Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Сметанина Мария Александровна
РОЛЬ КОНСТИТУТИВНОГО РЕЦЕПТОРА АНДРОСТАНОВ В РЕАЛИЗАЦИИ КАНЦЕРОГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ В ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ
03.02.07 - генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Новосибирск 2012
Работа выполнена в лаборатории регуляции экспрессии генов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Меркулова Татьяна Ивановна
Официальные оппоненты:
Гуляева Людмила Федоровна, доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией молекулярных механизмов канцерогенеза Федерального государственного бюджетного учреждения Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, г. Новосибирск Шевченко Александр Игоревич, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории эпигенетики развития Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Ведущее учреждение:
Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии ДВекторУ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, г.Кольцово
Защита диссертации состоится л ______2012 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д 003.011.01 в ИЦиГ СО РАН, в конференц-зале Института по адресу 630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10.
Тел/факс: (383) 3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН.
Автореферат разослан л _________2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Гепатоклеточная карцинома стоит на третьем месте среди причин смертности от рака во всем мире (Shariff et al., 2009). Известно, что гепатоканцерогенез является многоступенчатым процессом, который включает в себя хорошо описанные стадии инициации, промоции и прогрессии опухолей. Однако, молекулярные события, происходящие на этих стадиях, пока еще мало изучены. Для исследования механизмов, лежащих в основе разных этапов развития гепатоклеточной карциномы, применяется стандартный подход, заключающийся в использовании экспериментальных моделей грызунов, у которых осуществляют инициацию опухолей химическими соединениями - инициаторами канцерогенеза с последующей промоцией опухолей с помощью других агентов (промоторов канцерогенеза) (Gold et al., 2001;
Heindryckx et al., 2009).
Орто-аминоазотолуол (ОАТ) вызывает опухоли печени у мышей ряда линий, например CBA, SWR, DBA/2, A/He, DD и C57BL, выступая в качестве и инициатора и промотора (Каледин, Захарова, 1984). ОАТ относится к классу аминоазокрасителей, широко используемых в легкой промышленности, в фармацевтике, и производство которых по всему миру может достигать порядка 0,5 миллионов тонн в год (National Toxicology Program, 2002). За последние несколько десятилетий получено большое количество данных о канцерогенной активности ряда аминоазокрасителей.
В частности, OAT был оценен Международным агентством по изучению рака (IARC) как возможный канцероген (класса 2B) для человека (IARC, 1975). Механизм действия этого соединения пока мало изучен. Ранее в лаборатории регуляции экспрессии генов ИЦиГ СО РАН была обнаружена тесная связь между опухолеиндуцирующим действием ОАТ и увеличением ДНК-связывающей активности конститутивного рецептора андростанов (СAR) в печени мышей. Было показано также, что ОАТ способен конкурировать с известным лигандом CAR - андростенолом за связывание с белками цитозоля клеток печени мышей (Пахарукова и др., 2007). Однако оставалось неисследованным влияние ОАТ на трансактиваторные свойства CAR и на экспрессию его генов-мишеней, для чего требовалось проведение экспериментов in vitro в CAR-репортерной системе и in vivo с использованием СAR-нокаутных мышей.
Одним из широко используемых промоторов опухолей печени у грызунов является фенобарбитал, применяемый в фармацевтике как антиконвульсант, а также как успокаивающее и спазмолитическое средство. Известной моделью для изучения промоции опухолей фенобарбиталом являются линии мышей, чувствительных (C3H/He) и относительно устойчивых (C57BL/6J и CC57BR/Mv) к действию данного соединения. Хотя известно, что посредником в промоции опухолей печени под воздействием фенобарбитала у мышей является CAR (Yamamoto et al., 2004), сравнительный же анализ влияния данного соединения на активность этого транскрипционного фактора у устойчивых и чувствительных линий до сих пор не проводился. Не проводился также сравнительный анализ действия фенобарбитала на экспересиию геновмишеней CAR, продукты которых могут способствовать развитию опухолей. Среди этих генов особый интерес представляют гены, связанные с регуляцией клеточного цикла и апоптоза, а также гены, кодирующие ферменты катаболизма тиреоидных гормонов, поскольку известно, что фенобарбитал снижает уровень этих гормонов у чувствительных, но не устойчивых линий мышей (Pakharukova et al., 2010).
Цель и задачи исследования. Целью данного исследования является изучение роли конститутивного рецептора андростанов (CAR) в механизмах опухолеиндуцирующего действия орто-аминоазотолуола (OAT) и опухолепромотирующего эффекта фенобарбитала (ФБ).
Для этого были поставлены следующие задачи:
1. Изучить влияние ОАТ на трансактивационную активность CAR мыши (mCAR) в его репортерной системе (клетках HepG2, котрансфецированных плазмидой, экспрессирующей mCAR, и репортерной плазмидой, содержащей репортерный ген под контролем CAR-зависимого элемента).
2. Оценить изменение экспрессии под воздействием ОАТ ряда геновмишеней CAR, включая (1) гены I фазы метаболизма ксенобиотиков - Cyp2b10, Cyp2c29, Cyp3a11 и NADPH CYP450 oxidoreductase; (2) гены II фазы метаболизма ксенобиотиков - Ugt1a1 и транспортеров - Mrp2 и Mrp4; а также (3) гены, участвующие в регуляции клеточного цикла и пролиферации - Mdm2, CyclinD1 и c-Myc, у мышей дикого типа в сравнении с CAR-нокаутными мышами.
