Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
УСТИНОВА ЮЛИЯ ВАДИМОВНА
РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСНОЙ ТЕХНОЛОГИИ
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА ОСНОВЕ
КОНВЕРСИИ ВТОРИЧНОГО РЫБНОГО СЫРЬЯ
03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата технических наук
Щелково Ц 2012
Работа выполнена на кафедре Биотехнология ФГБОУ ВПО Московский государственный университет пищевых производств
Научный руководитель: | доктор технических наук, профессор Иванова Людмила Афанасьевна |
Официальные оппоненты: | Нежута Александр Александрович доктор биологических наук, кандидат технических наук ГНУ Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности РАСХН, заведующий лабораторией Сушка биопрепаратов |
ыско Ксения Андреевна кандидат технических наук ФГУП НПО Микроген Минздравсоцразвития России, ведущий специалист |
Ведущая организация: Государственное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии" Российской академии сельскохозяйственных наук
Защита состоится: л 30 ноября 2012 г. в 1000 на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината, д. 17, ВНИТИБП, e-mail: vnitibp@mail.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности РАСХН.
Автореферат разослан л 29 октября 2012 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат биологических наук Фролов Юрий Дмитриевич
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы
Биотехнология рыбопродуктов в настоящее время охватывает широкую сферу научных изысканий и, в первую очередь, к ним относятся исследования в области биологически активных веществ сырья водного происхождения, на которых основаны технологии изготовления биологически ценных продуктов с заданными свойствами.
В последние годы наблюдается тенденция снижения объемов вылова и переработки рыбного сырья. В целом по России с 2000 г. уровень добычи рыбы снижается в среднем ежегодно на 17,7%, следствием чего является уменьшение производства рыбной продукции почти на 10%. Для преодоления этих негативных тенденций в настоящее время утверждена Концепция развития рыбного хозяйства РФ на период до 2020 г., задачами которой являются не только увеличение объемов вылова, но и повышение эффективности использования и развития ресурсного потенциала рыбохозяйственного комплекса в целом. Одним из путей повышения эффективности является внедрение новых технологий переработки рыбных отходов.
В таких странах, как Исландия, Норвегия, Финляндия, Япония давно эффективно функционируют заводы по комплексной переработке рыбы. В нашей стране в настоящее время такие заводы отсутствуют, несмотря на то, что объемы вторичного рыбного сырья (отходов и неиспользуемого улова) в России ежегодно достигают 800 тыс. т., что составляет до 20% от общего улова.
Снижение объема нерационально утилизируемых отходов рыбоперерабатывающих предприятий за счет внедрения новых технологических процессов является эффективным способом, позволяющим повысить глубину переработки рыбного сырья и экономичность производства.
Настоящая работа посвящена разработке комплексной технологии переработки вторичного рыбного сырья, позволяющей получить ряд стратегически необходимых белоксодержащих продуктов, аминокислотных смесей и других полезных веществ на их основе (в частности, гистамина) для применения в пищевой, сельскохозяйственной и фармацевтической отраслях.
Цель и задачи исследования
Основная цель диссертационной работы состояла в разработке эффективных технологий переработки отходов от разделки массовых промысловых рыб рыбохозяйственного бассейна России для получения белковой продукции, аминокислотных смесей и препарата гистамина, отличающихся от традиционных энерго- и ресурсосбережением, и предложении сфер их применения.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
- оценка биохимического состава исходного сырья (отходы от разделки промысловых рыб) для определения его пригодности к дальнейшей переработке;
- разработка технологии белкового препарата кормового назначения из вторичного рыбного сырья с предложением наиболее эффективного способа экстракции липидов;
- разработка технологии белкового препарата пищевого назначения на основе экстракции и последующего осаждения протеинов исходного сырья;
- разработка технологии аминокислотных смесей путем протеолиза полученных ранее белковых препаратов промышленными ферментами;
- предложение сфер применения продуктов, получаемых введением в их состав разработанных добавок;
- разработка биотехнологии ферментного препарата гистидиндекарбоксилазы, позволяющего трансформировать гистидин из аминокислотной смеси в гистамин на основе нового перспективного штамма, выявленного путем скрининга;
- разработка с использованием полученного препарата гистидиндекарбоксилазы метода конверсии гистидина в гистамин для его последующего использования в фармацевтической промышленности;
- разработка нормативно-технической документации, включая ТУ на белковые продукты и аминокислотные смеси и Лабораторные регламенты.
Научная новизна работы
Научно обоснованы принципы создания комплексной технологии биологически активных веществ на основе конверсии вторичного рыбного сырья.
На основании исследования биохимического состава вторичного сырья рыбоперерабатывающих предприятий показана целесообразность его использования в качестве альтернативного источника полноценного белка.
По результатам изучения влияния условий процесса экстракции липидов из биомассы рыбных отходов на качественный состав жировой и белковой фракций рекомендован технологический режим, позволяющий максимально полно разделять указанные фракции с минимальными потерями сухого вещества.
Впервые на основе установленных параметров экстракции и последующего осаждения протеина рыбных отходов разработан наиболее эффективный способ получения белкового концентрата пищевого назначения - заменителя растительных белков.
Основываясь на экспериментальных данных и выявленных зависимостях степени ферментативного гидролиза от условий проведения процесса установлен наиболее эффективный режим ферментолиза белковых продуктов и разработана экономически обоснованная технология получения аминокислотных смесей.
Впервые проведен направленный скрининг микроорганизмов и отобран штамм-продуцент гистидиндекарбоксилазы с высокой активностью. На основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры новый штамм идентифицирован как Bacillus licheniformis КЛ13.
Впервые на основе лабораторных исследований и полученных зависимостей накопления новым штаммом B. licheniformis гистидиндекарбоксилазной активности и выхода гистамина от условий культивирования этого штамма, параметров выделения и очистки ферментного препарата, разработана биотехнология препарата гистидиндекарбоксилазы.
Практическая значимость работы
Проведенные лабораторные исследования явились основой для создания новой комплексной технологии переработки вторичного рыбного сырья с целью получения ряда биологически активных веществ. Впервые разработаны технологии кормового и пищевого белкового концентрата и аминокислотных смесей на их основе из вторичного сырья рыбоперерабатывающих предприятий. На готовые продукты подготовлены и зарегистрированы в ФГУП СТАНДАРТИНФОРМ следующие технические условия: ТУ 9283-001-02068634-2011 Концентрат кормовой белковый; ТУ 9283-002-02068634-2011 Концентрат белковый пищевой из рыбы; ТУ 9283-003-02068634-2012 Аминокислотные смеси на основе белоксодержащих продуктов из рыбы. На ТУ 9283-002-02068634-2011 получено положительное заключение органа Роспотребнадзора (экспертное заключение № 985 от 07 октября 2011 г).
Разработаны Лабораторные регламенты на изготовление пищевого и кормового белкового концентратов.
Произведена наработка опытной партии пищевого белкового концентрата в ОАО Удмуртский хладокомбинат. Результаты подтверждены актом о наработке и протоколом испытаний готового продукта (утверждены и.о. генерального директора ОАО Удмуртский хладокомбинат 12.12.2011).
Подана заявка № 2011135454 от 25.08.2011 на выдачу патента РФ Способ получения белкового концентрата из рыбных отходов.
По результатам лабораторных и производственных испытаний определены основные направления практического использования разработанных белковых добавок: создание обогащенных пищевых и кормовых продуктов, функциональных продуктов, жидких питательных прикормов для растений.
Осуществлено изготовление рубленных кулинарных изделий из рыбы, рубленных кулинарных изделий из мяса, крабовых палочек, протеиновых печений для спортивного питания с введением в их состав белкового концентрата или полуфабриката. Установлено, что применяемые добавки не оказывают негативного влияния на микробиологические и органолептические показатели готовых изделий. Применительно к рубленным изделиям было зафиксировано улучшение цвета и структуры продукта по сравнению с рецептурой, содержащей соевый изолят. Результаты подтверждены актом лабораторных испытаний (утвержден проректором по научной работе ФГБОУ ВПО МГУПП 05.09.12). Использование разработанного белкового полуфабриката при изготовлении крабовых палочек снижает их себестоимость. Применяемая добавка не оказывает негативного влияния на органолептические, микробиологические и физико-химические показатели готового изделия. Результаты подтверждены актом о дегустации (утвержден генеральным директором ООО НСТ плюс 15.07.2012).
На основе наиболее перспективного штамма Bacillus licheniformis КЛ13, полученного в результате скрининга микроорганизмов-продуцентов гистидиндекарбоксилаз, разработана биотехнология препарата гистидиндекарбоксилазы Г20Х и проведена наработка опытной партии в ООО Зеленые линии. Результаты подтверждены актом о наработке (утвержден генеральным директором ООО Зеленые линии 20.08.2012 ).
Штамм бактерий Bacillus licheniformis КЛ13 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-11185.
Подана заявка № 2012122258 от 30.05.2012 на выдачу патента РФ Штамм Bacillus licheniformis для получения гистидиндекарбоксилазы.
С использованием ферментолизата белков рыбных отходов и препарата гистидиндекарбоксилазы, полученного на основе нового штамма-продуцента Bacillus licheniformis КЛ13, разработана биотехнология гистамина, применимого в производстве фармацевтической продукции.
Разработанная комплексная технология позволяет не только получить белковые продукты, аминокислотные смеси и препарат гистамина, но и решить экологические проблемы, возникающие при утилизации рыбных отходов.
Апробация работы
Основные положения работы докладывались на Российских и международных конференциях и симпозиумах: Международной научно-технической конференции "Инновационные технологии переработки продовольственного сырья" (Владивосток, 2011 г.); IX международной научно-практической конференции и выставке Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты (Москва, 2011 г.); IX Международной научной конференции студентов и молодых ученых Живые системы и биологическая безопасность населения (Москва, 2011 г.); IV Международной научно-практической конференции молодых ученых (Таганрог, 2012 г.); Международной конференции Биология - наука XXI века (Москва, 2012 г.); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока (Улан-Удэ, 2012 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 3 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 202 источника, и 9 приложений. Работа изложена на 195 страницах машинописного текста, включает 43 таблицы и 42 рисунка.
ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
В обзоре литературы рассмотрено современное состояние проблемы утилизации вторичного рыбного сырья в России. Оценены объемы ежегодно образующихся отходов и выявлены основные пути их нерациональной утилизации. Приведены примеры способов (разработанных отечественными и зарубежными специалистами) эффективной переработки вторичного и малоценного первичного рыбного сырья, включающие комплексную переработку, получение белоксодержащих продуктов кормового и пищевого назначения, а также аминокислотных смесей. Отдельно рассмотрен вопрос получения гистамина на основе традиционного химического синтеза и ферментативной конверсии гистидина, описаны основные продуценты данного фермента (гистидиндекарбоксилазы), приведены примеры практического использования гистамина.
Анализ имеющихся публикаций выявил ограниченность исследований в области получения пищевых белоксодержащих препаратов на базе рыбных отходов, кормовых низколипидных добавок, бактериальных ферментных препаратов гистидиндекарбокислазы, что и позволило сформулировать цели и задачи диссертационного исследования.
ГЛАВА II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
На рис. 1 представлена общая схема проведенного эксперимента.
Объектом исследования явились рыбные отходы, состоящие преимущественно из голов, шкур, хребтов и хвостов. Вторичное сырье было предоставлено компаниями ГК Марина, ГК Русское море, ОАО Удмуртский Хладокомбинат.
Микроорганизмы. В работе была использована лабораторная коллекция микроорганизмов кафедры Биотехнология ФГБОУ ВПО МГУПП, коллекция культур микроорганизмов, выделенных сотрудниками кафедры из природных источников обитания (почва, рыбные отходы, соленые и квашеные продукты питания), а также коллекция микроорганизмов рода Lactobacillus, полученных из биологических сред организма человека в процессе обследования здоровых людей, предоставленная Лабораторией генетики микроорганизмов Института общей генетики им. Н.И. Вавилова.
Методы.
Определение массовой доли влаги и жира проводили согласно ГОСТ 7636-85.
Определение массовой доли золы проводили согласно ГОСТ 13979.6-69.
Определение содержания белковых веществ проводили по методу Кьельдаля согласно ГОСТ 7636-85, Несслера и Лоури.
Экстракцию липидов из вторичного рыбного сырья осуществляли органическим растворителем в течение 15-90 мин при 35-60 С, гидромодуль 1,5-5.
Определение КМАФАнМ проводили согласно ГОСТ 10444.15-94; дрожжей и плесневых грибов - ГОСТ 28805-90.
Определение аминокислотного состава проводили согласно Руководству Р 4.1.1672-03.
Экстракцию белка из предварительно гомогенизированного рыбного сырья осуществляли в интервале рН 2,0-12,0. Суспензию разделяли в поле центробежных сил в течение 20 мин при 8000 мин-1. Целевым продуктом являлся средний слой.
Осаждение белков из раствора осуществляли с использование органических растворителей, ТХУ и методом изоэлектрической преципитации (рН 4,8-5.2).
Определение протеолитической активности ферментных препаратов проводили по методу Ансона в модификации.
Скрининг микроорганизмов, изолированных из трех природных источников обитания, проводили по схеме, разработанной в соответствии с особенностями роста культур в зависимости от источника выделения.
Количественное определение гистамина осуществляли колориметрическим методом.
Определение гистидиндекарбоксилазной активности осуществляли модифицированным спектрофотометрическим методом.
Идентификацию культуры до вида проводили путем анализа секвенсов вариабельных участков 16S рРНК, а также ПЦР анализа с использованием видоспецифических праймеров.
Выделение гистамина проводили методом ионообменной хроматографии на смоле Dowex 50WX4.
Все измерения проводили не менее, чем в трех повторностях. Результаты экспериментальных исследований были обработаны с помощью программы Microsoft Excel 2007. В работе представлены средние результаты с достоверностью 95%.
ГЛАВА III ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Исследование биохимического состава вторичного рыбного сырья
В работе был исследован биохимический состав отходов от разделки следующих видов промысловых рыб: килька, мойва, сельдь, судак, треска, форель (табл.1).
Таблица 1 - Биохимический состав рыбных отходов, %.
Вид рыб | Состав отходов | Влажность | Белок (сырой протеин) | ипиды | Зольность |
Килька | Головы, хребты, кожа | 72,12 | 14,40 | 0,20 | 1,46 |
Мойва | Головы, хребты, кожа | 69,50 | 14,20 | 14,00 | 2,28 |
Сельдь | Головы, хребты, кожа | 65,92 | 14,90 | 18,10 | 0,82 |
Судак | Головы, хребты, кожа | 67,35 | 18,50 | 3,60 | 10,38 |
Треска | Головы, хребты, кожа | 76,58 | 19,10 | 1,00 | 3,03 |
Форель | Головы | 61,98 | 15,40 | 16,20 | 6,12 |
На основании представленных результатов был сделан вывод о том, что отходы рыбоперерабатывающих предприятий содержат достаточно высокое количество белка (14,20-19,10%), и поэтому могут быть использованы в качестве потенциального источника полноценного протеина.
Разработка технологии кормового белкового концентрата из вторичного рыбного сырья
1 Обоснование эффективных условий экстракции липидов из вторичного рыбного сырья
Одной из целей получения очищенных белковых продуктов является обеспечение их продолжительного хранения. Поэтому важно удалять из них реакционноспособные и легко окисляемые компоненты - липиды. В связи с этим был определен способ и экспериментально обоснованы условия экстракции липидов из рыбных отходов.
Для выбора экстрагента проводили сравнительное исследование с использованием ряда органических растворителей: изопропанол, ацетон, н-гексан, этилацетат, бутанол-1, этанол. Наиболее полное извлечение липидов было достигнуто с применением этилацетата. Однако использование его в качестве основного экстрагента ограничено его возможным негативным воздействием на производственный персонал. Поэтому для выделение липидов из гомогенизированных рыбных отходов был выбран дешевый и безопасный экстрагент - этанол, применяемый в пищевой и комбикормовой промышленности.
Для определения эффективного гидромодуля при проведении обезжиривания соотношение экстрагента и гомогенизированной массы рыбных отходов варьировали от 1,5:1; 2:1; 2,5:1; 3:1; 3,5:1; 4:1; 4,5:1 до 5:1. Наиболее целесообразным для проведения экстракции следует считать соотношение 2,5:1, при котором выход липидов составил 73,6%.
Для определения эффективной концентрации этанола, позволяющего удалить максимальное количество липидов из биомассы рыбных отходов, исходное сырье обрабатывали 40, 50, 60, 70, 80, 96% этанолом при установленном ранее гидромодуле 2,5. С учетом экономических требований, предъявляемых к разрабатываемой технологии, рекомендуемой была выбрана концентрация 70%, позволяющая удалить достаточное количество липидов - 69,40%.
Для изучения зависимости выхода липидов из вторичного рыбного сырья от температуры этанола (при условии: гидромодуль 2,5, концентрация этанола - 70%) проводили экстракцию при температурах 35, 40, 45, 50, 55 и 60 С. При температурах раствора этанола 55 и 60 С выходы экстрагируемых липидов практически совпадали, что позволило рекомендовать для дальнейшего применения температуру экстракции 55 С, целесообразную как с экономической, так и с биохимической точек зрения.
Для определения эффективной продолжительности экстракции липидов исследование проводили в течение 15, 30, 45, 60, 75 и 90 мин (при условии: гидромодуль 2,5, концентрация этанола - 70%, температура экстрагента - 55 С) (рис. 2).
Наиболее эффективной и экономически целесообразной следует считать продолжительность экстракции 60 мин, при этом количество удаляемых липидов составляет 89,3%
Таким образом были экспериментально выявлены и обоснованы следующие условия экстракции липидов из вторичного рыбного сырья: основной экстрагент - 70% этанол; гидромодуль - 2,5; температура экстрагента - 55 С; длительность экстракции - 60 мин.
2 Получение сухого кормового белкового концентрата
Обезжиренную рыбную массу, полученную после экстракции липидов, высушивали конвективным методом. В готовом продукте определяли содержание влаги, белка, жира, зольность, оценивали общую микробную обсемененность (табл. 2).
Полученный кормовой белковый концентрат (КБК) отвечает требованиям существующей нормативной документации на кормовые рыбные продукты. По основному показателю - содержанию белка - КБК более чем в 2 раза превосходит нормируемое значение.
Таблица 2 - Биохимические и микробиологические показатели КБК.
Наименование показателя | Нормируемое значение | Обозначение нормативного документа | Значение показателя по результатам исследований |
Массовая доля влаги,% | не более 13,00 | ГОСТ 2116-2000 | 4,80 |
Массовая доля белковых веществ, % | не менее 36,00 | 72,70 | |
Массовая доля белковых веществ, %а.с.в. | не нормируется | - | 76,36 |
Массовая доля жира, % | не более 18,00 | ГОСТ 2116-2000 | 1,90 |
Массовая доля жира, %а.с.в. | не нормируется | - | 2,00 |
Массовая доля золы, % | не более 1,00 | ГОСТ 2116-2000 | 20,60 |
Массовая доля золы, %а.с.в. | не нормируется | 21,64 | |
КМАФАнМ, КОЕ/г | не более 5*104 | СанПиН 2.3.2.1078-01 | 3*102 |
Патогенная микрофлора | не допускается | ГОСТ 2116-2000; СанПиН 2.3.2.1078-01 | не выявлена |
Выход по белку по разработанной технологии составил 65-67%. Выход белкового препарата из 1 кг переработанного сырья составляет 170-180 г (влажность 5%).
3 Оценка аминокислотного состава белков готового КБК
Определение аминокислотного состава готового КБК проводили на аппаратурной базе ООО Зеленые линии. Исследование аминокислотного состава показало, что содержание основных незаменимых аминокислот (кроме триптофана) в полученном КБК превышает 32%, в кормовой рыбной муке - 31%.
4 Оценка функциональных свойств белков готового КБК
Для исследования возможности применения КБК в составе консервированных кормов (используемых для домашних животных) были исследованы важнейшие функциональные свойства белков полученного КБК (рис. 3,4 и табл.3).
Согласно представленным результатам, максимум растворимости белков КБК наблюдался при температуре 30 С и составил 45,61%. В интервале рН от 2 до 11 растворимость КБК практически не менялась и в среднем составила 45%. Максимум растворимости наблюдался при рН 12,0 и составил 63,34%.
Таблица 3 - ВСС, ЖСС и набухаемость КБК.
Наименование показателя | Значение |
ВСС, % | 404,80 |
ЖСС, % | 198,50 |
Набухаемость, см3/г | 2,80 |
Значения определяемых показателей ВСС, ЖСС и набухаемости достаточно высоки и подтверждают возможность использования КБК в качестве биологически активной добавки в консервированные корма для домашних животных.
5 Оценка сорбционной способности КБК по отношению к микроорганизмам
Исследование сорбци-онной способности КБК проводили по отношению к микроорганизмам, в т.ч. патогенным и условно-патогенным (рис. 5). Полученные результаты показали, что КБК обладает выраженной способностью адсорбировать палочко- и кокковидные бактерии различных форм патогенности. Отдельно следует выделить практически 100% адсорбцию B.cereus и E. cloacae как серьезных потенциальных возбудителей заболеваний у животных.
Разработка технологии пищевого белкового концентрата из вторичного рыбного сырья
1 Экстракция белка из гомогенизированной массы рыбных отходов
Исходное вторичное сырье измельчали до однородной, гомогенной массы, имеющей консистенцию рыбного фарша (влажность фарша 60-78%). Экстракцию белка из измельченных отходов проводили при разных значениях рН (интервал рН 2,0-12,0; шаг 0,5) (рис. 6). Как видно из диаграммы на рис. 6, наибольшая растворимость белков была достигнута в сильнощелочной области рН (11,0). Поэтому для дальнейшего детального изучения экстракции белков был выбран диапазон рН 10,5-11,5 и проведено аналогичное исследование с шагом рН 0,1.
Максимальная раствори-мость белков 76,51% была достигнута при рН экстрагента 10,8. Это значение было выбрано в качестве рекомендуемого для разрабатываемой технологии.
Образующиеся на данном этапе отходы после отделения растворенных белков могут быть также использованы, а именно: осадок, после высушивания, может служить в качестве кормовой минеральной добавки, а липидная фракция, содержащая насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, может найти применение в фармацевтической промышленности.
2 Осаждение белка из раствора
Для оценки сравнительной эффективности осаждение экстрагированных белков было проведено различными способами: этанолом, изопропанолом, трихлоруксусной кислотой, а также методом изоэлектрической преципитации (рН 5,0). Установлено, что наиболее эффективным является изоэлектрическое осаждение, позволяющее получить максимальный выход целевого продукта.
Согласно результатам, представленным на рис.6, ИЭТ изучаемого комплекса белков находится в области рН 5,0. Поэтому для более детального изучения осаждения белков был выбран диапазон рН 4,8-5,2 и проведено аналогичное исследование с шагом рН 0,1 (рис. 7). Осаждение при рН 5,1 позволяет максимально перевести белки в нерастворимое состояние и получить белковый полуфабрикат (БП).
3 Оценка биохимических и микробиологических показателей БП
Полученный БП из вторичного рыбного сырья представляет собой аналог сурими. Значения биохимических показателей БП представлены в табл.4 в сравнении с показателями для традиционного фарша сурими. Микробиологические показатели БП представлены в табл. 5.
Таким образом, полученный БП не уступает по биохимическому составу традиционному фаршу сурими, а по такому показателю как содержание белка - превосходит его более чем на 40%. По микробиологическим показателям БП полностью соответствует нормам СанПиН 2.3.2. 1078-01. Выход БП из 1 кг исходного сырья составляет 470-490 г (влажность 74%).
Таблица 4 - Биохимические показатели БП и сурими.
Наименование показателя | Нормируемое значение для фарша рыбного пищевого мороженого для производства Крабовых палочек по ТУ 15-03-467-89 | Нормируемое значение для сурими | Значение показателя по результатам исследований |
Массовая доля влаги,% | 74,0077,00 | 72,1876,78 | 74,26 |
Массовая доля золы, % | не нормируется | 0,340,75 | 1,99 |
Массовая доля золы, %а.с.в. | не нормируется | не нормируется | 7,73 |
Массовая доля белковых веществ, % | не нормируется | 13,3816,28 | 23,36 |
Массовая доля белковых веществ, %а.с.в. | не нормируется | не нормируется | 90,75 |
Массовая доля жира, % | не нормируется | 0,22,65 | 0,39 |
Массовая доля жира, %а.с.в. | не нормируется | не нормируется | 1,52 |
Таблица 5 - Микробиологические показатели БП.
Наименование показателя | Нормируемое значение | Обозначение нормативного документа | Значение показателя по результатам исследований |
КМАФАнМ, КОЕ/г | не более 1*105 | СанПиН 2.3.2.1078-01 | 1*103 |
Бактерии группы кишечной палочки (БГКП), КОЕ/0,001 г | не допускается | не выявлены | |
S.aureus, КОЕ/0,01 г | не допускается | не выявлены |
4 Получение сухого пищевого белкового концентрата (ПБК)
БП высушивали конвективным методом. В готовом ПБК определяли содержание влаги, белка, жира, а также оценивали общую микробную обсемененность.
Результаты проведенных исследований представлены в табл. 6 в сравнении с нормируемыми значениями для пищевого соевого изолята.
Таблица 6 - Биохимические и микробиологические показатели ПБК и соевого изолята.
Наименование показателя | Нормируемое значение для соевого изолята | Обозначение нормативного документа | Значение показателя по результатам исследований ПБК |
Массовая доля влаги,% | не нормируется | FAO document | 10,00 |
Массовая доля белковых веществ, % | не нормируется | 83,50 | |
Массовая доля белковых веществ, %а.с.в. | не менее 90,00 | 92,78 | |
Массовая доля золы, % | не нормируется | 5,30 | |
Массовая доля золы, %а.с.в. | не более 4,5 | 5,89 | |
Массовая доля жира, % | не нормируется | 1,20 | |
Массовая доля жира, %а.с.в. | не более 0,5 | 1,33 | |
КМАФАнМ, КОЕ/г | не более 2,5*104 | СанПиН 2.3.2.1078-01 | 3*102 |
БГКП, КОЕ/0,1 г | не допускаются | не выявлены | |
Дрожжи и плесени, КОЕ/г | дрожжи не более 90; плесени не более 10 | не выявлены | |
Патогенная микрофлора, в т.ч. сальмонеллы, КОЕ/25 г | не допускается | не выявлена |
Как видно из табл. 6, полученный ПБК обладает сопоставимыми с соевым изолятом биохимическими и микробиологическими характеристиками. Выход белка из сырья в ПБК согласно разработанной биотехнологии составил 70-75%. Выход ПБК из 1 кг переработанного сырья составляет 120-130 г (влажность 10%).
5 Оценка аминокислотного состава белков готового ПБК
Определение аминокислотного состава проводили на аппаратурной базе ООО Зеленые линии. Суммарная доля 7 незаменимых аминокислот (кроме триптофана) в полученном ПБК составляет 35,80%. Следует отметить, что соевый изолят, как наиболее часто употребляемая белковая добавка в продуктах питания, содержит около 31% незаменимых аминокислот. Таким образом, ПБК обладает повышенной биологической ценностью и поэтому может быть рекомендован к использованию в качестве функциональной добавки в рецептурах пищевых продуктов.
6 Оценка функциональных свойств белков готового ПБК
Проводилось сравнительное исследование важнейших функциональных свойств полученного ПБК и соевого изолята как наиболее близкого и широко распространенного аналога (рис. 8, 9; табл. 7).
Как видно из графиков на рис. 8, максимум растворимости ПБК наблюдался при температуре 40 С и составил 40,18%. Следует отметить, что максимум растворимости соевого изолята (38,85%) наблюдается при температуре 80 С (рис. 8), а при 40 С его растворимость примерно на 20% ниже, чем у ПБК, что свидетельствует в пользу применения ПБК при изготовлении продуктов, для которых высокотемпературная обработка нежелательна или недопустима.
Как видно из графиков на рис. 9, максимум растворимости ПБК наблюдался при рН 2,0 и составил 60,12%. Максимум растворимости соевого изолята наблюдался при рН 11 и составил 44,13%. Следует отметить, что в диапазоне значений рН, характерных для пищевых продуктов и их полуфабрикатов (4,5-8,5), растворимость белков ПБК выше, чем у соевого изолята в 1,2-2,8 раза, что дополнительно расширяет сферу применения разработанного нового продукта и дает существенные преимущества в использовании по сравнению с традиционными соепродуктами.
Таблица 7 - ВСС, ЖСС, набухаемость ПБК и соевого изолята.
Наименование показателя | ПБК | Соевый изолят |
ВСС, % | 261,4 | 305,4 |
ЖСС, % | 199 | 222,5 |
Набухаемость, см3/г | 4,4 | 10,4 |
По показателям ВСС, ЖСС и набухаемости разработанный продукт несколько уступает соевому аналогу, но в целом значения определяемых показателей сопоставимы, высоки и достаточны для использования ПБК в качестве биологически активной добавки в пищевых продуктах.
7 Оценка сорбционной способности ПБК по отношению к микроорганизмам
Исследование сорбционной способности ПБК проводили по отношению к микроорганизмам, в т.ч. патогенным и условно-патогенным (рис. 10).
Как видно из диаграммы, сорбционная способность ПБК по отношению к большинству микроорганизмов (за исключением C. maltosa и Sarcina sp.) по сравнению с соевым изолятом выше.
Таким образом, ярко выраженный адсорбционный потенциал разработанного продукта к микрофлоре, в т.ч. патогенной и условно-патогенной, позволяет использовать полученную добавку в производстве изделий лечебно-профилактического назначения.
Разработка технологий аминокислотных смесей на основе КБК и ПБК
В рамках диссертационного исследования была изучена возможность получения обогащенных аминокислотами биологически активных добавок пищевого и кормового назначения путем ферментативного гидролиза белковых продуктов (КБК и ПБК), полученных ранее из вторичного сырья рыбоперерабатывающих предприятий.
1 Выбор наиболее эффективного ферментного препарата
Для выбора ферментного препарата, способного быстро и качественно осуществить протеолиз белков проводилось сравнительное исследование по воздействию 12 ферментных препаратов на исследуемый субстрат. Максимальная глубина гидролиза была выявлена при использовании Пепсина, что и определило дальнейшее его использование в работе.
2 Выбор условий протеолиза белков ПБК
В исследованиях были использованы математические методы планирования эксперимента и реализован полнофакторный эксперимент. Интервалы варьирования факторов включали все экономически целесообразные и биохимически значимые величины. Результаты статистической обработки позволили сделать вывод, что наиболее эффективными являются следующие условия проведения гидролиза белкового концентрата (ПБК) из отходов переработки рыбы ферментным препаратом Пепсин: концентрация субстрата - 5%; количество вносимого фермента - 1% от массы обрабатываемого субстрата; длительность процесса - 6 ч; температура реакционной среды - 50 С. Указанные условия позволяют достичь глубины гидролиза 27,53%.
3 Получение жидкого прикорма для растений на основе КБК
Ферментолизат после протеолиза КБК в выбранных условиях отделяли от непрогидролизованного осадка путем фильтрации. Полученную жидкую аминокислотную смесь использовали в качестве прикорма для роста и поддержания растений (огурцов Cucumis sp.).
В интервале концентрации 1-5% отмечалась положительная динамика роста, а максимальная эффективность достигалась при 2%-й концентрации аминокислотной смеси. В полученных ростках определяли содержание белка (сырого протеина). При проращивании семян с использованием 2%-ой аминокислотой смеси наблюдалось накопление белка в стеблях, корнях и листьях.
Таким образом, аминокислотная смесь, вводимая в составе жидкости для орошения в качестве прикорма, может рассматриваться как эффективное средство повышения пищевой ценности и ускорения роста экологически чистых продуктов (organic food).
4 Получение сухой аминокислотной смеси
Ферментолизат отделяли от непрогидролизованного осадка путем фильтрации, затем упаривали и высушивали. Выход готовой аминокислотной смеси (с влажностью не более 10%) составил 25,31 % и 21,83 % от массы прогидролизованных ПБК и КБК соответственно.
При этом дополнительным продуктом в разработанной технологии являлся пептидный осадок, который также может быть использован в качестве биологически активного вещества в составе кормов.
5 Оценка аминокислотного состава сухого ферментолизата
Определение аминокислотного состава сухих смесей, полученных после протеолиза КБК и ПБК проводили на аппаратурной базе ООО Зеленые линии. Полученные аминокислотные смеси обладают повышенной биологической ценностью (содержание незаменимых аминокислот более 44 %) по сравнению с гидролизатами рыбного и соевого белка, содержание незаменимых аминокислот в которых составляет 39% и 35% соответственно.
6 Интенсификация процесса ферментолиза ПБК
Интенсификация процесса ферментолиза ПБК осуществлялась путем введения дополнительной стадии автолиза исходного сырья. Экспериментально обоснованные условия: выдерживание суспензии отходов в течение 5 ч при температуре 45-50 С с применением 2% хлорида натрия в качестве автолитического агента. В результате автолиза около 80% белковых фракций имели молекулярную массу менее 5 кДа, из них более 40% - менее 1,5 кДа. Полученный после предварительного автолиза вторичного рыбного сырья ПБК подвергали ферментативному гидролизу. Было выявлено, что предварительный автолиз сырья позволил увеличить степень гидролиза ферментным препаратом Пепсин более чем в 1,5 раза, выход готовой аминокислотной смеси (с влажностью не более 10%) составил 47,23% от исходного ПБК. Высокая степень конверсии белков ПБК (более 50%) подтверждает возможность использования разработанного ПБК и аминокислотных смесей на его основе в качестве функциональных добавок в пищевые продукты. В результате проведенного исследования степень гидролиза составила 50,91%.
Разработка биотехнологии гистидиндекарбоксилазы
В настоящее время гистамин для фармацевтических целей получают в основном синтетическим путем, что оказывает значительное влияние на стоимость готового препарата. Именно поэтому в задачи диссертационной работы входило изучение возможности создания рентабельной биотехнологии фермента гистидиндекарбоксилазы, трансформирующего гистидин, получаемый из вторичного рыбного сырья, в гистамин.
1 Скрининг микроорганизмов-продуцентов гистидиндекарбоксилаз
В рамках диссертационной работы было получено более 60 изолятов культур микроорганизмов. В результате скрининга было установлено, что наибольшее количество гистамина (9,26 мкг/см3) в культуральной жидкости (КЖ) образуется в результате культивирования штамма КЛ13, который и был отобран для дальнейших исследований.
2 Исследование морфологических, культуральных и физиолого-биохимических признаков изолята КЛ13
При определении видовой принадлежности изолята КЛ 13 учитывали совокупность морфологических, культуральных и физиолого-биохимических признаков. По результатам изучение физиолого-биохимических свойств изолята КЛ13 был сделан вывод о принадлежности тестируемого штамма к роду Bacillus.
Идентификация штамма Bacillus sp.КЛ13 до вида осуществлялась в лаборатории ФГУПГосНИИГенетика. Проведенный анализ секвенсов вариабельных участков 16S рРНК тестируемого штамма показал, что с вероятностью 99% его вид можно идентифицировать как Bacillus licheniformis.
3 Выбор наиболее эффективных условий культивирования Bacillus licheniformis КЛ13 с целью получения активного фермента гистидиндекарбоксилазы
Планирование исследования осуществляли по методу Гаусса-Зейделя, предусматривающего последовательное изучение влияющих факторов и использование каждого предыдущего в качестве фона для последующего.
В процессе исследования последовательно варьировали следующие факторы: концентрацию гистидина в ПСр (0-50 мкг/см3); рН питательной среды (2,0-12,0); длительность культивирования (1-8 сут); возраст посевного материала (ПМ) (1-5 сут); концентрации микроэлементов в ПСр (0,01-0,05%); посевную дозу (102-107кл/см3).
Согласно результатам, полученным на этапе скрининга, наиболее эффективная концентрация добавляемого в ПСр (ГРМ-бульон) гистидина с целью индукции биосинтеза фермента находится в интервале 5-15 мкг/см3 ПСр. Для выбора точного значения были проведены дополнительные исследования в указанном интервале концентраций с шагом 2 мкг/см3 (рис.11). Следует отметить, что содержание гистидина в составе панкреатического гидролизата рыбной муки (в ГРМ-бульоне) составляет 0,12%.
Как видно из графика на рис.11, наиболее эффективной является концентрация гистидина 8 мкг/см3 ПСр. При данной концентрации индуктора количество гистамина в фильтрате КЖ после культивирования составило 14,04 мкг/см3, а активность гистидиндекарбоксилазы - 1,00 ед/см3.
Установлено, что при культивировании Bacillus licheniformis КЛ13 рН среды должен быть нейтральным (pH 7,0).
Оптимальное время культивирования Bacillus licheniformis КЛ13 для накопления максимальной активности препарата равно 96 ч.
Для получения фермента с максимальной активностью (6,01 ед/см3) необходимо использовать 2-х дневный посевной материал. При этом, концентрация гистамина в фильтрате КЖ достигала 47,9 мкг/см3.
Установлено, что такие микроэлементы как Zn, Co, Cu и Mn ингибируют рост штамма B. licheniformis КЛ13. Добавление же 0,05% ионов Mg2+ оказывает благоприятное влияние на рост культуры и биосинтез фермента, позволяя достичь активности 15,27 ед/см3 (рис. 12). Концентрация гистамина в фильтрате КЖ в этом случае составляла 58,76 мкг/см3.
Экспериментально установлена оптимальная посевная доза с концентрацией 107 кл/см3 ПМ.
4 Изучение путей повышения активности гистидиндекарбоксилазы B. licheniformis КЛ13
С целью повышения активности ферментного препарата посевной материал предварительно выращивали на питательной среде типа ГРМ-агар с добавлением гистамина. Концентрация гистамина варьировалась в диапазоне 5-50 мкг/см3. Колонии выросшей культуры далее использовали для получения 2-х дневного ПМ для глубинной ферментации. По окончании 96 ч культивирования в фильтрате КЖ определяли активность гистидиндекарбоксилазы.
Повышение активности фермента гистидиндекарбоксилазы до 27,5 ед/см3 было достигнуто после предварительного выращивания ПМ на среде, содержащей 35 мкг/см3 гистамина.
С целью дальнейшего повышения активности ферментного препарата проводили УФ-индуцированный мутагенез продуцента. Максимальная активность (78,67 ед/см3) фермента гистидиндекарбоксилазы в фильтрате КЖ достигалась под воздействием УФ-облучения на культуру в течение 50 мин. Для дальнейших исследований использовали полученный в результате мутагенеза ПМ.
5 Осаждение гистидиндекарбоксилазы B.licheniformis КЛ13 из культуральной жидкости
Установлено, что наиболее эффективно осаждение фермента из фильтрата культуральной жидкости B.licheniformis КЛ13 происходит изопропанолом в соотношении 5:1 и рН 9,0, при этом выход сухого препарата (влажность 10,6%) достигает 9 г/дм3. Активность высушенного ферментного препарата гистидиндекарбоксилазы (Г10Х) (влажность 10,6%) составила 666,67 ед/г.
6 Очистка гистидиндекарбоксилазы B.licheniformis КЛ13
В ООО Зеленые линии была проведена очистка фильтрата культуральной жидкости B.licheniformis КЛ13 методом ультрафильтрации на установке ВЛАДИСАРТ. После высушивания ферментного препарата активность гистидиндекарбоксилазы в нем составила 1087 ед/г.
7 Выбор эффективных условий ферментативной конверсии гистидина ферментным препаратом гистидиндекарбоксилаза Г10Х
На основании проведенного многофакторного эксперимента были выбраны эффективные условия конверсии гистидина гистидинекарбоксилазой B.licheniformis КЛ13. Вариабельными параметрами были: рН среды (интервал варьирования 4,0-9,0), температура реакционной смеси (интервал 30-60 С), доза ферментного препарата (1-6 ед/г субстрата). Длительность реакции составляла 60 мин, концентрация субстрата 3%. Оптимум действия фермента достигался при температуре 40 С, нейтральном рН и дозе ферментного препарата 1 ед/г субстрата. В таких условиях 28,49% гистидина трансформировалось в гистамин.
8 Получение гистамина на основе ферментативной конверсии гистидина в жидкой аминокислотной смеси
Полученную в результате конверсии гистидина из аминокислотной смеси после протеолиза КБК с использованием разработанного ферментного препарата гистидиндекарбоксилазы (в условиях, обоснованных выше), реакционную смесь очищали путем ионообменной хроматографии на смоле Dowex 50WX4. В элюате определяли содержание гистамина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на базе ООО Зеленые линии. Содержание гистамина составило 98,7% а.с.в.
Продукты, полученные в результате проведенного диссертационного исследования, и сферы их полезного применения представлены на рис. 13.
В соответствии с проведенными расчетами экономической эффективности разработанных технологий, себестоимость готовых препаратов составила: КБК - 96,05 руб/кг; ПБК - 207,58 руб/кг, гистамина - 32,21 руб/г. Отпускная цена готовых изделий значительно ниже или сопоставима с рыночной ценой ближайших конкурентных аналогов. Так, рассчитанная цена гистамина, полученного с использованием разработанного ферментного препарата в 5 раз ниже среднерыночной цены за данный препарат.
ВЫВОДЫ
- Исследование биохимического состава вторичного рыбного сырья показало, что отходы рыбоперерабатывающих предприятий содержат высокое количество белка (14,20-19,10%), что позволяет считать их перспективным источником полноценного протеина
- Разработана малоотходная биотехнология КБК на основе экспериментально выявленных эффективных условий экстракции липидов из вторичного рыбного сырья. Показано, что КБК обладает высокой биологической ценностью, содержание основных незаменимых аминокислот превышает 32%.
- Разработана малоотходная биотехнология ПБК на основе экстракции белков из вторичного рыбного сырья (рН 10,8) и их осаждения в ИЭТ (рН 5,1). Показано, что ПБК обладает сопоставимыми с соевым белком биохимическими характеристиками и может быть введен в рецептуры пищевых продуктов с целью повышения их биологической ценности (содержание незаменимых аминокислот в полученном ПБК составляет 35,80%).
- На основании исследования функциональных свойств белков КБК и ПБК подтверждена возможность их использования в составе кормов и продуктов питания, соответственно, в качестве биологически активной добавки и с лечебно-профилактическими целями.
- На основе анализа экспериментальных данных и выявленных зависимостей степени ферментативного гидролиза от условий проведения данного процесса обоснован наиболее эффективный режим проведения ферментолиза белковых продуктов. Установлено, что автолиз вторичного рыбного сырья способствует проведению ферментолиза, повышая субстратную доступность для фермента (Пепсина).
- Экспериментально установлено, что полученные аминокислотные смеси обладают повышенной биологической ценностью (содержание незаменимых аминокислот более 44 %) по сравнению с гидролизатами рыбного и соевого белка.
- Результаты скрининга более 60 изолятов микроорганизмов позволили выявить культуру, обладающую максимальной гистидиндекарбоксилазной активностью
- Разработана биотехнология гистидиндекароксилазы Г20Х с использованием стадий ультрафильтрации и спиртового осаждения. Активность гистидиндекарбоксилазы Г20Х составила 1087 ед/г.
- Разработана технология получения гистамина из аминокислотной смеси после протеолиза КБК с использованием нового ферментного препарата гистидиндекарбоксилазы.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК:
- Устинова Ю.В. Получение кормовых белковых концентратов как способ рациональной утилизации вторичного рыбного сырья / Л.А. Иванова, Д.Н. Марусина // Пищевая промышленность России. - 2011. - №11. - С. 26-28.
- Устинова Ю.В. Разработка технологии получения белковых продуктов из вторичного сырья рыбоперерабатывающих предприятий / Л.А. Иванова, О.В. Румянцева // Экология и промышленность России. - 2012. - №1. - С. 50-53.
- Устинова Ю.В. Изучение процессов ферментолиза белкового концентрата пищевого назначения./ Л.А. Иванова, О.В. Румянцева, И.Ю. Батталова // Естественные и технические науки. - 2012. - №3. - С. 364-369.
Статьи и материалы конференций:
- Устинова Ю.В. Использование отходов от разделки рыбы в качестве основного сырья для получения кормовых белковых добавок / Л.А. Иванова, Д.Н. Марусина, О.В. Румянцева // Сборник материалов IX международной научно-практической конференции и выставки Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты, конференции молодых ученых Инновационные технологии продуктов здорового питания / МГУПП - М., 2011. - С. 187-189.
- Устинова Ю.В. Исследование возможности использования рыбных отходов в качестве потенциального источника белка и других ценных компонентов / Л.А. Иванова, О.В. Румянцева // Живые системы и биологическая безопасность населения: материалы IX Международной научной конференции студентов и молодых ученых / МГУПП - М., 2011. - С. 40-43.
- Устинова Ю.В. Использование вторичного сырья рыбоперерабатывающих предприятий в качестве альтернативного источника белка / Л.А. Иванова // Инновационные технологии переработки продовольственного сырья: материалы Международной научно-технической конференции / Дальрыбвтуз - Владивосток, 2011. - С. 107-109.
- Устинова Ю.В. Изучение возможности получения фермента гистидиндекарбоксилазы биотехнологическим способом для фармацевтической и пищевой индустрии / Л.А. Иванова, А.С. Беловолова, А.Ю. Прищепо // Международная научно-практическая конференция Молодых учёных: Сборник научных трудов / Науч.ред. д.п.н., проф. И.А. Рудакова. - М.: Издательство Перо, 2012. - С. 286-289.
- Устинова Ю.В. Биотехнология фермента гистидиндекарбоксилазы на основе нового штамма Bacillus licheniformis / Л.А. Иванова, А.С. Беловолова, А.Ю. Прищепо // Биология - наука XXI века: Материалы Международной конференции / Ред. Р.Г. Василов. - М.: МАКС Пресс, 2012. - С. 316-317.
- Устинова Ю.В. Повышение эффективности протеолиза белкового концентрата из вторичного рыбного сырья / Л.А. Иванова, И.Ю. Батталова // Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока: материалы II Всероссийской научно-практической конференции (с международным участием) / ВСГУТУ. - Улан-Удэ, 2012. - С. 13-15.
Сокращения
АСВ - абсолютно сухое вещество;
БГКП - бактерии группы кишечной палочки;
БП - белковый полуфабрикат;
ВСС - водосвязывающая способность;
ЖСС - жиросвязывающая способность;
ИЭТ - изоэлектрическая точка;
КБК - кормовой белковый концентрат;
КЖ - культуральная жидкость;
КМАФАнМ - количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов;
НД - нормативный документ;
ПБК - пищевой белковый концентрат;
ПД - посевная доза;
ПМ - посевной материал;
ПСр - питательная среда;
ТХУ - трихлоруксусная кислота.
Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю заведующей кафедрой Биотехнология ФГБОУ ВПО МГУПП, профессору, д.т.н. Ивановой Л.А. за формирование научных взглядов, руководство при написании работы, всестороннюю поддержку и внимание, а также всем сотрудникам кафедры Биотехнология ФГБОУ ВПО МГУПП. За помощь в организации и выполнении работы автор выражает глубокую признателеность руководителю аналитического центра ООО Зеленые линии Русановой Е.П. и всему коллективу аналитического центра ООО Зеленые линии.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии