Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Попова Светлана Валентиновна
ПРИМЕНЕНИЕ НАТИВНЫХ И ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ
АНТИГЕНОВ В КАЧЕСТВЕ БИОЛИГАНДОВ В ГИДРОЗОЛЬНЫХ ПРЕПАРАТАХ ДЛЯ ЭКСПРЕССНОЙ ИММУНОДИАГНОСТИКИ
03.01.06 - биотехнология
(в том числе и бионанотехнологии)
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва - 2012
Работа выполнена в ГБОУ ВПО Кировская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития РФ (ГБОУ ВПО КГМА).
Научный руководитель: доктор технических наук, профессор
Мешандин Алексей Гаврилович
Официальные оппоненты:
Гаврилов Владимир Андреевич - доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина, профессор кафедры биотехнологии.
Виха Галина Васильевна - доктор биологических наук, некоммерческая организация учреждение (НОУ) Институт диагностики и профилактики социально значимых заболеваний, заместитель директора по науке.
Ведущая организация: ФГБОУ ВПО Удмуртский государственный университет, г. Ижевск.
Защита состоится л____ 2012 г. в часов на заседании Диссертационного Совета Д 220.042.01 при ФГБОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23 (ФГБОУ ВПО МГАВМиБ); тел. (495) 377-93-83.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО МГАВМиБ
Автореферат разослан л _____________ 2012 года
Ученый секретарь диссертационного
совета, профессор Грязнева Т. Н.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Наметившиеся новые тенденции в медицине XI века ориентированы на профилактику и выявление ранних нарушений показателей здоровья, поэтому в настоящее время требуется новая тактика лабораторных исследований и необходима диагностика, позволяющая выявлять контингенты повышенного риска патологий, методические приемы, в том числе упрощенные для массовых исследований и контроля реабилитации. Наиболее перспективной является разработка новых высокоинформативных чувствительных и специфичных способов диагностики. При этом особое место должно отводиться методам профилактического обследования населения с целью раннего выявления заболевания, что диктует необходимость повышения требований к показателям диагностической эффективности скрининговых тестов (Дмитриев Г.А., Фриго Н.В., 2004; Лосева О. К., Ловенецкий А.Н., 2002).
Следовательно, актуальны простые по исполнению методы, позволяющие обнаружить причинные антигены и маркеры в минимальных и следовых количествах в большом объеме анализируемых образцов в различных стадиях течения заболевания. В сфере первичной помощи пациентам экспресс-диагностика может существенно улучшить исходы заболеваний за счет более широкого скрининга с целью выявления пациентов, которые нуждаются в применении специального обследования, а также за счет систематического мониторинга (включая самомониторинг) эффекта лечебных мер у амбулаторных больных.
Таким образом, основным предметом нашего исследования стали изучение применения нативных и рекомбинантных антигенов, в качестве биолигандов в гидрозольных препаратах для экспрессной иммунодиагностики.
Цель работы. Разработка и апробация нового оригинального экспресс метода с применением нативных и генно-инженерных антигенов в реакции гидрозольной агглютинации для выявления антител к вирусам гепатита псовых, птичьего гриппа, к микобактериям туберкулёза, детекции хорионического гонадотропина человека в тесте на беременность.
Задачи исследования:
- Разработать гидрозольные антигенные диагностикумы для выявления антител к вирусу гепатита псовых, птичьего гриппа, M.tuberculosis.
- Изучить возможность применения гидрозольных диагностикумов с нативными и генно-инженерными антигенами с целью обнаружения антител в исследуемом материале.
- Разработать гидрозольный антительный диагностикум для выявления антигена хорионического гонадотропина человека (ХГЧ).
- Определить диагностическую ценность реакции гидрозольной агглютинации для диагностики ряда заболеваний.
Научная новизна работы. Впервые разработана технология получения гидрозольных препаратов на основе коллоидных растворов оксида железа (Fе3O4) и гексацианферрата (II) железа (III), проведена их сравнительная характеристика. Доказана целесообразность и эффективность их применения для детекции в исследуемом материале:
- Антител к вирусу гепатита псовых.
- Антител к вирусу птичьего гриппа.
- Антител к M. tuberculosis.
- Антигена хорионического гонадотропина человека (ХГЧ).
Научно-практическая значимость работы. На основании полученных результатов исследования осуществлён синтез основных реагентов для экспресс-тестов, показана простота и экономичность постановки анализа, достаточная чувствительность и специфичность реакции гидрозольной агглютинации в выявлении антител к вирусам гепатита псовых, птичьего гриппа, M. tuberculosis, антигена хорионического гонадотропина человека, что позволяет рекомендовать разработанные нами экспресс-тесты для использования в ветеринарии и медицинской практике.
Апробация работы. Результаты работы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на научных и научно - практических конференциях: V съезде общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова (Москва, 2008); XI межрегиональной научно-практической конференции молодых учёных и студентов с международным участием Молодёжь и медицинская наука в XXI веке (Киров, 2009); IV Всероссийской итоговой студенческой научной конференции (Самара, 2010); V Международной (XIV Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2010).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из которых 4 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждений, выводов, практических предложений, списка использованной литературы (105 источников, из них 27 - иностранных авторов), приложений. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц, 8 рисунков.
Основные положения, выносимые на защиту:
- Реакция гидрозоля, нагруженного соответствующим антигеном, может быть использована для обнаружения антител к вирусу гепатита у собак, вирусу H5N1 птичьего гриппа, M. Tuberculosis.
- Реакция гидрозоля, нагруженного мышиными моноклональными антителами к бета-субъединице ХГЧ, может быть использована для обнаружения антигена хорионического гонадотропина человека в тесте на беременность.
- Реакция гидрозольной агглютинации при выявлении в сыворотке крови и капиллярной крови антител к M. Tuberculosis по своим основным характеристикам не уступает традиционным микробиологическим методам.
- Гидрозоль на основе гексацианферрат (II) железа (III) обеспечивает наиболее оптимальный комплекс иммунохимических свойств разработанных тестов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Работа выполнена на кафедре общей химии ГБОУ ВПО КГМА в период с 2007 по 2012 г.г. Ряд исследований проведены на базах ОАО НПП АВИВАК (С.-Петербург); НИИ Гриппа РАМН (С.-Петербург); клинических лабораторий больниц: ФГУ ЛИУ - 12 по Кировской области и КОГБУЗ Кировской областной клинической больницы.
Объектами исследований являлись гидрозольные реагенты, используемые в реакции гидрозольной агглютинации (РГЗА).
Для исследования нами были изготовлены гидрозоли, нагруженные нативными и генно-инженерными антигенами (с целью выявления антител в сыворотке крови) и мышиными моноклональными антителами к бета-субъединице ХГЧ (с целью обнаружения антигена), состав которых был следующим:
I. Твёрдофазные носители (табл. 1):
Таблица 1- Твердофазные носители в качестве основы для гидрозольных диагностикумов
№ | Тип пигмента, формула | Плотность, г/см3 | Размер частиц, нм | Цвет |
1. | Гексацианоферрат (II) железа (III) или берлинская лазурь Fe4[Fe(CN)6] 3 | 1,92 | 80-200 | Синий |
2. | Оксид железа Fe3O4 | 4,73 | 200-500 | Коричневый |
II. Модификатор для твердой фазы гидрозольных диагностикумов HgCl2.
III. Биолиганды (табл. 2):
Таблица 2- Биолиганды, использованные в РГЗА
№ | Тип биолиганда | Область применения |
1. | изат антигенов гепатита псовых (Киров, ГСХА) | Для диагностики инфекционного гепатита у животных. |
2. | Антигены вирусов гриппа (H5N1) (вируса птичьего гриппа), производства НИИ гриппа РАМН, Санкт - Петербурга | Для диагностики птичьего гриппа |
3. | Рекомбинантные антигены туберкулёза, полученные с помощью генно-инженерных технологий (BL(DT3)/pCFP-ESAT), Покровский завод биопрепаратов, Владимирская область | Для диагностики туберкулёза |
4. | Комплексный туберкулезный антиген - диагностикум ППД производства Санкт - Петербургского НИИ вакцин и сывороток им. Мечникова | Для диагностики туберкулёза |
5. | Моноклональные антитела к бета-субъединице хорионического гонадотропина, ООО Прогрес-сивные биомедицинские технологии, Москва | Для диагностики беременности у женщин |
Методика по изготовлению гидрозолей для исследования состояла из нескольких этапов. Сначала выполняли синтез твёрдых фаз: Fe4 [Fe(CN)6]3 и Fe3O4. Далее твёрдые фазы модифицировали 2% НgСl2, после чего осуществляли хемосорбцию исследуемых биолигандов.
Объекты исследований. Для исследования в качестве биологических материалов использовали гепаринизированную кровь подопытных привитых и непривитых животных, сыворотки крови больных людей с верифицированным диагнозом, сыворотки крови и мочу беременных женщин, сыворотки крови и мочу здоровых доноров в объёме 8 - 20 мкл. Сыворотку получали путём центрифугирования крови, допускалось взятие крови капиллярным способом.
Принцип реакции гидрозольной агглютинации (РГЗА) заключался в следующем: протекающая на молекулярном уровне реакция взаимодействия антигена с антителами должна приводить к развитию явлений, доступных наблюдению невооружённым глазом. Эту задачу удаётся решить, опираясь на факты множественности антигенных детерминант, а также на наличие двух областей связывания антигена у каждой молекулы антитела. Если частицы нагрузить антителами, то в силу бивалентности антител происходит их связывание или агглютинация. Образование даже небольших агрегатов приводит к их быстрому и хорошо заметному осаждению из суспензии. При смешивании разбавленных сывороток или крови с взвесью таких поливалентных частиц даже ничтожная концентрация антигена достаточна для возникновения заметной агглютинации. Она обнаруживает себя тем, что частицы не оседают на сферическое дно лунки планшета в виде маленького сгустка, а выстилает ровным слоем всю поверхность твёрдой фазы (лунок планшета). При визуализации реакции на фильтровальной бумаге красная лента мы получали следующую картину: при положительной реакции - плотный, компактный комплекс с чёткой границей; при отрицательной реакции - распределение частиц реагирующих веществ без чёткой границы в виде пятна.
Для постановки РГЗА использовали U-образные иммунологические планшеты, в лунках которых разводили и титровали сыворотки крови, капиллярную кровь, мочу брали без разведения. Затем вносили равные аликвоты гидрозоля, перемешивали с помощью пипеточного дозатора. Через 5-10 минут осуществляли регистрацию результатов в планшете и на пористом носителе - фильтровальной бумаге (рис. 1, 2).
U-образный планшет
1:25
1:50
1:100
1:200
1:400
1:800
1:1600
А Б
А Б
Рис. 2. Визуализация результатов на фильтровальной бумаге
А - отрицательная сыворотка, Б - положительная сыворотка
Для сравнения мы применяли следующие референс-методы: микробиологические методы (микроскопия мазка и культуральный метод); хемилюминисцентный метод (анализатор CENTAUR); иммунохроматографический экспресс - метод (ИМХР) (тест-полоски с коллоидным золотом в качестве метки).
Полученные результаты обработаны статистическими методами. При сравнении качественных признаков применялся критерий Мак-Нимара, при помощи метода распределения 2 (хи-квадрат) определяли теоретическую частоту положительных результатов эксперимента при равномерном распределении. Для выявления вида зависимости титра от концентрации применялся регрессионный анализ. Для определения диагностической ценности тестов использованных в работе, рассчитаны операционные характеристики: диагностическая чувствительность (Se), диагностическая специфичность (Sp). Для расчета использованы следующие формулы: Se =а/(а+с)100%, Sp =d/(d+b)100%, где а Ц истинноположительный результат, b - ложноположительный результат, с Ц ложноотрицательный результат, d Ц истинноотрицательный результат (J. Geerling, 1998).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследование гидрозольных препаратов в задачах выявления
антител к вирусу гепатита псовых в сыворотке крови
Для определения эффективности РГЗА при диагностике вирусного гепатита у собак с применением двух гидрозолей нами была изучена частота обнаружения сывороточных антител и их уровень у 5 непривитых и 6 привитых собаках спустя 3-9 месяцев после прививки (образцы крови были предоставлены ветеринарной клиникой г. Кирова). Первый антигенный гидрозольный диагностикум взят на основе гексацианферрата II железа III (Fe 4 [Fe(CN) 6] 3), или берлинская лазурь, второй - оксида железа (Fe3O4), на поверхности которых адсорбировали антиген вируса гепатита псовых в соотношении 10 мкг антигена по белку (1мг/мл) на 1 мл исходного гидрозоля (по выше указанной методике). Таким образом получали гидрозоли, с которыми проводили реакцию гидрозольной агглютинации. Подлежащую тестированию гепаринизированную кпиллярную кровь собак (8 мкл) титровали с двойным шагом в лунках U-образных полистирольных планшетов. Далее в лунки вносили по 20 мкл гидрозоля, содержимое перемешивали с помощью пипеточного дозатора. Затем учитывали результат: в лунках самого планшета в интервале от 0,5 до 5 минут и на фильтровальной бумаге, путем переноса по 5 мкл смеси кровь+гидрозоль на фильтровальную целлюлозную бумагу с подложкой. Для эксперимента брали разведения: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600. Данные полученных серопозитивных и серонегативных результатов в РГЗА представлены в табл. 3.
Таблица 3- Выявляемость антител к вирусу гепатита псовых в сыворотке
крови привитых собак с гидрозольными препаратами
| Объекты исследования | Гидрозольные препараты на основе: | |
Гексацианферрата II железа III (лберлинской лазури) (Fe 4 [Fe(CN) 6] 3) | Оксида железа (Fе3O4) | |
Привитые собаки от гепатита псовых: 6 проб крови | + - результаты в реакции гидрозольной агглютинации в титре от 1:25 до 1:400 | + - результаты в реакции гидрозольной агглютинации в титре от 1:25 до 1:200 |
Контрольная группа непривитых собак: 5 проб крови | - - результаты в реакции гидрозольной агглютинации | - - результаты в реакции гидрозольной агглютинации |
Время реакции 1-10 минут | Цвет реакции - синий | Цвет реакции - коричневый |
Диагностические титры специфических антител определялись в 6 пробах у всех привитых собак с обоими гидрозолями. При этом установлено, что определяемый максимальный титр специфических антител к вирусу гепатита псовых с гидрозолем на основе берлинской лазури достигал величины 1:400, а с оксидом железа (Fe3O4) - 1:200. Так, титр антител с помощью первого гидрозоля выявлялся в 2 раза выше (р<0,01), чем со вторым. Достоверность отличий между группами в РГЗА по критерию хи-квадрат составил p=0,007.
Таким образом, сравнивая полученные из такой небольшой выборки данные РГЗА с помощью вышеперечисленных объектов, установлены условно - диагностические титры для суммарных антител к вирусу гепатита псовых у вакцинированных собак (от 1:25 до 1:400). Кроме того, было установлено, что результативность реакции с гидрозолем берлинской лазури выше в сравнении с реакцией с гидрозолем оксида железа (Fe3O4).
Исследование гидрозольных препаратов в задачах выявления антител к вирусу H5N1 (птичьего гриппа) в сыворотке крови
Для обнаружения антител в сыворотке крови проводили РГЗА только на основе берлинской лазури, модифицированной катионами Hg2+,на поверхности которого адсорбировали специфические, в нашем случае гриппозные антигены. Готовили три гидрозоля с различным содержанием антигена H5N1: 1-й - 5 мкг, 2-й - 50 мкг, 3-й - 100 мкг по белку (10мг/мл) на 1 мл исходного гидрозоля. Подлежащие тестированию сыворотки (10 мкл) с двойным шагом в лунках U-образных полистирольных планшетов титровали от 1:20 до 1:1280. Далее вносили в лунки по 20 мкл гидрозоля и через 2-10 минут производили учет результатов. Его осуществляли путем переноса по 5 мкл смеси сыворотка+гидрозоль на фильтровальную бумагу. Результаты представлены на рис. 3.
Рис. 3. Зависимость обратного титра от соотношения биолиганда (H5N1) и коллоидного раствора берлинской лазури
На основании полученных результатов было установлено, что чем выше концентрация биолиганда в гидрозоле, 5 мкл - 50- мкл - 100 мкл, тем титр обнаруживаемых антител ниже (1:1280 - 1:80 - 1:40 соответственно) и чаще наблюдалось ухудшение иммунохимических свойств препарата. Это можно объяснить наличием стерических факторов. При этом необходимо отметить, что отрицательные сыворотки, изучаемые в настоящей работе, не проявляли каких-либо тенденций агглютинации с изучаемым гидрозольным препаратом.
Таким образом, нами было найдено оптимальное соотношение биолиганда и гидрозоля на основе берлинской лазури 5 мкг антигена (H5N1) и 1 мл гидрозоля. Также нами определён максимальный титр специфических антител к вирусу птичьего гриппа в РГЗА - 1:1280, при этом наблюдалось чёткое различие между положительной и отрицательной реакциями.
Исследование гидрозольных препаратов в задачах выявления специфических антител к M. tuberculosis
Работа проводилась в 3 этапа. На первом этапе формировали панели сывороток крови, взятых от 16 пациентов с установленным диагнозом - туберкулёз, подтверждённый клинико-лабораторными методами. Из них 90,0% от бациллярных больных с активной формой легочного туберкулёзного процесса и 10,0% от пациентов с внелегочной формой туберкулёза (туберкулёз среднего уха, мочевого пузыря, лимфаденит).
В качестве контрольной группы взяли 48 образцов сывороток здоровых доноров, возраст которых составлял от 25 до 55 лет.
РГЗА проводилась как на основе берлинской лазури, так и оксида железа (Fе3O4). В каждом случае синтезировали гидрозоли с нативными антигенами ППД и рекомбинантными антигенами туберкулёза (BL(DT3)/pCFP-ESAT) по вышеуказанной методике.
Получали четыре вида гидрозолей: гексацианфератт железа с адсорбированным рекомбинантным антигеном туберкулёза (BL(DT3)/pCFP-ESAT), гексацианферрат железа с ППД антигеном, оксид железа (Fе3O4) с рекомбинантным антигеном туберкулёза (BL(DT3)/pCFP-ESAT), оксид железа (Fе3O4) с ППД антигеном.
Предварительно исследуемые сыворотки крови больных и здоровых доноров титровали от 1:20 до 1:2560.
Данные, полученные при изучении серопозитивных и серонегативных результатов к M. tuberculosis, представлены на рис. 4.
Рис. 4. Сравнение гидрозольных диагностикумов для детекции антител
к возбудителю туберкулёза с различными биолигандами в РГЗА
Результаты постановок на первой панели показали, что все 4 гидрозоля фиксируют наличие специфических антител к M. Tuberculosis в 16 пробах. Наиболее высокие титры в серопозитивных пробах были выявлены с гидрозолями на основе берлинской лазури и оксида железа (Fе3O4) с адсорбированными рекомбинантными антигенами (1:2560 и 1:1280 соответственно, р<0,001). В сравнении с гидрозолями на основе берлинской лазури и оксида железа (Fе3O4) с адсорбированным нативным антигеном титры антител были ниже (1:640 и 1:160 соответственно, р<0,05). При анализе показателей выявления титров специфических антител к M. Tuberculosis установлены наиболее выраженные отличия в РГЗА с гидрозолем на основе берлинской лазури с адсорбированными рекомбинантными антигенами.
На втором этапе, учитывая данные первых испытаний для реакции гидрозольной агглютинации, использовали только два гидрозоля с рекомбинантными антигенами (BL(DT3)/pCFP-ESAT), которые адсорбировали и на берлинскую лазурь, и на оксид железа (Fе3O4). Мы исследовали панели сывороток от 20 больных с верифицированным диагнозом туберкулёз, 20 здоровых доноров. Параллельно у 10 из них была исследована капиллярная кровь. Сравнивая показатели, полученные в РГЗА, мы обнаружили наиболее выраженные достоверные отличия между двумя гидрозолями. Гидрозоль на основе оксида железа (Fе3O4) с адсорбированными рекомбинантными антигенами (BL(DT3)/pCFP-ESAT) в данном испытании в капиллярной крови не сработал, а в сыворотке крови проявил слабую агглютинабельность - 10,0% от общего количества обследуемых. По результатам этой серии испытаний высокую чувствительность и специфичность показал гидрозольный препарат на основе берлинской лазури с рекомбинантными антигенами (BL(DT3)/pCFP-ESAT) как в сыворотке, так и в капиллярной крови. Реакцию агглютинации наблюдали со всеми сыворотками от 20 пациентов в разведении 1:1000 и с капиллярной кровью от 10 больных - в разведении 1:100. В данном случае, для сравнения двух качественных признаков: лесть или нет, определённых у одних и тех же больных, была проведена статистическая обработка по критерию МакЦНимара. В итоге было выявлено, что экспериментальные значения критерия больше критического, с вероятностью ошибки менее 0,01 (<1%). Таким образом, можно с достоверностью более 99% (мощность критерия >0,09) утверждать, что предложенный метод диагностики позволит выявить антитела к M.tuberculosis при различной локализации возбудителя.
На третьем этапе для подтверждения результативности РГЗА в выявлении противотуберкулёзных антител нами было проведено сравнение данных в параллельных исследованиях в качественных тестах: в реакции гидрозольной аглютинации (РГЗА) и в иммунохроматографической реакции (ИМХР) с тест - полосками с коллоидным золотом - производства ВНИИБП ФМГА. Проведено тестирование 44 проб (сывороток крови) от больных различными формами туберкулёза с различной локализацией, бактериологически подтверждённым диагнозом. В контрольную группу вошли 40 образцов, из которых взяли: 20 пациентов с заболеваниями сходных локализаций, но не имеющих туберкулёза в анамнезе (больные с хроническими бронхитами, бронхиальной астмой и другие); 20 - здоровые доноры. В данном случае в РГЗА использовали оптимальный с нашей точки зрения гидрозоль - берлинскую лазурь с адсорбированными рекомбинантными антигенами (BL(DT3)/pCFP-ESAT). Постановка осуществлялась с заведомо положительными и отрицательными сыворотками крови в титрах 1:20-1:200 по выше описанной методике. Обобщение полученных результатов обследования здоровых и больных лиц туберкулёзом представлены в табл. 5.
Таблица 5- Обобщение полученных серопозитивных и серонегативных
результатов в РГЗА и ИМХР
Культуральный и микробиоло- гический методы | Реакция гидрозольной агглютинации (РГЗА) | Иммунохроматографический метод (ИМХР) (ВНИИБП) | ||
Положительный | Отрицательный | Положительный | Отрицательный | |
Положительный 44 сыворотки | 40 | 4 | 31 | 13 |
Отрицательный 40 сывороток | 39 | 1 | 36 | 4 |
Общий результат 84 сыворотки | 79 | 5 | 67 | 17 |
Чувствительность | 91% (40/44) | 70% (31/44) | ||
Специфичность | 98% (39/40) | 91% (36/40) | ||
При сравнении полученных данных исследования на тест-полосках с коллоидным золотом (ВНИИБП) и нами изготовленного гидрозольного реагента было установлен следующий факт. Последний показал чувствительность 91% (40/44) и специфичность 98% (39/40), а также хорошую корреляцию результатов с данными культурального и микробиологического методов (общая согласованность данных =96,6%). При этом аналогичные показатели для тест-полосок были ниже. Результаты расчёта чувствительности сравниваемых реакций имели преимущество РГЗА перед ИМХР (показатель чувствительности составил 91, 0% и 70, 0% соответственно). Анализируя показатели выявления специфических антител, было установлено, что РГЗА, в сравнении с ИМХР, позволила повысить результативность серодиагностики туберкулёза в этой группе больных в 3,2 раза (р <0,05) и увеличить расшифровку диагноза до 13,4%. В ходе исследований мы провели сравнительной анализ результатов традиционных и экспресс-анализов и их технико-экономическое обоснование, которые показывают явные преимущества применения реакции гидрозольной агглютинации в выявлении антител к микобактериям туберкулёза.
Таким образом, в ходе работы было выявлено, что наиболее эффективным диагностикумом в выявлении анитител к M. Tuberculosis как в сыворотке крови, так и в капиллярной является гидрозоль - гексацианферрат II железа III (лберлинская лазурь), с адсорбированными рекомбинантными антигенами (BL(DT3)/pCFP-ESAT).
Экспериментальные данные по определению антигена хорионического
гонадотропина человека (ХГЧ)
За последнее время накопилось большое количество данных о целесообразности включения в широкую практику методов экспрессной диагностики ХГЧ (хорионического гонадотропина человека), основанных на выявлении антигена. Преимуществами этих методов являются: простота и экспрессность постановки, экономичность, отсутствие сложной аппаратуры и т.д. Наши исследования были направлены на изучение возможности РГЗА для выявления антигена ХГЧ в сыворотке крови и моче беременных женщин. С этой целью мы использовали реакцию гидрозольной агглютинации с гидрозольным реагентом, нагруженным мышиными моноклональными антителами к бета субъединице ХГЧ. Нами было исследовано 259 образцов сывороток крови и 287 проб мочи беременных женщин. Концентрация ХГЧ (от 31 мМЕ/мл до 281000 мМЕ/мл.) была ранее определена иммунохемилюминесцентным методом (хемилюминесцентный анализатор CENTAUR) в различные сроки беременности (от 1 до 39 недель). В качестве референсного метода для выявления ХГЧ в моче также использовали тест - полоски со специфическими моноклональными антителами мечеными коллоидным золотом, производство ООО Прогрессивные Био-Медицинские Технологии г. Москва. Разведение положительной и лотрицательной сывороток проводили в буферном растворе в U - образном планшете в титрах 1:100 и 1:1000. Мочу брали без разведения. В качестве отрицательных образцов брали сыворотку и мочу мужчин. В данной работе в качестве твёрдой фазы использовали те же гидрозольные реагенты: гексацианферрат II железа III и оксид железа (Fе3O4), на поверхности которых адсорбировали по определённой технологии моноклональные антитела к бета-субъединице ХГЧ. Выбор оптимального соотношения биолиганда и растворов берлинской лазури и оксида железа (Fe3O4) остановили на - 250 мкг антител на 1 мл исходных коллоидных растворов. Исследование проводили параллельно с сывороткой крови и мочой беременных женщин. Данные исследования сведены в табл. 6.
Таблица 6- Сравнение экспериментальных данных в РГЗА с гидрозольными диагностикумами с ИХЛА и ИМХР для детекции бета-субъединицы ХГЧ
| Методы исследования | Моча | Сыворотка в разведении 1:100 | Сыворотка в разведении 1:1000 | ||||
40 л- | 287л+ | 30 л- | 259л+ | 30 л- | 259 л+ | ||
Реакция агглютинации с берлинской лазурью | - | + | - | + | - | + | |
Реакция агглютинации с оксидом железа (Fe3O4) | - | + | - | + | - | + | |
Хемилюминисцентный тест (ИХЛА) | Исследование не проводили | - | + | - | + | ||
ИМХР (тест-полоски с коллоидным зотом) | - | + | Исследование не проводили | ||||
Сопоставляя показатели РГЗА с гидрозолями на основе берлинской лазури, оксида железа (Fe3O4) с другими методами (хемилюминисцентный тест, ИМХР с тест-полосками с коллоидным золотом), мы не обнаружили существенных различий при определении содержания хорионического гонадотропина человека в сыворотке крови и в моче беременных женщин. Проведённая статистическая обработка полученных данных показала, что результаты исследования при использовании сравниваемых методов хорошо коррелируют (р=0.921), достоверных отличий по биологическим жидкостям не выявлено.
ВЫВОДЫ
1. Разработан и апробирован новый иммунохимический метод гидрозольной агглютинациии (РГЗА) на основе берлинской лазури и оксида железа (Fe3O4) для выявления специфических антител к возбудителям: гепатита псовых, птичьего гриппа, туберкулеза как в сыворотке крови, так и в капиллярной крови.
2. Гидрозольные диагностикумы с нативными и генно-инженерным антигеном применимы в случае выявления антител к M. tuberculosis. Сравнивая гидрозоли различного состава, были обнаружены преимущества использования препарата на основе берлинской лазури с генно-инженерным антигеном. Во-первых, он обеспечивает сохранность специфических иммунохимических свойств диагностикума в течение одного года, в то время как диагностикум на основе берлинской лазури с нативным антигеном лишь в одномесячный период специфической иммунохимической активности. Во-вторых, по совокупности иммунохимических свойств берлинская лазурь с адсорбированным генно-инженерным антигеном является наиболее универсальным определителем, обеспечивающим лучшую дифференцировку л+ и л- результатов. В-третьих, данная гидрозоль обладает высокой чувствительностью (91%) и позволяет определять в образцах крови специфические антитела в титре от 1:100 до 1:2560. Кроме того, немаловажным является и тот факт, что обнаружение противотуберкулёзных антител возможно у больных с различной локализацией патологического процесса.
3. Разработаны новые диагностические препараты на основе берлинской лазури и оксида железа (Fe3O4), нагруженные мышиными моноклональными антителами к бета субъединице ХГЧ для выявления антигена хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) в сыворотке крови и в моче беременных женщин. Положительная корреляция наблюдалась при детекции антигена ХГЧ в исследуемых сыворотках в титрах от 1:100 до 1:1000 и в неразведенной моче при помощи обеих гидрозолей.
4. Диагностическая ценность реакции гидрозольной агглютинации с антигенным и антительным диагностикумами определяется высокой специфичностью (в среднем 98%) и чувствительностью (91%), простотой постановки, минимальных затратах. Её использование повышает информативность серологической диагностики заболеваний: гепатита псовых, птичьего гриппа, туберкулеза и диагностики беременности.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. С целью повышения качества лечебной помощи медицинским и ветеринарным специалистам рекомендуется гидрозольные препараты использовать как скрининговые тесты в диагностике самых разнообразных нозологий - туберкулеза, птичьего гриппа и гепатита псовых.
2. Материалы исследований внедрены и используются в учебном процессе на кафедре общей химии Кировской медицинской академии при чтении лекций и проведении практических занятий со студентами лечебного и педиатрического факультетов.
3. Теоретические положения, методики расчета и результаты исследований диссертации использованы в отчёте о НИР по договору № 14-06/11-К от 20 июня 2011г. Результаты научных исследований использованы для разработки методических рекомендаций (положений) в рамках темы: Лазурь, выполненной по заказу Федерального медикоЦбиологического агенства (ФМБА) Минздравсоцразвития РФ, для оформления проекта технических условий и инструкции по применению. Предполагается выпуск теста для диагностики туберкулеза на профильных предприятиях ФМБА.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИСЕРТАЦИИ
1. Усовершенствование методик выявления инфекционных и соматических патологий при помощи реакции гидрозольной агглютинации /Попова С.В., Мешандин А.Г., Ворона М. В. и др. // Информационный лист № 43-024-08. ЦКиров: ЦНТИ. - 2008. - С. 1-2.
2. Использование гидрозольных препаратов в качестве экспрессных бесприборных диагностикумов в выявлении антител к М.tuberculosis /Попова С.В., Мешандин А.Г., Плехов В.Л. и др. // Материалы V съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. - Москва: РАН. - 2008. - С. 283-284.
3. Попова С.В., Мешандин А.Г. Использование гидрозольных препаратов в качестве экспрессных бесприборных диагностикумов в выявлении антител к M.tuberculosis, птичьего гриппа, определение ХГЧ // Вятский медицинский вестник. - Киров: КГМА. - 2009. - № I. - С.117.
4. Попова С.В., Мешандин А.Г., Ворона М. В. Изучение коллоидных растворов на основе гексацианферрата железа в качестве возможных диагностических препаратов// Вятский медицинский вестник. - Киров: КГМА. - 2009. - № I. - С.111.
*5. Попова С.В., Мешандин А.Г. Применение метода гидрозольной агглютинации в диагностике туберкулёзной инфекции //Российском биомедицинский журнал. - 2009.- № 10.- С. 478-491.
*6. Попова С.В., Мешандин А.Г. Использование гидрозольных препаратов в качестве экспрессных диагностикумов в ветеринарии // Ветеринарный врач. - 2010. - № 4 - С. 24-26.
*7. Попова С.В., Мешандин А.Г., Ворона М. В. Экспрессный бесприборный метод гидрозольной агглютинации //Вестник РГМУ. - 2010.- специальный выпуск 2.- С. 536-537.
*8. Попова С.В., Мешандин А.Г., Ворона М. В. Диагностические препараты на основе коллоидного раствора гексацианферрата железа и оксида железа // Сборник научных трудов. - Самара: СГМУ. - 2010. - С. 263-264.
* - публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии