролиферации к апоптозу. Нарушение клеточного гомеостаза колоноцитов предопределяет возникновение атрофических, метапластических, диспластических изменений. При резком, остро возникшем дисбалансе факторов, вызывающих апоптоз и усиливающих пролиферацию, создаются условия для последующего развития некроза эпителиоцитов СОТК с формированием эрозивно-язвенного поражения. В настоящее время особую роль в регуляции клеточного гомеостаза СОТК отводят PCNA, Ki-67, циклину D1, р53 и апоптозу [Adams J.M.et al.,1999; Igarashi M. et al.,2001; Pickett C.A. et al., 2005; Bartusel T. et al., 2005; Yang F.G. et al., 2005]. Сведения об их взаимосвязях с функциональной морфологией основных компонентов APUD-системы, тучных клеток при ВЗК отсутствуют.

Нарушение клеточного обновления при ВЗК способствует в значительной мере более частому развитию опухолевых заболеваний толстой кишки у таких пациентов. Изменение клеточного гомеостаза у больных с ВЗК связано с развитием атрофии слизистой кишки. В свою очередь появление атрофии СОТК служит фоном для возникновения дисплазии и колоректального рака.

В результате нашего исследования установлено, что при ВЗК и КРР происходят изменения функциональной морфологии APUD-системы. Нейроэндокринные сдвиги при ЯК характеризуются: значительным превышением (в 2 раза) ПЭ МПК над таким же показателем для СПК, а также по сравнению с контрольной группой; в то же время по показателям ОП оба типа нейроэндокринных клеток не отличались друг от друга.

При БК выявлено снижение показателя ПЭ МПК по сравнению с контрольной группой. При этом такой же показатель для СПК был повышен, и по показателям ОП, содержание серотонина в клетках было выше, чем мелатонина, что, в свою очередь, может быть обусловлено особенностями патогенеза БК, связанной с нейроиммуноэндокринными нарушениями моторики кишечника и других каскадных биохимических реакций, в регуляции которых биогенные амины принимают активное участие.

Согласно перекисной концепции патогенеза развивается дисбаланс между продуктами перекисного окисления липидов (ПОЛ) и компонентами системы антиоксидантной защиты [Балаболкин М.И. с соавт., 2004; Креминская В.М., Клебанова Е.М., 2004].

В результате нашего исследования установлено, что при ЯК отмечается уменьшение количества свободных радикалов, наиболее вероятно за счет увеличения синтеза мелатонина, обладающего выраженным антиоксидантным действием. При БК отмечена тенденция к усилению накопления свободных радикалов по ПЭ NO-синтазы по сравнению с контрольной группой.

Известно, что мелатонин обладает выраженным антиоксидантным эффектом, независящим от состояния активности его рецепторов [Beyer B. et al., 1998; Cevik H. et al., 2005]. Более того, в отличие от большинства других внутриклеточных антиоксидантов, локализующихся преимущественно в определенных клеточных структурах, присутствие мелатонина и его антиоксидантная активность идентифицированы во всех клеточных структурах, включая ядро [Комаров Ф.И. и соавт., 2001]. Получены данные, об угнетении под влиянием мелатонина процессов перекисного окисления липидов в клетках иммунной системы (лимфоцитах) и этот эффект усиливается при одновременном назначении витамина Е, железа и под воздействием магнитного поля [Jaite J. et al., 2003].

Таким образом, увеличение количества МПК и соответственно количества синтезируемого мелатонина при ЯК приводит к уменьшению количества свободных радикалов за счет антиоксидантного действия мелатонина. В то время как при БК снижение МПК и соответственно количества синтезируемого мелатонина приводит к накоплению свободных радикалов и более глубокому повреждению СОТК.

Следующим направлением в нашем исследовании было изучение процессов апоптоза и клеточного обновления.

Апоптоз уравновешивает новообразование клеток. В настоящее время установлено, что значительная часть клеток слизистых оболочек, завершив свой жизненный цикл, погибает на месте путем апоптоза [Andersson R., Wang X., 1997]. Допускается, что именно апоптоз, а не отторжение - главный механизм удаления состарившихся клеток [Hall P. et al., 1994]. Путем программированной клеточной гибели происходит удаление клеток, выживание которых нежелательно для организма, например мутантных клеток или клеток, зараженных вирусом. В последнем случае этот процесс имеет важное биологическое значение, поскольку фрагментация ДНК предупреждает перенос генетического материала в другие клетки [Jacquelyn J. et al., 1998]. Велико значение апоптоза в поддержании тканевого гомеостаза и в регуляции объема тканей. Гомеостаз тканей обеспечивается равновесием между новообразованием клеток (митоз) и их гибелью (апоптоз). Преобладание митозов над апоптозами приводит к гиперплазии, апоптозов над митозами - к атрофии [Solary E. et al., 1996]. Апоптоз - физиологический процесс и его нарушение ведет к нелигитивному выживанию клеток, патологии развития или к заболеваниям и опухолям [Shirin H., Moss S.F., 1999].

Возникновение и прогрессирование ЯК связано с резким снижением маркеров пролиферативной активности PCNA, циклина D1 и нарастанием апоптоза. Изменение ПКОЭ кишечника является причиной воспалительного процесса. По данным F. Sipos et al. (2002), при ЯК соотношение показателей апоптоза/пролиферации различаются в зависимости от степени гистологической активности воспалительного процесса в СОТК.

Выявленные нами ПКОЭ при ЯК демонстрировали достоверное усиление процессов апоптоза по сравнению с контрольной группой и преобладание апоптоза над пролиферацией клеток, что отражает усиление гибели клеток при развитии ЯК. При БК отмечено слабое преобладание процессов пролиферации клеток над процессами апоптоза, что отражает сохранение способности эпителиоцитов к регенераторным процессам, что, в свою очередь, может быть результатом снижения выработки мелатонина.

Следует подчеркнуть, что пролиферативная активность эпителиоцитов кишечника в течение длительного времени обладает относительным постоянством, при этом апоптозный индекс увеличивается по мере старения организма [Kvetnoy I. et al., 2001]. В настоящее время доказано, что содержание PCNA во многом определяет прогноз возникновения и развития опухолей [Martins A.C. et al., 2005; Aziz S.A. et al., 2005].

Приведенные литературные данные позволяют сделать заключение о роли апоптоза и пролиферации эпителиоцитов СОТК в возникновении и прогрессировании ЯК и о наличии взаимосвязи процессов клеточного обновления колоноцитов с функциональной морфологией APUD-системы.

По нашем данным при ЯК несмотря на достоверное преобладание процессов апоптоза над пролиферацией, отмечается достоверное повышение пролиферативной активности по сравнению с контрольной группой, что может свидетельствовать об изначальном компенсаторном повышении пролиферативной активности в ответ на альтерацию, но при утяжелении процесса истощении компенсаторных механизмов.

Таким образом, можно констатировать, что ВЗК - БК и ЯК - можно рассматривать как апудопатии. Предметом дальнейших дискуссий и исследований может быть решение вопроса - какие из выявленных нейроэндокринных сдвигов являются механизмами патогенеза, а какие саногенеза. Это будет на наш взгляд важно для разработки новых патогенетически обоснованных методов лечения.

Кроме того, мы изучили изменение нейроэндокринных показателей при колоректальном раке.

По нашим данным ПЭ МПК при КРР на расстоянии 1 см от опухоли незначительно превышала такой же показатель для СПК, однако, как ПЭ МПК, так и ПЭ СПК были снижены по сравнению с контрольной группой, что может свидетельствовать об истощении компенсаторных механизмов.

Выявлено снижение пролиферации клеток и усиление апоптоза. Кроме того, отмечено усиление апоптоза при КРР по сравнению с контрольной группой. Также выявлено достоверное снижение активности свободнорадикальных процессов по сравнению с контрольной группой.

Установлено увеличение МПК и синтеза мелатонина в СОТК при КРР на расстоянии 1 см от опухоли, а также снижение активности свободнорадикального повреждения и усиление апоптоза в этой зоне, что можно расценивать, как попытку организма отграничить распространение опухолевого процесса.

Таким образом, исходя из вышеизложенного, можно предположить, что ДНЭС принимает активное участие в развитии ВЗК и КРР.

Во второй части исследования проводилось изучение использования мелатонина в терапии ВЗК.

Изменение количества и синтеза мелатонина при ВЗК, выявленное в первой части исследования, позволило предположить возможность его использования в комплексной терапии ВЗК.

Группа больных БК (n=20) была разбита на две подгруппы по 10 больных в каждой (n=10), для проведения сравнительного анализа эффективности применения мелатонина, при включении его в комплексную терапию БК в сравнение с подгруппой получавшей только традиционную патогенетическую терапию. Выделенные подгруппы были сопоставимы (репрезентативны). В подгруппе больных БК (n=10), из них 4 (40%) мужчин и 6 (60%) женщин, средний возраст которых 33,5 лет, получали комплексную терапию с использованием мелатонина.

В клиническом статусе: у 7(70%) больных состояние расценено как удовлетворительное, у 3(30%) средней тяжести. Локализация поражения в терминальном отделе подвздошной кишки выявлена у 2 (20%) больных, толстой кишке у 7(70%), прямой - 1(10%). По течению БК: острое у 1(10%), рецидивирующее - 7(70%), непрерывно рецидивирующее - 2(20%). Среднее количество обострений в год составило 2 + 1,5. Индекс Беста < 150 у 5(50%) больных, индекс Беста > 150 у 50% больных. Кишечные осложнения в анамнезе (в виде свищей, стриктур и т.д.) отмечены у 25% больных, внекишечные 20%. Средняя длительность заболевания составила 3,5+ 1,5 лет.

В группе больных БК (n=10), получавших только патогенетическую терапию средний возраст 34,5 лет, из них мужчины 4 (40%), женщины 6 (60%). Средняя длительность заболевания составила 6,0+ 1,0 лет. В клиническом статусе: у 7(70%) больных состояние расценено как удовлетворительное, у 3(30%) средней тяжести. Локализация поражения в терминальном отделе подвздошной кишки выявлена у 2(20%), толстой кишке у 7(70%), прямой - 1(10%). По течению БК: острое у 1(10%), рецидивирующее - 7(70%), непрерывно рецидивирующее 2(20%). Среднее количество обострений в год составило 2 + 1,5. Индекс Беста < 150 у 50% больных, индекс Беста > 150 у 50% больных. Кишечные осложнения в анамнезе (в виде свищей, стриктур и т.д.) отмечены у 25% больных, внекишечные 20%.

Сравнение результатов электронно-микроскопического исследования образцов биопсии в подгруппах больных болезнью Крона, получавших комплексную терапию с использованием мелатонина и получавших только патогенетическую терапию.

В подгруппе больных БК, получавших комплексную терапию с использованием мелатонина, при электронной микроскопии биопсий до начала лечения выявлено:

Почти на всем протяжении СОТК сохраняются бокаловидные и цилиндрические клетки. В бокаловидных клетках содержатся в разном количестве слизистые гранулы. На поверхности цилиндрических клеток ворсинок мало, они короткие часто отсутствуют (Рис. 22). Встречаются небольшие участки некроза на месте единичных язв.

Рис. 24. Клетка Панета с гранулами

в цитоплазме. х I000

Рис. 22. Ворсинки отсутствуют или единичные мелкие.х10000

В базальных отделах СОТК располагаются недифференцированные клетки, иногда встречаются клетки Панета (Рис. 24), единичные нейроэндокринные клетки. Главные патологические изменения касаются наличия воспалительной инфильтрации, которая встречается по всей толщине кишечной стенки, но преимущественно в подслизистом слое (в т.н. в собственной пластинке). В целом воспалительная инфильтрация выражена умеренно и главным образом в подслизистом слое.

Имеются участки некроза (Рис.26). Воспалительная инфильтрация наблюдается в виде отдельных очагов в разных отделах кишки. Чаще воспалительные очаги мелкие (3-5 клеток) реже более крупные, состоящие из 10-15 клеток (Рис. 27). В инфильтратах встречаются главным образом лимфоидные клетки (мелкие, средние лимфоциты и лимфобласты, реже имеются гранулоциты). Местами располагаются плазматические и тучные клетки.

Рис. 26. Участок некроза слизистой оболочки в области образования язвы. х 12000

Рис. 27. Слабая воспалительная инфильтрация в различных участках подслизистого слоя, одиночные или мелкие группы лимфоидных

клеток х6000

При исследовании биопсий этих же больных через 30 дней комплексной терапии выявлено, что: слизистая оболочка практически на всем протяжении имеет обычное ультраструктурное строение. Бокаловидные клетки встречаются на всем протяжении крипт, особенно их много в верхних отделах желез. Эти клетки содержат в апикальных отделах крупные слизистые гранулы. В базальных отделах располагаются ядра

Между слизистыми клетками видны цилиндрические клетки плотно прилежащие друг к другу или к слизистым клеткам. В цитоплазме цилиндрических клеток иногда имеются плотные гранулы. На большем протяжении на поверхности цилиндрических клеток развиты ворсинки, часто образующие щеточную каемку. Лишь в отдельных местах ворсинки иногда развиты умеренно (Рис.40,41).

Рис.40. Отдельные цилиндрические клетки содержат на поверхности небольшое количество ворсинок. Слизистые клетки развиты хорошо. х8000.

Рис.41. На большом протяжении слизистой оболочки видны на поверхности ворсинки, образующие щеточную каемку х6000

Воспалительная инфильтрация практически отсутствует. Встречаются отдельные лимфоциты, гранулоциты, тучные клетки, не превышающие их количество и локализацию в норме. В базальных отделах трубчатых желез иногда располагаются, как и в норме, эндокринные клетки (Рис. 43,44).

Рис. 43. В базальном слое СОТК располагается нейроэндокринная клетка,богатая нейроэндокринными гранулами х 5000

Рис.44. Тучные клетки в подслизистом слое содержат крупные округлые различного размера гранулы х 5000

Таблица №7

Сравнение электронно-микроскопических признаков слизистой кишки в подгруппе больных БК, получавших комплексную терапию с мелатонином.

ПРИЗНАК	до лечения	после лечения	разница	кр. Вилкоксона
воспаление	3	0	3	0,011
слизистые клетки	3	4	1	0,043
слизистые гранулы	3	4	0,5	0,067
цилиндрические клетки	3,5	4	0,5	0,068
ворсинки	2	3,5	1	0,012
эндокринные клетки	2,5	4	1,5	0,028
эндокринные гранулы	2,5	4	1	0,043
недифференцированные клетки	3,5	4	0	0,36
дистрофия	2	0	1,5	0,012
полнокровие	2,5	0	2,5	0,012
отек	2	0	2	0,012
щелевидные язвы	1	0	0,5	0,068
суммарный балл	8,5	24,5	16	0,012
суммарный балл №	9,5	22	12	0,013

Достоверность различий по критерию Вилкоксона

Электронно-микроскопическое исследование толстой кишки (Воспаление, дистрофия, полнокровие, отек: сильное 4, среднее 3, умеренное 2, слабое 1, отсутствует 0. Количество клеток, гранул, ворсинок, язв: высокое 4, среднее 3, умеренное 2, низкое 1, отсутствуют 0.)

Оценка признаков и сравнение результатов электронно-микроскопического исследования в подгруппе больных БК до и после лечения с использованием мелатонина проводилась с использованием бальной системы.

Выявлено достоверное уменьшение воспаления, увеличение количества слизистых клеток с полноценными гранулами. Цилиндрические клетки с нормальным количеством ворсинок. Эндокринные клетки с нормальным количеством гранул. Исчезли дистрофия, полнокровие и отек.

При изучении биопсий второй подгруппы больных БК, которая получала только патогенетическую терапию, выявлено: в СОТК достаточно распространены дистрофические изменения эпителиальных клеток, как слизистых, так и цилиндрических. На поверхности цилиндрических клеток незначительное количество ворсинок (Рис. 46). Встречаются участки некроза, на местах, соответствующих образованию изъязвлений (Рис. 49), выраженная дистрофия.

Рис. 46. Отдельные слизистые клетки. Рис.49. Участок некроза СОТК поверхности цилиндрических клеток оболочки в месте образования язвы.

единичные короткие ворсинки. х 6000 х 5000

В собственной пластинке, в подслизистом и мышечном слоях достаточно сильно выражена воспалительная инфильтрация с преобладанием лимфоцитов и в меньшей степени клеток гранулоцитарного ряда. Встречаются плазматические и тучные клетки.

Через 30 дней традиционной патогенетической терапии обнаружено, что большинство бокаловидных клеток слизистой оболочки развиты умеренно или слабо. Такие клетки содержат небольшое количество слизистых гранул иногда гранулы единичные. В отдельных слизистых клетках наблюдаются явления слабо выраженной дистрофии.

Цилиндрические клетки часто не плотно примыкают друг к другу и соседним слизистым клеткам. На поверхности большинства цилиндрических клеток ворсинки развиты слабо и редко образуют щеточную каемку (Рис.60,61).

Рис.60,61. Часть цилиндрических клеток имеет на поверхности умеренное количество ворсинок, иногда их мало х 5000, х 4000

В подслизистом слое иногда сохраняются небольшого объема воспалительные инфильтраты, главным образом состоящие из лимфоидных клеток разной степени зрелости. Встречаются тучные клетки и в меньшей степени нейроэндокринные.

Таблица № 8

Сравнение электронно-микроскопических признаков слизистой кишки

в подгруппе больных БК, получавших традиционную патогенетическую терапию.

ПРИЗНАК	до лечения	после лечения	разница	кр. Вилкоксона
воспаление	4	1	3	0,018
слизистые клетки	3	4	0	0,11
слизистые гранулы	2	3	0	0,36
цилиндрические клетки	3	4	1	0,043
ворсинки	1	2	1	0,052
эндокринные клетки	2	3	2	0,028
эндокринные гранулы	2	3	0	0,27
недифференцированные клетки	3	4	1	0,22
дистрофия	3	1	2	0,018
полнокровие	3	0	2	0,018
отек	3	0	2	0,018
щелевидные язвы	3	0	2	0,018
суммарный балл	2	19	18	0,018
суммарный балл №	6	19	12	0,018

При подсчете показателей достоверно выявлено уменьшение воспаления, однако количество слизистых клеток и содержащихся в них гранул достоверно не изменилось. Количество цилиндрических клеток увеличилось, но количество ворсинок достоверно не изменилось. Количество эндокринных клеток возросло, однако количество эндокринных гранул в них увеличилось недостаточно. Дистрофия, полнокровие и отек достоверно уменьшились.

Мы провели сравнительный анализ эффективности применения мелатонина при лечении БК представленный в таблице №9.

Таблица № 9

Сравнительный анализ электронно-микроскопических признаков в подгруппах больных БК

Электронно-микроскопическое исследование толстой кишки (Воспаление, дистрофия, полнокровие, отек: сильное 4, среднее 3, умеренное 2, слабое 1, отсутствует 0. Количество клеток, гранул, ворсинок, язв: высокое 4, среднее 3, умеренное 2, низкое 1, отсутствуют 0.)
ПРИЗНАК	БК + мелатонин			БК без мелатонина
ПРИЗНАК	до лечения	после лечения	разница	до лечения	после лечения	разница
воспаление	3	0	3	4	1	3
слизистые клетки	3	4	1	3	4	0
слизистые гранулы	3	4	0,5	2*	3**	0
цилиндрические клетки	3,5	4	0,5	3	4	1
ворсинки	2	3,5	1	1	2**	1
эндокринные клетки	2,5	4	1,5	2	3	2
эндокринные гранулы	2,5	4	1	2	3	0
дистрофия	2	0	1,5	3*	1	2^
полнокровие	2,5	0	2,5	3	0	2
отек	2	0	2	3	0	2
щелевидные язвы	1	0	0,5	3*	0	2^
суммарный балл	8,5	24,5	16	2*	19**	18
суммарный балл №	9,5	22	12	6	19**	12

Проведенный сравнительный анализ показал, что: при добавлении мелатонина у больных достоверно (р<0,05) снижается распространенность и интенсивность воспалительных изменений в СОТК, уменьшаются дистрофические изменения в эпителиальных клетках, которые встречаются реже и не столь выражены, как при лечении препаратами без добавления мелатонина. Уменьшается образование язвенных изменений, отсутствуют гранулемы и абсцессы в криптах.

В этой группе больных через 30 дней лечения с добавлением мелатонина СОТК практически имеет нормальное строение. В ней отмечается обилие бокаловидных и цилиндрических клеток, большинство последних содержат развитые ворсинки, которые образуют на значительном протяжении щеточную каемку. Встречаются так же отдельные клетки Панета, нейроэндокринные клетки и тучные клетки. Воспалительная инфильтрация отсутствует. Встречаются лимфоциты и гранулоциты не превышающее их количество в нормальной слизистой оболочке.

В группе больных, леченных традиционной схемой без добавления мелатонина, все патологические изменения в СОТК более выражены. Особенно это касается воспалительной инфильтрации и дистрофических изменений эпителиальных клеток, а также более часто встречающихся участков некроза на месте образования язв.

Таким образом, проведенное электронно-микроскопическое исследование СОТК при БК свидетельствует, что дополнительное использование мелатонина наряду с обычно применяемыми препаратами значительно улучшает результаты лечения в период активной фазы болезни и способствует более полному восстановлению обычного ультраструктурного строения слизистой оболочки толстой кишки.

Сравнение подгрупп больных язвенным колитом.

Помимо группы больных БК была сформирована группа из 20 больных ЯК (n=20), средний возраст которых составил 51год.

Эта группа также была разбита на две подгруппы по 10 больных в каждой (n=10), для проведения сравнительного анализа эффективности применения мелатонина, при включении его в комплексную терапию ЯК в сравнение с подгруппой получавшей только традиционную патогенетическую терапию. Выделенные подгруппы были сопоставимы (репрезентативны). В подгруппе больных ЯК (n=10), получавших комплексную терапию с использованием мелатонина, средний возраст 51 лет, мужчины 4 (40%), женщины 6 (60%). В клиническом статусе: у 70% больных состояние расценено как удовлетворительное, у 3(30%) средней тяжести. Локализация поражения в толстой кишке у 8(80%), прямой - 2(20%). По течению ЯК: рецидивирующее - 8(80%), непрерывно рецидивирующее - 2(20%). Среднее количество обострений в год составило 2 + 1,5. Средняя длительность заболевания составила 5,3+ 4,2 лет.

В группе больных ЯК (n=10), получавших только патогенетическую терапию средний возраст 51лет из них мужчины 4 (40%), женщины 6 (60%). Средняя длительность заболевания составила 2,5+ 1,0 лет. В клиническом статусе: у 7(70%) больных состояние расценено как удовлетворительное, у 3(30%) средней тяжести. Локализация поражения толстой кишке - 8(80%), прямой - 2(20%). По течению ЯК: рецидивирующее - 8(80%), непрерывно рецидивирующее 2(20%). Среднее количество обострений в год составило 2 + 1,5.

Оценка результатов лечения в подгруппе больных ЯК, получавших терапию с использованием мелатонина.

Макро- и микроскопические изменения при ЯК хорошо известны. В настоящее время общепризнанно, что патологический процесс при ЯК начинается в прямой кишке с образованием эрозий и/или язв и распространяется в проксимальном направлении, захватывая вышележащие слои кишечной стенки, распространяясь на всю толстую кишку, а в, ряде случаев, поражая и терминальный отдел подвздошной кишки [Аруин Л.И и соавт., 1998; Farmer R.G. et al., 1993; Kirsner J.B., Shorter R.G.,1995; Glickman R.M.,1998]. Микроскопическая картина определяется стадией заболевания и характером течения процесса.

До начала лечения в подгруппе больных ЯК, получавших комплексную терапию с использованием мелатонина выявлено: ультраструктурные изменения наблюдаются в эпителиальных клетках. В некоторых бокаловидных клетках слизистые гранулы присутствуют в небольшом количестве, они различного размера и разной степени зернистости. Обнаруживается воспалительная инфильтрация в виде различного размера очагов, состоящих главным образом из лимфоидных клеток и в меньшей степени сегментоядерных лейкоцитов и отдельных эозинофилов.

Бокаловидные клетки разного размера и формы, иногда с признаками дистрофических или атрофических изменений (Рис. 69,72).

Рис. 69. Выраженная дистрофия Рис. 72. Выраженная в различной степени бокаловидной клетки, слизистых гранул мало, воспалительная инфильтрация в

они гомогенные, слизи в них не видно. х 8000 подслизистом слое х 4000.

Цилиндрические клетки также разного размера, часть этих клеток на поверхности имеет ворсинки, другие практически их лишены или последние короткие, единичные (Рис. 70,71). Отдельные лимфоидные клетки и/или лейкоциты видны внутри крипт, образуя единичные крипт - абсцессы.

Рис. 70,71. Цилиндрические клетки с различным количеством ворсинок на поверхности. х 6000, х 8000

Воспалительные изменения при ЯК характеризуются инфильтрацией стромы слизистой оболочки, нарушением нормального строения крипт, эрозивно-язвенными поражениями, дистрофическими изменениями в колоноцитах. Наряду с усилением эрозивно-язвенного процесса, обусловленного некротическими изменениями в СОТК, по мере прогрессирования воспаления, происходит компенсаторное увеличение частоты митозов эпителиоцитов кишечных крипт. Известно, что активация процессов компенсации является общебиологической реакцией на повреждение. В связи с этим, наблюдается закономерность, - чем больше повреждение, тем интенсивнее происходят процессы регенерации. О тяжести воспалительного процесса в СОТК свидетельствовали плотность инфильтративных изменений, клеточный состав инфильтрата, наличие крипт-абсцессов и их количество. По мере усиления воспалительного процесса в СОТК нарастает частота и тяжесть диспластических изменений.

Считается, что при ЯК происходит увеличение апоптоза эпителиоцитов СОТК и снижение - лейкоцитов в собственной пластинке слизистой. В результате этого лейкоциты задерживаются в СОТК, активность их увеличивается, вследствие чего и происходит повреждение слизистой при ЯК [Seidelin J.B. et al., 2003].

Воспалительные инфильтраты встречаются в участках собственной пластинки, реже в подслизистом и иногда в мышечном слое.

У основания крипт наблюдаются тучные клетки, встречаются отдельные эндокринные клетки. Следует отметить очаговое умеренно выраженное полнокровие капилляров и мелких сосудов слизистой оболочки. Иногда видны пердиапидезные скопления отдельных групп эритроцитов. В слизистой оболочке видны отдельные некротические участки (места расположения язв). В основании язв определяются скопления некротической ткани, в зоне которой и рядом с ней отмечается фибриноидное набухание и некроз. Сохранившиеся островки слизистой оболочки набухшие и полнокровные. Они часто формируют полиповидные образования различной величины, без четкой дифференциации на тело и ножку полипа. Одновременно с поражением стенки толстой кишки отмечаются явления регенерации слизистой оболочки в виде гипертрофии и формирования железистых комплексов в наползающей на язвы слизистой оболочке. Участки регенерации сочетаются с участками фиброза, являющимися одной из форм атрофии, деформирующей структуру стенки кишки. При этом отмечается развитие грубоволокнистой соединительной ткани и образование грануляций в дне язв. Обнаруживаются клетки Панета. В части клеток различного типа (лимфоидных, гранулоцитах, эпителиальных) иногда встречается различное количество лизосом. Местами в слизистой оболочке наблюдаются участки некроза.

Таблица№11

Сравнение результатов электронно-микроскопического исследования образцов

биопсии в подгруппах больных язвенным колитом, получавших комплексную

терапию с использованием мелатонина.

ПРИЗНАК	до лечения	после лечения	разница	кр. Вилкоксона
воспаление	3,5	0,5	3	0,028
слизистые клетки	2	3,5	1,5	0,043
слизистые гранулы	2	4	1,5	0,043
цилиндрические клетки	2	3,5	1,5	0,043
ворсинки	2	4	2	0,028
эндокринные клетки	2,5	4	1	0,028
эндокринные гранулы	2,5	3,5	0,5	0,2
дистрофия	3,5	0	2,5	0,028
полнокровие	4	0,5	2,5	0,028
крипт-абсцессы	4	0,5	3	0,028
язвы	3,5	0	3,5	0,028
суммарный балл	-1,5	22	21,5	0,028

Таким образом, достоверно уменьшается воспаление, нормализуется клеточный состав и секреторная активность клеток СОТК. Уменьшается дистрофия, полнокровие, исчезают крипт-абсцессы.

Оценка результатов лечения в подгруппе больных язвенным колитом, получавших терапию без использования мелатонина через 30дней лечения.

На большем протяжении СОТК выявляются бокаловидные и цилиндрические клетки, располагающиеся в трубчатых железах, имеющих обычное строение. В нижних отделах желез видны недифференцированные клетки. Бокаловидные клетки содержат в цитоплазме, как правило, большое количество слизистых гранул, в отдельных клетках их количество умеренное или низкое (Рис. 80). На поверхности цилиндрических клеток располагаются микроворсинки, образующие часто щеточную каемку (Рис. 82).

Рис. 80. Бокаловидные клетки содержат Рис. 82. Цилиндрическая клетка. На

в цитоплазме обычное количество поверхности видны ворсинки, местами

зернистых слизистых гранул. х 10000 образующие щеточную каемку. х 5000.

В отдельных участках слизистой оболочки главным образом в области ее собственной пластинки встречаются единичные или мелкие группы (из 2-5 клеток) лимфоидных, реже гранулоцитарных и плазматических клеток

В слизистой оболочке нередко встречаются тучные клетки, нейроэндокринные и клетки Панета. Одним из наиболее постоянных морфологических признаков ЯК обнаружение клеток Панета главным образом в базальных отделах слизистой оболочки, что служило маркером метаплазии эпителия, поскольку эти клетки в норме локализуются только в тонкой кишке, а в сигмовидной не встречаются.

Функциональное значение клеток Панета до конца не установлено. Некоторые авторы полагают, что клетки Панета осуществляют трофическую функцию, способствуя обновлению кишечного эпителия [Аруин Л.И., 1998]. Наши данные о частом появлении в толстой кишке панетовских клеток при ЯК соответствуют наблюдениям других исследователей, которые описывали увеличение числа этих клеток при ЯК в 300 раз, так что их количество значительно превышает обычное число этих клеток в типичных местах их расположения - криптах тощей и подвздошной кишок [Аруин Л.И., 1998]. Столь частое обнаружение клеток Панета при ЯК подчеркивает их важную роль в течении и оценке прогноза при данной патологии. Следует подчеркнуть, что появление панетовских клеток в глубине крипт является не только характерным признаком хронического воспаления (панетовская метаплазия), но и указывает на изменения функциональной морфологии эндокринных клеток кишечника при ЯК [Аруин Л.И. и соавт., 1998].

Эрозии, изъязвления, крипт-абсцессы в исследуемом материале не встречаются. В отдельных эпителиальных клетках имеются умерено выраженные дистрофические изменения в виде разрушения или отека отдельных органоидов или клеток в целом.

В группе больных ЯК, получавших только традиционную патогенетическую терапию, до начала лечения при исследовании биопсий выявлено, что на поверхности цилиндрических клеток отсутствуют ворсинки (Рис. 89)

Рис. 89. На поверхности цилиндрических клеток

отсутствуют ворсинки x 5000.

Рис. 93. Некротические изменения в клетках. x 10000

Морфологически ЯК характеризовался геморрагически-гнойным воспалительным процессом. При минимальной активности патологического процесса в толстой кишке, как правило, отмечалось утолщение слизистой оболочки с многочисленными геморрагиями, эрозиями, мелкими изъязвлениями. При выраженной активности процесса наблюдалась гипоплазия слизистой оболочки вплоть до полной ее аплазии, часто встречались язвы, размеры и глубина которых зависели от распространенности некробиотических изменений. Границы между эпителиоцитами не всегда четко контурировалиcь (Рис. 93.).

При активном воспалительном процессе в строме СОТК в воспалительном инфильтрате, наряду с моноядерными, часто определялись полиморфноядерные лейкоциты, инфильтрация гранулоцитами эпителия крипт (так называемый криптит). При высокой активности воспалительного процесса обнаруживалась гранулоцитарная инфильтрация поверхностного эпителия (микроабсцессы эпителия).

По данным литературы в период обострения ЯК в СОТК обнаруживаются выраженная воспалительная инфильтрации, отек и кровоизлияния. Непрерывно рецидивирующее течение ЯК с тяжелейшими структурными изменениями СОТК свидетельствует об участии иммунных механизмов. Характерные черты эпителия кишечника, проявляющиеся в норме полноценной регенерацией, при ЯК утрачивают свои свойства. Даже в период ремиссии, в СОТК сохраняются признаки воспалительной инфильтрации. Наряду с инфильтративными изменениями, как правило, обнаруживаются и явления атрофии СОТК. Значительное число случаев дисплазии эпителия СОТК в периоде ремиссии ЯК, главным образом, связано с избыточной пролиферацией и иммунодефицитным состоянием, всегда сопутствующим этому заболеванию. У больных с ЯК присутствует генетическая нестабильность генома колоноцитов, приводящая к возникновению мутаций и инактивированию туморсупрессивных генов и развитию КРР [Haspar N. et al, 1994; Адлер Г., 2001].

Через 30 дней лечения отмечено, что полноценные слизистые клетки встречаются редко. Большинство бокаловидных клеток содержат единичные или небольшие группы слизистых гранул. (Рис. 99) Общее количество бокаловидных клеток уменьшено. В цитоплазме части сохранившихся бокаловидных клеток отмечаются явления дистрофии и некроза.

Рис.100. На поверхности цилиндрических Рис. 103. Скопление эритроцитов

клеток небольшое количество (пердиапидезные кровоизлияния)

ворсинок х 6000 х 4000

На поверхности цилиндрических клеток ворсинки развиты слабо, реже умерено, они короткие, единичные клетки содержат на поверхности щеточную каемку. Иногда цилиндрические клетки атрофичны, истончены, их цитоплазма бедна органоидами (Рис. 100). Избыточное развитие соединительно-тканных волокон и явления склероза. Сосуды СОТК во многих местах расширены, полнокровны. Отмечаются явления пердиапидезных кровоизлияний (Рис. 103).

В СОТК достаточно сильно выражена воспалительная инфильтрация, распространяющаяся преимущественно в области собственной пластинки, но проникающая местами и в другие отделы слизистой оболочки. В отдельных участках слизистой оболочки видны очаги выраженного некроза отдельных клеток или их групп с образованием изъязвлений.

Следует отметить, что в слизистой оболочке, главным образом в подслизистом и мышечном слое, встречаются участки избыточного развития волокон соединительной ткани и явления склероза (Рис. 104). В базальных отделах слизистой оболочки встречаются часто клетки Панета, реже видны тучные. Полученные результаты отражены в Таблице №12.

Таблица№12

Сравнение электронно-микроскопических признаков слизистой кишки

в подгруппе больных ЯК, получавших традиционную патогенетическую терапию

ПРИЗНАК	до лечения	после лечения	разница	кр. Вилкоксона
воспаление	4	2	2	0,068
слизистые клетки	2,5	3	1	0,27
слизистые гранулы	2	3	1	0,068
цилиндрические клетки	2,5	3	1	0,11
ворсинки	2,5	3	0,5	0,48
эндокринные клетки	2,5	3	1	0,11
эндокринные гранулы	1,5	3	1	0,068
недифференцированные клетки	3	3	0	1
дистрофия	3	3	-0,5	0,42
полнокровие	4	2	2	0,068
крипт-абсцессы	4	1,5	2,5	0,068
язвы	4	1	3	0,068
суммарный балл	-2	14	15	0,068

Результаты сравнения электронно-микроскопического исследования образцов биопсии в подгруппах больных ЯК, получавших комплексную терапию с использованием мелатонина и получавших только патогенетическую терапию представлены в таблице №13.

Таблица №13

Сравнение результатов электронно-микроскопического исследования образцов биопсии в подгруппах больных язвенным колитом, получавших комплексную терапию с использованием мелатонина и получавших только патогенетическую терапию.

ПРИЗНАК	ЯК + мелатонин			ЯК без мелатонина
ПРИЗНАК	до лечения	после лечения	разница	до лечения	после лечения	разница
воспаление	3,5	0,5	3	4	2**	2^
слизистые клетки	2	3,5	1,5	2,5	3	1
слизистые гранулы	2	4	1,5	2	3**	1
цилиндрические клетки	2	3,5	1,5	2,5	3	1
ворсинки	2	4	2	2,5	3	0,5^
эндокринные клетки	2,5	4	1	2,5	3	1
эндокринные гранулы	2,5	3,5	0,5	1,5	3	1
недифференцированные клетки	3,5	3,5	0	3	3	0
дистрофия	3,5	0	2,5	3	3**	_0,5^
полнокровие	4	0,5	2,5	4	2	2
крипт-абсцессы	4	0,5	3	4	1,5**	2,5
язвы	3,5	0	3,5	4	1	3
суммарный балл	-1,5	22	21,5	-2	14**	15^

При комплексном лечении с добавлением мелатонина менее выражены воспалительные изменения в СОТК, это касается как интенсивности воспаления, так и его распространенности, отсутствуют участки некрозов и язвенные изменения, полнокровие сосудов и образование пердиапидезных кровоизлияний. Наблюдается практически полное восстановление ультраструктуры различных типов строения эпителиальных клеток, их количества, локализации и исчезновение признаков воспаления в СОТК.

При лечении только традиционной схемой воспалительные и дистрофические изменения эпителиальных клеток более выражены и распространены, чаще встречаются участки некрозов и язвенные изменения.

Таким образом, на основании проведенного электронно-микроскопического исследования СОТК при ЯК есть все основания считать, что дополнительное применение мелатонина в комплексном лечении этого заболевания способствует его более полному и быстрому купированию воспаления и восстановлению нормального ультраструктурного строения органа.

ВЫВОДЫ

При воспалительных заболеваниях кишечника - болезнь Крона и язвенный колит в СОТК изменяется количество нейроэндокринных клеток, и их функциональная активность.
При ЯК, достоверно отмечается значимое увеличение количества МПК и синтеза мелатонина по сравнению с СПК и контрольной группой.
При БК несмотря на увеличение количества МПК и СПК по сравнению с контрольной группой, отмечается снижение количества МПК по отношению к СПК, что свидетельствует об истощении компенсаторных резервов организма.
При КРР количество МПК в СОТК незначительно превышала такой же показатель для СПК, однако показатель площади экспрессии МПК по сравнению с контрольной группой был снижен, что может свидетельствовать об истощении компенсаторных механизмов организма в борьбе с распространением опухоли.
Выявлено снижение уровня NO-синтазы и соответственно показателей перекисного окисления липидов при ЯК по сравнению с контрольной группой, что вероятно обусловлено повышенным синтезом мелатонина, обладающего выраженным антиоксидантным действием. При БК выявлено увеличение уровня NO-синтазы и свободнорадикального повреждения вероятно вследствие снижения синтеза мелатонина.
При оценке уровня свободнорадикального повреждения в СОТК при КРР установлено достоверное снижение активности свободнорадикальных процессов по сравнению с контрольной группой, что вероятно является следствием увеличения количества синтезируемого мелатонина.
При ЯК отмечено снижение показателей клеточной пролиферативной активности (PCNA) и усиление апоптоза (р53) по сравнению с контрольной группой, что является саногенным эффектом при кишечном воспалении за счет антипролиферативного действия мелатонина. При БК, когда синтез мелатонина истощается, уровень апоптоза снижается и увеличиваются показатели пролиферативной активности.
Отмечается усиление апоптоза в СОТК при КРР, что демонстрирует попытку организма за счет повышения выработки мелатонина активировать апоптоз вокруг опухоли, который участвует в удалении поврежденных клеток при пролиферации клеточной популяции (в данном случае опухолевой популяции клеток) для ограничения опухолевого процесса.
Разработаны рекомендации по использованию мелатонина в комплексном лечении ВЗК Использование 3 мг мелатонина в составе комплексного лечения БК и ЯК достоверно в более короткие сроки позволяет добиться не только клинико-лабораторной ремиссии заболевания, но и восстановления ультраструктурного строения СОТК.
Мелатонин является одним из регуляторов механизмов патогенеза ВЗК и КРР, определяя взаимоотношения факторов альтерации и саногенеза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для диагностики и прогнозирования течения ВЗК - БК и ЯК в клинической практике целесообразно использовать количественные характеристики и оценку функциональной активности нейроэндокринных клеток толстой кишки, секретирующих мелатонин, серотонин, показателей клеточного обновления (пролиферирующего клеточного ядерного антигена и апоптоза), а также показателей активности образования свободных радикалов.
Для ранней диагностики распространения и генерализации КРР рекомендовано определение уровня мелатонина в СОТК.
Для лечения ВЗК БК и ЯК в клинической практике рекомендовано использовать комплексную терапию с применением 3 мг мелатонина, что позволяет в более короткие сроки добиться ремиссии заболевания и восстановления ультраструктуры слизистой оболочки толстой кишки.

СПИСОК РАБОТ

Воспалительные заболевания кишечника. Рахимова О.Ю., Юрков М.Ю., Митрофанова И.П., Пайзулаева З.К.// Руководство по гастроэнтерологии, Москва, 2010г., 4.10 Воспалительные заболевания кишечника, стр. 379-408. Медицинское информационное агентство.
Изучение молекулярных механизмов патогенеза иммуно-опосредственных воспалительных заболеваний на примере псориаза. Пирузян Э.С., Соболев В.В., Абдеев Р.М., Золотаренко А.Д., Николаев А.А., Саутин М.Е., Ишкин А.А., Пирузян Ан.Л., Ильина С.А., Корсунская И.М., Рахимова О.Ю., Брускин С.А. //Аcta Naturae №3, 2009г., стр.139-149.
Использование мелатонина при лечении воспалительных заболеваний кишечника. Рахимова О.Ю., Рапопорт С.И., Митрофанова И.П., Пайзулаева З.К. //Тезисы № 233 Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии №5, ХVIII том, 2008г. Приложение №32 Материалы Четырнадцатой Российской Гастрознтерологической Недели, 6-8 октября 2008г., г. Москва. Стр.62.
Исследование нейроэндокринных изменений при воспалительных заболеваниях кишечника и раке толстой кишки. Рахимова О.Ю., Пайзулаева З.К., Александров В.Б., Рапопорт С.И. // лКлиническая медицина №4, 2010г.,стр 44-47.
Исследование нейроэндокринных изменений при воспалительных заболеваниях кишечника у лиц пожилого и старческого возраста. / Пайзулаева З.К., Рахимова О.Ю., Рапопорт С.И. // Естественные и технические науки.2010. № 3, С.45.
К вопросу о поисках благоприятных обстоятельств для перехода от терапевтического к хирургическому лечению при болезни Крона и язвенном колите. Александров В.Б., Юрков М.Ю., Рахимова О.Ю., Гончаров А.Л. // Актуальные вопросы колопроктологии. Материалы второго съезда колопроктологов России с международным участием, 2007, г. Уфа. Стр. 461.
Колоректальный рак - актуальная проблема внутренней медицины. Александров В.Б., Рахимова О.Ю.// Клиническая медицина №3, 2008г., стр. 7-12.
Колоректальный рак (некоторые вопросы диагностики и лечения). Александров В.Б., Рахимова О.Ю. // Врач. №11, 2009г. стр. 8-10.
ечение тяжелых форм неспецифического язвенного колита и болезни Крона. Юрков М.Ю., Митрофанова И.П., Савицкий А.В., Рахимова О.Ю.// Актуальные вопросы колопроктологии. стр.366. Материалы второго съезда колопроктологов России с международным участием, 2007, г. Уфа. Стр. 457-458.
Мелатонин в лечении больных болезнью Крона толстой кишки. Пайзулаева З.К., Рахимова О.Ю., Митрофанова И.П., Александров В.Б., Рапопорт С.И.// Вестник хирургической гастроэнтерологии №4, 2008г., стр.117.
Мелатонин в лечении больных неспецифическим язвенным колитом. Митрофанова И.П., Пайзулаева З.К., Рахимова О.Ю., Александров В.Б., Рапопорт С.И. // Тезисы. РУДН 2008. IХ Международный конгресс Здоровье и образование в ХХI веке. Влияние космической погоды на биологические системы в свете учения А.Л. Чижевского 27-30 ноября 2008г., г. Москва. Стр.344
Мелатонин и артериальная гипертензия у пожилых. / Н. Г. Репетий, О. Ю. Рахимова // Актуальные вопросы современной медицины. Сборник тезисов и статей XXXVII итоговой научно-практической конференции научно-педагогического состава Самарского военно-медицинского института. - Самара, 2004. - С. 246-247.
Мелатонин и регуляция деятельности сердечно-сосудистой системы. / Н. Г. Репетий, О. Ю. Рахимова, Г. А. Пичко // Актуальные вопросы современной медицины. Сборник тезисов и статей XXXV итоговой научно-практической конференции научно-педагогического состава Самарского военно-медицинского института. - Самара, 2002. - С. 206-208.
Мелатонин: роль и значение в патологических процессах у лиц пожилого и старческого возраста. / Н. Г. Репетий, О. Ю. Рахимова, О. Н. Косачев, - Самара: Издательство СамВМИ, 2004. - 89 с.
Место лапароскопической технологии при выполнении тотальной колпроктэктомии. Александров В.Б., Виноградов Ю.А., Гончаров А.Л., Горшков К.С., Корнев Л.В., Рахимова О.Ю., Сологубов В.В., Юрков М.Ю.// Актуальные вопросы колопроктологии. Материалы второго съезда колопроктологов России с международным участием, 2007, г. Уфа. Стр. 366.
МСКТ при дивертикулезе тонкого кишечника и болезни Крона, осложненных кишечной непроходимостью. Осипенко В.И., Панова М.М., Александров К.К., Рахимова О.Ю. Конференция Современные методы медицинской визуализации и интервенционной радиологии.Узбекистан, Ташкент, 2010 стр. 273.
О роли ЕС-клеток продуцирующих мелатонин в патогенезе эрозивно-язвенных поражений желудка. / Н. Г. Репетий, О. Ю. Рахимова, Н. В. Бондаренко, М. А. Осадчук, А. Ю. Кулиджанов // Актуальные проблемы диагностики, лечения и профилактики гастроэнтерологических заболеваний у военнослужащих: Матер. Всероссийской научно-практической конференции. - Нижний Новгород, 2001. - С. 28-30.
Оценка нейроэндокринного статуса кишечника по экспрессии двух основных локально синтезируемых гормонов - серотонина и мелатонина у больных болезнью Крона и язвенным колитом. Рахимова О.Ю., Пайзулаева З.К., Митрофанова И.П., Александров В.Б., Рапопорт С.И. //Тезисы. Научно-практическая конференция Украинская школа эндокринологии. 3-5 июня 2009г., г. Харьков. Стр.193.
Оценка накопления свободных радикалов в слизистой оболочке акишечника по экспрессии основного фермента их синтеза NО-синтазы у больных болезнью Крона и язвенным колитом. Рахимова О.Ю., Пайзулаева З.К., Митрофанова И.П., Александров В.Б., Рапопорт С.И. //Тезисы №228 Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии №5, ХIХ том, 2009г. Приложение №34 Материалы Пятнадцатой Российской Гастрознтерологической Недели, 12-14 октября 2009г., г. Москва. Стр.61.
Оценка нейроэндокринного статуса кишечника у больных раком толстой кишки. Рахимова О.Ю., Пайзулаева З.К., Митрофанова И.П., Александров В.Б., Рапопорт С.И. //Тезисы. ХVII Российский национальный конгресс Человек и лекарство 12-16 апреля 2010г., г. Москва, стр.253.
Оценка нейроэндокринного статуса кишечника у больных язвенным колитом и болезнью Крона толстой кишки. Рахимова О.Ю., Пайзулаева З.К., Митрофанова И.П., Александров В.Б., Рапопорт С.И. //Тезисы. VIII Московская ассамблея Здоровье столицы. 17-18 декабря 2009г., г. Москва. Стр.213.
Оценка процессов клеточного обновления слизистой оболочки толстой кишки по экспрессии маркера пролиферации РСNA и маркера апоптоза р53 у больных болезнью Крона и язвенным колитом. Рахимова О.Ю., Пайзулаева З.К., Митрофанова И.П., Александров В.Б., Рапопорт С.И. //Тезисы. I съезд колопроктологов СНГ. 22-23 октября 2009г., г. Ташкент. Стр.20.
Продукция мелатонина у больных гипертонической болезнью. / Н. Г. Репетий, О. Ю. Рахимова, Г. А. Пичко // Актуальные вопросы современной медицины. Сборник тезисов и статей XXXV итоговой научно-практической конференции научно-педагогического состава Самарского военно-медицинского института. - Самара, 2002. - С. 208-211.
Псориаз и болезнь Крона. Рахимова О.Ю., Виноградов Ю.А., Юрков М.Ю., Савицкий А.В., Митрофанова И.П.//Клиническая медицина №7,2008г., стр.70-72.
Роль мелатонина в организме человека / Н. Г. Репетий, О. Ю. Рахимова // Актуальные вопросы современной медицины: Сборник тезисов и статей XXXIV итоговой научно-практической конференции научно-педагогического состава Самарского военно-медицинского института, посвященной 300-летию военного образования в России. - Самара, 2001. - С. 198-199.
Роль мелатонина в развитии заболеваний желудочно-кишечного тракта. Рахимова О.Ю.//Клиническая медицина № 3,2009г., стр.11-18.
Роль нейроэндокринный клеток желудочно-кишечного тракта в механизмах радиационного старения. / Н. Г. Репетий, О. Ю. Рахимова, А. А. Колпаков // Материалы Научно-практической конференции судебно-медицинских экспертов, посвященной 60-летию образования государственных судебно-экспертных учреждений министерства обороны РФ на территории Приволжско-Уральского военного округа. - Самара, 2005. - С. 233-235.
Роль мелатонина в ускоренном старении организма и связанную с ним возрастную патологию. / Пайзулаева З.К., Рахимова О.Ю., Рапопорт С.И. // Владикавказский медико-биологический вестник.2010. том.10,С. 201.
Сочетание болезни Крона и псориаза. Рахимова О.Ю., Юрков М.Ю., Митрофанова И.П., Пайзулаева З.К. //Тезисы. VIII Международный конгресс Здоровье и образование в ХХI веке; Концепции болезней цивилизации 14-17 ноября 2007г., г. Москва. Стр.538.
Язвенный колит и болезнь Крона - о выборе решения о переходе от консервативного к хирургическому лечению. Репетий Н.Г., Александров В.Б., Рахимова О.Ю. //Мед.весн.МВД.2010.№4.С.12-15
Аnalysis of candidate genes expression of psoriasis and Crohn's disease in order to elaborate new approaches for treatment disease. Abdeev R., Sobolev V., Bruskin S.,Masloboeva N., Soboleva A., Rakhimova O., Piruzian E.// International Congress of Genetics 2008-Abstract Submission System. Berlin 12-17 July 2008, р. 290.
Quantitative evaluation of the expression of candidate genes of psoriasis and Crohn's disease Abdeev R., Sobolev V., Bruskin S., Elkin A., Rakhimova O., Piruzian E.// 33 FEBS Congress 11 IUBMB Conference Biochemistry of Cell Regulation Athens? Greece 28 June-3July 2008, р. 8.

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по медицине

Blog