Geum.ru
Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по разным специальностям 2

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном

На правах рукописи

образовательном учреждении высшего профессионального образования Казанский национальный исследовательский технологический университет

Научный консультант: доктор химических наук

, профессор Гармонов Сергей Юрьевич

Официальные оппоненты: Плетенева Татьяна Вадимовна доктор химических наук, профессор, ГБОУ ВПО Российский университет дружбы народов, г. Москва, НГУЕН Чунг Зунг зав. кафедрой фармацевтической и токсикологической химии Егорова Светлана Николаевна доктор фармацевтических наук, профессор, Биофармацевтический анализ месалазина и ГБОУ ВПО Казанский государственный медицинский университет, сульфаниламидов для оценки фенотипа зав. кафедрой фармации ФПК и ППС ацетилирования организма человека

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Нижегородская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия Российской Федерации

Защита состоится л14 сентября 2012 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 212.080.07 при ФГБОУ ВПО Казанский национальный исследовательский технологический университет по адресу: 420015, г. Казань, ул. К. Маркса, д.68, зал заседаний Ученого совета, А-330.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке кандидата химических наук ФГБОУ ВПО Казанский национальный исследовательский технологический университет.

Автореферат разослан л27 июня 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Нугуманова Гульнара Наиловна Казань - 203

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

из организма человека для косвенного установления фенотипа ацетилирова ния.

Актуальность темы. Разработка методов анализа лекарственных веществ Для достижения поставленых целей решались следующие задачи:

(ЛВ) в биологических объектах для фармакокинетических исследований играет - изучение условий хроматографического разделения и режимов элюироважную роль в оценке биоэквивалентности, обеспечении безопасности, эффек- вания, расчет и оценка параметров пригодности хроматографической системы тивности и персонализации применения лекарственных средств (ЛС). при разработке методик определения месалазина, сульфаметаксазола и сульДля ЛВ, содержащих аминные функциональные группы, биотрансформа- фадиметоксина в моче и слюне;

ция осуществляется главным образом путем реакций N-ацетилирования, и у - выявление факторов, обеспечивающих чувствительность и избирательчеловека сформированы фенотипы быстрого и медленного метаболизма, раз- ность спектрофотометрических определений месалазина, сульфаметаксазола и личающиеся генетически детерминированной активностью N-ацетилтрансфе- сульфадиметоксина в моче и слюне в виде окрашенных производных с 7-хлорразы (NAT) гепатоцитов. При этом активность NAT является одним из важных 4,6-динитробензофуроксаном (ХБФО);

факторов, определяющим индивидуальные колебания концентрации ЛВ в ор- - оценка влияния компонентов анализируемой матрицы на регистрируеганизме пациентов, и, в конечном итоге, их ответ на многие ЛС, применяемые мый в условиях ВЭЖХ и спектрофотометрии аналитический сигнал, определепри ряде социально значимых заболеваний (инфекционных, сердечно- ние метрологических характеристик разработанных способов для подтверждесосудистой системы, органов дыхания, печени). ния их соответствия требованиям, принятым для фармацевтического анализа;

Наиболее часто фенотипирование NAT производится с помощью фарма- - проведение расчета и оценки фармакокинетических параметров тесткокинетических исследований выведения с мочой изониазида и сульфанила- препаратов ацетилирования у здоровых добровольцев, разработка способов мидов спектрофотометрическим методом с применением хромогенных реаген- установления активности NАТ при экскреции месалазина, сульфаметаксазола тов (карбонильные соединения, диазотирование с последующим азосочетанием и сульфадиметоксина с мочой и слюной;

и др.), однако существенными недостатками этих методик являются низкая - установление фармакокинетических параметров тест-препаратов окислечувствительность определений, малоизбирательность из-за сложного состава ния и ацетилирования у больных хроническим вирусным гепатитом В.

анализируемой матрицы, многостадийность и длительность. В тоже время Научная новизна работы:

оценка активности NAT методом высокоэффективной жидкостной хромато- - установлены условия хроматографического разделения месалазина, графии (ВЭЖХ) при определении кофеина в моче, гидразидов кислот и суль- сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в условиях обращено-фазной ВЭЖХ, фаниламидов в крови имеет ограничения по клиническому применению этого а также выявлены факторы повышения избирательности и чувствительности теста у некоторых категорий больных. биофармацевтического анализа этих лекарственных веществ в биологических Перспективным направлением развития фармацевтической химии является жидкостях организма человека;

разработка неинвазивных подходов по биофармацевтическому анализу для - найдены и обоснованы рабочие условия высокочувствительного и избиустановления фармакокинетических параметров новых тест-препаратов ацети- рательного определения месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина лирования в моче и слюне. Это обуславливает необходимость создания изби- в моче и слюне методом ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектрированирательных, чувствительных, высокопроизводительных и доступных для кли- ем, оптимизированы способы их пробоподготовки при высокопроизводительнической практики методов количественного определения ЛВ в биологических ных аналитических определениях тест-препаратов процессов ацетилирования;

жидкостях. Этим требованиям удовлетворяют методы ВЭЖХ и спектрофото- - впервые показана возможность количественного определения месалазиметрии при использовании высокоизбирательных аналитических реагентов. на, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в моче и слюне спектрофотометПрименение комплекса этих методов позволяет решать сложные задачи, воз- рическим методом на основе реакции с 7-хлор- 4,6-динитробензофураксаном;

никающие при проведении фармакокинетических исследований, а также раз- - разработаны способы косвенного определения активности Nрабатывать алгоритмы персонализации фармакотерапии и оценивать влияние ацетилтрансферазы на основе оценки фармакокинетических параметров месаЛВ на активность ферментативных систем метаболизма. лазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина при их экскреции с мочой, Цель работы состояла в разработке методов хроматографического и спек- сульфадиметоксина в слюне с применением ВЭЖХ и спектрофотометрии и трофотометрического определения месалазина и сульфаниламидов в биологи- обосновано их использование для персонализации фармакотерапии;

ческих жидкостях, оценке фармакокинетических параметров при их выведении 5 - комплексом методов биофармацевтического анализа изучена фармакоки- Апробация работы. Результаты работы и основные положения диссертанетика тест-препаратов ацетилирования и окисления при хроническом вирус- ции были доложены и обсуждены на XVII, XVIII Российских национальных ном гепатите В. конгрессах Человек и лекарство (Москва, 2010, 2011), 65 и 66-ой ВсероссийПрактическая значимость. Разработан комплекс методик спектрофото- ской конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2010, 2011), III метрического и хроматографического определения содержания месалазина, Всероссийской конференции с международным участием Аналитика России сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в моче и слюне. На их основе пред- (Краснодар, 2009), ХV Всероссийской научно-практической конференции ложены диагностические подходы для оценки индивидуальной активности Молодые ученые в медицине (Казань, 2010), VII Съезде медицинских генеметаболической системы ацетилирования организма человека, которые могут тиков (Ростов на Дону, 2010), Всероссийской конференции "Аналитическая быть рекомендованы как лабораторные тесты при персонализированном при- хроматография и капиллярный электрофорез" (Краснодар, 2010), III региоменении лекарственных средств. нальной научно-практической конференции с международным участием СинВнедрение результатов. Результаты исследования внедрены во Всерос- тез и перспективы использования биологически активных соединений (Касийском Центре молекулярной диагностики и лечения Министерства здраво- зань, 2011), ХIХ Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Москва) и в град, 2011), III Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезучебный процесс ФГБОУ ВПО Казанский национальный исследовательский ням (Москва, 2011).

технологический университет в дисциплинах Контроль качества лекарст- Публикации: Основные результаты диссертационной работы опубликовенных препаратов и Основы токсикологии. ваны в 17 печатных изданиях, включая 5 статей в рецензируемых изданиях, На защиту выносится: рекомендуемых для размещения материалов диссертаций, 1 статью в междуна- результаты исследования хроматографического разделения месалазина, родном журнале и 11 тезисов докладов.

сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в условиях обращено-фазной ВЭЖХ; Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзо- результаты изучения влияния состава и рН подвижной фазы, условий ра литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исэлюирования, данных по оценке пригодности предложенных хроматографиче- следований, их обсуждения, выводов, заключения, списка литературы, вклюских систем и свойств ЛВ на выбор условий избирательного и чувствительного чающего 261 источник. Работа изложена на 183 страницах машинописного детектирования месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина при их текста, иллюстрирована 38 рисунками и 30 таблицами.

анализе в моче и слюне; ичный вклад автора в опубликованных в соавторстве работах состоит в - обоснование и подбор оптимальных условий чувствительного и избира- выборе и обосновании методик эксперимента, непосредственном его проведетельного спектрофотометрического определения месалазина, сульфаметокса- нии, в участии во всей процедуре анализа и обобщении полученных эксперизола и сульфадиметоксина в виде производных с 7-хлор-4,6- ментальных результатов, расчете фармакокинетических параметров, установдинитробензофуроксаном в слюне и моче, способов пробоподготовки при ко- лении закономерностей и формулировке выводов.

ичественных определениях этих тест-препаратов; Благодарности. Автор работы выражает глубокую благодарность к.х.н.

- результаты исследования метрологических характеристик разработанных Шитовой Н.С. за научные консультации и помощь в фармакокинетических способов определения, полученные путем обработки экспериментального ма- исследованиях и статистической обработке их результатов; д.х.н., профессору териала, подтверждающие их соответствие требованиям, принятым для био- Юсуповой Л.М. за синтез 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана, использованнофармацевтических методов анализа; го в работе; к.х.н. Салахову И.А и провизору-аналитику Хуснутдиновой А.Р. за - результаты расчета и анализа фармакокинетических данных месалазина, помощь в проведении хроматографических исследований.

сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в биологических жидкостях и опти- мизации критериев фенотипирования для экспрессной и точной оценки инди- видуальной активности ферментных систем; СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

- способы определения индивидуальной активности N-ацетилтрансферазы, осВ первой главе описан химизм метаболических процессов ацетилированованных на биофармацевтическом анализе фармакокинетических параметров мения; ферментные системы, участвующие в биотрансформации ксенобиотиков и салазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина;

биофармацевтические подходы по оценки их активности; современные методы - данные по фармакокинетике тест-препаратов ацетилирования и окислеколичественного определения ЛВ в биологических жидкостях человека, а такния при хроническом вирусном гепатите В.

же связь скорости ацетилирования с различными заболеваниями.

7 Во второй главе дано описание объектов, методов и средств исследования ЛВ в биологических жидкостях, схем и методик проведения экспериментов и расчета фармакокинетических параметров, способов статистической обработки результатов.

При выполнении работы были использованы следующие лекарственные средства: субстанция 5-аминосалициловой кислоты (лAlfa Aesar, Germany), месалазин (таблетки по 0,4 г, Сан Фармасьютикал Индастриз Лтд, Индия), субстанция сульфаметоксазола (лSigma-Aldrich, Switzerland), субстанция сульфадиметоксина (лSigma-Aldrich, Switzerland), сульфадиметоксин (таблетки по 0,5 г, OAO Биосинтез, Россия), изониазид (таблетки по 0,3 г, Акрихии, Россия)), субстанция антипирина (лSigma-Aldrich, Germany).

В работе использована система жидкостной хроматографии SHIMADZU (Япония) с программным обеспечением LC Solutin. Для контроля pH мобильной Рис. 1. Схема метаболизма месалазина и его пролекарств фазы использовали pH-метр фирмы Hanna (Румыния). В предварительных испыв организме человека таниях для определения спектров анализируемых веществ использовался сканирующий спектрофотометр SPECORD 40 фирмы AnalitykJena (Германия). Спектрофотометрические измерения также проводили на спектрофотометре СФ-26.

Биофармацевтический анализ мочи и слюны здоровых добровольцев и больных проводился при участии зав. каф. инфекционных болезней КГМУ, д.м.н., профессора Фазылова В.Х. и д.м.н., доцента Кравченко И.Э.

Фармакокинетическая и статистическая обработка результатов проводилась при использовании компьютерных программ Statistika 6, Excel, M-IND и Mathcad 11.

В третей главе приведены результаты разработки методов определения , нм , нм тест-препаратов ацетилирования: сульфаметоксазола и месалазина в моче, Рис. 2. Спектр поглощения сульфади- Рис. 3. Спектр поглощения сульсульфадиметоксина в моче и слюне методом ВЭЖХ и спектрофотометрии.

метоксина (5 мкг/мл) в смеси ацето- фаметоксазола (10 мкг/мл) в смеМесалазин (5-аминосалициловая кислота) и сульфаниламиды (сульфаменитрил - 0,5 % раствор ортофосфор- си ацетонитрил - 0,02 М раствор таксазол и сульфадиметоксин) были использованы в качестве тест-препаратов ной кислоты (15:85 об. %). гидрофосфата натрия pH=6,2 (3:ацетилирования в связи с их широким применением как антибактериальных об. %).

средств, обладающих оптимальной фармакокинетикой (быстрая всасываемость в желудочно-кишечном тракте, создание широкого диапазона концентраций в Рис. 4. Спектр поглощения месабиологических жидкостях), а также потенциальной возможностью оценки гелазина (10 мкг/мл) в смеси ацетонетической детерминированности процессов их метаболизма в моче и слюне.

нитрил - 0,05 % водный раствор Месалазин является активным метаболитом при биотрансформации ряда ЛС трифторуксусной кислоты (10:(cульфасалазин, олсалазин, балсалазид) (рис. 1), что определяет необходимость % об).

, нм персонализации их применения путем оценки фенотипа ацетилирования.

В качестве универсального метода определения тест-препаратов в биоло- гических жидкостях использована ВЭЖХ. Выбранные длины волн позволили Для определения месалазина использовали бинарную ПФ, состоящую из определить каждое из исследуемых соединений на длине волны максимально- смеси ацетонитрила и раствора трифторуксусной кислоты. Этот элюент позвого поглощения или близкой к ней (рис. 2-4). При аналитических длинах волн в ляет хроматографировать 5-аминосалициловую и 4-аминосалициловую (внутусловиях ВЭЖХ также наблюдалось поглощение биогенных компонентов ренний стандарт) кислоты в виде симметричных пиков на обращено-фазном слюны и мочи неустановленной природы в УФ-области спектра (рис. 5-7). сорбенте C16, что объясняется, по видимому, более резким изменением селек9 тивности колонки вследствие модификации силанольных активных центров (Pecosphere C-8 и C18, XTerra RP-18, CYANO) с использованием той же ПФ поверхности. При этом использовали изократическое элюирование, которое разделения достичь не удалось.

является более экономичным и поэтому более предпочтительным при опреде- Правильность ВЭЖХ определений ЛВ в моче и слюне была оценена с ислении одного соединения. пользованием метода введено-найдено, что демонстрирует отсутствие мешающего влияния компонентов мочи на результаты определений (табл. 1).

Рис. 5. Хроматограммы: месалазин (1) и 4-аминосалициловая кислота (2). I - стандартные растворы. II - в моче человека. ПФ: ацетонитрил - 0,05 % раствор Рис. 7. Хроматограммы: сульфаметоксазола (1) и внутреннего стандарта трифторуксусной кислоты (10:90, об. %), скорость потока 1 мл/мин. Discovery антипирина (2). I - стандартные растворы, II - в моче человека. ПФ: ацетонитRP Amide C16 150 4,6 мм, 40С, =300 нм. Содержание аналитов 10 мкг/мл.

рил - 0,02 М гидрофосфат натрия, pH=6,2 (3:97, об.%), 1 мл/мин. Discovery RP Amide C16 150 4,6 мм, 40 С, =269 нм. Концентрация всех аналитов мкг/мл Таблица 1. Результаты определения сульфадиметоксина, сульфаметоксазола и месалазина в биологических жидкостях методом ВЭЖХ (n=6), p=0,Лекарственные Объект Введено, Найдено, RSD вещества анализа мкг/мл мкг/мл 0,50 0,490,02 0,2,00 2,010,06 0,Моча 5,00 5,020,07 0,Рис. 6. Хроматограммы сульфадиметоксина: I - стандартный раствор, II - в 10,00 9,980,07 0,моче человека. ПФ: ацетонитрил - 0,5 % раствор фосфорной кислоты (15:85, Сульфадиметоксин 0,25 0,250,01 0,об. %). Discovery RP Amide C16 150 4,6 мм, 40 С, =270 нм, скорость потока Слюна 0,50 0,500,01 0,1 мл/мин. Концентрация 5 мкг/мл.

2,00 1,980,09 0,Была исследована возможность использования фосфорной кислоты и бу- 5,00 5,030,11 0,ферных растворов на ее основе в качестве элюентов при определении сульфа1,00 0,980,06 0,ниламидов в биологических жидкостях. В этом случае отсутствует поглощение 5,00 4,960,07 0,Сульфаметоксазол Моча компонентов ПФ в области коротких длин волн, что позволяет повысить чув10,00 10,100,08 0,ствительность определений. При использовании ПФ ацетонитрил - 0,5 % фос15,00 14,960,09 0,форная кислота (15:85, об. %), ацетонитрил - 0,02 М гидрофосфат натрия 1,00 1,10,06 0,pH=6,2 (3:97, об. %) на колонке Discovery RP Amide C16 пики ЛВ хорошо раз5,00 4,920,12 0,Месалазин Моча деляются с компонентами мочи. На других обращенно-фазных колонках 10,00 10,100,11 0,15,00 14,920,10 0,11 Количественное определение ЛВ проводилось методом внешнего стандар- В фармацевтическом анализе одним из подходов улучшения аналитичета по площади пика для сульфадиметоксина и внутреннего стандарта для ских свойств ЛВ при спектрофотометрических определениях является получесульфаметоксазола и месалазина. В интервале 0,1 мкг/мл - 20 мкг/мл линейные ние их производных. Сравнительное сопоставление существующих подходов градуировочные зависимости аналитического сигнала от содержания иссле- позволило выявить перспективу использования реакций ЛВ, содержащих дуемых ЛВ записываются следующим образом: аминные функциональные группы с хлординитрозамещенными бенз-2,1,3для сульфадиметоксина S (mAU*s)=1,504Cx (мкг/мл) (R2 = 0,9999, n = 15, оксадиазола. Среди них - 7-хлор-4,6-динитробензофуроксан (ХБФО), обла% RSD=0,68); дающий высокой реакционной способностью и контрастностью полос поглодля сульфаметоксазола S(mAU*s) = 0,775CX (мкг/мл) (R2 = 0,9999, n = 15, щения с ариламинами. ХБФО был использован в работе для определения меса% RSD=1,63); лазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в моче и слюне. Было устадля месалазина S(mAU*s) = 2,119CX (мкг/мл) - 5,285 (R2 = 0,9999, n = 15, новлено, что исследованные ЛВ образуют азот-углерод связанные, интенсивно % RSD=1,54). окрашенные продукты аналитических реакций Оценка ключевых показателей валидационных параметров предложенных условий разделения выявила перспективу их использования для определения сульфадиметоксина, сульфаметоксазола и месалазина в биологических жидкостях (табл. 2).

Таблица 2. Результаты валидации методик определения лекарственных веществ в моче и слюне методом ВЭЖХ Сульфа- СульфаПараметры Критерии Месалазин диметоксин метоксазол Rs1,5 Rs=2,0 Rs=1,8 Rs=1,Пригодность N не менее хроматографи- 2000 т.т. N=3000 т.т. N=2842 т.т. N=2780 т.т.

ческой системы Симметрия Максимумы поглощения производных ЛВ находятся в интервале 480-5пика: 0,8 - 2,0 1,39 1,34 1,нм, при этом их положение и интенсивность определяются природой раствоСпецифичность Полное разделение пиков рителя и рН среды (рис. 8,9). Было установлено, что добавки органических Линейность R2 не менее R2=0,9999 R2=0,9999 R2=0,9999 растворителей при проведении реакции влияют на устойчивость продуктов и калибровки 0,9интенсивность их полос поглощения, что может быть связано с обеспечением Интервал оптимальной растворимости продуктов реакции и степени ее завершения.

определяемых - 0,1-20 0,1-20 0,1-20 Была изучена возможность определения тест-препаратов в биологических содержаний, жидкостях. Как пример, на рис. 10 представлены спектры поглощения раствомкг/мл ров реагента, его смеси с образцом мочи и продукта аналитической реакции с Метод введесульфадиметоксином. Из представленных спектрально-аналитических данных Правильность но-найдено %RSD=2,25 %RSD=2,25 %RSD=3,видно, что в условиях анализа при = 490-500 нм влияние реагента и мочи на %RSDполосы поглощения продукта реакции весьма незначительно. Его можно поПредел ностью исключить, включив эти компоненты в состав раствора сравнения при обнаружения, - 0,03 0,03 0,спектрофотометрическом детектировании, а также возможно использование мкг/ мл трихлоруксусной кислоты для удаления мешающих компонентов в моче.

Метод Метод Метод Таким образом, такое изменение пробоподготовки позволяет проводить Воспроизводи- внешнего внутреннего внутреннего избирательные и чувствительные спектрофотометрические определения суль%RSDмость стандарта, стандарта, стандарта, фаниламидов и месалазина в биологических жидкостях.

%RSD=0,68 %RSD=1,63 %RSD=1,13 Рис. 12. Устойчивость продукта 7-хлор- Рис. 13. Влияние концентрации Рис. 8. Спектры поглощения 4,6- Рис. 9. Спектры поглощения 4,64,6-динитробензофуроксана (1,510-4М) с реагента на аналитический сигнал динитробензофуроксановых производ- динитробензофуроксановых промесалазином в смеси ДМСО-вода (5:95 при проведении реакции с месаланых сульфадиметоксина (4.10-5 М): 1 - изводных месалазина (3.10-5 М): зином (310-5М) в смеси диметилоб.) во времени, =500 нм, pH=6,8, l=1 см этанол-вода (50:50, об.%); 2 - то же - в воде; 2 - этанол-вода (30:70, об.

сульфоксид-вода (5:95 об. %), (30:70, об. %); 3 - ацетонитрил-вода %), 3 - ацетонитрил-вода (30:70, =500 нм, pH=6,8, l=1 см (30:70, об.%); 4 - диметилсульфоксид- об.%), 4 - диметилсульфоксидвода (5:95, об.%); 5 - этанол-вода (5:95, вода (30:70, об. %), 5 - то же Правильность спектрофотометрических определений сульфадиметоксина, об.%); 6 -в воде, pH=6,8, l=1 см (5:95, об. %), pH=6,8, l=1 см сульфаметоксазола и масалазина в биологических жидкостях была оценена методом введено - найдено. Полученные данные показывают, что при выбранных условиях детектирования компоненты мочи и слюны не оказывают мешающего влияния на спектрофотометрические определения аналитов (табл.

3).

Оценка ключевых показателей валидационных параметров предложенных условий спектрофотометрического анализа выявила перспективу их использования для определения сульфадиметоксина, сульфаметоксазола и месалазина в биологических жидкостях (табл. 4).

Рис. 10. Спектры поглощения: 1 - Рис. 11. Зависимость оптической плотХБФО (1,510-4 М) в ацетонитриле, 2 - ности от рН при проведении реакции Таблица 3 Результаты определения лекарственных веществ в биологичекомпоненты мочи и ХБФО (1,510- 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана ских жидкостях методом введено-найдено (n=5, р=0,95) М) в присутствии трихлоруксусной (1,510-4М) и сульфаметоксазола (310-Лекарственные Объект Введено, Найдено, кислоты (10-2М), 3 - динитробензо- М) в воде, =490 нм, l=1 см RSD вещества анализа мкг/мл мкг/мл фуроксановое производное сульфа3,12 3,040,10 0,метоксазола (310-5 М) в воде, pH=6, Моча 6,24 6,120,19 0,8, l=1 см 9,36 9,270,17 0,Сульфадиметоксин Для выбора оптимальных условий определений изучено влияние кислот- 4,68 4,640,15 0,ности реакционной среды, концентрации реагента и устойчивости производ- Слюна 7,80 7,820,10 0,ных во времени. Как видно, наиболее полное образование производного и мак10,92 10,950,10 0,симальная интенсивность светопоглощения наблюдается в интервале pH 6-1,28 1,270,07 0,при двух и более кратном избытке реагента (рис. 11-13). Светопоглощение 2,56 2,360,09 0,Сульфаметоксазол Моча аналитической смеси повышается первые 3 мин. В течение дальнейших трех 5,12 5,100,12 0,часов величина оптической плотности сохраняется на одном уровне, что де7,68 7,720,07 0,монстрирует устойчивость производных во времени.

0,32 0,350,02 0,0,77 0,810,03 0,Месалазин Моча 1,53 1,500,04 0,4,6 4,620,07 0,15 Таблица 4. Результаты валидации методик спектрофотометрического определения лекарственных веществ в моче и слюне Сульфади- СульфамеПараметры Критерии Месалазин метоксин токсазол Контрастность Не менее полос поглоще- 90 80 70 Рис. 14. Фармакокинетические кривые Рис. 15. Фармакокинетические ния, нм кумулятивной экскреции сульфадиме- кривые кумулятивной экскреции Стабильность,час - 3 3 токсина с мочой после перорального сульфаметоксазола с мочой после Правильность %RSD 6 %RSD = 3,04 %RSD = 2,84 %RSD = 2,однократного приема в дозе 0,5 г: 1- перорального приема в дозе 0,4 г:

R2 = 0,999 R2 = 0,995 R2 = 0,9быстрый фенотип; 2- медленный фено- 1-быстрый фенотип; 2- медленный Линейность и R2 не менее А=0,1594Сх А = 0,08Сх А = 0,147Сх тип ацетилирования фенотип ацетилирования калибровочная 0,990 (мкг/мл) + (мкг/мл) + (мкг/мл) + кривая 0,0012 0,034 0,00Были рассчитаны фармакокинетические параметры кумулятивного вывеИнтервал опредения сульфадиметоксина, сульфаметоксазола и месалазина с мочой. Для быделяемых содер- - 0,32 - 4,6 0,312 - 9,36 0,512 Ц5,стрых ацетиляторов характерны более низкие значения площади под фармакожаний, мкг/мл кинетической кривой, времени полувыведения ЛВ и более высокие значения Предел обнаруконстанты элиминации, объема распределения, чем для медленных ацетилято- 0,1 0,09 0,жения, мкг/мл ров (табл. 5-7). Разница в периоде полувыведения и количестве выводимого 103 2,4.104 2,5.104 3,8.1, л. мол-1. см-препарата для пациентов одной и той же группы объясняется, по-видимому, вариациями функционального состояния желудочно-кишечного тракта и друПолученные результаты позволяют сделать вывод о значительных прегими факторами среды.

имуществах разработанных методик определения тест-препаратов в биожидкоНа рис. 17 представлено содержание сульфадиметоксина в слюне. Устастях перед другими, уже известными из литературы. Это связано, прежде всеновление фенотипа ацетилирования возможно путем анализа почасовых проб го, с быстротой, точностью, прецезионностью анализа и возможностью его слюны через 24 час после приема тест-препарата. Полученные кинетические широкого клинического использования.

данные по моче и слюне коррелируют между собой.

С помощью комплекса разработанных методик обследованы здоровые добровольцы и оценено их распределение на медленный и быстрый фенотипы.

По нашим данным соотношение ацетиляторных фенотипов у здоровых добровольцев составляет 55% медленных и 45% быстрых ацетиляторов, что согласуется со сведениями из литературы. По этим результатам рассчитаны фармакокинетические параметры (табл. 5-7). Контрольное определение фенотипа ацетилирования у здоровых добровольцев проводилось с помощью тест-препарата изониазида.

Полученные данные позволяют использовать в качестве критерия для фенотипирования ацетилирования указанные параметры, из которых наиболее Рис. 16. Фармакокинетические кривые Рис. 17. Уровень содержания сульудобным является оценка фракции дозы тест-препарата.

кумулятивной экскреции месалазина с фадиметоксина в слюне после пероФармакокинетические кривые кумулятивной экскреции ЛВ с мочой примочой в разовой дозе 800 мг в виде рального однократного приема в ведены на рис. 14-16. Как видно, установление количества ЛВ позволяет сулекарственной формы месакола: 1 - дозе 500 мг. 1 - быстрый фенотип, 2-.

дить о фенотипе ацетилирования обследуемых. При этом уровень выводимого быстрый фенотип; 2-медленный фе- медленный фенотип ацетилирования ЛВ для быстрых и медленных ацетиляторов различается более чем в два раза.

нотип ацетилирования 17 Таблица 5. Фармакокинетические параметры экскреции сульфадиметокси- В четвертой главе описаны взаимоcвязи скорости окисления и ацетилирона с мочой (доза 0,5 г) у здоровых добровольцев (MeanSD) вания тест-препаратов метаболизма при хроническом вирусном гепатите В (ХВГВ). По имеющимся литературным данным соотношение фенотипов в разФенотип ацетилирования Параметр P* ных этнических группах отличается, поэтому при формировании группы приБыстрый Медленный давалось значение ее однородности, которую составляли лица европейской Число добровольцев 20 популяции, проживающие в Республике Татарстан. При этом быстрое ацетиАктивность NАТ (фракция лирование является преобладающим (67 %), что свидетельствует об предрас4,20,7 9,91,8 P<0,0дозы изониазида, %) положенности лиц с быстрым фенотипом к ХВГВ и согласуется с литературP<0,AUC, мкгч/мл 242505060 5437672ными данными (рис. 18, табл. 8).

Kel, ч-1 P<0,0,1300,014 0,070 0,0Vd, мл

0,205 66 146Фракция дозы сульфадиме6,40,7 13,31,4 P<0,0токсина за 24 часа, % Таблица 6. Фармакокинетические параметры экскреции сульфаметоксазола с мочой (доза 0,4г) у здоровых добровольцев (MeanSD) Фенотип ацетилирования Параметр P* Быстрый Медленный Число добровольцев 20 Активность NАТ (фрак- Рис. 18. Соотношение фенотипов ацети- Рис. 19. Соотношение фенотипов окис3,90,4 9,10,8 P<0,0ция дозы изониазида, %) лирования: 1 - больные ХВГВ (n=24), 2 - ления: 1 - больные ХВГВ (n=24), 2- здоздоровые добровольцы (n=110) ровые добровольцы (n=40) P<0,AUC, мкгч/мл 131041772 4221773Kel, ч-1 P<0,0,360,03 0,19 0,Больные ХВГВ по активности цитохромов P450 распределяются на две T1/2, ч P<0,2,010,21 5,000,фенотипические группы (рис. 19): средний (37%) и медленный фенотип окисVd, мл

0,84 24 94ления (63%) в сравнении со здоровыми, которые распределяются тримодально:

Фракция дозы сульфаме4,40,7 9,42,4 P<0,05 быстрый (21%), средний (43%) и медленный фенотип (36%). У больных ХВГВ токсазола за 8 часов, % с увеличением длительности и прогрессирования заболевания замедляется элиминация тест-препарата окисления антипирина. Активность NАТ у больТаблица 7. Фармакокинетические параметры экскреции месалазина с ных ХВГВ в группах медленных и средних фенотипов окисления не имеет стамочой (доза 0,8г) у здоровых добровольцев (MeanSD) тистически значимых различий.

Фенотип ацетилирования Параметр P Таблица 8. Фармакокинетические параметры тест-препарата Быстрый Медленный ацетилирования изониазида у больных ХВГВ (p<0,001) Число добровольцев 18 Активность NАТ (фракция Фармакокинетические Быстрое ацетили- Медленное аце3,10,2 9,41,4 P<0,0дозы изониазида, %) параметры рование (n=16) тилирование(n=8) P<0,0AUC, мкгч/мл 121233941 2947777Площадь под фармакокинетиче244902300 91500132Kel, ч-1 P<0,00,5500,063 0,401 0,0ской кривой (AUC), мкгч/мл T1/2, ч P<0,01,300,10 1,730,090 Константа элиминации, ч-0,45380,0140 0,23610,0Vd, мл P<0,129 42 7115 Время полувыведения (T1/2), ч 1,370,68 4,880,Фракция дозы месалазина Объем распределения, мл 90,726,2 33,73,1,60,5 3,70,9 P<0,0за 10 часов, % 19 достигают 0,03 мкг/мл при диапазоне определяемых содержаний от 0,1 до У больных ХВГВ не наблюдается быстрый фенотип окисления (табл. 9), мкг/мл.

что возможно, обусловлено уменьшением количества соответствующих суб3. Установлены рабочие условия спектрофотометрического определения стратов и нарушением баланса между способностью медленных окислителей месалазина и сульфаниламидов в моче и слюне в виде окрашенных производбыстро ацетилировать вещества, а быстрых окислителей медленно их ацетилиных с 7-хлор-4,6-динитробензофуроксаном ( 490-500 нм) с пределами обнаровать. Для оптимизации эффективности применения противовирусных и геружения 0,09; 0,1; 0,16; мкг/мл для сульфадиметоксина, месалазина и сульфапатопротекторных ЛС, подвергающихся ацетилированию и окислению, рекометоксазола соответственно. Выявлены факторы регулирования избирательномендуется определение фенотипов ацетилирования и окисления у больных сти, чувствительности и экономичности определений лекарственных веществ в ХВГВ.

биологических жидкотях подбором состава среды, устойчивости во времени, а также направленным изменением спектральных характеристик производных Таблица 9. Фармакокинетические параметры антипирина у больных ХВГВ определяемых веществ.

по оценке его содержания в слюне (per os в дозе 0,6 г) (MeanSD) (p<0,05) 4. Разработаны методики биофармацевтического анализа активности Nацетилтрансферазы на основе оценки фармакокинетических параметров месаСредний фе- Медленный Фармакокинетический параметр, лазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина при их экскреции с мочой и нотип окис- фенотип окисразмерность сульфадиметоксина в слюне методами ВЭЖХ и спектрофотометрии, обосноления (n=9) ления (n=15) вано их использование для персонализации фармакотерапии.

Константа скорости элиминации, час-1 0,3320,021 0,1540,5. Методами биофармацевтического анализа изучена фармакокинетика Константа скорости накопления препарата 0,5560,036 0,5420,0тест-препаратов ацетилирования и окисления при хроническом вирусном гепав крови, час-тите В. При этом преобладает быстрый фенотип ацетилирования (67%) и по Объем распределения, л 68,32,8 45,01,фенотипу окисления происходит перераспределение на средний (37%) и медМаксимальная концентрация препарата в 4,740,6 9,040,88 ленный (63%) типы. Установлена прогностическая значимость этих биофармаслюне, мкг/мл цевтических тестов для коррекции применения лекарственных средств при Период полуэлиминации препарата, час 3,150,33 7,230,вирусном гепатите В.

Клиренс, мл/час 201282100 45227Площадь под кривой концентрацияПубликации в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, 363 109время (AUC), мкгчас/мл рекомендованных для размещения материалов диссертаций:

* Примечание: P - статистический уровень значимости различий между показателями быстрого и медленного фенотипов ацетилирования; Mean - 1. Гармонов, С.Ю. Спектрофотометрическое определение 5средняя величина; SD - среднеквадратичное отклонение.

аминосалициловой кислоты в моче для оценки ее экскреции из организма человека / C.Ю. Гармонов, Нгуен Чунг Зунг, И.Ф. Мингазетдинов, Л.М. Юсупова, Н.С. Шитова, Р.Н. Исмаилова, В.Ф. Сопин// Вестник Казанского технолоВЫВОДЫ гического университета.-2010. - №10. - С. 57- 63.

1. Обоснованы и установлены условия чувствительного и избирательного 2. Гармонов, С.Ю. Индукционное влияние ксимедона на активность микопределения месалазина и сульфаметоксазола в моче, сульфадиметоксина в росомальных оксидаз печени человека / C.Ю. Гармонов, Н.С. Шитова, А.В.

моче и слюне методом обращенно-фазной ВЭЖХ со спектрофотометрическим Жарехина, В.И. Погорельцев, Нгуен Чунг Зунг, Т.А. Киселева, И.Е. Зыкова, детектрированием. Выявлено влияние состава подвижных фаз, их рН, содерИ.Э. Кравченко // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической жания в них неводного компонента, режимов элюирования на разделение лехимии. - 2010. - №4. - С. 34-38.

карственных веществ.

3. Гармонов, С.Ю. Методы оценки и регуляция активности генетически 2. Валидационные параметры при определении месалазина и сульфаметокдетерминированных метаболических ферментных систем организма человека / сазола в моче, сульфадиметоксина в моче и слюне соответствует современным С.Ю. Гармонов, И.Э. Кравченко, Нгуен Чунг Зунг, И.Ф. Мингазетдинов, В.Х.

требованиям к пригодности хроматографической системы. Определение харакФазылов // Биомедицина. - 2010. - №3. - С. 39-41.

теризуются высокой селективностью (более 1,2), разрешением (более 1,5) и симметрией пиков (менее 1,5). Пределы детектирования исследуемых веществ 21 4. Гармонов, С.Ю. Установление фенотипа ацетилирования на основе Л.М. Юсупова, В.Ф. Сопин, С.Ю. Гармонов // Тезисы докладов ХIХ Менделеспектрофотометрического определения сульфадиметоксина в моче / C.Ю. Гар- евского съезда по общей и прикладной химии.- Волгоград, 2011.- С.376.

монов, Нгуен Чунг Зунг, Л.М. Юсупова, Р.Н. Исмаилова, В.Ф. Сопин // Вест- 9. Гармонов, С.Ю. Спектрофотометрическое определение месалазина в ник Казанского технологического университета.-2011.- №19. С.18-24. моче и изучение его экскреции из организма человека / С.Ю. Гармонов, Нгуен 5. Гармонов, С.Ю. Спектрофотометрическое определение месалазина в Чунг Зунг, И.Ф. Мингазетдинов, Г.А. Абдурахимова // Сборник научных трумоче как тест для оценки фенотипа ацетилирования организма человека / С.Ю. дов: УРазработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукГармонов, Нгуен Чунг Зунг, И.Ф. Мингазетдинов, Л.М. Юсупова, Н.С. Шито- цииФ. - Пятигорск, 2011.- Вып. 66.-С. 375.

ва, Р.Н. Исмаилова, В.Ф. Сопин // Химико-фармацевтический журнал. - 2011. - 10. Гармонов, С.Ю. Персонализированный прием ксимедона в качестве Т. 45.- №12.-С. 48-51. индуктора системы микросомальных оксидаз / С.Ю. Гармонов, И.Э. Кравчен ко, Нгуен Чунг Зунг // Материалы XVIII Российского национального конгресСтатьи и материалы конференций: са "Человек и лекарство". - Москва, 2011.-С.502.

11. Гармонов, С.Ю. Оценка активности метаболических ферментных сис1. Nguyen Trung Dung. Determination of mesalazine in human urine by HPLC / тем у больных стрептококковыми ангинами с целью персонализации лечения / Nguyen Trung Dung, S.Yu. Garmonov // Viet Nam Journal of Science and С.Ю. Гармонов, Нгуен Чунг Зунг, А.В. Жарехина, И.Э. Кравченко // МатериаTechnology.-2011.-V.49.-№.3A.-P.259-265.

ы III Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. - 2. Гармонов, С.Ю. Методы биофармацевтического анализа метаболичеМосква, 2011. Том. 9 - прилож. 1.-C.188.

ских ферментных систем организма человека / С.Ю. Гармонов, Н.С. Шитова, 12. Нгуен Чунг Зунг. Лекарственный препарат месалазин как тест-маркер А.В. Жарехина, Нгуен Чунг Зунг, Т.А. Киселева // Материалы III Всероссийдля оценки фенотипа ацетилирования организма человека / Нгуен Чунг Зунг, ской конференции с межд. участием "Аналитика России".- Краснодар, 2009.- Г.А. Абдурахимова, А.Р. Акбирова, Р.Т. Рыспаева, Л.М. Юсупова, С.Ю. ГарС.384.

монов // Тезисы докладов III региональной научно-практической конференции 3. Гармонов, С.Ю. Индукционное влияние ксимедона на активность микс международным участием Синтез и перспективы использования биологичеросомальных оксидаз печени человека / С.Ю. Гармонов, Н.С. Шитова, А.В.

ски активных соединений. Казань: КГМУ, 2011. С. 64-65.

Жарехина, Нгуен Чунг Зунг // Тезисы докл. 65-ой Всероссийской конференции по фармации и фармакологии. - Пятигорск, 2010.- С.44. Салахов, И.А. Унифицированные подходы к контролю качества лекарСоискатель ственных средств методом ВЭЖХ / И.А. Салахов, Г.Р. Нурисламова, Нгуен Чунг Зунг, И.Ф. Мингазетдинов, Э.А. Иртуганова, C.Ю. Гармонов // Материалы Всероссийской конференции "Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез". - Краснодар, 2010.-С.159.

5. Гармонов, С.Ю. Методы диагностики групп риска пациентов при исНгуен Чунг Зунг пользовании маркеров ацетилирования и окисления / С.Ю. Гармонов, Н.С.

Шитова, Нгуен Чунг Зунг, Т.А. Киселева, В.Ф. Сопин // Тезисы докладов XVII Рос. нац. конгресса "Человек и лекарство". - Москва, 2010.-С.75.

6. Киселева, Т.А. Фармакогенетический анализ метаболических ферментных систем организма человека / Т.А.Киселева, Нгуен Чунг Зунг // Тезисы докладов XV юбилейной Всероссийской научно-практической конференции "Молодые ученые в медицине".- Казань, 2010.-С.234.

7. Нгуен Чунг Зунг. Оценка и регуляция активности генетически детерминированных метаболических ферментных систем организма человека / Нгуен Чунг Зунг, Т.А. Киселева, Н.С. Шитова, А.В. Жарехина, С.Ю. Гармонов // Материалы VII Съезда медицинских генетиков.-Ростов на Дону, 2010.-С396.

8. Нгуен Чунг Зунг. Хроматографическое и спектрофотометрическое определение месалазина в моче человека / Нгуен Чунг Зунг, И.Ф. Мингазетдинов, Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по разным специальностям