Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
ПОЖВАНОВ Григорий Александрович
РОЛЬ ФИТОГОРМОНОВ И АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА В РЕГУЛЯЦИИ ГРАВИТРОПИЗМА У АРАБИДОПСИСА
03.01.05 - Физиология и биохимия растений
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Санкт-Петербург - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования СанктПетербургский государственный университет (СПбГУ).
Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Медведев Сергей Семёнович Официальные оппоненты Романов Георгий Александрович доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева Российской академии наук, заведующий лабораторией Муравник Людмила Евгеньевна кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Ботанический институт им. В.Л. Комарова Российской академии наук, старший научный сотрудник Ведущая организация Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского
Защита состоится л5 декабря 2012 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 002.211.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Ботаническом институте им. В.Л. Комарова Российской академии наук по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 2. Тел. (812) 372-54-16, факс (812) 372-54-43, e-mail: yudina_bin@mail.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения науки Ботанического института им. В.Л. Комарова Российской академии наук.
Автореферат разослан л2 ноября 2012 г.
Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук О. С. Юдина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Понимание физиологических и молекулярных основ становления полярности высших растений является одной из фундаментальных проблем биологии растений. Полярность можно определить как асимметрию в организации и физиологических функциях растительного организма (Медведев, 2004). Растения приобретают полярную организацию на самых ранних стадиях развития: точка проникновения спермия определяет ризоидальный полюс зиготы фукуса (Hable, Hart, 2010), а зародыш арабидопсиса уже на стадии 2-х клеток проявляет асимметрию в распределении фитогормона ауксина (Berleth et al., 2004). С этого момента и на протяжении всего онтогенеза растения, находясь на Земле, испытывают воздействие силы тяжести, модуль и вектор которой постоянны. Сила тяжести задаёт ось полярности наземных и подземных органов растения, а ростовая реакция на изменение положения органа в пространстве - гравитропизм - регулируется ауксином при участии системы его транспорта и цитоскелета. Предполагается, что в регуляции гравитропизма также могут принимать участие и другие фитогормоны - цитокинины, этилен (Карпенко и др., 1993; Aloni et al., 2006). За прошедшие 10 лет достигнут значительный прогресс в изучении роли переносчиков ауксина семейства PIN в регуляции гравитропизма арабидопсиса (Muday, Murphy, 2002;
Kleine-Vehn et al., 2006; Robert, Friml, 2009; Viaene et al., 2012). Выяснилось, что локализация переносчиков PIN на цитоплазматической мембране клеток задаёт направление полярного транспорта ауксина в кончике корня, а при гравистимуляции перемещение PIN3 на нижнюю мембрану клеток колумеллы индуцирует латеральный градиент концентрации ИУК в области апикальной меристемы корня (Friml et al., 2002). Кроме того, с использованием ингибиторов актинового цитоскелета было показано, что микрофиламенты актина необходимы для рециркуляции белков PIN и, таким образом, вовлечены в регуляцию гравитропической реакции (Muday, 2000). Для исследования актинового цитоскелета были созданы трансгенные конструкции, позволяющие визуализировать микрофиламенты in vivo (Sheahan et al., 2004). Было показано, что актиновый цитоскелет важен на самой ранней стадии гравитропической реакции (Baluka, Hasenstein, 1997; Hou et al., 2003; Morita, 2010; Nakamura et al., 2011), а позднее его организация находится под влиянием ауксина (Nick et al., 2009). Тем не менее, остаётся неясным, какое значение для гравитропической реакции имеет специфическая организация актинового цитоскелета, может ли актиновый цитоскелет определять направление транспорта ИУК при гравистимуляции, и какое участие в регуляции гравитропизма принимает стрессовый гормон этилен.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы было изучение роли фитогормонов и актинового цитоскелета в регуляции гравитропической реакции корней арабидопсиса.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Провести сравнительный анализ развития гравитропического изгиба корней арабидопсиса дикого типа и трансгенных растений GFP-fABD2.
2. Разработать метод количественного анализа ИУК на гистологических препаратах трансгенных растений арабидопсиса DR5::GUS.
3. Охарактеризовать параметры латерального перераспределения ауксина в корнях арабидопсиса при гравистимуляции.
4. Оценить влияние этилена на гравитропическую реакцию корней арабидопсиса.
5. Исследовать изменения организации актинового цитоскелета при гравистимуляции корней арабидопсиса.
Научная новизна диссертационной работы. Впервые с использованием трансгенных растений GFP-fABD2, позволяющих прижизненно визуализировать микрофиламенты, показано, что гравистимуляция корней Arabidopsis thaliana вызывает реорганизацию актинового цитоскелета в зоне растяжения корня.
Продемонстрировано, что при гравистимуляции происходит снижение доли аксиально ориентированных микрофиламентов, а доля актиновых микрофиламентов, ориентация которых сонаправлена вектору силы тяжести, увеличивается в 3Ц4 раза.
Для оценки морфологии актиновых микрофиламентов, визуализированных с помощью родамин-фаллоидина, предложен индекс искривлённости.
Показано, что после 15 мин гравистимуляции индекс искривлённости микрофиламентов актина в стеле корней арабидопсиса возрастает в 2 раза.
Разработан оригинальный метод количественной оценки фитогормона ауксина на гистологических препаратах арабидопсиса DR5::GUS. Впервые проведён количественный анализ латерального перераспределения ауксина в зоне растяжения корня арабидопсиса, и с его помощью установлено, что при гравистимуляции в нижней части корня происходит увеличение концентрации ИУК в 2Ц3 раза.
Впервые показано, что при гравистимуляции этилен не влияет на гравирецепцию и трансдукцию сигнала в корнях растений дикого типа, а у трансгенных растений GFP-fABD2 тормозит развитие гравитропической реакции как на этапе рецепции и трансдукции сигнала, так и на этапе ростового ответа.
Научно-практическое значение. Полученные в диссертационной работе данные расширяют представления о клеточных и гормональных механизмах регуляции гравитропической реакции в корне арабидопсиса. В работе предложен метод оценки концентрации ауксина, который может быть использован при определении других фитогормонов, для которых доступны GUS-репортерные генетические конструкции. Оригинальные данные о влиянии этилена на гравитропическую реакцию корней трансгенных растений арабидопсиса GFP-fABD2 могут быть востребованы при изучении актинсвязывающих белков и важны для понимания физиологии трансгенного растения.
Апробация работы. Результаты работы были представлены в виде устных докладов на VI съезде Общества физиологов растений России в Сыктывкаре (18Ц24.06.2007), конференции молодых учёных ДБиология - наука XXI векаУ в Пущино, Россия (29.10Ц2.11.2007), III Всероссийском симпозиуме ДФизиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасностиУ в Москве, Россия (18.10Ц21.10.2010), международной конференции ДФизиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологийУ, VII съезде Общества физиологов растений России в Нижнем Новгороде (4Ц10.07.2011) и симпозиуме ДPlant Biology in SpaceУ в рамках FESPB 2012 во Фрайбурге, Германия (29.07Ц3.08.2012), а также в виде стендовых докладов на конференциях FESPB 2008 в Тампере, Финляндия (17Ц 22.08.2008), IPGSA 2010 в Таррагоне, Испания (28.06Ц2.07.2010) и FESPB 2010 в Валенсии, Испания (4Ц10.07.2010).
Поддержка исследования. Работа была выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ №№ 08-04-00566-а ДВзаимодействие Са-потоков и редокс-реакций в клеточных стенках в гормональной регуляции роста растенийУ, 11-04-00701-а ДРоль фитогормонов, цитоскелета и активных форм кислорода в регуляции роста клеток растяжением и трансдукции гравитационного сигналаУ (руководитель грантов - проф., д.б.н. С.С.Медведев), персональных грантов Правительства Санкт-Петербурга №№ 2.6/22-04/004, 2.6/16-05/219-А и гранта ООО ОПТЭК в 2012 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи, из них одна в рецензируемом журнале из списка ВАК, 8 тезисов, и приняты к публикации 2 статьи в рецензируемых журналах.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах текста, иллюстрирована 32 рисунками (из них 8 в приложении) и состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (1источников, в т.ч. 183 на иностранных языках) и приложения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования, условия выращивания и гравистимуляция растений. Объектом исследования служили 7-суточные проростки Arabidopsis thaliana (L.) Heynh дикого типа (экотип Columbia-0) и трансгенные растения DR5::GUS и GFP-fABD2 (Ulmasov et al., 1997; Sheahan et al., 2004). В растениях DR5::GUS экспрессия репортера GUS находится под контролем ауксинчувствительного промотора DR5, что позволяет выявлять распределение ауксина в ткани с помощью гистохимической реакции. Растения арабидопсиса GFP-fABD2 конститутивно экспрессируют GFP, слитый со вторым актинсвязывающим доменом фимбрина 1 арабидопсиса (fABD2), что позволяет визуализировать актиновый цитоскелет in vivo. Растения выращивали в стерильных условиях в вертикально ориентированных чашках Петри на среде Мурасиге - Скуга (МС/2, 1% сахароза, 0,7% агарозы) при 16-часовом фотопериоде и температуре 20C в климатической камере MLR-351. Для изучения зависимости плотности GUS-зависимого окрашивания от концентрации ИУК в питательную среду добавляли раствор ИУК до конечной концентрации 10-6, 10-7 или 10-8 М.
Для изучения организации актиновых микрофиламентов за 24 часа до проведения эксперимента проростки переносили на стерильные покровные стёкла, на которых в верхней и нижней части размещали по 2 стеклянных спейсера толщиной 0,11 мм, и закрывали нейлоновой микропористой газопроницаемой мембраной (поры 0,2 м). Полость между стёклами заполняли средой МС/2 без агарозы, стёкла размещали вертикально при 100% влажности.
Выращивание растений на стёклах позволяет сохранить ориентацию растения относительно стекла и минимизировать механические воздействия на цитоскелет. Гравитропическую реакцию индуцировали путём поворота чашек Петри на 90 в вертикальной плоскости.
Визуализация активности GUS и анализ цифровых изображений GUS-зависимого окрашивания. Активность глюкуронидазы в растениях DR5::GUS визуализировали с помощью окрашивания с X-Gluc в 50 мМ Naфосфатном буфере (pH 7,0, 1 мМ X-Gluc, 0,5 мМ ферро- и 0,5 мМ феррицианид калия, 0,5% Тритон X-100 и 2 мМ EDTA) при 37С в течение 24 ч после 2-х мин вакуумной инфильтрации. Препараты фиксировали в течение 1 мин в 2% глутаральдегиде и заключали в глицерин. Цифровые микрофотографии GUS-зависимого окрашивания получали с помощью фотокамеры Canon EOS 40D, установленной на микроскоп Биолам Р-16. Использовали идентичные для каждой серии опытов настройки: ISO 100, Tv 1/200 с, формат JPEG sRGB 8-бит.
Перевод цифровых единиц в физические единицы длины производили по микрофотографиям шкалы объект-микрометра. Изображения анализировали в ImageJ и Adobe Photoshop в цветовой модели RGB, площадь исследуемых тканей корня определяли в ImageJ. Цветовую информацию получали в Photoshop инструментом Color Sampler с усреднением по области 55 точек и переносили в Excel (Пожванов, Медведев, 2008).
Определение содержания ИУК в корне методом ГХ/МС. В работе использовали вариант метаболомного анализа с получением ТМС-производных.
Фиксацию и экстракцию метаболитов проводили в метаноле при 6C. В качестве внутреннего стандарта использовали ванилин. Дериватизацию проводили с BSTFA при 100С в течение 25 мин. Анализ проводили на газовом хроматографе - масс-спектрометре Agilent 6850 GC / 5975B VL MSD на капиллярной колонке DB-5HT, контролируя постоянство газового потока при линейном повышении температуры. Пробу вводили в режиме импульсной инжекции без деления потока. Детекцию проводили в режиме мониторинга отдельных ионов (SIM): 194 m/z (ванилин-ТМС), 202 m/z и 319 m/z (ИУК2ТМС). Хроматограммы обрабатывали в Agilent MSD ChemStation.
Концентрацию ИУК рассчитывали в Excel, исходя из предположения о линейной зависимости между отношением площадей пиков и концентраций ИУК и внутреннего стандарта.
Расчёт концентрации ИУК в тканях корня. Входными данными служили значения яркости в канале R цифрового изображения и данные об абсолютном содержании ауксина в 1-см отрезке кончика корня, полученные методом ГХ/МС. Оптическую плотность GUS-зависимого окрашивания в канале R рассчитывали в точке цифрового изображения как DR = Цlg(R/R0), где R0 - яркость фона. Содержание ИУК оценивали по формуле вида CИУК = aD2 + bDR + c, где a, b, c - параметры квадратичной регрессии.
R Визуализация и анализ организации актинового цитоскелета.
Актиновый цитоскелет в растениях DR5::GUS окрашивали родамин-фаллоидином после фиксации параформальдегидом. Растворы готовили на основе актинстабилизирующего буфера (АСБ, 50 мМ PIPES, 5 мМ EGTA, 5 мМ MgSO4, pH 6,9). Проростки на стёклах фиксировали в течение 60 мин в 1,5% параформальдегиде в АСБ, pH 7, и трёхкратно обрабатывали в АСБ с 1% Тритон X100 и 5% ДМСО в течение 5 мин для пермеабилизации. Окрашивание проводили в темноте в течение 30 мин с 0,18 М родамин-фаллоидина в АСБ. После трёх 5-мин отмывок в АСБ удаляли спейсеры и анализировали препарат при помощи прямого конфокального микроскопа Leica TCS SPE (объектив 40, NA 1,15; лазер 532 нм). Актиновый цитоскелет в растениях GFP-fABD2 визуализировали in vivo при помощи инвертированного конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM 710 (объектив 40, C-Apochromat, NA 1,2; лазер 488 нм). Обработку конфокальных изображений проводили в ПО Leica LAS AF, Carl Zeiss ZEN 2009, 2011. Суммарные проекции оптических срезов в зоне растяжения в центральной части и в области коры корня анализировали визуально и в Adobe Photoshop.
Для описания морфологии актиновых микрофиламентов использовали индекс искривлённости: icurv. = (naxial) / (nradial), где naxial и nradial - число пересечений актиновых микрофиламентов с аксиальными и радиальными линиями сетки соответственно. Микрофиламенты актина классифицировали как аксиальные, наклонные или поперечные, если угол между ними и осью корня составлял соответственно 0Ц22.5, 22.5Ц67.5 и 67.5Ц90. На гистограммах показана встречаемость в конфокальных изображениях аксиально, наклонно и поперечно ориентированных микрофиламентов.
Определение скорости роста корня и угла гравитропического изгиба корней проростков арабидопсиса проводили по изображениям, полученным с фотокамер Canon PowerShot G9, смонтированных на роботизированной установке Zaber. С её помощью фотокамеры позиционировали против чашек Петри с растениями и производили съёмку с интервалом 6 мин. В ImageJ измеряли длину корня l и угол гравитропического изгиба гравистимулированных растений. В каждом варианте подсчитывали l и для 810 индивидуальных проростков. Для изучения влияния этилена на скорость роста корня и угол гравитропического изгиба в чашках Петри с растениями размещали ватный тампон, содержащий 1 мл 7 мМ водного раствора (pH 7) этилен-продуцента этефона. Объёмная концентрация этилена в атмосфере чашки Петри составляла до 2000 ppm.
Статистическая обработка результатов. Эксперименты проводили как минимум в трёхкратной биологической повторности. Значимость различий оценивали по критерию Стьюдента (p<0,05). В работе обсуждаются только статистически значимые различия. На рисунках приведены типичные микрофотографии.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние гравистимуляции и этилена на рост корней растений Col-0 и GFP-fABDНа первом этапе работы было проведено сравнение скорости роста в длину и развития гравитропического изгиба у растений дикого типа (Col-0) и трансгенных растений GFP-fABD2. Оказалось, что скорость роста корня трансгенных растений (0,24 мм/ч) снижена на 17% по сравнению с растениями дикого типа (0,29 мм/ч). Прирост корня в растениях GFP-fABD2 достигал величины, равной приросту корней растений дикого типа на 30Ц45 мин позже (рис. 1). Следует отметить, что в первые 20Ц60 мин от начала наблюдения у трансгенных растений скорость роста была ниже, чем в последующем. Это означает, что растения GFP-fABD2 чувствительны к перемещению в установку, где производили серийную съёмку. Вероятно, эта повышенная чувствительность к механическим воздействиям опосредована актиновым цитоскелетом и требует специальных условий выращивания для наблюдения микрофиламентов in vivo.
Обработка этиленом в концентрации до 2000 ppm в течение 3 ч приводила к торможению роста корня как растений дикого типа, так и трансгенных растений GFP-fABD2 на 41% и 33% соответственно (рис. 1, рис. 4;
видео: ; таблица 1). Достоверных различий в скорости роста вертикально ориентированных корней растений дикого типа и GFP-fABD2, обработанных этиленом, не наблюдалось. После поворота на 90 в поле силы тяжести скорость роста трансгенных растений (0,25 мм/ч) также была ниже (на 19%), чем у растений дикого типа (0,31 мм/ч). Обработка этиленом в концентрации до 2000 ppm в течение 3 ч до гравистимуляции приводила к торможению роста корня как у растений дикого типа (на 19%), так и у GFPfABD2 (на 44%; рис. 2, таблица 1). Таким образом, обработка этиленом приводила к снижению скорости роста гравистимулированных растений дикого типа до уровня нормально растущих трансгенных растений GFP-fABD2.
Ингибирующий эффект этилена на трансгенные растения было более выраженным при гравистимуляции, нежели при их нахождении в вертикальном положении.
Таблица 1. Влияние этилена на скорость роста корней (мм/ч) вертикально ориентированных и гравистимулированных проростков арабидопсиса Col-0 и GFPfABD2 при гравистимуляции и обработке этиленом (3 ч).
Вариант Вертикальное положение Гравистимуляция Col-0 GFP-fABD2 Col-0 GFP-fABDКонтроль 0,290 0,024 0,239 0,018 0,313 0,021 0,254 0,0Этилен 0,169 0,027 0,155 0,019 0,249 0,016 0,142 0,0(2000 ppm, 3 ч) Гравистимуляцию осуществляли путём поворота чашек Петри с растениями на 90 относительно вектора силы тяжести.
Col-0 GFP-fABD GFP-fABD2 1.0.0 60 120 180 240 300, Рис. 1. Влияние этилена на рост корней вертикально ориентированных Arabidopsis thaliana дикого типа (Col-0) и трансгенных растений GFP-fABD2 (n=10).
Col-0 GFP-fABD GFP-fABD2 1.0.0 60 120 180 240 300, Рис. 2. Влияние этилена на рост корней гравистимулированных (поворотом на 90) Arabidopsis thaliana дикого типа (Col-0) и трансгенных растений GFP-fABD2 (n=10).
,, Сравнительный анализ влияния обработки этиленом на развитие гравитропического изгиба корней растений дикого типа и GFP-fABD2 показал, что у растений Col-0, обработанных этиленом, угол гравитропического изгиба не отличался от контрольных, либо в первые 30 мин гравистимуляции развивался быстрее. Поскольку при обработке этиленом у растений Col-0 наблюдали торможение роста корня в длину (рис. 2), а развитие ростовой реакции, оцениваемое по углу гравитропического изгиба (рис. 3), происходило так же, как в контрольном варианте, можно сделать вывод о том, что этилен ускоряет развитие гравитропической реакции в растениях дикого типа. У гравистимулированных растений GFP-fABD2 в первые 30 мин угол гравитропического изгиба не отличался от угла изгиба растений дикого типа, но затем наблюдали замедление ростовой реакции на 60Ц120 мин по сравнению с растениями дикого типа. При обработке растений GFP-fABD2 этиленом наблюдали торможение гравитропической реакции в течение всего времени наблюдения (рис. 3). Повидимому, в трансгенных растениях наличие химерного белка GFP-fABD2, взаимодействующего с актиновым цитоскелетом, не влияет на этап гравирецепции и трансдукции сигнала в проростках, ориентированных вертикально.
Однако при обработке этиленом присутствие белка GFP-fABD2 приводит к торможению развития гравитропической реакции как на этапе рецепции и трансдукции сигнала, так и на этапе ответной ростовой реакции.
итературные данные свидетельствуют о том, что этилен может являться положительным регулятором гравитропизма у кукурузы: обработка салициловой кислотой - специфическим ингибитором синтеза этилена из АЦК - приводила к торможению гравитропического ответа колеоптилей кукурузы (Lee et al., 1990; Медведев, Маркова, 1991). Из настоящей работы следует, что влияние этилена на гравитропическую реакцию корня различается у растений дикого типа и трансгенных растений GFP-fABD2: у растений дикого типа этилен подавляет рост корня и не влияет на угол гравитропического изгиба, а у GFPfABD2 тормозит и рост, и гравитропический изгиб. Вероятно, конститутивная экспрессия трансгенного белка, взаимодействующего с актином, затрудняет связывание других белков с актиновым цитоскелетом, среди которых могут быть белки, опосредующие эффект этилена.
2. Изучение роли ауксина в регуляции гравитропизма Стандартная методика метаболитного профайлинга не позволяет обнаружить ауксин в ткани. После оптимизации условий анализа в режиме SIM (202, 319 m/z) стало возможным зарегистрировать производные ИУК в количестве от 1,3 10Ц15 г в образце. 7-суточный проросток трансгенного A. thaliana DR5::GUS содержал в среднем 15,9 1,0 пг свободной ИУК на мг сырой массы растения. С учётом содержания ИУК в отрезках корней A. thaliana DR5::GUS, определенного методом ГХ/МС, формула для оценки концентрации ИУК по гистохимическому окрашиванию приобрела вид:
CИУК = 242,01DR2 + 12,447DR - 0,2675 10Ц15 моль/мCol- GFP-fABDGFP-fABD2 0 60 120 180 240 300, Рис. 3. Влияние этилена на развитие гравитропического изгиба (в град.) корней Arabidopsis thaliana дикого типа (Col-0) и трансгенных растений GFP-fABD2 после поворота на 90 в поле силы тяжести (n=10).
Рис. 4. Развитие гравитропического изгиба корней проростков Arabidopsis thaliana дикого типа (Col-0) и трансгенных растений GFP-fABD2 в течение 60 мин после обработки этиленом. Слева - вертикально растущие проростки, справа - гравистимуляция. Стрелками отмечено положение кончика корня в начале эксперимента. Масштабная линейка 1 см.
смонтированное видео (12 ч в 30 с видео) доступно по адресу: (MP4, 50,27 Мб).
,.
С использованием предложенного нами метода оценки содержания ИУК на гистологических препаратах были определены параметры латерального перераспределения ауксина, которое реализуется при гравистимуляции корней растений арабидопсиса в течение 90 мин. В растениях, расположенных вертикально, содержание ИУК было равномерным и составляло около 1,0 1,5 10Ц14 моль/м2 (рис 5а, 6а). После гравистимуляции содержание ИУК в апикальной меристеме и зоне растяжения корня составляло в верхней части около 1,8 10Ц14 моль/м2 и 0,8 10Ц14 моль/м2 соответственно, а в нижней части корня в области апикальной меристемы достигало 6,5 10Ц14 моль/м2, в зоне растяжения - 4,7 10Ц14 моль/м2 (рис. 5б, 6б).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что при переориентации растений арабидопсиса в поле силы тяжести в течение 90 мин в зоне апикальной меристемы корня и зоны растяжения формируется латеральный градиент концентрации ауксина. Концентрация этого фитогормона в нижней части корня в 2Ц3 раза превышает концентрацию в верхней части корня. Это приводит к ингибированию роста растяжением в нижней части гравистимулированных корней и обеспечивает ростовой изгиб в сторону действия силы тяжести. В нашей работе латеральное перераспределение ИУК, визуализируемое с помощью GUSзависимого окрашивания, в силу времени развития не может соответствовать этапу трансдукции гравитационного сигнала. Мы предполагаем, что латеральный градиент ИУК, наблюдаемый после гравистимуляции, необходим для регуляции ростового ответа.
3. Изучение роли актинового цитоскелета в регуляции гравитропизма С применением широко используемого метода визуализации актинового цитоскелета с помощью окрашивания родамин-фаллоидином (Van Gestel, Verbelen, 2001) в вертикально ориентированных растениях микрофиламенты F-актина были выявлены в центральной части апикальной меристемы корня и в стеле в зоне растяжения. В клетках апикальной меристемы корня микрофиламенты актина были ориентированы в различных направлениях, не демонстрируя чёткой организации, характерной для клеток стелы (рис. 7). В зоне растяжения актиновый цитоскелет был представлен преимущественно толстыми пучками микрофиламентов, которые имели преимущественно аксиальную ориентацию.
Доля наклонно ориентированных микрофиламентов, направленных к латеральной поверхности плазматической мембраны клеток, была незначительной (рис. 7). Актиновый цитоскелет в клетках коры корня не был выявлен. Для оценки морфологии актинового цитоскелета использовали индекс искривлённости микрофиламентов. В зоне растяжения индекс искривлённости микрофиламентов возрастал более чем вдвое после 15Ц30 мин гравистимуляции и затем снижался, приближаясь к контрольному уровню (рис. 8). Поскольку родамин-фаллоидин позволил выявить актиновый цитоскелет только в стеле, но не в коре и ризодерме, в дальнейшем мы использовали растения арабидопсиса, трансформированные генетической конструкцией GFP-fABD2, позволяющей визуализировать актиновые микрофиламенты прижизненно без необходимости фиксации и длительной обработки перед наблюдением.
Рис. 5. GUS-зависимое окрашивание кончика корня контрольного (а) и гравистимулированного в течение 90 мин (б) растений Arabidopsis thaliana DR5::GUS. Стрелкой отмечено направление действия силы тяжести. Интенсивность синего окрашивания коррелирует с концентрацией ИУК. Содержание ИУК вдоль профилей АЦБ (зона растяжения) и ВЦ Г (апикальная меристема) приведено на рис. 6. Масштабная линейка 100 м.
Рис. 6. Содержание ИУК в апикальной меристеме и зоне растяжения корня A. thaliana DR5::GUS в норме и при гравистимуляции. (а) - содержание ИУК в вертикально ориентированном корне (контроль) в зоне растяжения; (б) - содержание ИУК в гравистимулированном в течение 90 мин корне арабидопсиса. На врезках схематично показан кончик корня и положение профилей концентрации ИУК в зоне растяжения (АЦБ) и в апикальной меристеме (ВЦГ), стрелкой отмечено направление вектора силы тяжести.
Контроль 15 мин 30 мин 60 мин 120 мин Апикальная меристема Зона растяжения Рис. 7. Организация актинового цитоскелета в апикальной меристеме и в зоне растяжения корня A thaliana DR5::GUS в вертикально растущем корне (контроль) и после 15, 30, 60 и 120 мин гравистимуляции путём поворота чашек Петри с растениями на 90.
Окрашивание родамин-фаллоидином после фиксации параформальдегидом. Приведены суммарные проекции 56 оптических срезов.
Масштабные отрезки 50 м.
контроль 15 мин 30 мин 60 мин 120 мин Рис. 8. Индекс искривлённости актиновых микрофиламентов в зоне растяжения гравистимулированных корней A. thaliana DR5::GUS.
В кончике корня растений GFP-fABD2 актиновый цитоскелет был выявлен во всех исследованных типах клеток от апикальной меристемы до зоны растяжения. В вертикально ориентированных корнях (контроль) микрофиламенты в клетках стелы были организованы в толстые пучки, ориентированные преимущественно аксиально (рис. 10, а, б). В коре корня и в ризодерме актиновый цитоскелет был представлен более тонкими нитями, расположенными параллельно оси корня или наклонно.
Следует отметить, что помещение проростка на предметный стол микроскопа также является гравистимуляцией. Поэтому необходимо было выяснить, как эта процедура будет влиять на организацию актинового цитоскелета. На рис. 9 приведены оптические срезы, полученные с 5-мин интервалом и проходящие через стелу и кору корня в зоне растяжения в растениях GFP-fABD2. Первые видимые перестройки актинового цитоскелета и появление новых микрофиламентов наблюдали не ранее, чем через 20 мин после помещения проростка арабидопсиса на предметный стол конфокального микроскопа. Этого времени достаточно, чтобы зарегистрировать серию из 10Цоптических срезов для визуализации актинового цитоскелета и избежать появления в z-серии микрофиламентов, изменение ориентации которых обусловлено гравистимуляцией в новом направлении (рис. 9). Кроме того, данные о динамике актинового цитоскелета свидетельствуют о том, что при гравистимуляции корней проростков GFP-fABD2 реорганизация актинового цитоскелета происходит позже, чем у растений, не синтезирующих трансгенный актин-связывающий белок. При помощи окрашивания родамин-фаллоидином наблюдали изменения в структуре актинового цитоскелета через 15 мин после начала гравистимуляции.
В дальнейшем изучали реорганизацию актинового цитоскелета при гравистимуляции путём поворота в вертикальной плоскости чашек Петри с растениями на стёклах на 90 относительно вектора силы тяжести. После гравистимуляции проростков GFP-fABD2 в течение 30 мин в коре корня Индекс искривлённости микрофиламентов актина, усл.ед.
наблюдали появление микрофиламентов актина, ориентированных наклонно (рис. 10, в, г) и поперечно (перпендикулярно оси органа, рис. 10, в).
Микрофиламенты в стеле были ориентированы преимущественно аксиально.
Рис. 9. Изменения организации актинового цитоскелета в зоне растяжения корня A. thaliana GFP-fABD2 при гравистимуляции, обусловленной размещением растений на предметном столе конфокального микроскопа.
Рамками обозначена область в коре корня, в которой к 20-й мин гравистимуляции выявлены вновь образовавшиеся микрофиламенты актина. Стрелками указаны наклонно и поперечно ориентированные микрофиламенты.
Приведены суммарные проекции 7Ц9 оптических срезов. Масштабные отрезки 50 м.
После 60 мин гравистимуляции в зоне растяжения корней растений GFPfABD2 наблюдали дальнейшее увеличение доли наклонно и поперечно ориентированных микрофиламентов (рис. 10, д, е). Доля аксиально ориентированных микрофиламентов снижалась приблизительно в два раза (рис. 10, в, г) по сравнению с контролем (рис. 10, б), тогда как доля наклонно и поперечно ориентированных микрофиламентов увеличивалась в 1,5 и 3Ц4 раза соответственно. Существенное увеличение доли поперечно ориентированных микрофиламентов означает, что при гравистимуляции происходит сборка преимущественно таких микрофиламентов, направление которых параллельно вектору силы тяжести.
Рис. 10. Реорганизация актинового цитоскелета в зоне растяжения корня A. thaliana GFPfABD2 при гравистимуляции путём поворота в вертикальной плоскости чашек Петри с растениями на стёклах на 90 относительно вектора силы тяжести.
а, б - контроль; в, г - гравистимуляция 30 мин; д, е - гравистимуляция 60 мин; а, в, д - кора корня; б, г, д - стела. Цифрами обозначены: 1 - аксиально, 2 - наклонно, и 3 - поперечно ориентированные микрофиламенты. Микрофиламенты визуализированы прижизненно с помощью конструкции GFP-fABD2. Приведены суммарные проекции 7Цоптических срезов. Масштабные отрезки 50 м.
1 11 1 Рис. 11. Количественная характеристика реорганизации актиновых микрофиламентов в гравистимулированных корнях арабидопсиса GFP-fABD2: а - контроль, б - гравистимуляция 60 мин, верхняя часть, в - гравистимуляция 60 мин, нижняя часть корня.
В отличие от метода окрашивания актинового цитоскелета с родаминфаллоидином, использование трансгенных растений GFP-fABD2 позволяет выявлять микрофиламенты актина в разных типах клеток (рис. 10). Растения, несущие данную конструкцию, не имеют нарушений физиологии, присущих слиянию GFP с актин-связывающим белком талином (GFP-mTn) или же двойному слиянию GFP-ABD2-GFP (Sheahan et al., 2004; Voigt et al., 2005, Wang et al., 2008). Дополнительное преимущество визуализации микрофиламентов с использованием конструкции GFP-fABD2 заключается в отсутствии необходимости процедур фиксации и отмывки растительного материала, которые могли бы повлиять на организацию актинового цитоскелета. Всё это позволяет распространить на растения дикого типа данные об реорганизации актинового цитоскелета при гравистимуляции, полученные на растениях GFPfABD2, учитывая, однако, меньшую скорость роста трансгенных растений.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ В результате выполненного исследования впервые установлено, что изменение положения корня арабидопсиса в пространстве приводит к реорганизации актинового цитоскелета в зоне растяжения корня после 20 мин гравистимуляции. Наиболее выраженные изменения наблюдали после 30Ц 60 мин, в течение которых в 3Ц4 раза увеличивалась доля поперечно ориентированных микрофиламентов, сонаправленных вектору силы тяжести.
Учитывая время, в течение которого происходит реорганизация микрофиламентов в зоне растяжения, можно сделать вывод о том, что выявленная нами реорганизация актинового цитоскелета относится к позднему этапу трансдукции гравитационного сигнала и ростовой реакции корня. Эти факты указывают на то, что актиновый цитоскелет имеет непосредственное отношение к развитию гравитропической реакции. По-видимому, для гравирецепции и трансдукции сигнала достаточно микрофиламентов, уже имеющихся в клетках.
Разработанный нами метод оценки концентрации ауксина на гистологических препаратах позволил измерить латеральный градиент концентрации ИУК, развивающийся при гравистимуляции (90 мин) в зоне растяжения корня арабидопсиса. Оказалось, что содержание ИУК в нижней части корня увеличивается в 2Ц3 раза. Поэтому мы предполагаем, что реорганизация актинового цитоскелета в зоне растяжения способствует поддержанию латерального градиента ИУК, задающего асимметричный рост корня.
Показано, что фитогормон этилен оказывает модулирующее действие на гравитропическую реакцию. У растений дикого типа этилен ускоряет развитие гравитропической реакции. У трансгенных растений GFP-fABD2, используемых для визуализации актинового цитоскелета, этилен приводит к торможению роста корня в длину и развития гравитропического изгиба.
Подводя итог настоящей работе, можно предложить следующую последовательность событий, инициированных переориентацией корня в поле силы тяжести (гравистимуляцией). На этапе рецепции и трансдукции гравитационного сигнала гравистимуляция вызывает седиментацию статолитов в направлении вектора силы тяжести (Blancaflor et al., 1998) и формирование первичного латерального градиента ИУК в кончике корня благодаря PIN3зависимому транспорту ауксина в корневом чехлике (Friml et al., 2002;
Ottenschlger et al., 2003; Band et al., 2012). На данном этапе актиновый цитоскелет является негативным регулятором гравитропической реакции, поскольку тормозит взаимодействие статолитов и механорецепторов (Morita, 2010).
В ходе трансдукции гравитационного сигнала и начала ответной ростовой реакции происходит реорганизация актинового цитоскелета в зоне растяжения корня. На этом этапе актиновый цитоскелет является позитивным регулятором, так как способствует формированию Дтранспортного каналаУ для передвижения ауксина на нижнюю часть гравистимулированного корня.
Формирование латерального градиента ИУК при этом обеспечивается за счёт перемещения переносчиков ауксина PIN2 на нижнюю часть клеток в коре корня, что обусловливает транспорт ИУК в латеральном направлении в зоне растяжения корня (Abas et al., 2006). На третьем (заключительном) этапе гравитропической реакции накопление ауксина в нижней части корня приводит к торможению роста клеток и формированию ростового изгиба.
ВЫВОДЫ 1. Разработан метод количественной оценки содержания ИУК на гистологических препаратах трансгенных растений арабидопсиса DR5::GUS.
2. Установлено, что при гравистимуляции поворотом на 90 относительно вектора силы тяжести в кончике корня формируется латеральный градиент ауксина, характеризующийся перепадом концентрации в 2Ц3 раза. При этом содержание ИУК в нижней части апикальной меристемы и зоны растяжения корня составляет около 5,510Ц14 моль/м2, а в верхней части - от 0,8 до 1,8 10Ц14 моль/м2.
3. Окрашивание актинового цитоскелета с помощью родамин-фаллоидина выявляет только толстые микрофиламенты актина в стеле корней арабидопсиса. После 15 мин гравистимуляции индекс искривлённости актиновых микрофиламентов в стеле в зоне растяжения корня увеличивался в 2 раза, после чего снижался, возвращаясь к первоначальному уровню.
4. Использование растений арабидопсиса, трансформированных конструкцией GFP-fABD2, позволяет выявлять актиновый цитоскелет во всех клетках кончика корня. В вертикально ориентированных корнях в клетках стелы микрофиламенты организованы в толстые пучки, ориентированные преимущественно аксиально. В коре корня и ризодерме актиновый цитоскелет представлен более тонкими нитями, расположенными параллельно или наклонно относительно оси корня.
5. После 30Ц60 мин гравистимуляции проростков GFP-fABD2 происходит снижение доли аксиально ориентированных микрофиламентов актина при одновременном увеличении доли наклонных и поперечных микрофиламентов.
6. Обработка этиленом в концентрации 2000 ppm вызывает подавление гравитропической реакции. При этом наблюдается снижение скорости роста и уменьшение угла гравитропического изгиба.
7. Предложена последовательность взаимодействия ауксина и актинового цитоскелета в регуляции гравитропической реакции в корне арабидопсиса.
ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:
1. Пожванов Г.А., Медведев С.С. Метод количественной оценки содержания ауксина по гистохимическому окрашиванию на активность GUS под контролем ауксин-чувствительного промотора // Физиология растений.
2008. Т. 55, №. 5. С. 786Ц792.
2. Пожванов Г.А., Суслов Д.В., Медведев С.С. Реорганизация актинового цитоскелета при гравистимуляции корней растений арабидопсиса // Труды Томского государственного университета. 2010. Vol. Т. С. 305Ц308.
Тезисы конференций:
1. Медведев С.С., Батов А.Ю., Шарова Е.И., Маркова И.В., Пожванов Г.А., Билова Т.Е., Аврутина О.В., Суслов М.В. Роль ауксина, кальция и клеточной стенки в процессах морфогенетического паттернирования тканей и органов растительного организма // VI Съезд Общества физиологов растений России Современная физиология растений: от молекул до экосистем. Материалы докладов. Сыктывкар, Россия. 18Циюня 2007, Коми НЦ УрО РАН. 2007. 327Ц329.
2. Пожванов Г.А. Количественная оценка содержания фитогормона ИУК по гистохимическому окрашиванию на GUS-активность // 11-я международная пущинская школа-конференция молодых учёных.
Материалы докладов. Пущино, Россия. 29 октября - 2 ноября 2007, ПНЦ РАН. 2007. С. 213Ц214.
3. Pozhvanov G.A. Quantitative estimation of IAA content based on histochemical staining of GUS-activity // FESPB 2008 Congress. 18Ц22 August 2008, Tampere, Finland. Physiologia Plantarum 133, 2008. P06-045.
4. Pozhvanov G., Shavarda A., Medvedev S. Quantitative auxin measurement in Arabidopsis roots with combined GC/MS and cytochemistry // International Plant Growth Substances Association Conference 2010. 28 June - 2 July 2010, Tarragona, Spain. 2010. PS05-06.
5. Pozhvanov G., Medvedev S. Polar IAA transport during Arabidopsis root gravitropism: quantitative analysis with cytochemistry and GC/MS // FESPB 2010 Congress. 4Ц9 July 2010, Valencia, Spain. P06-004.
6. Пожванов Г.А., Суслов Д.В., Медведев С.С. Актиновый цитоскелет и транспорт ИУК в гравитропической реакции корней трансгенных растений Arabidopsis thaliana DR5::GUS и fABD2:GFP // III Всероссийский симпозиум Физиология трансгенного растения и фундаментальные проблемы биобезопасности. Материалы докладов. Москва, Россия, 18Цоктября 2010. С. 65.
7. Пожванов Г.А., Суслов Д.В., Медведев С.С. Перестройки актинового цитоскелета в ходе гравитропической реакции корней арабидопсиса // VII Съезд Общества физиологов растений России Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий и Международная научная школа Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции. Материалы докладов.
Нижний Новгород, Россия. 4Ц10 июля 2011, Издательство НГУ. С. 567.
8. Pozhvanov G.A., Suslov D.V., Shavarda A.L., Medvedev S.S. Arabidopsis root gravitropism is directed by IAA redistribution and subsequent actin cytoskeleton rearrangement // FESPB 2012 Congress, Plant Biology in Space Satellite Symposium. 29 July - 3 August 2012, Frieburg, Germany. P. 227.
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ АСБ Ч актин-стабилизирующий буфер АЦК Ч 1-аминоциклопропан-1-карбоновая кислота, предшественник этилена ГХ/МС Ч газовая хроматография - масс-спектрометрия ИУК Ч индол-3-уксусная кислота, ауксин МС/2 Ч среда Мурасиге-Скуга ТМС Ч триметилсилильный фрагмент, ЦSi(CH3)BSTFA Ч бис-триметилсилилтрифторацетамид Col-0 Ч Columbia-0, растения арабидопсиса дикого типа DR5 Ч синтетический ауксин-чувствительный промотор EDTA Ч этилендиаминтетраукусная кислота EGTA Ч этиленгликоль-бис[бета-аминоэтиловый эфир]-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота fABD2 Ч второй (C-концевой) актин-связывающий домен фимбрина арабидопсиса GFP Ч зелёный флуоресцентный белок GFP-fABD2 Ч генетическая конструкция для визуализации актинового цитоскелета, в которой GFP слит с актин-связывающим белком GUS Ч -D-глюкуронидаза PIN Ч семейство белков-переносчиков ауксина, обеспечивающих выход ИУК из клетки PIPES Ч пиперазиндиэтансульфоновая кислота RGB Ч цифровая модель представления цвета, в которой информация представлена данными о яркости в каждом из 3-х каналов: красном, зелёном и синем X-Gluc Ч 5-бром-4-хлор-3-индолил--D-глюкопиранозид Подписано в печать л30 октября 2012 г. Формат 60x84/Бумага офсетная. Печать офсетная.
Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ № 3110.
Типография Восстания - 1 191036, Санкт-Петербург, ул. Восстания, д. 1.