Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине
На правах рукописи
САВИНА
Валентина Андреевна
РОЛЬ АРОМАТАЗЫ Р450 В ПАТОГЕНЕЗЕ СИНДРОМА ПОЛИКИСТОЗНЫХ ЯИЧНИКОВ
14.01.01 - акушерство и гинекология
14.01.02 - эндокринология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата медицинских наук
Санкт-Петербург - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им.Д.О. Отта Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук
Научные руководители:
доктор медицинских наук,
профессор Тарасова Марина Анатольевна
заслуженный деятель науки РФ,
доктор медицинских наук, профессор Потин Владимир Всеволодович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор, ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет медицинский факультет, заведующая кафедрой акушерства, гинекологии и репродуктологии | Ниаури Дарико Александровна |
доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И.И.Мечникова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, заведующая кафедрой эндокринологии им. акад. В.Г.Баранова | Ворохобина Наталья Владимировна |
Ведущая организация: ФГБВОУ ВПО Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова Министерства обороны РФ.
Защита состоится л____ ____________________ 2012 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.021.01 при ФГБУ НИИАГ им.Д.О. Отта СЗО РАМН (199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ НИИАГ им.Д.О. Отта СЗО РАМН.
Автореферат разослан л___ _________________ 2012 г.
Учёный секретарь
диссертационного совета
доктор медицинских наук Кузьминых Татьяна Ульяновна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Нормогонадотропная недостаточность яичников является одной из частых причин нарушения менструального цикла и бесплодия (RCOG, 2004). Эта форма овариальной недостаточности, характеризующаяся неизмененным базальным уровнем гонадотропинов в крови, может быть обусловлена регуляторными внеовариальными факторами. Проба с эстрадиолом, моделирующая предовуляторный подъем эстрогенов в крови, позволяет выявить нарушение механизма положительной обратной связи между яичниками и гипофизом при нормогонадотропной ановуляции, обусловленной сахарным диабетом 1 типа и гипотиреозом (Начинкина Ю.О. 1994; Ткаченко Н.Н. и соавт., 1997). Однако у большинства больных с нормогонадотропной ановуляцией парентеральное введение эстрогенов вызывает адекватное повышение гонадотропинов в крови (Айламазян Э.К. и соавт., 1994; Потин В.В. и соавт., 1990; Ниаури Д.А., 1995). Это указывает на роль первично-овариальных нарушений в патогенезе данной патологии. Было высказано предположение, что причиной ановуляции у этих больных является недостаточный предовуляторный подъем эстрогенов в крови, обусловленный, например, хроническим воспалительным поражением яичников, аутоиммунным оофоритом, эндометриозом или частичными наследственными ферментативными дефектами, нарушающими синтез эстрогенов в яичниках. С 1991 года в литературе периодически появляются описания случаев снижения ароматазной активности на 81-99,8%, связанных с наличием мутаций в гене ароматазы CYP19 (Shozu M. et al., 1991; Harada N. et al., 1992; PortratЦDoyen S. et al., 1996; Mullis P.E. et al., 1997; Ludwig M. et al., 1998; Deladoey K. et al., 1999; Scott R.R. et al., 2008). Клиническая картина снижения активности ароматазы у больных женского пола выражается внутриутробной вирилизацией различной степени тяжести с последующим развитием гипергонадотропного гипогонадизма, поликистозных изменений яичников, ожирения, первичной аменореи, бесплодия. Можно думать, что менее выраженное снижение ароматазной активности проявляется синдромом поликистозных яичников (СПЯ) - заболеванием, входящим в структуру нормогонадотропной недостаточности яичников, встречающимся у 5-10% женщин репродуктивного возраста (Knochenhauer E.S. et al., 1998; Michelmore K.F. et al., 1999). Наиболее характерными признаками СПЯ являются: увеличение яичников с множественными антральными фолликулами, ановуляция, нарушение менструального цикла по типу опсоменореи (до 95%) (Kumarapeli V. et al., 2008), гиперпродукция лютеинизирующего гормона (ЛГ) гипофизом, гиперандрогенемия, гирсутизм (до 70%) (Соболева Е.Л. и соавт., 2007; ESHRE/ASRMЦSponsored 3rd PCOS Consensus Workshop Group, 2012), ожирение (38-88%) и нарушение толерантности к глюкозе (Balen A.H. et al., 1995; Legro R.S. 2008). Еще в прошлом веке появились работы по изучению особенностей стероидогенеза в яичниках при СПЯ (Потин В.В. и соавт., 1990; Short R.V., London D.R. 1961; Erickson G.F. et al., 1979). Увеличение соотношения андрогены/эстрогены в сыворотке крови, в фолликулярной жидкости и в инкубационной среде при культивировании гранулезных клеток яичников больных СПЯ позволило предположить, что дефицит ароматазы является ведущим фактором патогенеза данного заболевания. Ряд медико-генетических исследований (Petry C.J. et al., 2005; Xita N. et al., 2008; Jin J.L. et al., 2009) указывает на наличие ассоциации полиморфизма гена CYP19 с развитием СПЯ. Так, при изучении аллельного варианта (ТТТА)n в 4 интроне гена CYP19 обнаружено (Xita N. et al., 2008) у больных СПЯ более низкое число повторов (ТТТА)n и более высокий уровень тестостерона в крови. В другой работе (Baghaei F. et al., 2003) полиморфизм гена CYP19 del(ТТТА)7 ассоциировался с увеличением уровня андрогенов и снижением уровня эстрогенов в крови, и возможно, снижением ферментативной активности ароматазы. В ходе исследования гена CYP19 в испанской и английской популяции (Petry C.J. et al., 2005) обнаружена корреляция между SNP50 (rs2414096) и избытком андрогенов. Китайские ученые (Jin J.L. et al., 2009) выявили ассоциацию полиморфизма SNP50 (rs2414096) с риском развития СПЯ в своей популяции. Вместе с тем, другие исследователи (Urbanek M. et al., 1999; Soderlund D. et al., 2005) не подтвердили участия каких-либо полиморфных вариантов гена CYP19 в развитии СПЯ у женщин в США и Мексике.
Представляется перспективным изучение особенностей полиморфизма гена ароматазы CYP19 при СПЯ в сравнении с популяционными показателями Северо-Запада Российской Федерации. В современной литературе не представлены результаты исследований экспрессии ароматазы гранулезными клетками яичников больных СПЯ и не разработаны доступные для клинической практики гормональные методы определения ароматазной активности.
Цель исследования отражена в названии и состоит в выяснении роли ароматазы р450 в развитии синдрома поликистозных яичников.
Задачи исследования
- Изучить реакцию половых стероидных гормонов и гонадотропинов на ингибитор ароматазы летрозол у здоровых женщин и разработать тест с летрозолом, позволяющий количественно оценивать ароматазную активность.
- Определить с помощью теста с летрозолом ароматазную активность при синдроме поликистозных яичников.
- С помощью иммуногистохимического метода изучить экспрессию овариальной ароматазы при синдроме поликистозных яичников.
- Определить частоту аллелей и генотипов по гену ароматазы CYP19 ((TTTA)n полиморфизм, del(TCT) полиморфизм и SNP50 (rs2414096)) у больных синдромом поликистозных яичников.
Научная новизна и теоретическая значимость работы. Разработан метод определения ароматазной активности по изменению половых стероидных гормонов и гонадотропинов в ответ на пероральный прием ингибитора ароматазы летрозола (заявка на изобретение № 201206289). Впервые показано, что реакция эстрадиола и гонадотропинов на ингибитор ароматазы летрозол при СПЯ не выходит за пределы ее физиологических колебаний у здоровых женщин. Установлено, что экспрессия овариальной ароматазы при СПЯ соответствует размерам антральных фолликулов. Не выявлено значимых отличий в частоте аллельных вариантов гена ароматазы CYP19 при СПЯ и у женщин группы сравнения. Теоретическая значимость работы состоит в выяснении роли ароматазы в развитии СПЯ.
Практическая значимость работы. Разработанная проба с летрозолом позволяет оценивать ароматазную активность у больных с различными формами овариальной недостаточности.
Основные положения, выносимые на защиту
- Однократный прием 10 мг ингибитора ароматазы летрозола приводит через 48 часов к достоверному снижению эстрадиола и адекватному повышению гонадотропинов в крови здоровых женщин.
- Результаты пробы с ингибитором ароматазы летрозолом, изучение экспрессии овариальной ароматазы иммуногистохимическим методом и генетического исследования аллелей и генотипов гена ароматазы CYP19 не позволяют считать абсолютный дефицит ароматазы причиной развития синдрома поликистозных яичников.
- Относительный дефицит ароматазы при синдроме поликистозных яичников, проявляющийся снижением коэффициента эстрадиол/тестостерон, следует связать с гиперпродукцией ЛГ гипофизом.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на межлабораторном заседании 7 июня 2012 г. в НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН, на II ежегодной конференции молодых учёных и специалистов НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН Репродуктивная медицина: взгляд молодых - 2011, на VI Всероссийской научно-практической конференции: Здоровье - основа человеческого потенциала: проблемы и пути их решения (24-26 ноября 2011, г. Санкт-Петербург) и на VI всероссийском конгрессе Современные технологии в эндокринологии (27-31 мая 2012, г. Москва). По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 5 статей - в рецензируемых научных журналах.
Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в работу отделения гинекологической эндокринологии ФГБУ НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН, в учебный процесс на кафедре акушерства и гинекологии СПбГМУ имени И.П. Павлова.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, общей характеристики обследованных женщин и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы.
Материалы диссертации изложены на 129 страницах машинописного текста, содержат 21 таблицу и 10 рисунков. Библиография включает 286 источников, в том числе 53 - отечественных и 233 - зарубежных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Для решения поставленных задач в период с 2010 по 2012 гг. в отделении гинекологической эндокринологии ФГБУ НИИАГ им. Д.О.Отта СЗО РАМН (заведующая отделением д.м.н. профессор М.А. Тарасова) обследовали 92 женщины с СПЯ и 55 женщин группы сравнения. Группу больных СПЯ составили женщины в возрасте от 19 до 36 лет. Диагноз СПЯ устанавливали на основании характерных клинических проявлений синдрома (ановуляция, нарушение менструального цикла, гирсутизм, ожирение), данных гормонального обследования (повышенный уровень ЛГ, общего и свободного тестостерона в крови, увеличение соотношения ЛГ/ФСГ (фолликулостимулирующий гормон), низкий уровень прогестерона в крови во вторую фазу менструального цикла) и эхографических критериев (увеличение объема яичников более 10 см, наличие множества мелких антральных фолликулов, расположенных по периферии под утолщенной капсулой, избыточная строма). Группу сравнения составили 55 женщин в возрасте от 22 до 56 лет без СПЯ, что подтверждали анамнестическими, гормональными, ультразвуковыми и лапароскопическими данными. Критериями исключения были: нарушение функции щитовидной железы: гипо- или гипертиреоз, пролактинсекретирующая аденома гипофиза, сахарный диабет 1 типа, надпочечниковая гиперандрогенемия, дефицит массы тела, наличие беременности на момент исследования, применение половых гормонов и их аналогов в течение трех месяцев до обследования.