3. Оценить статус пролиферации гепатоцитов у мышей дикого типа по сравнению с CAR-нокаутными мышами как на ранних, так и на поздних сроках после введения ОАТ.
4. Изучить влияние фенобарбитала на ДНК-связывающую активность CAR в печени мышей чувствительной к действию фенобарбитала линии С3Н/He и устойчивых линий C57BL/6J и CC57BR/Mv.
5. Изучить влияние фенобарбитала на уровень мРНК генов-мишеней CAR Sult2a1, Ugt1a1 и Mdm2 в печени мышей чувствительной к действию фенобарбитала линии С3Н/He и устойчивых линий C57BL/6J и CC57BR/Mv.
Научная новизна. В экспериментах in vitro впервые выявлено усиление трансактивационной активности CAR мыши под действием ОАТ, гепатокацерогенного для мышей, но не 3-MeДАБ, неканцерогенного для этих животных. Данные по усилению трансактиваторной способности mCAR in vitro согласуются с результатами экспериментов по введению ОАТ и 3-MeДАБ животным, у которых было показано увеличение только под действием ОАТ экспрессии ряда генов-мишеней CAR, участвующих как в регуляции метаболизма ксенобиотиков (гены ферментов метаболизма и транспортеров ксенобиотиков), так и в пролиферативных процессах клеток печени (c-Myc). Роль CAR в этих процессах доказана с использованием нокаутных мышей, у которых ОАТ не влиял на уровень экспрессии данных генов. Впервые получены данные об участии CAR в пролиферативных процессах в печени, запускаемых ОАТ.
Впервые показано, что известный опухолевый промотор фенобарбитал увеличивает ДНК-связывающую активность CAR в печени чувствительных мышей С3Н/He, но не устойчивых C57BL/6J и CC57BR/Mv. Такой эффект оказался сопряженным с действием фенобарбитала на экспрессию генов-мишеней CAR, продукты которых могут способствовать развитию опухолей. А именно, выявлено, что только у мышей чувствительной линии под действием фенобарбитала происходит значительное усиление экспрессии Sult2a1 - основного фермента катаболизма тиреоидных гормонов (выполняющих опухолесупрессорную функцию) и Mdm2 - важного регулятора пролиферации и апоптоза.
Теоретическая и практическая значимость.
Настоящая работа вносит существенный вклад в понимание молекулярных механизмов гепатоканцерогенеза. Показано, что важную роль в этих механизмах играет конститутивный рецептор андростанов - CAR. Полученные данные дополняют современные представления о механизмах инициации и промоции опухолей печени негенотоксическими канцерогенами, а также способствуют выяснению молекулярногенетических основ предрасположенности организма к возникновению химически индуцированных опухолей печени.
Информацию об активации CAR, полученную в тестах in vitro, можно использовать при выяснении показателей биологической активности, токсичности и потенциальной канцерогенности разнообразных веществ.
Модель с использованием CAR-нокаутных мышей может быть актуальной для выяснения механизма действия других соединений - активаторов CAR. Кроме того, эти данные могут послужить стимулом для изучения механизмов отсроченного канцерогенного действия химических соединений, что имеет большое значение при оценке рисков для человека.
Разработанный подход может быть использован как диагностический инструмент для выявления предрасположенности животных к промоции опухолей печени химическими соединениями - активаторами CAR.
В целом, решение фундаментальных вопросов о роли CAR в канцерогенных эффектах химических соединений (как инициаторов, так и промоторов опухолей) может стать ступенью к решению практических задач по установлению мишеней для лекарственных средств, направленных на борьбу с развитием рака печени.
Положения, выносимые на защиту.
1. Гепатокагцерогенный для мышей аминоазокраситель ортоаминоазотолуол (ОАТ) является активатором транскрипционного фактора СAR. Активация СAR под действием ОАТ приводит к усилению экспрессии генов Cyp2b10, Cyp2c29, Cyp3a11, Ugt1a1, Mrp2, Mrp4 и c-Myc в печени мышей.
2. CAR необходим для реализации эффектов ОАТ в активации пролиферации гепатоцитов у мышей.
3. Межлинейные различия в опухолепромотирующем действии фенобарбитала связаны с активацией CAR и увеличением экспрессии в печени его генов-мишеней Sult2a1 и Mdm2 у мышей чувствительной к действию фенобарбитала линии С3Н/He, но не у мышей устойчивых линий C57BL/6J и CC57BR/Mv.
Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на II Съезде общества клеточной биологии (Цитология.
2007. Т. 49. С. 781-782.), а также на международной конференции FASEB Summer Research Conference УLiver Growth, Development and DeseaseФ (США, шт. Колорадо, Сноумасс, 3-8 августа 2008). По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК.
Вклад автора. Основные результаты настоящего исследования получены автором самостоятельно. Эксперименты по иммуногистохимическому окрашиванию срезов печени проводились совместно с Ph.D С.М. Куринной.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, изложения и обсуждения собственных экспериментальных данных, выводов и списка литературы (236 наименований). Работа изложена на 147 страницах машинописного текста и содержит 8 таблиц и 19 рисунков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОТЫ Эксперименты in vitro проводили методом котрансфекции с использованием клеток гепатомы человека HepG2 (ATCC). В экспериментах in vivo были использованы (а) мыши-самцы дикого типа линии C57BL/6 и мыши, нокаутные по CAR, той же линии разведения вивария для трансгенных животных Baylor College of Medicine (Хьюстон, США), а также (б) самцы мышей линий C57BL/6J, CC57BR/Mv, С3Н/Не разведения вивария ИЦиГ СО РАН. Для проверки уровня экспрессии генов использовали метод ПЦР с детекцией в режиме реального времени.
Содержание белков в ядерном экстракте и лизатах оценивали методом Вестерн-блот гибридизации. Пролиферативный статус гепатоцитов оценивали методом иммуногистохимического анализа срезов печени.
Экстракты ядер клеток печени получали согласно методу Горски-Шапиро (Gorski et al., 1986; Shapiro et al., 1988). Связывание белков экстракта ядер с различными олигонуклеотидами изучали методом задержки ДНК-зонда в геле.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Активация CAR и повышение экспрессии его генов-мишеней под действием гепатоканцерогена ОАТ 1.1. Влияние ОАТ на трансактивационную активность mCAR in vitro Для изучения влияния гепатоканцерогенов ОАТ и 3'-МеДАБ на трансактивационную активность CAR клетки гепатомы человека HepGкотрансфецировали плазмидой, экспрессирующей полноразмерный CAR мыши (pCMX-mCAR), CAR-репортерной плазмидой LXRE-TK-Luc, экспрессирующей ген люциферазы под контролем CAR-зависимого репортерного элемента (LXRE), а также плазмидой, экспрессирующей ген -галактозидазы (pCMX--gal) - для определения эффективности трансфекции. В качестве контроля клетки также трансфецировали вектором pCMX без вставки целевого гена или только репортерной плазмидой. Оказалось, что OAT активировал mCAR уже при концентрации 0,5 мкМ (*р<0,05), и с возрастанием концентрации ОАТ активность mCAR постепенно повышалась (рис. 1А). При концентрации ОАТ 200 мкМ мы наблюдали максимальную активность рецептора, которая оказалась в 8 раз больше по отношению к контролю (***p<0,001). Активность люциферазы во внутренних контролях (pCMX+LXRE-TK-Luc и только LXRE-TK-Luc) была не выше, чем в опытных образцах (pCMX-mCAR+LXRE-TK-Luc), что свидетельствует о низком (фоновом) уровне эндогенного CAR.
В качестве позитивного контроля был использован 1,4-бис[2-(3,5дихлоропиридокси)]бензол (ТСРОВОР или TC), являющийся высокоспецифичным лигандом и агонистом CAR (Tzameli et al., 2000). Для достижения эффекта, аналогичного эффекту ТСPOBOP, потребовалась концентрация ОАТ 100 мкМ (в 200 раз большая, по сравнению с концентрацией ТС). При этой концентрации активность mCAR увеличивалась в 4,4 раза (рис. 1А, 1Б). Сходный с ОАТ по структуре аминоазокраситель 3-МеДАБ не активировал mCAR ни при 100, ни при 200 мкМ (рис. 1Б).
Б) A) 6.12.*** 5.00 *** 10.4.8.*** 6.00 3.*** 4.2.** 2.00 * 1.0.0.0 0.5 10 100 2ДМСО TC OAT 3'-MeДАБ() 3'-MeДАБ() OAT, мкM Рисунок 1. OAT активирует mCAR в клетках HepG2. A) Дозозависимая активация mCAR под действием OAT. Б) Эффекты OAT (100 мкM), TCPOBOP (TC, 0,5 мкM) и 3MeДАБ (100 () или 200 () мкM) на трансактивационную активность mCAR. n=4 для группы клеток, обрабатываемых исследуемым веществом. Данные, помеченные звездочками, указывают на достоверную разницу по сравнению с контролем (растворителем ДМСО) (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, согласно t-критерию Стьюдента).
Таким образом, впервые было показано, что ОАТ является активатором mCAR, хотя и менее эффективным по сравнению с TCPOBOP. Проделанные эксперименты хорошо согласуются с предыдущими данными по увеличению ДНК-связывающей активности CAR в печени мышей под действием ОАТ, но не 3-MeДАБ, и показывают, что оно сопряжено с увеличением трансактиваторных свойств данного рецептора.
1.2. Влияние ОАТ на уровень мРНК генов-мишеней CAR в печени мышей Известно, что CAR, являясь одним из ключевых регуляторов поцессов детоксикации, регулирует ряд генов I и II фаз метаболизма ксенобиотиков, гены транспортеров ксенобиотиков, также показано его участие в регуляции генов клеточного цикла и пролиферации (Swales, Negishi, 2004; Masi et al., 2009). Для изучения эффектов ОАТ были выбраны представители всех перечисленных групп генов. Влияние ОАТ на экспрессию генов-мишеней CAR определяли методом ПЦР в режиме реального времени. В экспериментах были использованы мыши линии С57BL/6, нокаутные по этому гену (CAR KO, CarЦ/Ц), и контрольные мыши той же линии (WT, Car+/+). Мышам вводили гепатоканцерогенный для них ОАТ или неканцерогенный 3-MeДАБ, а растворитель (кукурузное масло) использовали как контроль. В некоторых экспериментах использовали TCPOBOP в качестве положительного контроля для мышей дикого типа, у которых он активирует экспрессию генов-мишеней CAR, и его же использовали в качестве отрицательного контроля для CAR-нокаутных мышей, у которых активация этих генов под действием TCPOBOP не происходит (Wei et al., 2000; Maglich et al., 2002; Assem et al., 2004).
Результаты экспериментов представлены на рис. 2 - 3.
активность активность Относительная люциферазная Относительная люциферазная Прежде всего, мы исследовали эффект ОАТ на экспрессию Cyp2bкак общеизвестного маркера транскрипционной активности CAR. В наших экспериментах для этого гена было зарегистрировано радикальное повышение уровня мРНК в печени мышей дикого типа под влиянием ОАТ (рис. 2, лев. панель) - в 42,3 раза. Известный агонист CAR - TCPOBOP увеличивал экспрессию мРНК этого гена в 205 раз, что согласуется с литературными данными (Hernandez et al., 2009). 3-MeДАБ повышал уровень мРНК этого гена лишь в 3,8 раза. У CAR-нокаутных мышей действия ни ОАТ, ни TCPOBOP на экспрессию мРНК Cyp2b10 не наблюдалось (рис. 2, прав. панель), а 3-MeДАБ повышал ее экспрессию приблизительно в 7 раз. Из этого можно заключить, что ОАТ повышает экспрессию мРНК гена Cyp2b10, действуя через CAR, а эффект 3-MeДАБ на экспрессию этого гена осуществляется CAR-независимым образом.
Cyp2b10, дикий тип Cyp2b10, CAR-нокауты 1032*** 3198*** 76500 4321** Контроль OAT 3'-MeДАБ TC ** Контроль OAT 3'-MeДАБ TC Cyp2c29, CAR-нокауты Cyp2c29, дикий тип 0.0.** 0.0.** 3 0.0.2 0.0.1 0.0. Контроль OAT 3'-MeДАБ TC Контроль OAT 3'-МеДАБ TC Cyp3a11, CAR-нокауты Cyp3a11, дикий тип 120 1* 100 1** Контроль OAT 3'MeДАБ TC Контроль OAT 3'-MеДАБ TC Рисунок 2. Влияние OAT и 3-MeДАБ на уровень мРНК генов I фазы метаболизма ксенобиотиков: Cyp2b10, Cyp2c29, Cyp3a11 в печени мышей дикого типа (левые панели) и CAR-нокаутных мышей (правые панели). Здесь и на рисунке 3: все вещества животным вводили внутрибрюшинно за 3 часа до умерщвления. В качестве контроля вводили кукурузное масло. Уровень экспрессии генов рассчитан относительно гена домашнего хозяйства Gapdh. Столбцы на диаграммах соответствуют средним значениям по группе из 3-х животных , кДНК каждого животного была представлена в трех повторах. Статистический анализ выполнен с помощью t-критерия Стьюдента (вводимое вещество по отношению к растворителю). Достоверно различные значения помечены звездочками (*p<0,05, ** p<0,01, ***p<0,001).
мРНК гена Cyp2bОтносительное содержание мРНК гена Cyp2bОтносительное содержание гена Cyp2cмРНК гена Cyp2cОтносительное содержание мРНК Относительное содержание мРНК гена Cyp3aмРНК гена Cyp3aОтносительное содержание Относительное содержание У мышей дикого типа наблюдалась также индукция экспрессии мРНК под влиянием ОАТ гена II фазы метаболизма ксенобиотиков Ugt1aи транспортеров Mrp2 и Mrp4: в 1,42 раза, в 2,22 раза и 1,68 раза, соответственно (рис. 3, лев. панель). У CAR-нокаутных мышей влияния ОАТ на эти гены не наблюдали (рис. 3, прав. панель). Следовательно, ОАТ осуществляет свое действие на гены Ugt1a1, Mrp2 и Mrp4 CAR-зависимым способом. 3-MeДАБ на экспрессию этих генов не влиял.
Ugt1a1, CAR-нокауты Ugt1a1, дикий тип 4 * 3.5 3 2.5 1.0. Контроль OAT 3'-MeДАБ Контроль OAT 3'-MeДАБ Mrp2, дикий тип Mrp2, CAR-нокауты ** 7 6 5 4 3 2 1 0 Контроль OAT 3'-MeДАБ Контроль OAT 3-'MeДАБ Mrp4, CAR-нокауты Mrp4, дикий тип 12 * 10 8 6 4 2 0 Контроль OAT 3'-MeДАБ Контроль OAT 3'-MeДАБ c-Myc, дикий тип c-Myc, CAR-нокауты 40 ** * 8 6 4 Контроль OAT 3'-MeДАБ TC Контроль OAT 3'-MeДАБ TC Рисунок 3. Влияние OAT и 3-MeДАБ на уровень мРНК генов II фазы метаболизма и транспортеров ксенобиотиков: Ugt1a1, Mrp2, Mrp4, а также протоонкогена c-Myc в печени мышей дикого типа (левые панели) и CARнокаутных мышей (правые панели).
Поскольку ОАТ является сильным гепатоканцерогеном для мышей (Каледин и др., 1978; Каледин и др., 1985), особый интерес представляли те гены-мишени CAR, которые участвуют в регуляции клеточного цикла и мРНК гена Ugt1aмРНК гена Ugt1aОтносительное содержание Относительное содержание мРНК гена MrpмРНК гена MrpОтносительное содержание Относительное содержание мРНК гена MrpмРНК гена MrpОтносительное содержание Относительное содержание гена c-Myс мРНК гена c-Myc Относительное содержание мРНК Относительное содержание пролиферации. А именно: Mdm2 (продукт этого гена является ингибитором p-53-зависимого апоптоза, а также усиливает пролиферацию клеток (Brooks, Gu, 2004; Finnberg et al., 2004)), CyclinD1 (продукт этого гена способствует переходу клеток из фазы G1 клеточного цикла в фазу S (Hinz et al., 1999)) и c-Myc - известный протоонкоген, являющийся транскрипционным активатором, способствующим пролиферации клеток (Dose, Gounari, 2009).
У мышей дикого типа ОАТ достоверно увеличивал уровень печеночной мРНК гена c-Myc в 1,62 раза (рис. 3, лев. панель). В случае положительного контроля (TCPOBOP) экспрессия c-Myc увеличивалась в 6 раз, что также согласуется с литературными данными (Blanco-Bose et al., 2008). Неканцерогенный для мышей 3-MeДАБ не влиял на экспрессию этого гена. На CAR нокаутных мышах действия ни ОАТ, ни TCPOBOP на экспрессию мРНК c-Myc не наблюдалось (рис. 3, прав. панель). Из этого можно сделать вывод, что ОАТ повышает экспрессию мРНК гена c-Myc CAR-зависимым способом. Более того, можно предполагать, что c-Myc может служить одним из посредников в реализации канцерогенных эффектов ОАТ.
Однако другие два гена - Mdm2 и Cyclin D1 - не отреагировали на воздействие ОАТ. Также не отреагировал один из генов I фазы метаболизма ксенобиотиков NADPH CYP450 oxidoreductase. Этот феномен может быть связан с тем, что конформация mCAR после (прямого/непрямого) взаимодействия с ОАТ становится таковой, что данный рецептор не является регулятором для этих генов. Похожие различия в ответах генов-мишеней CAR на воздействия разных индукторов этого рецептора наблюдали и другие ученые. Например, TCPOBOP сильно активирует экспрессию обоих генов - Cyp2b10 и Cyp3a11, а хлорпромазин - только первого (Wei et al., 2002). Подобным образом, фенобарбитал индуцирует Cyp2f2, тогда как TCPOBOP - нет (Braeuning et al., 2009).
Таким образом, наши данные демонстрируют CAR-зависимую индукцию транскрипции под действием ОАТ 7 из 10 изученных генов:
Cyp2b10, Cyp2c29, Cyp3a11, Ugt1a1, Mrp2, Mrp4 и c-Myc.
1.3. Влияние ОАТ на уровень белков Cyp2b10 и c-Myc в печени мышей Для генов Cyp2b10 (как общеизвестного маркера активации CAR) и c-Myc (как потенциального звена в пролиферативных эффектах ОАТ, опосредуемых CAR) было проведено исследование изменения содержания их белковых продуктов в печени мышей в ответ на ОАТ. На рис. представлены результаты Вестерн-блот анализа белков лизатов клеток печени контрольных и обработанных ОАТ животных. Из рис. 4А видно, что уровень белков Cyp2b10 и c-Myc в печени мышей дикого типа под действием ОАТ значительно увеличивался по сравнению с контролем (по данным денситометрии: в 18 и 3 раза, соответственно). Таким образом, уровень индукции белков Cyp2b10 и c-Myc под влиянием OAT согласуется с уровнем индукции их транскриптов (в 42,3 раза и в 1,62 раза, соответственно, рис. 2 и 3, лев. панели). В печени CAR-нокаутных мышей (рис. 4Б) под действием ОАТ не было обнаружено никаких изменений в содержании белков Cyp2b10 и c-Myc, как и в случае содержания мРНК этих генов (рис. 2 и 3, прав. панели). Полученные данные демонстрируют, что изменение уровеней экспрессии белков и мРНК генов Cyp2b10 и c-Myc зависят от CAR.
Рисунок 4. Влияние OAT на уровень белков Cyp2Bи c-Myc в печени мышей дикого типа (А) и CARнокаутных мышей (Б).
OAT и кукурузное масло (контроль) вводили животным внутрибрюшинно за 6 часов до умерщвления. Вестернблот анализ выполнен с помощью антител к Cyp2b10, c-Myc и -актину (как контроль нанесения белков). Каждая дорожка соответствует образцу из печени одной мыши.
1.4. Влияние ОАТ на пролиферацию гепатоцитов у мышей дикого типа в сравнении с CAR-нокаутными мышами Статус пролиферации гепатоцитов у мышей дикого типа в сравнении с CAR-нокаутными мышами изучали как на ранних (краткосрочные эксперименты), так и на поздних (долгосрочные эксперименты) сроках после введения ОАТ.
В краткосрочных экспериментах 10-недельным мышам внутрибрюшинно вводили ОАТ. Контрольным животным вводили растворитель - кукурузное масло. По истечении 3 или 7 дней (для разных групп) мышей умерщвляли, а их печени использовали для иммуногистохимического анализа. В качестве маркера пролиферации был использован Ki67 (для того, чтобы определить количество гепатоцитов во всех фазах клеточного цикла, кроме G0).
Результаты, показанные на рис. 5 (А-З) демонстрируют, что ни через - ни через 7 дней после введения, ОАТ не повышал пролиферацию гепатоцитов у мышей дикого типа. У CAR-нокаутных мышей, обработанных ОАТ, также не наблюдалось никаких изменений в пролиферации гепатоцитов.
A) Б) В) Г) WT, к.м., 3 дня WT, ОАТ, 3 дня WT, к.м., 1 нед. WT, ОАТ, 1 нед.
Д) Е) Ж) З) CAR KO, к.м., 3 дня CAR KO, ОАТ, 3 дня CAR KO, к.м., 1 нед. CAR KO, ОАТ, 1 нед.
Рисунок 5. Пролиферация гепатоцитов у мышей дикого типа (WT) и CARнокаутных мышей (CAR KO) в ответ на OAT в краткосрочных экспериментах.
Иммуногистохимическое окрашивание антителами к маркеру пролиферации Ki67 было выполнено на парафиновых срезах печени мышей.
В долгосрочных экспериментах ОАТ вводили внутрибрюшинно мышатам в 13-дневном возрасте, в котором для получения опухолей печени достаточно однократного введения канцерогена (Ильницкая и др., 2004). Контрольным мышатам вводили растворитель - кукурузное масло.
По истечении 7 месяцев мышам за 2 часа до умерщвления вводили раствор бромдезоксиуридина (BrdU), который интеркалирует в двуцепочечную ДНК во время репликации, таким образом, выявляя клетки, находящиеся в S-фазе. Согласно результатам иммуногистохимического анализа, у мышей дикого типа обработка ОАТ увеличивает количество гепатоцитов, вошедших в S-фазу, почти в 7 раз (рис. 6). У CAR-нокаутных мышей под воздействием ОАТ изменений в пролиферативном статусе гепатоцитов не наблюдали. Включение BrdU в клетки печени CAR-нокаутных мышей, обработанных ОАТ, было сравнимо с таковым у необработанных мышей дикого типа. Таким образом мы показали, что однократное введение ОАТ индуцирует пролиферацию гепатоцитов у мышей дикого типа, но не у CAR-нокаутных мышей, и, следовательно, конститутивный рецептор андростанов ответственен за этот процесс. Также мы наблюдали достоверное, хотя и небольшое, увеличение печеночного индекса (отношение массы печени к массе тела) под действием ОАТ у мышей дикого типа в сравнении с CAR-нокаутными мышами. Кроме того, была получена одна ОАТ-индуцированная опухоль печени у мыши дикого типа, у CAR нокаутных мышей опухолей не обнаружено.
Дикий тип, OAT Дикий тип, кукурузное масло Рисунок 6. Разница в пролиферации гепатоцитов между мышами дикого типа и CAR-нокаутными мышами в ответ на OAT в долгосрочных экспериментах. Включение CAR-нокауты, кукурузное масло CAR-нокауты, OAT BrdU (бромдезоксиуридина) оценено методом иммуногистохимического анализа срезов печени мышей.
Одним из возможных объяснений сильно отложенных во времени CAR-зависимых митогенных эффектов OAT могут быть вторичные эффекты активации CAR, происходящей в течение такого продолжительного периода (за счет остаточных количеств ОАТ в организме (Lawson, 1970)), которые могут способствовать отсроченному пролиферативному ответу. Другое возможное объяснение отсроченных последствий обработки ОАТ заключается в активации с-Myc сразу же после введения OAT, при этом - только у мышей дикого типа, но не у CAR-нокаутных мышей. Имеются данные о долгосрочных накопительных эффектах c-Myc как транскрипционного фактора, напрямую задействованного в ремоделировании хроматина и повышении метилирования гистонов в регуляторных районах генов-мишеней c-Myc (Lin et al., 2009; Louis et al., 2005). Следовательно, c-Myc-опосредованное ремоделирование хроматина также могло иметь место при долгосрочных эффектах, наблюдаемых в ответ на OAT.
2. Увеличение ДНК-связывающей активности CAR и повышение экспрессии его генов-мишеней под действием фенобарбитала связаны с риском развития опухолей у мышей Процесс химического канцерогенеза, помимо стадии инициации, включает стадию промоции. Фенобарбитал является классическим промотором, который на фоне инициации опухолей неонатально рядом канцерогенов (диэтилнитрозоамин, нитрозоэтилмочевина и др.), с течением жизни значительно увеличивает количество и размеры опухолей (Gold et al., 2001). Известны линии мышей, чувствительных к опухолепромотирующему действию фенобарбитала - С3Н и устойчивых - C57BL и CC57BR (Bursch et al., 2004). Причины таких различий пока не ясны. Однако известно, что посредником в промоции опухолей печени под воздействием фенобарбитала у мышей является CAR (Phillips et al., 2007).
В связи с этим представляло большой интерес изучить влияние фенобарбитала на ДНК-связывающую активность CAR и на экспрессию ряда его генов-мишеней, потенциально связанных с промоцией опухолей печени у контрастных линий мышей: С3Н, C57BL и CC57BR.
2.1. Изучение влияния фенобарбитала на ДНК-связывающую активность CAR в печени мышей чувствительной линии С3Н и устойчивых C57BL и CC57BR Исследование влияния фенобарбитала на ДНК-связывающую активность CAR проводили методом задержки в геле ДНК-зонда, соответствующего известному сайту связывания CAR из промотора гена PIT-1 крысы (Frank et al., 2003), белками ядерного экстракта клеток печени мышей изучаемых линий. Мышам давали фенобарбитал с питьевой водой в течение 7 дней. В каждом варианте для приготовления ядерного экстракта использовали печени 2-х животных, в сумме проделано независимых экспериментов. Из данных, приведенных на рис. 7А, видно, что ДНК-связывающая активность CAR под действием фенобарбитала увеличивается только у мышей С3Н, чувствительных к промотирующему действию этого вещества. У мышей устойчивых линий она не меняется. В качестве внутреннего контроля использовали ДНК-связывающую активность транскрипционного фактора ETS (рис. 7Б), на которую, как было показано ранее, не влияет целый ряд ксенобиотиков (Kropachev et al., 2001). Результаты денситометрического анализа радиоавтографов показали, что у мышей чувствительного фенотипа С3Н ДНК-связывающая активность CAR под действием фенобарбитала увеличивалась в 2,3 раза (2,330,75), тогда как у устойчивых линий она не менялась (1,050,28 - у CC57BR и 1,060,21 - у C57BL,
0,05).Подтверждение того, что в полосе задержки меченого ДНК-зонда к CAR с белком экстракта ядер в качестве этого белка действительно выступал CAR, было получено с помощью специфических антител.
В результате всех проведенных экспериментов установлено четкое соответствие между чувствительностью мышей к промотирующему действию фенобарбитала на развитие опухолей печени и активацией конститутивного рецептора андростанов.
Рисунок 7. Влияние фенобарбитала (ФБ) на ДНКсвязывающую активность CAR в печени мышей С3Н, CC57BR и C57BL. А) CAR и Б) ETS.
Стрелками указана подвижность соответствующего меченого зонда после инкубации с ядерными экстрактами клеток печени контрольных (-) и обработанных фенобарбиталом (ФБ) мышей исследуемых линий. Представлены типичные радиоавтографы.
2.2. Влияние фенобарбитала на уровень мРНК генов-мишеней CAR в печени мышей С3Н, C57BL и CC57BR Известно, что CAR опосредует порядка 50% изменений в экспрессии генов печени, индуцированных фенобарбиталом (Phillips et al., 2007).
Среди таких генов-мишеней CAR есть гены ферментов катаболизма тиреоидных гормонов - сульфотрансферазы (SULT) и УДФглюкуранозилтрансферазы (UGT) (Qatanani et al., 2005). Данные ферменты необходимы для регуляции уровня и активности этих гормонов, что может быть критичным для развития опухолей, поскольку тиреоидные гормоны могут выполнять опухолесупрессорную функцию. Поскольку фенобарбитал снижал уровень тиреоидных гормонов в крови мышей чувствительного фенотипа С3Н, но не изменял его у устойчивых мышей (Pakharukova et al., 2010), мы предположили, что фенобарбитал повышает уровень мРНК генов ферментов метаболизма тиреоидных гормонов только у чувствительных к этому веществу животных. Поэтому методом ПЦР в реальном времени мы изучили влияние фенобарбитала на уровень мРНК Sult2a1 - гена сульфотрансферазы, катализирующей реакцию сульфатирования тиреоидных гормонов - трийодтиронина (Т3) и тироксина (Т4), а также Ugt1a1 - гена УДФ-глюкуранозилтрансферазы, катализирующей реакцию глюкуронидации T4 (Visser et al., 1993), в печени мышей чувствительной и устойчивых линий. В качестве внутреннего контроля оценивали уровень мРНК гена глицеальдегид-3-фосфат дегидрогеназы (Gapdh), т.к. известно, что фенобарбитал не влияет на экспрессию этого гена (Tien et al., 2007).
Рисунок 8. Влияние фенобарбитала на уровень мРНК генов Sult2a1 (А) и Ugt1a1 (Б) в печени мышей С3Н, CC57BR и C57BL.
Уровень экспрессии генов у животных, получавших фенобарбитал (окрашенные столбцы) и не получавших фенобарбитал (неокрашенные столбцы), представлен в относительных единицах от уровня экспрессии Gapdh в виде среднее значение (n=3). Статистический анализ выполнен с помощью ANOVA, критерия НьюманаКеулса. Достоверные отличия от животных, не получавших фенобарбитал внутри каждой линии указаны звездочками (**p<0,01, ***р<0,005).
На рис. 8А видно, что экспрессия гена сульфотрансферазы (Sult2a1) под действием фенобарбитала увеличивалась в 260 раз у мышей С3Н/He, чувствительных к этому соединению. При таком радикальном повышении уровня экспрессии Sult2a1 продукт этого гена может существенным образом влиять на содержание Т3 и T4. Напротив, у мышей устойчивых линий экспрессия Sult2a1 либо увеличивалась значительно меньше, чем у чувствительных животных (в 6,1 раза - в случае C57BL), либо не изменялась совсем (в случае CC57BR).
Экспрессия гена другого фермента - UGT1А1 (Ugt1a1) увеличивалась под действием фенобарбитала незначительно у всех мышей:
и у чувствительной (2,1 раза у C3H), и у устойчивых линий (2,5 раза у CC57BR; 2,7 раза у C57BL) (рис. 8Б). Исходя из таких изменений в экспрессии Ugt1a1, можно сделать заключение, что этот фермент не вносит существенный вклад в катаболизм T4 у контрастных линий мышей.
Таким образом, вероятно, резкая активация экспрессии фермента сульфотрансферазы SULT2A1 под действием фенобарбитала приводит к ускорению процессов инактивации Т3 и T4 в крови мышей чувствительного фенотипа С3Н, что и обусловливает снижение уровня тиреоидных гормонов в крови у этих мышей.
Известно, что кроме ферментов метаболизма тиреоидных гормонов и других соединений CAR также участвует в регуляции экспрессии ряда генов, контролирующих процессы пролиферации (Costa et al., 2005;
Kodama, Negishi, 2006). Одним из таких генов-мишеней CAR является Mdm2, который, помимо CAR, регулируется рецептором тиреоидных гормонов (Zhao et al., 2006). Белок MDM2 является ингибитором p-53зависимого апоптоза, а также усиливает пролиферацию клеток (Brooks, Gu, 2004; Finnberg et al., 2004). Поэтому на следующем этапе методом ПЦР в реальном времени мы изучили влияние фенобарбитала на уровень мРНК гена Mdm2 у мышей исследуемых линий. Из рис. 9 видно, что у мышей С3Н, чувствительных к действию фенобарбитала, экспрессия Mdmувеличивалась в 3 раза по сравнению с контрольными животными. У мышей CC57BR и C57BL, устойчивых к действию фенобарбитала, экспрессия этого гена не изменялась (в 0,82 и 1,1 раза, соответственно).
Рисунок 9. Влияние фенобарбитала на уровень MdmмРНК гена Mdm2 в печени мышей С3Н, CC57BR и * 14 C57BL. Данные Уровень экспрессии генов у животных, получавших фенобарбитал (окрашенные столбцы) и не получавших фенобарбитал (неокрашенные столбцы), представлен в относительных единицах от уровня экспрессии Gapdh в виде среднее значение (n=3).
C3H CC57BR C57BL Статистический анализ выполнен с помощью ANOVA, критерия Ньюмана-Кеулса. * - достоверное отличие от животных, не получавших фенобарбитал внутри линии (р<0,05).
Таким образом, было обнаружено соответствие между увеличением ДНК-связывающей активности CAR, увеличением экспрессии генов Sult2a1 и Mdm2, и риском промоции опухолей печени под воздействием фенобарбитала.
Содержание мРНК MdmВЫВОДЫ 1. В репортерной системе in vitro показано, что гепатокагцерогенный для мышей аминоазокраситель орто-аминоазотолуол (ОАТ) является активатором CAR мыши.
2. С использованием CAR-нокаутных мышей продемонстрировано, что под влиянием ОАТ индукция транскрипции генов Cyp2b10, Cyp2c29, Cyp3a11, Ugt1a1, Mrp2, Mrp4 и c-Myc является CAR-зависимой.
Показано также, что ОАТ увеличивает содержание белков Cyp2b10 и cMyc в печени мышей дикого типа, но не у CAR-нокаутных мышей.
3. Показано, что после однократного введения OAT мышам в возрасте дней наблюдается активация пролиферации гепатоцитов у 7-месячных мышей дикого типа, но не у CAR-нокаутных мышей. Таким образом, конститутивный рецептор андростанов вовлечен в этот процесс.
4. На модели инбредных мышей, чувствительных (С3Н/He) и устойчивых (C57BL/6J и CC57BR/Mv) к действию фенобарбитала как промотора опухолей печени показано, что фенобарбитал увеличивает ДНКсвязывающую активность CAR в печени мышей С3Н, но не C57BL и CC57BR.
5. Установлено, что в печени мышей С3Н фенобарбитал усиливает экспрессию генов-мишеней СAR: Sult2a1, основного фермента катаболизма тиреоидных гормонов, и Mdm2, важного регулятора пролиферации и апоптоза. Таким образом, CAR-опосредованная стимуляция гепатоканцерогенеза фенобарбиталом может осуществляться за счет одновременного подавления опухолесупрессорной функции тиреодных гормонов и индукции генов, непосредственно контролирующих пролиферацию и апоптоз.
СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В РЕЦЕНЗИРУЕМЫХ ИЗДАНИЯХ 1. Сметанина М.А., Пахарукова М.Ю., Меркулова Т.И. Активация конститутивного рецептора андростанов и повышение экспрессии его генов-мишеней в печени мышей под действием ортоаминоазотолуола // Вестник ВОГиС. 2010. Т. 14. № 1. С. 659-670.
2. Pakharukova M.Y., Smetanina M.A., Kaledin V.I., Obut T.A., Merkulova T.I. The increased CAR-dependent metabolism of thyroid hormones in mice with high cancer susceptibility // Life Sci. 2010. V. 87(13-14). P.
439-444.
3. Smetanina M.A., Pakharukova M.Y., Kurinna S.M., Dong B., Hernandez J.P., Moore D.D., Merkulova T.I. Ortho-aminoazotoluene activates mouse constitutive androstane receptor (mCAR) and increases expression of mCAR target genes // Toxicol Appl Pharmacol. 2011. V. 255(1). P. 76-85.
Автор выражает искреннюю благодарность Д.Д. Муру (D.D. Moore) из Бэйлор колледжа медицины (Baylor College of Medicine, г. Хьюстон, США) за методические советы в проведении экспериментов и предоставленную возможность работы с CAR-нокаутными мышами.