Гормональные исследования проводили в гормональной лаборатории отдела эндокринологии репродукции ФГБУ НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН (руководитель лаборатории к.б.н. Н.Н. Ткаченко). Гормональное обследование включало определение иммуноферментным методом в сыворотке крови уровня ФСГ, ЛГ, общего тестостерона (Алкор Био, Россия), а также свободного тестостерона и эстрадиола на 2-5 день менструального цикла (лDRG diagnostics, Германия). При выполнении лапароскопической операции содержание гормонов в крови оценивали повторно на 10-12 день менструального цикла (в день операционного вмешательства). Определение содержания в сыворотке крови пролактина и прогестерона (Алкор Био, Россия) выполняли на 20-21 день менструального цикла. При проведении пробы с летрозолом в сыворотке крови определяли содержание ФСГ, ЛГ, общего тестостерона, свободного тестостерона и эстрадиола до и через 24, 48 и 72 часа после перорального приема 10 мг летрозола на 2-й день менструального цикла.
Ультразвуковое сканирование матки и яичников проводили на аппарате Sonoace X4 (Корея) с использованием трансвагинального датчика с частотой 4-9 МГц. При ультразвуковом исследовании определяли размеры матки, толщину и структуру эндометрия, размеры яичников, состояние фолликулярного аппарата, наличие доминантного фолликула и жёлтого тела, их размеры; наличие других полостных образований.
апароскопию проводили на 10-12 день менструального цикла по общепринятой методике с помощью лапароскопа фирмы Karl Storz (Германия). При лапароскопии выполняли биопсию яичников. Диагноз СПЯ подтверждали при наличии увеличенных в размерах яичников, имеющих гладкую, блестящую белочную оболочку с выраженным сосудистым рисунком и отсутствием старых желтых тел. Стадии наружного генитального эндометриоза (НГЭ) оценивали согласно классификации Американского общества фертильности.
Гистологическое и иммуногистохимическое исследование биоптатов яичников выполняли в отделе патоморфологии ФГБУ НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН (руководитель отдела з.д.н. Р.Ф. д.м.н. профессор И.М. Кветной). Для гистологического исследования образцы ткани яичников в виде полос размерами 0,5 х 1,0 см фиксировали в 10% нейтральном формалине (рН 7,2), обезвоживали в автоматической установке Leica TP1020, заливали в парафин, готовили срезы толщиной 5мкм. Для обзорной окраски использовали гематоксилин и эозин. Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием первичных кроличьих поликлональных антител к ароматазе р450 (Clone ab 18995; 1:100, Abcam, США). Визуализацию реакции проводили, применяя набор EnVision/HRP (лDako, Дания). Негативный контроль выполняли с применением блокирующей сыворотки (DAKO LSAB 2 kit). Позитивный контроль проводили на ткани плаценты. Для проведения иммуногистохимической реакции использовали стандартный одноэтапный протокол с демаскировкой антигена (высокотемпературной обработкой ткани) в 0,01М цитратном буфере (рН 7,6). Количественную оценку результатов иммуногистохимических реакций выполняли с помощью программы Видеотест-Морфология 5.0. Фотосъемку проводили при увеличении 400х (окуляр 10х, объектив 40х). В группе сравнения ароматазную активность определяли в гранулезных клетках доминантных фолликулов и фолликулах 5-6 мм в диаметре, в группе больных СПЯ - в максимальном фолликуле. Ароматазную активность измеряли по методике, предложенной Suzuki T. et al., 1994, используя показатель интегральной оптической плотности и количество клеток гранулезы в объекте по формуле: интегральная оптическая плотность/количество клеток гранулезы. Значения оценивали по 5 полям зрения, высчитывали среднее значение.
Генетическое обследование проводили совместно с лабораторией пренатальной диагностики наследственных заболеваний человека ФГБУ НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН (под непосредственным руководством в.н.с. профессора Т.Э. Иващенко, руководитель лаборатории член-кор. РАМН з.д.н. РФ проф. В.С. Баранов). Генетическое исследование включало анализ аллельных вариантов гена CYP19 ((TTTA)n полиморфизм), (del(TCT)) и SNP50 (rs2414096) методом полимеразной цепной реакции.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с применением стандартных пакетов программ прикладного статистического анализа (Statistica for Windows v. 7.0, Microsoft Excel и др.) с использованием методов параметрической и непараметрической статистики. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий или факторных влияний) принимали равным 0,05.
Результаты исследования
Клиническая характеристика больных СПЯ
Группу больных СПЯ составили 92 женщины в возрасте от 19 до 36 лет (средний возраст 27,10,4 года). Индекс массы тела колебался от 18,2 кг/м до 39,3 кг/м и в среднем составил 25,30,7 кг/м. Симптомы андрогензависимой дермопатии проявлялись в виде вульгарных угрей у 31 (33,7%) женщины и в виде гирсутизма - у 43 (46,7%) женщин. Возраст менархе колебался от 11 до 17 лет и в среднем составил 13,40,1 года, что достоверно (р=0,03) превышало показатель группы сравнения (12,50,3 года). У всех больных СПЯ были выявлены нарушения менструального цикла по типу олигоопсоменореи (n=62) или вторичной аменореи (n=30). У 31 (33,7%) женщины с СПЯ имелось первичное бесплодие продолжительностью от одного года до 12 лет, средняя продолжительность - 3,60,5 года. У двух (2,2%) больных СПЯ имелось вторичное бесплодие.
Результаты гормонального обследования
Всем больным СПЯ (n=92) выполнили гормональное обследование, включавшее оценку содержания в крови гонадотропинов, андрогенов и эстрадиола на 2-5 день менструального цикла, уровень пролактина и прогестерона на 20-21 день менструального цикла. В группе сравнения гормональное обследование и ультразвуковое исследование органов малого таза провели 32 соматически здоровым женщинам с овуляторным циклом. Возраст женщин колебался от 22 до 37 лет и в среднем составил 29,40,8 года. Результаты гормонального обследования представлены в таблице 1.
Таблица 1
Уровень гонадотропинов и половых стероидных гормонов (Mm)
в крови обследованных женщин на 2-5 день менструального цикла и уровень пролактина и прогестерона на 20-21 день менструального цикла и граница доверительного интервала при р=0,05
Гормоны | Больные СПЯ (n=92) | Группа сравнения (n=32) | р |
ФСГ, МЕ/л | 5,50,2 5,1-5,9 | 6,20,3 5,6-6,7 | p=0,02 |
Г, МЕ/л | 8,60,5 7,5-9,5 | 4,00,3 3,4-4,6 | p<0,001 |
Эстрадиол, пмоль/л | 191,612,4 165,7-215,5 | 204,213,3 160,9-199,1 | p=0,8 |
Тестостерон, нмоль/л | 2,20,2 1,7-2,4 | 1,60,1 1,4-1,9 | p=0,2 |
Свободный тестостерон, пмоль/л | 10,30,9 8,7-12,4 | 4,30,5 3,2-5,4 | p<0,001 |
Андростендион, нмоль/л | 9,10,7 10,5-2,7 | 5,70,6 4,5-6,8 | p<0,001 |
Отношение эстрадиола (пмоль/л) к общему тестостерону (нмоль/л) | 86,86,1 64,3-89,3 | 117,88,7 100,1-135,7 | p<0,001 |
Отношение эстрадиола (пмоль/л) к свободному тестостерону (пмоль/л) | 23,92,5 18,8-29,3 | 60,36,2 47,3-79,3 | p<0,001 |
Пролактин, мМЕ/л | 345,618,6 310,8-380,9 | 372,120,9 329,6-415,1 | p=0,1 |
Прогестерон, нмоль/л | 7,10,9 5,3-8,8 | 54,81,8 51,4-58,48 | p<0,001 |
В крови больных СПЯ наблюдалось достоверное (p<0,05) повышение уровня ЛГ, свободного тестостерона и андростендиона и снижение уровня ФСГ на 2-5 день менструального цикла по сравнению с аналогичными показателями у женщин с овуляторным менструальным циклом. Соотношение ЛГ/ФСГ у больных СПЯ (1,60,1) было достоверно (p<0,001) выше, чем в группе сравнения (0,70,1). Достоверное (p<0,001) снижение коэффициентов эстрадиол/общий тестостерон и эстрадиол/свободный тестостерон при СПЯ по сравнению с аналогичными коэффициентами у женщин с овуляторным циклом свидетельствует об относительном дефиците овариальной ароматазы, вероятно, обусловленным гиперпродукцией ЛГ гипофизом. На 20-21 день менструального цикла в крови больных СПЯ уровень прогестерона был значительно (p<0,001) ниже аналогичного показателя у женщин группы сравнения и свидетельствовал об ановуляции. На 10-12 день менструального цикла (в день проведения лапароскопии) гормональное исследование повторили 19 больным СПЯ и 16 женщинам репродуктивного возраста с сохраненным овуляторным циклом из группы сравнения (табл. 2).
Таблица 2
Уровень гонадотропинов и половых стероидных гормонов (Mm) в крови обследованных женщин на 2-5 и 10-12 день менструального цикла
Гормоны | Больные СПЯ (n=19) | Группа сравнения (n=16) | ||
2-5 | 10-12 | 2-5 | 10-12 | |
ФСГ, МЕ/л | 6,00,7 | 5,90,4 | 6,30,5 | 7,4 1,6 |
Г, МЕ/л | 8,91,0* | 9,60,7* | 4,20,3 | 20,01,7^ |
Эстрадиол, пмоль/л | 18417,8** | 195,215,4* | 216,817,6 | 694,837,6^ |
Тестостерон, нмоль/л | 1,90,3 | 2,30,3 | 1,70,2 | 1,70,1 |
Свободный тестостерон, пмоль/л | 6,51,4* | 10,81,7*^^ | 3,90,6 | 3,8 0,4 |
Андростендион, нмоль/л | 7,10,9** | 8,20,3*^^ | 5,10,1 | 5,9 0,1 |
Примечание:
* - p<0,001 по сравнению с аналогичным показателем в группе сравнения
** - p<0,05 по сравнению с аналогичным показателем в группе сравнения
^ - р<0,001 по сравнению с исходным показателем на 2-5 день цикла
^^ - р<0,05 по сравнению с исходным показателем на 2-5 день цикла
К 10-12 дню менструального цикла содержание свободного тестостерона и андростендиона в крови больных СПЯ достоверно (p<0,05) повысилось, повышение уровня общего тестостерона наблюдалось, но не было достоверным (р=0,4). На 2-5 день менструального цикла у больных СПЯ содержание эстрадиола в крови было достоверно (p<0,02) ниже, чем в группе сравнения. К 10-12 дню содержание эстрадиола (195,215,4 пмоль/л) в крови больных СПЯ, практически, не изменилось. Можно думать, что из-за нарушения ароматизации андрогенов в эстрогены предовуляторного подъема уровня эстрадиола в крови не происходило, и периовуляторный пик гонадотропинов отсутствовал. У женщин с овуляторным циклом к 10-12 дню менструального цикла прослеживался достоверный (p<0,001) предовуляторный подъем уровня эстрадиола в крови с 216,817,6 пмоль/л до 694,837,6 пмоль/л и периовуляторный подъем ЛГ - с 4,20,3 МЕ/л до 20,01,7 МЕ/л.
Результаты ультразвукового обследования
Ультразвуковое исследование органов малого таза выполнили всем женщинам с СПЯ (n=92). Продольный, сагиттальный и поперечный размеры матки больных СПЯ были достоверно (p<0,001 и р<0,05) меньше, чем в группе сравнения. Пролиферация эндометрия у больных СПЯ была замедлена, и величина М-эхо (3,20,1 мм) в начале цикла была достоверно (р<0,001) ниже, чем у женщин с овуляторным циклом (4,20,1 мм). Объем яичников больных СПЯ был достоверно (p<0,001) больше, чем у женщин группы сравнения и превышал 10 см. Яичники больных СПЯ значимо (p<0,001) отличались наличием множества мелких антральных фолликулов. На 10-12 день менструального цикла (в день проведения лапароскопии) ультразвуковое исследование повторили 19 больным СПЯ и 16 женщинам репродуктивного возраста с овуляторным циклом из группы сравнения. Оценивали средний диаметр максимального фолликула и толщину эндометрия (табл. 3).
Таблица 3
Диаметр лидирующего фолликула и толщина эндометрия (Mm) обследованных женщин на 2-5 и 10-12 день менструального цикла
Эхографические показатели | Больные СПЯ (n=19) | Группа сравнения (n=16) | ||
2-5 | 10-12 | 2-5 | 10-12 | |
Толщина эндометрия, мм | 3,20,1* | 6,60,6*^ | 4,20,1 | 10,10,4^ |
идирующий фолликул, мм | 5,40,7* | 6,60,4* | 7,20,2 | 18,50,7^ |
Примечание:
* - p<0,001 по сравнению с аналогичным показателем группы сравнения
^ - р<0,001 по сравнению с исходным показателем на 2-5 день цикла
К 10-12 дню менструального цикла средний диаметр максимального фолликула в группе больных СПЯ увеличивался незначительно. У женщин с овуляторным циклом с увеличением диаметра лидирующего фолликула возрастали уровень эстрадиола в крови и толщина эндометрия, о чем свидетельствует положительная корреляция между данными показателями (r=0,49; р=0,05 и r=0,6; р=0,01 соответственно). У больных СПЯ к концу фолликулярной фазы менструального цикла наблюдался рост эндометрия, но его толщина была достоверно (p<0,001) меньше соответствующего показателя у женщин группы сравнения.
Результаты лапароскопии, гистологического и
иммуногистохимического исследования биоптатов яичников
апароскопию выполнили 19 больным СПЯ. Возраст больных СПЯ варьировал от 19 до 33 лет и в среднем составил 26,50,8 года. Во всех случаях диагноз СПЯ при лапароскопии был подтвержден, проведена диатермокаутеризация яичников и биопсия яичников. В группе сравнения лапароскопию произвели 16 женщинам с сохраненным овуляторным циклом. Возраст женщин колебался от 22 до 37 лет и в среднем составил 30,61,3 года. У всех женщин был регулярный менструальный цикл. Показаниями к оперативному вмешательству послужили: длительное бесплодие неясной этиологии и подозрение на НГЭ. Одна больная была прооперирована по поводу хронических тазовых болей, и одной женщине была проведена лапароскопия по поводу параовариальной кисты. При лапароскопии у 10 больных был выявлен НГЭ I степени, у троих - НГЭ II степени. При диагностировании НГЭ проводили электрокоагуляция эндометриодных гетеротопий. У всех женщин выполняли биопсию яичников.
Гистологическим и иммуногистохимическим методом исследовали 19 биоптатов яичников больных СПЯ и 16 биоптатов яичников женщин группы сравнения. При гистологическом исследовании биоптатов яичников у всех больных СПЯ определялся выраженный склероз белочной оболочки яичников и гиперплазия стромы. Содержание атрезирующихся фолликулов было достоверно (p<0,05) выше в биоптатах яичников больных СПЯ (у 89,5% больных), чем в группе сравнения (у 56,3% женщин). При этом атрезия фолликулов у больных СПЯ имела тенденцию к кистозной трансформации. В корковом слое яичников больных СПЯ количество примордиальных фолликулов было ниже, чем в группе сравнения, но отличие не было статистически достоверным (р=1,0).
При иммуногистохимическом исследовании биоптатов яичников больных СПЯ имелся дефицит экспрессии ароматазы клетками гранулезы максимальных фолликулов. Экспрессия ароматазы, приходящаяся на одну клетку гранулезы максимального фолликула яичников больных СПЯ (45,41,4), была достоверно (p<0,001) ниже, чем у женщин с сохраненным овуляторным циклом (556,711,4). При оценке продукции ароматазы клетками гранулезы антральных фолликулов (5-6 мм) яичников женщин группы сравнения определено, что на данной стадии развития ароматазная активность была низкой. Экспрессия ароматазы, приходящаяся на одну клетку гранулезы антрального фолликула яичников женщин с сохраненным овуляторным циклом (41,71,8), была сопоставима (р=0,1) с продукцией ароматазы клетками гранулезы максимальных фолликулов яичников больных СПЯ (45,41,4). Таким образом, экспрессия овариальной ароматазы при СПЯ соответствует размерам антральных фолликулов.
У женщин с овуляторным циклом ароматазная активность в клетках гранулезы доминантного фолликула была достоверно (р<0,001) выше, чем в клетках гранулезы антральных фолликулов. При этом с увеличением диаметра доминантного фолликула с 15 мм до 22 мм ароматазная активность достоверно (r=0,09; p=0,73) не увеличивалась, тогда как уровень эстрадиола в крови с увеличением диаметра фолликула достоверно (r=0,49; р=0,05) возрастал. Таким образом, в течение нормального менструального цикла в конце фолликулярной фазы содержание эстрогенов в крови зависит от количества клеток гранулезы доминантного фолликула.
Результаты пробы с летрозолом
В группе сравнения пробу с ингибитором ароматазы р450 летрозолом выполнили 16 соматически здоровым женщинам с овуляторным циклом. Возраст женщин колебался от 24 лет до 31 года и в среднем составил 27,90,6 года. Возраст наступления менархе варьировал от 12 до 14 лет и в среднем составил 12,80,2 года, продолжительность менструального цикла в среднем составила 28,10,5 дня. В анамнезе у 4 женщин имелись беременности, закончившиеся физиологическими родами.
У здоровых женщин наиболее выраженные изменения (снижение уровня эстрадиола, повышение уровня андрогенов и гонадотропинов в крови) приходились на 3-й день пробы (через 48 часов) после приема летрозола. Под влиянием летрозола уровень эстрадиола в крови достоверно (р=0,003) снижался на 38,38,6 пмоль/л (24,04,8%). Согласно механизму отрицательной обратной связи на третий день пробы происходило значимое (р<0,001) увеличение содержания в крови ФСГ на 4,10,5 МЕ/л (70,110,3%) и ЛГ на 3,60,5 МЕ/л (138,324,0%). Однако увеличение уровня общего тестостерона и свободного тестостерона в крови под влиянием летрозола не было статистически значимым (р=0,2 и р=0,3 соответственно). Учитывая разнонаправленность изменений андрогенов и эстрогенов под влиянием летрозола, для оценки реакции на препарат использовали отношение эстрадиол/общий тестостерон и отношение эстрадиол/свободный тестостерон. В группе здоровых женщин на третий день пробы граница доверительного интервала (при р=0,05) коэффициента эстрадиол/общий тестостерон колебалась от 47,6 до 97,5, а коэффициента эстрадиол/свободный тестостерон от 15,2 до 36,1.
Таблица 4
Изменения уровня гонадотропинов в крови обследованных
женщин в ответ на прием летрозола
Показатели | Уровень гормонов в крови (Mm) | р | |
СПЯ (n=15) | Группа сравнения (n=16) | ||
ФСГ(МЕ/л) - 1й день пробы | 5,30,4 (4,4-6,2)* | 6,00,3 (5,4-6,6) | 0,2 |
ФСГ(МЕ/л) - 3й день пробы | 8,60,3 (7,9-9,3) | 10,10,6 (8,9-11,3) | 0,1 |
Абсолютная разница ФСГ(МЕ/л) | 3,30,6 (2,1-4,5) | 4,10,5 (2,9-5,2) | 0,4 |
Относительная разница ФСГ от исходного (%) | 81,723,4 (30,8-132,7) | 70,110,3 (50,6-92,2) | 0,7 |
Г(МЕ/л) - 1й день пробы | 7,71,0 (5,5-9,8) | 3,50,5 (2,5-4,5) | 0,004 |
Г(МЕ/л) - 3й день пробы | 10,21,4 (7,2-13,2) | 7,10,6 (5,9-8,3) | 0,06 |
Абсолютная разница ЛГ(МЕ/л) | 2,60,9 (0,6-4,5) | 3,60,5 (2,6-4,7) | 0,3 |
Примечание:
* - в скобках приведены границы доверительного интервала (при р=0,05)
Таблица 5
Изменения уровня эстрадиола, общего и свободного тестостерона в крови обследованных женщин в ответ на прием летрозола
Показатели | Уровень гормонов в крови (Mm) | р | |
СПЯ (n=15) | Группа сравнения (n=16) | ||
Общий тестостерон (нмоль/л) - 1й день пробы | 2,00,2 (1,6-2,4)* | 1,40,2 (1,1-1,8) | 0,08 |
Общий тестостерон (нмоль/л) - 3й день пробы | 2,40,2 (1,9-2,9) | 1,70,2 (1,3-2,1) | 0,2 |
Абсолютная разница общего тестостерона (нмоль/л) | 0,50,1 (0,2-0,8) | 0,20,2 (-0,1-0,6) | 0,9 |
Относительная разница общего тестостерона (%) | 29,17,8 (12,1-46,2) | 22,116,4 (-13,0-57,3) | 0,6 |
Свободный тестостерон (пмоль/л) - 1й день пробы | 9,62,5 (4,2-15,0) | 5,61,0 (3,5-7,7) | 0,3 |
Свободный тестостерон (пмоль/л) - 3й день пробы | 9,91,8 (6,0-13,9) | 5,91,1 (3,6-8,2) | 0,1 |
Абсолютная разница свободного тестостерона (пмоль/л) | 0,31,1 (-2,0-2,7) | 0,30,4 (-0,6-1,2) | 0,3 |
Относительная разница свободного тестостерона (%) | 15,48,1 (-2,3-33,17) | 18,716,0 (15,9-53,3) | 0,3 |
Эстрадиол (пмоль/л) - 1й день пробы | 146,77,8 (129,8-163,6) | 144,27,9 (127,3-161,0) | 1,00 |
Эстрадиол (пмоль/л) - 3й день пробы | 98,53,1 (91,8-105,2) | 105,94,5 (96,3-115,4) | 0,2 |
Абсолютная разница эстрадиола (пмоль/л) | -48,26,8 (-63,0-(-33,4)) | -38,38,6 (-19,8-(-56,8)) | 0,4 |
Относительная разница эстрадиола (%) | -31,52,7 (-37,4-(-25,6)) | -24,04,8 (-13,7-(-34,2)) | 0,3 |
Отношение эстрадиола (пмоль/л) к общему тестостерону (нмоль/л) - 1й день пробы | 79,98,0 (62,5-97,4) | 114,615,8 (80,4-148,8) | 0,1 |
Отношение эстрадиола (пмоль/л) к общему тестостерону (нмоль/л) - 3й день пробы | 44,64,0 (35,9-53,3) | 72,511,5 (47,6-97,5) | 0,05 |
Отношение эстрадиола (пмоль/л) к свободному тестостерону (пмоль/л) - 1й день пробы | 23,25,1 (12,0-34,4) | 39,08,0 (21,8-56,3) | 0,3 |
Отношение эстрадиола (пмоль/л) к свободному тестостерону (пмоль/л) - 3й день пробы | 14,52,7 (8,7-20,3) | 25,74,8 (15,2-36,1) | 0,06 |
Примечание:
* - в скобках приведены границы доверительного интервала (при р=0,05)
Проба с ингибитором ароматазы летрозолом была проведена 15 больным СПЯ, возраст которых варьировал от 23 до 29 лет и в среднем составил 26,20,6 года. Индекс массы тела варьировал от 19,1 кг/м до 34,2 кг/м и в среднем составил 26,21,6 кг/м. Возраст менархе колебался от 11 до 15 лет и в среднем составил 12,60,3 года. У всех больных СПЯ были выявлены нарушения менструального цикла по типу олигоопсоменореи (n=6) или вторичной аменореи (n=9). У 5 женщин с СПЯ имелось первичное бесплодие продолжительностью от 1,5 до 3 лет, средняя продолжительность Ц 2,50,3 года.
Реакция больных СПЯ на летрозол была схожей с реакцией здоровых женщин (табл. 4-5). Не наблюдалось значимых различий в исследуемых группах в абсолютном и относительном увеличении к третьему дню пробы уровня ФСГ и андрогенов в крови (р>0,05), в уменьшении содержания эстрадиола в крови (р>0,05). Относительный прирост содержания ЛГ в крови больных СПЯ, на третий день пробы был достоверно (р=0,01) ниже, чем в группе сравнения, однако при сравнении абсолютных показателей динамики ЛГ разница в исследуемых группах не была статистически значима (р=0,3). Снижение коэффициентов эстрадиол/общий тестостерон и эстрадиол/свободный тестостерон при СПЯ на третий день пробы было более выраженным, чем у здоровых женщин.
Результаты генетического исследования
Всем больным СПЯ (n=92) было проведено генетическое исследование, включающее в себя анализ аллелей и генотипов по гену CYP19 ((TTTA)n полиморфизм, del(TCT) полиморфизм и SNP50 (rs2414096)).
Аналогичное генетическое исследование проведено всем (n=55) женщинам группы сравнения. Возраст женщин колебался от 22 до 56 лет и в среднем составил 30,71,3 года. Средний возраст менархе в группе сравнения равнялся 12,50,3 года. На момент исследования 49 женщин группы сравнения имели регулярный менструальный цикл, у 6 женщин наступила своевременная менопауза. В группе сравнения беременности в анамнезе отмечены у 38 женщин, у 28 женщин было двое физиологических родов, у двоих - одни роды, 8 женщин имели в прошлом невынашивание беременности. У всех женщин репродуктивного возраста группы сравнения зарегистрирована овуляция с полноценной лютеиновой фазой.
Частыми генотипами по гену CYP19 ((TTTA)n полиморфизм) как у больных СПЯ, так и у женщин группы сравнения были: (TTTA)7(TTTA)7 (25% и 30,9% соответственно), (TTTA)7(TTTA)8 (15,2% и 18,2% соответственно) и (TTTA)7(TTTA)11 (28,3% и 16,4% соответственно). Остальные генотипы гена CYP19 ((TTTA)n полиморфизм) встречались реже в обеих группах. При анализе частот генотипов по гену CYP19 ((TTTA)n полиморфизм) не выявлено статистически значимых различий между сравниваемыми группами (p>0,05). Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей одного из двух полиморфных вариантов гена CYP19 (del(TCT)) между выборками больных с СПЯ и группы сравнения также не выявил достоверных различий (p>0,05). Согласно полученным данным, генотипы SNP50 (rs2414096) А/А и G/G по гену CYP19 встречались реже в группе больных СПЯ, чем в группе сравнения, но эта разница не была достоверной (p>0,05). Частота A/G генотипа по гену CYP19 SNP50 (rs2414096) в группе с СПЯ превышала таковую в группе сравнения (46,7% и 40% соответственно), однако, данные различия также не были статистически достоверны (p>0,05). При анализе ассоциации анамнестических данных, результатов гормонального исследования больных СПЯ с полиморфизмом гена ароматазы р450 CYP19 ((TTTA)n полиморфизм, del(TCT) полиморфизм и SNP50 (rs2414096)) достоверных различий обнаружено не было (p>0,05). Анализ аллелей и генотипов по гену ароматазы CYP19 ((TTTA)n полиморфизм, del(TCT) полиморфизм и SNP50 (rs2414096)) не выявил ассоциации с клиническими и гормональными особенностями СПЯ.
ВЫВОДЫ
- У женщин с полноценным овуляторным менструальным циклом экспрессия овариальной ароматазы положительно коррелирует с размером доминантного фолликула и уровнем эстрадиола в крови.
- Однократный пероральный прием 10 мг ингибитора ароматазы летрозола вызывает через 48 часов достоверное снижение уровня эстрадиола (-24,04,8%) и адекватное повышение ФСГ (70,110,3%) и ЛГ (138,324,0%) в крови здоровых женщин.
- Экспрессия овариальной ароматазы при синдроме поликистозных яичников соответствует размерам антральных фолликулов.
- Реакция половых стероидных гормонов и гонадотропинов на ингибитор ароматазы летрозол при синдроме поликистозных яичников не выходит за пределы ее физиологических колебаний у здоровых женщин.
- Снижение коэффициентов эстрадиол/общий тестостерон и эстрадиол/свободный тестостерон у больных синдромом поликистозных яичников по сравнению с аналогичными коэффициентами у женщин с сохраненным овуляторным циклом свидетельствует об относительном дефиците овариальной ароматазы, вероятно, обусловленным гиперпродукцией ЛГ гипофизом.
- Частоты аллелей и генотипов по гену ароматазы CYP19 ((TTTA)n полиморфизм, del(TCT) полиморфизм и SNP50 (rs2414096)) не отличаются у больных СПЯ и у женщин группы сравнения (p>0,05).
- Результаты пробы с ингибитором ароматазы летрозолом и генетического исследования гена ароматазы CYP19 не позволяют считать дефицит овариальной ароматазы причиной развития синдрома поликистозных яичников.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
- Проба с летрозолом (заявка на изобретение № 201206289) для определения ароматазной активности может использоваться в научно-исследовательской и клинической практике. Однократный пероральный прием 10 мг ингибитора ароматазы летрозола на 2-й день менструального цикла вызывает достоверное снижение уровня эстрадиола и адекватное повышение гонадотропинов в крови здоровых женщин.
- Оценка пробы с летрозолом:
А. Снижение уровня эстрадиола в крови через 48 часов более чем на 56,8 пмоль/л или более чем на 34,2% указывает на повышенную ароматазную активность. Снижение уровня эстрадиола в крови через 48 часов менее чем на 19,8 пмоль/л или менее чем на 13,7% указывает на пониженную ароматазную активность.
- У здоровых женщин снижение уровня эстрадиола сопровождается подъемом уровня гонадотропинов в крови: ФСГ с 6,00,3 МЕ/л до 10,10,6 МЕ/л (70,110,3%), ЛГ с 3,50,5 МЕ/л до 7,10,6 МЕ/л (138,324,0%).
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
- Аллельные варианты гена CYP19 (ароматазы р450) и активность ароматазы р450 у больных синдромом поликистозных яичников / В.А. Савина, Н.Ю. Швед, В.В. Потин [и др.] // Медицинская генетика. Ч 2012. Ч № 4. Ч С. 36 - 41.
- Ароматазная активность при синдроме поликистозных яичников / В.А. Савина, В.В. Потин, М.А. Тарасова, Н.Н. Ткаченко // Материалы VI Всероссийского конгресса эндокринологов. Ч М., 2012. Ч С. 502. Чэлектрон. опт. диск (CD-ROM).
- Овариальная ароматаза р450 при синдроме поликистозных яичников / В.А. Савина, И.М. Кветной, М.А. Клещев [и др.] // Медицинский академический журнал. Ч 2012. Ч Т. 11, вып. 1. Ч С. 47- 53.
- Применение ингибитора ароматазы летрозола для индукции овуляции у женщин с синдромом поликистозных яичников / А.З. Морчиладзе, В.А. Савина, Н.Н. Ткаченко, М.И. Ярмолинская // Журнал акушерства и женских болезней. Ч 2011. Ч Т. LX, вып. 2. Ч С. 52- 58.
- Роль овариальной ароматазы р450 в патогенезе нормогонадотропной ановуляции / В.А.Савина, В.В. Потин, В.В. Рулев [и др.] // Журнал акушерства и женских болезней. Ч 2011. Ч Том LX, спецвып. Ч С. 81.
- Савина, В.А. Определение экспрессии ароматазы в яичниках иммуногистохимическим методом / В.А. Савина, Г.Х. Толибова // Журнал акушерства и женских болезней Ч 2011г. Ч Т. 60. Ч № 4. Ч С.144.
- Савина, В.А. Овариальная ароматаза р450 при нормогонадотропной недостаточности яичников / В.А. Савина // Журнал акушерства и женских болезней. Ч 2012. Ч Т. LXI, вып. 1. Ч С. 84- 89.
- Савина, В.А. Роль ароматазы в патогенезе первично-овариальной недостаточности / В.А. Савина, В.В. Потин, М.А. Тарасова // Журнал акушерства и женских болезней. Ч 2010. Ч Т. 59, вып. 6. Ч С. 85- 93.
- Савина, В.А. Экспрессия ароматазы в яичниках в норме и при нормогонадотропной ановуляции / В.А. Савина, Г.Х. Толибова // Труды шестой Всероссийской научно-практической конференции Здоровье - основа человеческого потенциала: проблемы и пути их решения. - СПб., 2011. Ч С. 211-212.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине