Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине  

На правах рукописи

ДАВЫДЕНКО

  Владимир Валентинович

МИКРОСОСУДИСТАЯ ИШЕМИЯ МИОКАРДА У БОЛЬНЫХ ПОРОКАМИ КЛАПАНОВ СЕРДЦА, СОВРЕМЕННЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ЕЁ  ХИРУРГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ

(клинико-экспериментальное исследование)

14.00.44 - сердечно- сосудистая хирургия

14.00.29 - гематология и переливание крови

  АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

  Санкт-Петербург

2007

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный университет им. акад. И.П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному  развитию России .

НАУЧНЫЕ КОНСУЛЬТАНТЫ:

доктор медицинских наук,  профессор Гриценко Владимир Викторович

доктор медицинских наук,  профессор Афанасьев Борис Владимирович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук,  профессор Хубулава Геннадий Григорьевич

доктор медицинских наук,  профессор Лебедев Лев Валерьевич

доктор медицинских наук,  профессор  Климко Николай Николаевич

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Государственное образовательное учреждении дополнительного профессионального образования  Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному  развитию России.

Защита диссертации состоится  л__ __________ 2008 г.  в ____ часов на заседании диссертационного совета  Д.208.090.05 ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет им. акад. И.П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному  развитию  России ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет им. акад. И.П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному  развитию России( 197089, Санкт-Петербург, ул. Л.Толстого, 6/8).

Автореферат диссертации разослан л_____________ 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, доцент Мясникова Марина Олеговна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Больные пороками клапанов сердца (ПКС) составляют значительную часть среди пациентов с заболеваниями сердечно - сосудистой системы и число их растет (Бокерия Л.А., Гудкова Р.Г., 2002). Основным методом лечения этой патологии является хирургическая коррекция ПКС. За последние десятилетия, благодаря развитию и совершенствованию кардиохирургии, в этой области достигнут  значительный прогресс.  Однако, у значительной части пациентов, даже после гемодинамически эффективной коррекции ПКС, сохраняется и прогрессирует сердечная недостаточность (Бокерия Л.А. и др., 2005). По современным представлениям это объясняется  исходным состоянием (ремоделированием) миокарда - развитием в нем  кардиосклероза и гибернации кардиомиоцитов вследствие хронической гипоперфузии (Camici P.G., 2004). Известно, что  гибернация миокарда, характеризующаяся  стойким снижением метаболических процессов в кардиомиоцитах и  нарушением  их сократительной  функции, обратима при нормализации кровоснабжения (Fallavolita J.A. et al., 2002; Vanoverschelde J-L.J., Melin J.A., 2005; Senior R., Lahiri A., 2007). Поэтому  восстановление адекватного кровоснабжения миокарда является важной задачей комплексного хирургического  лечения больных ПКС, решение которой невозможно без полного представления перед операцией характера и уровня нарушения кровотока в  сердечной мышце.

  Возможность количественно оценить  миокардиальный кровоток и изучить  роль в кровоснабжении  и метаболизме миокарда всех отделов  коронарного русла и интрамуральной сосудистой сети появилась лишь  в последние годы, благодаря широкому применению не только  коронарографии, но и  внедрению в клиническую практику новых методов оценки перфузии миокарда: однофотонной  эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ), позитронной эмиссионной томографии, магнитно-резонансной томографии. Было выявлено, что ишемия миокарда может быть обусловлена не только патологией проксимального отдела коронарных артерий (спазм, стеноз, окклюзия),  но и  изменением  его дистального отдела  и  интрамуральных микрососудов.  Поэтому стали различать ишемическую  болезнь сердца (ИБС) и микрососудистую ишемию миокарда, которая в случаи клинического проявления стенокардией стала обозначаться как кардиальный синдром Х (Коркушко О.В., Лишневская В. Ю., 2003; Александров А.А. и др., 2006; Kemp H.G.Jr. et al., 1973; Opherik D. et al., 1981). Как показали данные исследований последних лет, при гипертрофии миокарда, кардиосклерозе, кардиомиопатии, миокардите,  а также при метаболическом синдроме (ожирение, сахарный диабет, дислипидемия, гипертоническая болезнь) очень часто (в 30-50% случаев) выявляется  именно  микрососудистая ишемия миокарда, что позволило рассматривать ее как синдром, свойственный многим заболеваниям (Коркушко О.В., Лишневская В. Ю., 2003; Дедов И.И., Александров А.А., 2004; Шестакова М.В., 2006; Boche R.J., 1988).  В основе микрососудистой ишемии миокарда  могут лежать как  обратимые функциональные нарушения кровотока (при дисфункции эндотелия, нарушениях реологических параметров крови, нарушении диастолической функции миокарда), так и  необратимая потеря  части микрососудистого русла вследствие  ремоделирования миокарда  при развитии кардиосклероза или несоответствие количества капилляров возросшей массе сердца при его гипертрофии (Cannon R.O., Epstein S.E., 1988). Значение микрососудистой ишемии миокарда  в полной мере не изучено, но показано, что она может играть важную роль в возникновении жизнеугрожающих аритмий, острой и хронической сердечной недостаточности, ухудшать  результаты  операций реваскуляризации миокарда и даже быть причиной внезапной смерти (Телкова И.А., Фадеев М.В., 2006, 2007). Вместе с тем, у больных ПКС, имеющих все  указанные выше причины и условия  для возникновения микрососудистой ишемии миокарда, специальных исследований по изучению распространенности и клинической значимости этого синдрома  не проводилось. Немногочисленны и противоречивы результаты  исследования влияния стандартной  хирургической коррекции ПКС на динамику интрамиокардиального кровотока (Окунева Г.Н. и др., 2006; Yoshikawa J. et al., 1993;  Nemes A. et al., 2002;  Rajappan K. et al., 2003).

В  настоящее время в случаях сочетания ПКС с ишемической болезнью сердца (ИБС), вызванной гемодинамически значимым стенозом (или окклюзией) проксимального отдела  коронарных артерий и их ветвей, дополнительно к коррекции порока с успехом выполняются аорто- или маммарокоронарное шунтирование, эндартерэктомия, балонная коронароангиопластика со стентированием. Однако, у пациентов  с диффузным поражением дистальной части коронарного русла и интрамуральных сосудов миокарда, имеющих микрососудистый характер  ишемии, эти методы неэффективны и ведётся поиск  иных способов реваскуляризации и  репарации микрососудистой сети (Бокерия Л.А. и др., 2004; Jones E.L. et al., 1983; Mukherjee D., et al., 1999). С этой целью изучается возможность  использования новой лечебной технологии - стимуляции неоангиогенеза в ишемизированном миокарде на основе методов транс- и эндомиокардиальной лазерной реваскуляризации, применения факторов роста сосудов и их генов либо клеточной регенераторной терапии (Беленков Ю.Н. и др., 2003, Бокерия Л.А., 2004; Шевченко Ю.Л., 2006; Hasson E. et al., 2005;  Sellke F.W. et al., 2006; Tse H.F. et al., 2007). В настоящее время наибольшие надежды возлагаются на  трансплантацию в  ишемизированный миокард  различных аутологичных клеток,  прежде всего  костного мозга, поскольку при этом одновременно со стимуляцией неоангиогенеза потенциально  возможен кардиомиогенез,  а также  отпадает необходимость  в проведении иммуносупрессивной терапии и отсутствуют морально-этические препятствия,  сопровождающие  трансплантацию эмбриональных и аллогенных клеток, нет риска заражения инфекцией от реципиента  (Бокерия Л.А. и др., 2005; Шумаков В.И. и др., 2005). Результаты экспериментальных и первых клинических исследований по применению этой технологии, в основном с использованием мононуклеарной фракции или культивированных  мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток  аутологичного костного мозга, оказались положительными и продемонстрировали возможность стимуляции неоангиогенеза и  репарации миокарда в зонах ишемии при остром инфаркте миокарда, ИБС, кардиомиопатии, сердечной недостаточности (Бокерия Л.А. и др., 2005; Шумаков В.И. и др.. 2005; Седов В.М. и др., 2006; Assmus B. et al., 2006; Schachinger V. et al., 2006; Tran N. et al., 2007; Tse H.F. et al., 2007). В отношении применения этой технологии у больных ПКС сведения единичны (Бокерия Л.А. и др., 2005).  Кроме того,  остается много нерешенных вопросов: обоснование и выбор наиболее доступного,  эффективного и безопасного для практического клинического применения трансплантата, оптимальная методика введения клеточного материала, оценка отдаленных результатов, определение показаний и противопоказаний к клеточной терапии. Поставленные вопросы в полной мере  относятся и к  лечению ишемии миокарда у больных ПКС.

  Таким  образом,  клиническая значимость синдрома микрососудистой ишемии миокарда и современные возможности ее  коррекции  у больных ПКС  мало изучены, что делает  актуальным исследование этой проблемы.

Цель исследования. Определить клиническую значимость синдрома микрососудистой ишемии миокарда у больных пороками клапанов сердца и  обосновать возможность его коррекции методом стимуляции неоангиогенеза  для повышения эффективности  хирургического лечения.

Задачи исследования.

1. Изучить у больных пороками клапанов сердца на основе комплексного  клинико-инструментального  обследования (включая данные электрокардиографии (ЭКГ), эхокардиографии (ЭхоКГ), селективной коронарографиии (КГ) и перфузионной однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ) характер кровоснабжения миокарда, распространенность и выраженность микрососудистой ишемии, особенности её клинического проявления.

2.  Исследовать у больных пороками клапанов сердца, перенесших стандартную хирургическую коррекцию порока, влияние исходного состояния  перфузии миокарда на течение интраоперационного и послеоперационного (госпитального) периодов, а также  динамику миокардиального кровотока в ближайшие  и отдаленные сроки после оперативного вмешательства.

3.  В экспериментальных условиях  острого повреждения микрососудистой сети миокарда (моделирование  инфаркта миокарда) и хронической его  ишемии (модель постинфарктного кардиосклероза) сравнить влияние на  перфузию миокарда, плотность капиллярной сети, репаративные процессы в зоне повреждения  интрамиокардиальной / системной  внутривенной  трансплантации  мононуклеарной фракции клеток  аутологичного костного мозга, культивированных мультипотентных мезенхимных стромальных клеток аутологичного костного мозга, ангиогенных факторов роста в ближайшие и отдаленные сроки.

4.  Изучить в указанных  экспериментальных условиях  возможные осложнения, отдаленные последствия и оценить безопасность  интрамиокардиальной аутотрансплантации указанных клеток костного мозга по данным ЭКГ, ЭхоКГ, перфузионной ОФЭКТ, макроскопического и гистоморфологического исследований.

5.  Выяснить влияние  цитомединов (тималина, кордиалина, кортексина, эпиталамина) на  развитие органотипичской культуры миокарда.

6.  Определить у больных пороками клапанов сердца различного возраста функциональную пригодность клеток  аутологичного костного мозга  для  клеточной терапии.

7.  Изучить воспроизводимость, безопасность, ближайшие и отдаленные результаты интракардиальной трансплантации мононуклеарной фракции аутологичного костного мозга больным пороками клапанов сердца в  условиях пилотного исследования.

Научная новизна работы.  Впервые у больных ПКС на основе комплексного клинико-инструментального  обследования установлена  клиническая значимость синдрома микрососудистой ишемии миокарда: распространенность, особенность клинического проявления,  влияние на течение раннего послеоперационного периода и отдаленные результаты, динамика перфузии миокарда после стандартной хирургической коррекции. Впервые в экспериментальных условиях острой и хронической ишемии миокарда на  одной модели получены данные по  сравнительному влиянию на перфузию миокарда, плотность капилляров и репаративные процессы в зоне повреждения  интрамиокардиальной /системной внутривенной трансплантации мононуклеарной фракции клеток аутологичного костного мозга культивированных мульти потентнтных мезенхимных стромальных клеток аутологичного костного мозга,  факторов роста сосудов, а также получены сведения о динамике данных ЭКГ, ЭхоКГ, ОФЭКТ, макро- и микроскопического состояния сердечной мышцы в ближайшие и отдаленные сроки. Впервые показано, что у больных ПКС, даже в пожилом возрасте, сохранена пригодность костного мозга грудины для  целей клеточной интракардиальной  трансплантации. Впервые получены данные о результатах  ограниченного клинического (пилотного) исследования  интракардиальной трансплантации мононуклеарной фракции клеток аутологичного костного мозга в комплексном хирургическом лечении  10 больных ПКС со сроком наблюдения до 3 лет.

Практическая ценность работы. На основании полученных результатов клинико-инструментального обследования больных ПКС выявлена целесообразность включения в комплексное обследование больных пороками клапанов сердца исследования перфузии миокарда, как перед кардиохирургической коррекцией, так и в отдаленные сроки после оперативного вмешательства, для выявления и оценки динамики скрытой микрососудистой ишемии миокарда. Определены условия и количественный  уровень гипоперфузии миокарда,  при котором стандартная  хирургическая коррекция ПКС  не  восстанавливает перфузию  и возникают показания к применению методов стимуляции ангио- и васкулогенеза. Полученные в проведенных  экспериментальных исследованиях (фаза преклинических испытаний) результаты  показали высокий терапевтический эффект различных способов стимуляции ангиогенеза, определили  оптимальный выбор  клеточного трансплантата для безопасного применения как в  условиях острого, так и  хронического повреждения микрососудистой сети миокарда, что  позволило обосновать  начало клинических  исследований. Положительные результаты пилотного исследования интракардиальной трансплантации мононуклеарной фракции клеток аутологичного костного мозга в комплексном хирургическом лечении  10 больных ПКС  обосновывают дальнейшую  возможность перехода клинических исследований в следующую фазу (в соответсвии с требованиями доказательной медицины) - к  многоцентровым, рандомизированным, двойным слепым и  плацебо контролируемым исследованиям. Сделан первый шаг  по внедрению принципиально нового компонента - лечебного ангиогенеза в комплексное хирургическое лечение больных ПКС.

Положения, выносимые на  защиту.

1. Для больных пороками клапанов сердца характерно наличие хронической  гипоперфузии (ишемии) миокарда, обусловленной не столько поражением магистральных коронарных артерий, сколько изменением  микрососудистого кровотока, которая  клинически может проявляется как кардиальный синдром Х, так и протекать скрытно.

2. Выраженная  микрососудистая ишемии миокарда оказывает неблагоприятное влияние на течение интраоперационного и послеоперационного периода,  отдаленные результаты у больных пороками клапанов сердца которым выполнено оперативное лечение порока; стандартные  методы хирургической коррекции  не восстанавливают перфузию  в участках миокарда с исходной выраженной и резкой степенью ее нарушения.

3. В эксперименте, как в условиях острого ишемического повреждения микрососудистого русла (при моделировании инфаркта миокарда), так и в условиях хронической ишемии (при моделировании постинфарктного кардиосклероза) различные способы лечебного ангиогенеза: интрамиокардиальное введение факторов роста сосудов, трансплантация мононуклеарной фракции  клеток  и культивированных  мультипотентных мезенхимных стромальных клеток аутологичного костного мозга улучшают перфузию поврежденного  миокарда, способствуют увеличению плотности капилляров в зоне ишемии, но  сопровождаются различным репаративным воздействием на поврежденный миокард.

4. У экспериментальных животных, перенесших  интрамиокардиальную трансплантацию исследуемых  клеток костного мозга, не выявлено, как интраоперационно, так и в ближайшие и отдаленные сроки наблюдения, специфических осложнений.

5. Цитомедины, выделенные из сердечной ткани, оказывают выраженное стимулипрующее действие на развитие органотипической культуры миокарда.

6. Дополнение стандартного хирургического лечения ПКС интракардиальной трансплантацией аутологичной мононуклеарной фракции клеток костного мозга  в зоны гипоперфузии миокарда улучшает его кровоснабжение и в сроки наблюдения до 3 лет не сопровождается видимыми  побочными отрицательными  эффектами.

Степень личного вклада автора в результаты исследования. Автор  непосредственно участвовал в обследовании и лечении всех больных, в проведении всех экспериментальных исследований. Самостоятельно проводил сбор, обработку и анализ  полученного научного клинического и экспериментального материала, самостоятельно сформулировал основные положения диссертации.

Исследование выполнено в рамках реализации Приказа Министра здравоохранения РФ  №78 от 16.02.2004 г. и решения Ученого Совета СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова (протокол №7 от 29.03.2004 г.) об организации Северо-Западного отделения Научно-методического центра клеточной терапии Минздрава России и его взаимодействия с подразделениями Университета для исследования и реализации потенциальных возможностей методов клеточной терапии в интересах клинической медицины.

Апробация работы. Результаты исследований и основные положения работы доложены и обсуждены  на III международном конгрессе патофизиологов (Лахти, Финляндия, 1998), на научной конференции Актуальные проблемы сердечно-сосудистой, легочной и абдоминальной хирургии, посвященной 95-летию со дня рождения академика РАМН Ф.Г.Углова (Санкт-Петербург, 1999)  на юбилейной научно-практической конференции посвященной 100-летию кафедры госпитальной хирургии №2 СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова (Санкт-Петербург, 2001), на  международном симпозиуме Стволовые клетки. Регенерация, клеточная терапия (Санкт-Петербург, 2004), на 132-м заседании секции сердечно-сосудистой  хирургии и ангиологии хирургического  общества Н.И. Пирогова (Санкт-Петербург, 2004), на семинаре руководителей врачей-интернов и руководителей производственной практики студентов (Санкт-Петербург, 2005), на 9-й ежегодной сессии НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН (Москва, 2005), на региональной конференции Достижения и трудности современной кардиологии, посвященной памяти профессора В.П.Померанцева (Москва, 2005), на 7-м международном симпозиуме всемирной организации искусственных органов, иммунологии и трансплантации (Санкт-Петербург, 2005), на 11-м Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2005), на юбилейной конференции, посвященной 60-летию кафедры рентгенологии и радиологии СПбГМУ им.акад. И.П.Павлова (Санкт-Петербург, 2005), на III-м всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам (Москва, 2005), на всероссийском симпозиуме  Биология клетки в культуре (Санкт-Петербург, 2006), на научной конференции с международным участием Новые технологии в ядерной медицине (Санкт-Петербург, 2006), на 12-м всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2006), на российско-британском совещании в сотрудничестве с Европейской комиссией Стволовые клетки: законодательство, исследования и инновации. Международные перспективы сотрудничества (Москва, 2007), на всероссийском радиологическом форуме Невский радиологический форум (Санкт-Петербург, 2007), на III-м всероссийском симпозиуме с международным участием Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии (Москва, 2007), на 157-м заседании секции сердечно-сосудистой хирургии и ангиологии хирургического  общества Н.И. Пирогова (Санкт-Петербург, 2007), на всероссийской научно-практической конференции с международным участием л Высокотехнологичные методы диагностики и лечения сердечно- сосудистых и эндокринных заболеваний (Санкт-Петербург, 2007), на научно-практической конференции л Итоги и перспективы творческого сотрудничества кафедры и клиники госпитальной хирурги №2 СПбГМУ и регионов Север-Запада РФ по оказанию кардиохирургической помощи населению (Санкт-Петербург, 2007), на 13-м Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2007).

Основные результаты диссертации представлены в 30 публикациях, из них 15 -  в изданиях, рекомендованных ВАК.

Реализация работы. Полученные в процессе выполнения работы результаты используются в повседневной деятельности кардиохирургического центра кафедры госпитальной хирургии №2, кафедры рентгенологии и радиологии, кафедры патологической физиологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова, Северо-Западного филиала научно-методического центра клеточной терапии МЗ  РФ (Санкт-Петербург, ул. Л.Толстого, д. 6/8). Созданная модель острой и хронической ишемии миокарда и методика оценки перфузии миокарда у кроликов применяются в  работе научно-исследовательского центра Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова и Центрального научно-исследовательского института рентгенологии и радиологии МЗ РФ (Санкт-Петербург, Песочный-2, ул.Ленинградская, д.70/4) ; технология выделения и культивирования мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга кролика используется в работе отделения клеточных культур института цитологии РАН (Санкт-Петербург, пр. Тихорецкий, д.4). На основании полученных в диссертации данных  получен патент на изобретение РФа№ 2311140  Способ лечения больных пороками клапанов сердца.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 300 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя использованной литературы, содержащего 415 источников, в том числе 131- отечественных и 284- зарубежных авторов, приложения. Текст иллюстрирован 25 таблицами и 71 рисунком.

 

 

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

  Материал и методы  исследования

Исследование состояло из трёх самостоятельных, последовательно выполненных, взаимообусловленных частей: лопределения клинической значимости  синдрома микрососудистой ишемии миокарда у больных ПКС, лэкспериментального обоснования возможности и безопасности коррекции острой и хронической ишемии миокарда стимуляцией неоангиогенеза путем интракардиальной трансплантации клеток аутологичного  костного мозга и ангиогенных факторов роста, пилотного исследования возможности и безопасности коррекции микрососудистой ишемии миокарда у больных ПКС интракардиальной трансплантацией мононуклеарной фракции клеток аутологичного костного мозга. Первая и третья часть исследования составили клинический раздел, вторая - экспериментальный раздел работы.

  Клинический раздел работы

Для определения  клинической значимости микрососудистой ишемии миокарда проведено исследование и оценка  состояния кровоснабжения миокарда  у 180 больных ПКС, отобранных методом случайной выборки из  числа  пациентов, проходивших лечение в кардиохирургическом отделении клиники госпитальной хирургии №2 в 2003-2006 годах. Среди них было 89 мужчин и 91 женщина. Возраст обследованных больных составил от 20 до 76 лет (средний возраст 47 7,4 года). В соответствии с критериями классификации хронической сердечной недостаточности Нью-Йоркской ассоциации  кардиологов (NYHA), 26а(14%) больных относились ко второму функциональному классу (II ФК), 148 (82%) больных - к третьему функциональному классу (III ФК),  6 (4%) больных - к третьему-четвертому функциональному классу  (III- IY ФК). У 76 (42%) пациентов был порок аортального клапана, у 80 (44%) пациентов - митрального и у 24 ( 14%) пациентов- митрального и аортального клапанов. Этиологии ПКС у больных была следующая : хроническая ревматическая болезнь сердца - 111(62%) пациентов,  атеросклероз- 23 (13%) пациента, инфекционный эндокардит -26 (14%) пациентов. врожденный порок- стеноз бикуспидального аортального клапана- 16 (9%) пациентов и пролапс митрального клапана - 4 (2%) пациента.

Анализ состояния  кровоснабжения миокарда проводили на основании комплексного клинико-инструментального исследования. При сборе  анамнеза, жалоб  и физикального обследования выясняли  наличие перенесенного инфаркта миокарда и стенокардии напряжения, выраженность  которой оценивали в соответствии с классификацией CCS (Canadian Cardiovascular Society),  определяли  ФК сердечной недостаточности по  NYHA, наличие дополнительных факторов, повышающих риск развития микрососудистой ишемии миокарда: артериальной гипертензии и  ожирения, гипергликемии, дислипидемии (на основании данных биохимического исследования крови).

  ЭКГ регистрировалась в стандартных и грудных отведениях с помощью электрокардиографа Fukuda 3010 (Япония) в состоянии функционального покоя  пациента. Признаками хронической гипоксии миокарда считали наличие отрицательного симметричного, заостренного или двухфазного зубца Т и горизонтальное смещение сегмента ST (депрессия или подъем) на 1 мм и более от изоэлектрической линии. Также  выясняли наличие признаков ремоделирования миокарда: гипертрофии левого и правого желудочков, рубцовых изменений в нем, определяли  локализацию и характер  кардиосклероза.

ЭхоКГ выполнена по стандартной методике с синхронной регистрацией ЭКГ на эхокамере  Sequoia 512 (Acuson, США) с использованием линейных датчиков 2 и  5 МГц в состоянии функционального покоя пациента. Среди исследуемых параметров особое внимание уделялось выявлению  признаков гипертрофии желудочков сердца (утолщение  их стенок) и  локальных зон  нарушения сократимости (гипо- и акинезии) миокарда . Оценивали сократительную способность миокарда левого желудочка сердца, рассчитывая фракцию выброса (ФВ) (норма- более 55%) по методу Simpson и фракцию укорочения  (ФУ) (норма - более 25%), а также стандартные показатели, характеризующие его  дивастолическую функцию  используя встроенные программы эхокардиографа.

Больным, у которых указанными методами выявлялась  хроническая недостаточность коронарного кровоснабжения дополнительно  по стандартной методке выполняли селективную коронарографию (КГ) на ангиографе Multistar D (Siemens, Германия). При оценке ангиограмм использовали классификацию Ю.С.Петросяна и  Л.С. Зингермана (1974): определяли анатомический тип кровоснабжения сердца (левый, правый, сбалансированный), локализацию поражения коронарных артерий, степень  сужения артерии (без сужения просвета, гемодинамически незначимый стеноз - сужение просвета менее 50%, гемодинамически значимый стеноз - сужение просвета более 50%, окклюзия), наличие коллатеральных перетоков и спазмов.

  Исследование перфузии миокарда в состоянии функционального покоя  пациента выполнено у 36 больных, имевших клинические и ЭКГ проявления ишемии миокарда и у 36  больных без них,  методом  ОФЭКТ на томографической  двухдетекторной гамма - камере DDC-61 Piccer (США) и Philips Forte 2005 (США) с применением параллельных коллиматоров высокого разрешения по стандартной методике с использованием радиофармацевтического препарата (РФП) 99m Тс-технетрил  (Диамед, Россия) в дозе 1000 МБк, который вводился  в локтевую вену. Первичный массив информации обрабатывался сопряженной с гамма-камерой рабочей станцией Philips Jet Stream (на платформе IBM/ Windows XP) с применением специального программного обеспечения Philips AutoSPECT. В результате такой обработки и реконструкции получали серию срезов миокарда в поперечной, фронтальной и саггитальной плоскостях. Полученные таким образом  срезы оценивались визуально и обрабатывались количественно с применением пакета Philips ADAC AutoQuant 6.0. Основой количественной оценки являлось ориентированное в одной плоскости изображение миокарда левого желудочка (bull eye). Полученные изображения (полярные перфузионные диаграммы) разделялись на 20 сегментов, позволяющих точно локализовать участки нарушения перфузии не только по отношению к стенкам левого желудочка (передней, задней, латеральной, межжелудочковой перегородке), но и в соответствии со схемой бассейнов  коронарных артерий. Участки  ишемии миокарда визуализируются в  виде снижения накопления  РФП дефектов перфузии по отношению к интактному миокарду. Различали следующие степени нарушения перфузии миокарда: незначительное снижение (снижение накопления РФП менее 30% от максимального), лумеренное снижение (от 30% до 50%), выраженное снижение  (от 50% до 70%), резкое снижение (свыше 70 %), соответствующее рубцовым изменениям.

У 60 больных ПКС проведено динамическое исследование  изменений перфузии миокарда через 1 и 12 месяцев  после  стандартной хирургической коррекции  ПКС (протезирования аортального клапана Ц  у 23 больных, митрального клапана - у 23 больных, митрального и аортального клапанов - у 10 больных и у  4 больных в сочетании с аортокоронарным шунтированием) и изучена ее  взаимосвязь с динамикой  самочувствия, состояния  пациентов  и показателями насосной функции левого желудочка сердца. Также у этих больных  проведен  сравнительный анализ течения послеоперационного (госпитального) периода в зависимости от исходного состояния перфузии миокарда: с незначительной и умеренной  гипоперфузией и с выраженной и резкой гипоперфузией.

  В пилотном исследовании у  10 больных ПКС, на основе их  добровольного информированного согласия, изучались возможность и безопасность коррекции микрососудистой ишемии миокарда методом интракардиальной трансплантации мононуклеарной фракции клеток аутологичного костного мозга (МФКАКМ), выполненной  в комплексе со стандартным хирургическом лечением. Критерием включения в эту группу (показанием для клеточной трансплантации) было выявление у пациентов  в миокарде  рубцовых изменений и  зон выраженной и резкой гипоперфузии, которые  не были связаны со стенозом проксимального отдела коронарных артерий и поэтому стандартные методы реваскуляризации в этих случаях были бы непригодны. Среди них было 7 мужчин и 3 женщины, в возрасте от 36 до 62 лет (средний возраст 5012 года). У 9 пациентов было поражение одного клапана (митрального - у 4 больных, аортального - у 5 больных), у 1 пациента- поражение  двух клапанов- аортального и митрального. Этиология ПКС была следующей: хроническая ревматическая болезнь сердца - 5 пациентов, атеросклероз- 2 пациента, инфекционный эндокардит - 2 пациента, врожденный бикуспидальный аортальный клапан со стенозом - 1 пациент. Среди пациентов этой группы 7 больных предъявляли жалобы на загрудинные боли при физической нагрузке, соответствующие стабильной стенокардии напряжения II-III ФК  по CCS, 9 больных - на одышку при умеренной или незначительной физической нагрузке. 8 пациентов относились к III ФК,  а 2 пациентов - к IY ФК сердечной недостаточности по NYHA. У больных этой группы перед хирургической коррекцией ПКС кроме указанных  выше исследований выполнена  стандартная иммунограмма.

Для оценки пригодности  костного мозга грудины для клеточной трансплантации  у 20 пациентов (10 пациентов - участников пилотного исследования и 10 пациентов из основной группы) в возрасте от 32  до 76 лет выполнена  стернальная пункция с последующей оценкой функционального состояния костного мозга методом  культивирования на наличие гемопоэтических  стволовых клеток (ГСК) и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК). Клетки трансплантата культивировали  в течение 14 дней в питательной среде на основе метилцелюлозы с добавлением ростовых факторов - Metho-Cult Methylcellulose Medium For Colony Assays of Human cells (WAK-CHEMIE Medical GMBH) в условиях 100% влажности  и содержания СО2 от 5 % до 10%, без пересева. О наличии в культуре ГСК судили общепринятым способом - подсчитывали среднее количество  колониеобразующих единиц гранулоцитарно-моноцитарного ряда (КОЕ-ГМ) и бурстообразующих единиц  эритроидного ряда (БОЕ-Э) на 4 чашках Петри. ММСК культивировали в  пластиковой посуде в течение 21 дня  в среде - МЕМ (ISN, США) с 10 % сыворотки эмбрионов коров (Hyclone, Новая Зеландия) и гентамицина сульфата (50 мкг/мл) в СО2- инкубаторе при 5% концентрации углекислого газа. Смену среды производили  через каждые трое суток. После первой смены среды в нее добавляли аскорбиновую кислоту  50 мкг/мл). Клетки, достигшие субконфлюэнтного состояния пересевали при помощи раствора трипсина и ЭДТА (Gibco, США). Критериями наличия  колоний МСК считали адгезивность клеток к пластику; появление из этих  колоний при длительном культивировании спонтанно дифференцированных в различных направлениях клеток. Сравнивались результаты культивирования в двух возрастных группах больных: до 50 лет (10 пациентов) и  от 50 лет и старше (10 пациентов)

Всем пациентам - участникам пилотного исследования интраоперационно, перед стернотомией,  пункционно выполнена миелоэксфузия (у 1 из подвздошной кости, у 9 пациентов - из грудины) в  объеме 120 5 мл. Затем выделяли МФКАКМ методом седиментации,  используя 6% гидроксиэтилированного крахмала (6% HAES, Фрезениус) в соотношении 1:4  (к смеси костного мозга с гепарином) (Шавва С.А., 1994).Общий объем трансплантата МФКАКМ был  205 мл и содержал  0,7109  до 1,3109 (в среднем 1,00,3 109) клеток. Подсчет клеток в трансплантате проводили в камере Горяева, а  жизнеспособность  определяли по проценту окрашенных 0,4%  раствором трипанового синего (Лабтех, Россия) клеток. После того, как был закончен основной этап хирургической коррекции: протезирование митрального клапана у 4 пациентов, аортального клапана у -  5 пациентов и митрального и аортального клапанов - у 1 пациента и дополнительно у 4 пациентов  - аортокоронарное шунтирование и герметизированы камеры сердца,  в зоны  гипоперфузии путем множественных интрамиокардиальных инъекций от 10 до 20 ( в среднем 182), каждая объемом не более 0.2 мл,  производилась трансплантация МФКАКМ, оставшийся объем клеток  вводился или в шунты или интракоронарно. У этих  больных комплексное клинико-инструментальное  обследование  выполнялось в динамике  через 1 , 12 месяцев, а у некоторых и через 36 месяцев после  клеточной трансплантации.

 

Экспериментальный раздел работы

Опыты проведены на  65 крысах-самцах  массой 23015 г.  и  на 118 кроликах-самцах линии Шиншиллы массой 2,7-3.0 кг.

  Выполнено сравнительное исследование возможности стимуляции неоангиогенеза в зоне  острого и хронического повреждения (ишемии) сосудистой сети миокарда кролика на основе  интрамиокардиального (или внутривенного - в периферическую вену) введения препарата, содержащего смесь  факторов  роста сосудов (ФРС), МФКАКМ и культивированных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток аутолгичного костного мозга (ММСКАКМ) кролика.

Получение и исследование ангиогенной активности препарата, содержащего ФРС.  В исследовании применялся экспериментальный  препарат, содержащий смесь естественных человеческих факторов роста сосудов, аналогичный  препарату Endothelial cell growth supplement (Sigma,США). Препарат изготовлялся в НИИ цитологии РАН по методике T. Maciag et al. (1979),  модифицированной В.М. Седовым и соавторами (патент на изобретение РФ № 2214256 от 20.10. 2003 года) из мозговой ткани  17-23 недельных плодов человека, полученных  малым кесаревым сечением в центре репродукции г. Санкт-Петербурга, выполненной по социальным и медицинским показаниям и использованных в научных целях с разрешения комитета здравоохранения г.Санкт-Петербурга. Для подтверждения  ангиогенного эффекта и  определения оптимальной терапевтической  дозы препарат  вводился инъекционно из 6 точек в мышцы интрамускулярно в концентрации 4600 мкг/кг; 460 мкг/кг; 46 мкг/кг; 4-4,6 мкг/кг в ишемизированные мышцы голени  на 10 сутки после  перевязки моделирование ишемии нижней конечности , которая осуществлялась перевязкой и пересечением бедренной артерии и её ветвей на левой задней лапе под нембуталовой анестезией в дозе 60 мг/кг веса животного (Yang H.T.et al., 1996) и сравнивался с  контрольной группой, где аналогично  вводился  равный  объем  физиологического раствора . Количество капилляров в зоне ишемии определяли гистохимическим исследованием с  постановкой реакции на выявление активности щелочной фосфатазы, позволяющей визуализировать функционирующие капилляры, число которых подсчитывалось по стандартной методике в 10 произвольно выбранных  полях зрения с последующим усреднением данных на продольных и поперечных срезах.

  Получение, характеристика и окрашивание клеток костного мозга.

Аспират костного мозга в объеме  101 мл получали у кролика путем пункции крыла подвздошной кости после премедикации (дролеридол 0,5 мг/кг, ксилазин 14 мг/кг) под местной анестезией 0,5% раствором новокаина и  помещали в пробирку, содержащую антикоагулянт CPDS (citrate phosphate dextrose solution; Terumo, Япония). МФКАКМ фракционировали с помощью центрифугирования (1600 g, 20 мин) в градиенте плотности Перколла (63%). Образовавшееся интерфазное кольцо с ядросодержащими клетками промывали в растворе Хенкса без Са2+ и Mg~+(Gibco, США) и осаждали центрифугированием. Культуру ММСКАКМ получали путем культивирования МФКАКМ. Культивирование МФКАКМ проводили в среде а-МЕМ (ICN, США) с 10% сыворотки эмбрионов коров (Hyclone, Новая Зеландия) и гентамицина сульфата (50 мкг/мл; Invitrogen, Великобритания) в СО2-инкубаторе при 5 % концентрации углекислого газа в течение 3 недель. Смену среды производили через каждые трое суток. После первой смены среды в нее добавляли аскорбиновую кислоту (50 мкг/мл; ICN, США). Клетки, достигшие субконфлюэнтного состояния, пересевали при помощи 0,25% раствора трипсина (Gibco, США) и ЭДТА (0,02% этилендиаминтетрауксусная кислота, Gibco, США).

Характеристику клеточных культур проводили путем окрашивания стандартной смесью реактивов BCIP-NBT (5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат с нитросиним тетразолем, Sigma, США) на щелочную фосфатазу (ЩФ) для идентификации клеток остеогенной дифференцировки и смесью суданов III и IV (BDH, Великобритания) для идентификации клеток адипоцитарной дифференцировки.

Перед трансплантацией клетки костного мозга окрашивали ядерным флуоресцентным красителем Hoechst (Sigma, США). Для этого перед трансплантацией в клеточную суспензию добавляли флуорохром в концентрации 1 мкг/мл и инкубировали в течение 60 минут в СО2-инкубаторе на шейкере. Из суспензии клеток готовили препараты и изучали на флуоресцентном микроскопе. При этом ядра клеток светились ярко-голубым цветом.

Подсчет клеток в суспензии и определение их жизнеспособности. Подсчет клеток костного мозга проводили в камере Горяева, а жизнеспособность определяли с помощью окраски трипановым синим (Лабтех, Россия).

Моделирование острого ишемического  повреждения сосудистой сети миокарда (инфаркт миокарда),  характеристика исследованных групп. Инфаркт миокарда воспроизводился лигированием левой коронарной артерии (Landau C. et al., 1995) у 118 кроликов. В условиях искусственной вентиляции легких под управляемым наркозом выполняли левостороннюю торакотомию в четвертом межреберье и перевязывали переднюю нисходящую ветвь левой коронарной артерии на расстоянии 1,0 см от верхушки сердца. Через 10 минут после коронароокклюзии в зону предполагаемого инфаркта интрамиокардиально инъекционно с помощью инсулинового шприца из 6 точек  вводили препарат, содержащий ФРС  в дозе 500 мк/кг или  клетки в среднем  20,2 x106 (МФКАКМ и  культуру ММСКАКМ) в 0,4 мл  ростовой среды  а-МЕМ (модифицированная среда Игла) или  эквивалентное количество питательной среды (плацебо) либо аналогичное количество клеток и плацебо вводились  через 10 минут после коронароокклюзии в краевую вену уха кролика через катетер. В контрольной группе животных инъекций в миокард не производилось. Рану послойно ушивали, пневмоторакс ликвидировали путем активной аспирации воздуха из плевральной полости. В каждой группе было по 13 животных.

Моделирование хронической ишемии миокарда (постинфарктный  миокарда),  характеристика исследованных групп. 30  кроликов через год после моделирования инфаркта миокарда и не получавших никакого лечения, когда у них  сформировался постинфарктный кардиосклероз и  хроническая ишемия  были  повторно оперированы. Им в аналогичных, описанным выше условиях обезболивания и искусственной  вентиляции легких, была повторно  выполнена торакотомия с иссечением послеоперационного рубца,  затем  10 животным (опытная группа) в зону постинфарктного рубца и вокруг него из 6 точек  вводились МФКАКМ, полученная в день операции в количестве 20,3 х106 , другим 10 животным (группа, получавшая  плацебо) - вводилось эквивалентное количество питательной среды а-МЕМ, а в контрольной группе лечения не проводилось.

Идентификация меченых трансплантированных клеток в миокарде. Через 20 суток после трансплантации клеток трех кроликов из каждой группы выводили из эксперимента (такой срок определялся длительностью жизни флуорохрома). Сердце разрезали на 2 части (базальную и апикальную) таким образом, что плоскость разреза проходила на уровне лигатуры перпендикулярно длинной оси сердца. Апикальную часть сердца измельчали и подвергали ферментативной диссоциации смесью трипсин-коллагеназы (Siigma, США). Диссоциированные клетки осаждали центрифугированием, наносили на предметное стекло и производили подсчет меченых клеток. Меченые клетки выявляли с помощью флуоресцентного микроскопа Axioscop (Zeiss, Германия).

Электрокардиография.  При  моделировании  острого инфаркта миокарда во всех группах животных ЭКГ выполнялась до операции (норма), через 3 суток, 7 суток, 30 суток после операции и перед выведением животного из эксперимента (1 год после операции), а при моделировании хронической ишемии миокарда -  перед повторной операцией и через 6 месяцев после трансплантации. Использовали портативный одноканальный электрокардиограф ЭКГ-001 (Красногвардеец, Россия). Амплитуда устанавливалась на 20 мм, а скорость лентопротяжного механизма - на 50 мм/с. Оценку ЭКГ проводили по второму стандартному отведению

Эхокардиография. ЭхоКГ выполнена на эхокамере Sequoia 512 (Acuson, США) с использованием линейного датчика 13 МГц по стандартной методике. При  моделировании  острого инфаркта миокарда в каждой группе животных ЭхоКГ выполнялась до операции, через 14 суток и 1 год после операции, а при моделировании хронической ишемии миокарда - перед повторной операцией и через 6 месяцев после трансплантации. Эхокардиография проводилась с параллельной регистрацией ЭКГ-сигнала. В режиме М- сканирования регистрировался конечно - диастолический размер левого желудочка (КДРлж, мм). Систолическую функцию левого желудочка регистрировали с помощью 2D Ч сканирования из верхушечного доступа в четырехкамерной и двухкамерной позициях. Расчеты фракции выброса (ФВ,%) по модифицированному дисковому методу Simpson проводили, используя встроенные программы эхокамер. Скорость кровоток в аорте (VAo, мм/сек) оценивали в режиме импульсно-волновой доштлерографии. Также изучали динамику состояния стенки левого желудочка сердца в зоне  моделирования и лечения  инфаркта или  постинфарктного кардиосклероза в опытных и контрольных группах - наличие дискинезии, гипокинезии, акинезии, очагов  патологической дифференцировки клеток (кальцификации и оссификации) в местах трансплантации.

Методика оценки перфузии миокарда. Оценка перфузии выполнялась методом ОФЭКТ. Использовался РФП Myoview (Nycomed, Великобритания), меченый технецием-99т. РФП в дозе 30-50 МБк вводился в краевую вену уха через периферический катетер. Спустя 10-15 минут после инъекции выполнялась ОФЭКТ на двухдетекторной гамма-камере E.Cam. var (Siemens, Германия). Для количественной оценки уровня перфузии миокарда использовали показатель соотношения среднего значения накопления РФП в патологической зоне к таковому в референтной зоне. Оценку равномерности перфузии определяли по соотношению максимального и минимального значений пикселя в патологической и референтной зонах. При  моделировании  острого инфаркта миокарда во всех группах животных ОФЭКТ выполнялась до операции (норма), через 10 суток, 1, 3, 6, 12 месяцев  после операции, а при моделировании хронической ишемии миокарда -  перед повторной операцией и через 6 месяцев после трансплантации.

Методика определения размера экспериментального инфаркта миокарда и  измерения дилатации левого желудочка и гистологическое исследование.  При  моделировании  острого инфаркта миокарда во всех группах животных  через 12 месяцев  после операции, а при моделировании хронической ишемии миокарда через 6 месяцев после трансплантации сразу после эвтаназии животных) извлекали сердце, промывали физиологическим раствором и разрезали в поперечном направлении с помощью специального устройства на 3 сегмента одинаковой толщины  (1- верхушечный, 2-срединный, 3- базальный). Затем срезы помещали в 10% раствор формалина на 4 суток. После фиксации каждый сегмент сердца заливали в парафин и изготавливали срезы толщиной 7 мкм по общепринятой методике. Гистологические препараты окрашивали гематоксилин-эозином и по Маллори, позволяющему выявить различные виды соединительной ткани. При этом коллагеновые волокна приобретали окраску разной интенсивности: от голубой до синей. Гистологические препараты сканировали и проводили компьютерную обработку полученных изображений с помощью программы Adobe Photoshop CS2. Общую площадь рубца вычисляли  по трем срезам и представляли в процентном отношении от площади среза. Дилатацию левого желудочка рассчитывали как отношение площади просвета левого желудочка к площади миокарда обоих желудочков. Полученный индекс дилатации левого желудочка (в отн. ед.). Гистологическое исследование  проводили на микроскопе Биолам (Россия).

Количественная оценка васкуляризации зоны поврежденного миокарда. Оценивалась пограничная с рубцом зона. В каждом препарате в пяти последовательных полях зрения при увеличении х400 (окраска по Маллори) производился  подсчет среднего количества сосудов регулируемого типа: артериол, капилляров, венул и нерегулируемого типа -  синусоидов.

Оценка безопасности применения  методов стимуляции ангиогенеза в ишемизированном миокарде. Для оценки безопасности  клеточной трансплантации и введения ФРС в опытных и контрольных группах сравнивались такие показатели, как интра - и послеоперационная летальность, частота  развития в раннем  послеоперационном периоде аритмий и  гнойно-воспалительных осложнений. В отдаленные сроки наблюдения (до 2 лет) по данным вскрытий макроскопически оценивалось состояние сердца и других  внутренних органов (на предмет возникновения  неопластических процессов), а микроскопически - наличие патологических изменений  в миокарде в зоне трансплантации (появление клеток с нетипичной дифференцировкой - очагов склероза, остеогенеза).

Исследование влияния цитомединов на развитие органотипической культуры сердца  новорожденных крыс. 45 отпрепарованных  сердец 3-х дневных крыс линии Вистар, разделяли на фрагменты величиной около 1 мм, которые помещали в чашки Петри с коллагеновым покрытием дна. Питательная среда состояла из 35% среды Игла, 35%, раствора Хенкса, 25% фетальной сыворотки быка и 5 % куриного эмбрионального экстракта с добавлением глюкозы (0,6% раствора), инсулина (0,5 ЕД /мл), глютамина (2мМ), пенициллин (100 ед./мл.). Исследовано 100 эксплантатов миокарда, которые были разделены на 5 групп. В 1 группе в  культуральную среду добавляли  5 нг/мл тималина, во 2 группу - 50 нг/мл кортексина, в 3 группу- 50 нг/мл эпиталамина, в 4 группу - 50 нг/мл кордиалина, 5 - группа контроль. Чашки Петри помещали в термостат при температуре 37С и через 3-е суток просматривали под фазово-контрастным микроскопом. С помощью окуляр-микрометра определяли индекс площади (ИП), который рассчитывали в условных единицах как соотношение площади всего эксплантата вместе с зоной выселяющихся клеток к исходной площади эксплантата. ИП в контрольной группе принимали за 100% и ИП в опытных группах сопоставляли с ним.

Статистическая обработка. Для статистической обработки данных использовалась статистическая программа SPSS. При небольшом числе наблюдений достоверность различий определяли с помощью непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Все данные представляли в виде "среднее стандартное отклонение" и значение р менее 0,05 рассматривали в качестве значимого.

Результаты собственных исследований.

Результаты  клинического исследования синдрома микрососудистой ишемии миокарда у больных ПКС.

  По данным клинико-электрокардиографического обследования до хирургической коррекции ПКС у 91 (51%) из 180  пациентов  выявлены признаки хронической недостаточности коронарного кровоснабжения. Среди  них 57 (62%)  больных имели порок аортального, 24 (26%) больных- порок митрального и 13 (12%) больных - порок митрального и аортального клапанов различной этиологии. По данным коронарографии  лишь у 25 % из них имелся  гемодинамически значимый стеноз коронарных артерий или их ветвей, не было выявлено патологических изменений коронарных артерий у 56 % пациентов, или стеноз был  гемодинамически незначимый - у 21% пациентов.

  По данным ОФЭКТ  различной степени нарушения перфузии миокарда зарегистрированы у всех (100%) обследованных больных ПКС:  4%  пациентов имели участки с незначительной , 43% пациентов - с умеренной, 43% пациентов- с выраженной и 10% пациентов- с резкой гипоперфузией  (рис.1).

Рис.1 Состояние перфузии миокарда у обследованных больных ПКС по данным ОФЭКТ

Из них только у 8% пациентов по данным коронарографии выявлялся гемодинамически значимый стеноз коронарных артерий. Количество пораженных сегментов миокарда левого желудочка сердца с гипоперфузией  варьировало от 1 до 15 (в среднем 52,1), а  площадь  миокарда со сниженной перфузией на полярных диаграммах составила в среднем 247% от общей площади миокарда левого желудочка. Снижение  перфузии  миокарда  имело место у больных с различной  этиологией ПКС, но наиболее выраженные нарушения отмечены у пациентов с инфекционным эндокардитом и  хронической ревматической болезнью сердца. Среди больных, имевших хроническую  микрососудистую ишемию миокарда,  лишь у половины  пациентов отмечались типичные для ИБС клинико-электрокардиографические изменения, у остальных  пациентов процесс протекал скрытно.  Признаки ремоделирования миокарда (гипертрофия, кардиосклероз) зарегистрированы у 96% больных, его дисфункция  (диастолическая и систолическая) имелась у 71% пациентов. По данным обследования у больных ПКС были  выявлены отдельные признаки метаболического синдрома:  артериальная гипертензия - у 62% пациентов, ожирение - у 19% пациентов, сахарный диабет 2 типа - у 7% пациентов, дислипидемия - у 21% пациентов. В показателях иммунограммы у обследованных больных ПКС отмечались  различные отклонения от нормы: чаще всего отмечалось  снижение активности лейкоцитов (снижение миграции, незавершенность фагоцитоза).

При сравнении особенностей  течения интраоперационного и  послеоперационного (госпитального) периода у больных с исходной незначительной и  умеренной гипоперфузией миокарда  и у пациентов с выраженной и резкой гипоперфузией было отмечено более тяжелое течение во втором случае: в 1,7 раза чаще  для восстановления сердечной деятельности во время операции использовалась дефибрилляция, в 2,2 раза чаще отмечалась сердечная слабость, требующая  медикаментозной поддержки, в 2,8 раза чаще  развивались нарушения сердечного ритма, в 1,3 раза дольше  были сроки пребывания в  реанимационном отделении и сроки госпитального послеоперационного периода в целом, только в этой группе  наблюдалась ранняя послеоперационная  летальность. 

  По данным  клинико- инструментального обследования 52 больных, выполненного через 12 месяцев после  стандартной хирургической коррекции ПКС у всех пациентов функция ИКС была удовлетворительная. К этому моменту  улучшение в самочувствии отметили 42 (81 %) пациентов, отсутствие  положительной динамики было у 10 (19 %) пациентов. Стенокардия напряжения  сохранялась у 5 (11 %) больных,  отмечена положительная динамика функционального класса (по NYHA) у 40 (77%) пациентов. Исследование перфузии миокарда методом ОФЭКТ показало, что улучшение по сравнению с дооперационным периодом  произошло у 34 (65 %) больных, без динамики - у 14 (27 %) больных,  ухудшение -  у 4 (8 %) больных. Количество сегментов с гипоперфузией сократилось в среднем с 52,1 до 31,5 , а площадь миокарда с гипоперфузией  по отношению ко всей площади  миокарда левого желудочка (по  полярным перфузионным диаграммам) снизилась с 24 7% до 15 8%. Среди  32 пациентов,  исходно имевших незначительное или умеренное снижение перфузии миокарда, улучшение ее произошло  у всех (100 %) больных. Вместе с тем только у 3 (6 %) пациентов наблюдалось полное восстановление перфузии до уровня здорового миокарда. Среди 20 пациентов  с исходным выраженным и резким снижением перфузии (более чем 50% от максимальной) улучшение перфузии после операции  наблюдалось лишь у 2 (10 %) пациентов, а в 70 % случаев было без динамики (18 пациентов) или даже ухудшилось- 4 (20 %) пациента. Это были  больные пожилого возраста (средний возраст 677 лет)  с распространенным кардиосклерозом (в том числе у 4 больных - постинфарктным), которые перед операцией относились к  III или IY ФК по NYHA. Выявлена корреляция между динамикой перфузии миокарда,  показателями  насосной функции левого желудочка сердца и самочувствием больных:  у лиц с положительной динамикой коэффициент корреляции (r)  между этими показателями составил  соответственно  0,92 и 0,86. Среди 18 пациентов с отсутствием положительной динамики перфузии миокарда во всех случаях сохранялась сниженная фракция выброса левого желудочка сердца, причем  у 10 (50 %) больных этот показатель  после операции не улучшился и  они  же субъективно не отмечали заметного улучшения в самочувствии после операции.

 

Результаты экспериментального  раздела исследований.

Оценка ангиогенного эффекта и оптимальной дозы препарата, содержащего ФРС. На модели ишемии нижней конечности крысы по данным гистохимического исследования  в группах животных, получивших  препарат в дозе 4600 мкг/кг веса животного и 460 мкг/ кг плотность капиллярного русла в зоне ишемии не различалась, но,  по  сравнении с контрольной группой и группами, получавшими  препарат в дозе 4,6 мкг/кг и 46 мкг/кг этот показатель был  выше в 5 раз. Таким образом, был зарегистрирован ангиогенный эффект применения препарата, содержащего ФРС и определена оптимальная терапевтическая доза - 460 мкг/ кг веса животного.

Характеристика клеток костного мозга. В результате фракционирования эксфузата костного мозга на градиенте Перколла были выделены МФКАКМ в количестве 20,2 x106. В ходе культивирования было показано, что начиная с 3-4 суток появлялись единичные адгезивные клетки, имеющие вытянутую форму. К 12-14 суткам адгезивные клетки формировали монослой, покрывая всё дно культуральной чашки. Морфологически культура становилась гомогенной и, в основном, была представлена вытянутыми фибробластоподобными клетками. После пересева клетки вновь культивировали до образования монослоя. На 2 пассаже мезенхимальные стромальные клетки костного мозга в основном имели веретеновидную форму. После ферментативной обработки и перевода клеток в суспензионное состояние их размер составлял в среднем 15-20 мкм. Общее  количество  клеток,  полученное  в результате культивирования, составляло 20,2 x106. В ходе культивирования на каждом пассаже делался отсев для проведения цитохимических реакций (на ЩФ для выявление клеток остеогенного ряда и на нейтральные липиды для выявления клеток адипоцитарного ряда). В качестве контроля использовали культуры МСК, дифференцированные в остеогенном и адипоцитарном направлениях. Для индукции дифференцировки в остеогенном направлении использовали среду а-МЕМ с добавлением Р-глицерофосфата натрия (10 мМ; Sigma, США), дексаметазона (100 нМ; Sigma, США) и аскорбиновой кислоты (50 мкг/мл); для индукции дифференцировки в адипоцитарном направлении использовали среду а-МЕМ с добавлением дексаметазона (10 нМ), аскорбиновой кислоты (50 мкг/мл) и ITS + LA-BSA (инсулин, трансферрин, селеновая кислота, линейная алкилбензосульфоновая кислота). Результаты цитохимических реакций показали, что культура клеток, которая применялась для трансплантации,  характеризовалась отсутствием спонтанной остеогенной и адипоцитарной дифференцировки. В то же время, проведенные исследования по стимуляции дифференцировки культуры клеток в остеогенном и адипоцитарном направлениях под действием индукторов указывали на их мультипотентность, т.е. культивированные клетки имели характеристику ММСКАКМ.

Детекция трансплантированных клеток в поврежденном миокарде

При моделировании острой ишемии миокарда через 20 суток  в зоне  интрамиокардиальной трансплантации как МФКАКМ так и  культивированных ММСКАКМ выявлялись меченые  флуоресцентным красителем клетки соответственно 132 % и 93% от исходного количества. При моделировании хронической ишемии миокарда через 20 суток  в зоне  интрамиокардиальной трансплантации МФКАКМ  также  выявлялись меченые  флуоресцентным красителем клетки 685%  от исходного числа . При трансплантации клеток в периферический венозный кровоток в миокарде они не обнаруживались.

Динамика перфузии миокарда в исследуемых группах. Сводные данные уровня перфузии в зоне поврежденного миокарда представлены в таблицах 1 и 2.

  Таблица 1

Динамика показателей уровня накопления РФП в  патологической зоне миокарда при моделировании и лечении острого инфаркта миокарда в  исследуемых группах по данным перфузионной ОФЭКТ (Mm, отн. ед.)

Группы	Уровень накопления РФП в патологической зоне, сроки исследования
	исходно	через 10 суток после оперпации	через 1,5 месяца после оперпации	через 6 месяцев после оперпации	Через год после операции
контроль	1,01 0,01	0,57 0,02	0,59 0,04	0,61 0,02	0,61 0,04
плацебо интрамиокардиально	1,01 0,02	0,59 0,02	0,62 0,02	0,64 0,04	0,61 0,03
плацебо внутривенно	0,99 0,02	0,62 0,02	0,59 0,02	0,58 0,04	0,63 0,02
ФРС интрамиокардиально	1,00 0,03	0,69 0,02 *	0,77 0,01*	0,80 0,03*	0,82 0,01*
МФКАКМ интрамиокардиально	1,00 0,01	0,75 0,03 *	0,89 0,03 *	0,98 0,03 *	0,99 0,01*
культивированные  ММСКАКМ интрамиокардиально	0,98 0,03	0,81 0,01 *	0,92 0,03 *	0,98 0,02 *	1,02 0,01*
МФКАКМ внутривенно	0,98 0,03	0,58 0,02	0,63 0,03	0,60 0,03	0,60 0,01
культивированные  ММСКАКМ внутривенно	1,00 0,01	0,60 0,01	0,57 0,03	0,64 0,04	0,59 0,03

Примечание: отн. ед.= среднее значение накопления РФП в патологической зоне / среднее значение накопления РФП в референтной зоне

Обозначение: *-  достоверность различия по сравнению с контрольной группой (p<0,05) 

Таблица 2

Динамика показателей уровня накопления РФП в  патологической зоне миокарда при моделировании и лечении хронической ишемии миокарда (постинфарктного кардиосклероза) в  исследуемых группах по данным перфузионной ОФЭКТ (Mm, отн. ед)

Группы	Уровень накопления РФП в патологической зоне   Сроки исследования
	исходно	Через 6 месяцев после операции
контроль	0,610,03	0,560,09
плацебо интрамиокардиально	0,620,05	0,570,06
МФКАКМ интрамиокардиально	0,620,05	0,880,04 *

Примечание: отн. ед.= среднее  значение накопления РФП в патологической зоне/ среднее значение накопления РФП в референтной зоне

Обозначение: *-  достоверность различия по сравнению с контрольной группой (p<0,05)

  Как видно из приведенных в таблице 1  данных,  исходно во всех группах нарушения перфузии в миокарде не было. Через 10 суток  после коронарооклюзии во всех группах происходило снижение перфузии в  области  передней стенки левого желудочка (в зоне ишемии), но оно не было одинаковым: в группах получавших интрамиокардиальную трансплантацию  культивированных ММСКАКМ, МФКАКМ и ФРС снижение перфузии было наименьшим и достоверно отличалось от других  опытных групп, тогда как в последних  различия с контролем не отмечено. Через  1, 5 месяцев в группах, получавших интрамиокардиальную трансплантацию культивированных ММСКАКМ, МФКАКМ и ФРС наблюдалось  постепенное восстановление перфузии в зоне поврежденного миокарда, которое  через 12 месяцев достигло нормального (дооперационного) уровня только в группах с клеточной трансплантацией. В остальных  группах на протяжении  всего срока исследования сохранялся выраженный дефект перфузии в зоне постинфарктного рубца.

При  моделировании и лечении постинфарктного кардиосклероза исходно во всех группах  в зоне постинфарктного рубца имелся выраженный дефект перфузии миокарда. Через 6 месяцев после лечения только  в группе животных, где выполнялась интрамиокардиальная трансплантация МФКАКМ, происходило  достоверное улучшение перфузии в зоне повреждения миокарда, хотя и не достигшее  полной нормализации (табл. 2).

Динамика ЭКГ в исследуемых группах. При моделировании и лечении  острой ишемии миокарда во всех группах после коронароокклюзии развивались электрокардиографические признаки острого инфаркта миокарда, которые имели отчетливую закономерную динамику. Однако у 100% животных контрольной, получавших плацебо,  внутривенное введение МФКАКМ и культивированных ММСКАКМ,  и  интрамиокардиальную трансплантацию МФКАКМ групп и 75%  животных, получавших интрамиокардиально ФРС регистрировались признаки трансмурального инфаркта миокарда. Тогда как в группе животных, которым интрамиокардиально трансплантировали культивированные ММСКАКМ и 25% животных, получивших интрамиокардиально ФРС, ЭКГ- данные указывали на развитие субэндокардиального инфаркта миокарда. Нарушения ритма сердца (предсердные экстрасистолы) в раннем  послеоперационном периоде развивались  одинаково часто  во всех исследованных группах, за исключением группы животных, где интрамиокардиально трансплантировались культивированные ММСКАКМ (там они отмечались в 3 раза реже). При моделировании и лечении постинфарктного кардиосклероза  положительная динамика ЭКГ (увеличение амплитуды зубцов) отмечена только в группе животных после интрамиокардиальной трансплантации МФКАКМ.

Динамика ЭхоКГ в исследуемых группах. Исходно показатели в исследуемых группах не различались. При моделировании и лечении  острой ишемии миокарда во всех группах после коронароокклюзии отмечалось достоверное увеличение КДРлж, снижение ФВ, VAo, однако  неодинаковое в  сравниваемых группах: наименьшие нарушения происходили в группе животных, получавших интрамиокардиально трансплантацию  культивированных ММСКАКМ, а наибольшие - в группе с интрамиокардиальной трансплантацией МФКАКМ.  Через 1 год после операции было зарегистрировано  выраженное положительное влияние интрамиокардиальной отрансплантации культивированных ММСКАКМ, проявляющееся в нормализации всех показателей. В то время как у животных после интрамиокардиальной аутотрансплантации МФКАКМ, наоборот, выявлялось резкое снижение показателей систолической функции левого желудочка по сравнению с контрольной группой. Динамика  показателей остальных  исследуемых групп не отличалась от контроля. При моделировании и лечении  постинфарктного кардиосклероза и хронической ишемии миокарда во всех группах исходно были одинаково  резко снижены показатели систолической  функции левого желудочка сердца. Через 6 месяцев только в группе животных, с интракардиальной трансплантацией МФКАКМ отмечена достоверная (p<0,05) положительная динамика показателей: ФВ и  VAo- повысились по сравнению с исходными, соответственно: с  45,73,7% до  56,61,2% и с 728 м/сек до 838 м/сек;  КДРлж уменьшился  с  16,80,7 мм до 15,90,8 мм.

Количественная оценка васкуляризации.  Через 12 месяцев после моделирования и лечения острого инфаркта миокарда  отмечено достоверное различие в вскуляризации  зоны поврежденного миокарда: после интрамиокардиальной  трансплантации клеток костного мозга и ФРС плотность микрососудов на единицу площади была  не только достоверно больше (p<0,05), чем в контрольной группе  и группах, получавшей плацебо, но и различалась  характером микрососудов: они  имели  в большинстве своем регулируемую стенку, тогда как в контрольной группе  в зоне повреждения формировались микрососуды синусоидного типа. В остальных группах различий с контролем не было зарегистрировано (рис.2 А)

Через 6 месяцев после лечения  постинфарктного кардиосклероза в группе  животных, где выполнялась  интрамиокардиальная трансплантация МФКАКМ отмечено достоверно большее число микрососудов по сравнению с контролем и группой, получавшей плацебо: 203  против  93 в одном поле зрения, при этом в опытной группе они преимущественно имели характер сосудов регулируемого типа, а в контрольной группе - синусоидов (рис.2 В)

Рис.2 Количество  микрососудов  регулируемого и синусоидного типа  в  единице площади  зоны повреждённого миокарда А- через 12 месяцев после моделирования и лечения инфаркта; В - через 6 месяцев после лечения постинфарктного кардиосклероза в сравниваемых исследованных группах кроликов. Обозначение - ось  ординат - количество  микрососудов в 1 поле зрения  площади инфаркта миокарда; ось абсцисс - исследуемые группы

Морфометрическая характеристика сердец. Через 12 месяцев после  моделирования и лечения острого инфаркта миокарда  макроскопическое исследование нативных сердец кроликов в  контрольной, получавших плацебо, интравенозную трансплантацию клеток костного мозга, 70% животных из группы, получивших интрамиокардиальное введение ФРС, существенно не отличались друг от друга: наблюдалось увеличение размеров сердца и наличие аневризмы левого желудочка по сравнению со здоровым сердцем (неоперированные животные). В сердцах кроликов, которым выполнялась интрамиокардиальная трансплантация культивированных ММСКАКМ и у 30% животных из группы, получивших интрамиокардиальное введение ФРС в передней стенке левого желудочка выявлялись рубцовые изменения,  но не было аневризмы и  размеры сердца были незначительно увеличены. В группе животных, которым осуществляли интрамиокардиальную трансплантацию МФКАКМ, размеры сердца значительно превышали размеры здорового сердца, а левый желудочек был аневризматически изменен. Площадь рубца и индекс дилатации левого желудочка  составляли соответственно: 20,21,9% и 0,190,02- в контроле, группах плацебо и с внутривенным введением клеток костного мозга 35,81,6% и 0,340,03 - в группе после интрамиокардиальной трансплантации МФКАКМ и  6,02,6% и  0,110,02 в группе после интрамиокардиальной трансплантации культивированных ММСКАКМ.

Через  6 месяцев после  лечении  хронической ишемии миокарда и постинфарктного кардиосклероза сердца кроликов опытной группы значительно отличались от контроля и группы. получавших плацебо: размеры сердца  были меньше, на передней стенке и верхушке левого желудочка видны мелкие рубцы и не выявлялось аневризмы. Индекс дилатации в группах соответственно составил: 0,130.03  и  0,190,03.

Гистологическая характеристика миокарда. Было выявлено, что при моделировании и  лечении острого инфаркта  миокарда что интрамиокардиапьная трансплантация и МФКАКМ приводила через 12 месяцев  к формированию принципиально отличной от  контрольной группы морфологической структуры миокарда. После трансплантации культивированных ММСКАКМ наблюдалась картина мелкоочагового склероза с последующим восстановлением структуры миокарда. Интрамиокардиальная  трансплантация  МФКАКМ сопровождалась формированием фиброзной аневризмы с поражением  не только левого но и правого желудочка.

Через 6 месяцев  при лечении хронического кардиосклероза в контрольных группах гистологически определялся трансмуральный  рубец с большим количеством фибробластов и коллагеновых волокон., а в опытной группе - у половины животных -  субэндокардиальные  рубцы (фиброз),  и  островки субэпикардиального фиброза, не распространяющиеся на межжелудочковую перегородку, у другой половины животных  имелся  участок ограниченного небольшого  не полностью трансмурального рубца (присутствовал слой кардиомиоцитов со стороны эндокарда. В зоне повреждения отмечалось множество функционирующих кардиомиоцитов, окруженных большим  количеством регулируемого типа мелких сосудов с периваскулярным фиброзом.

Оценка безопасности методов стимуляции ангиогенеза в ишемизированном миокарде. Интраоперационная, послеоперационная летальность во всех сравниваемых группах достоверно не различались и составили соответственно в среднем 103% и 104 %. Количество гнойно-воспалительных осложнений со стороны зоны операции в группах животных, получавших интрамиокардиальную трансплантацию клеток костного мозга  было достоверно (p< 0,05) ниже , чем в других группах.  Через 1- 2 года после интрамиокардиальной трансплантации клеток костного мозга и ФРС макроскопически у животных  при осмотре внутренних органов  не было выявлено признаков злокачественных новообразований, а в местах трансплантации клеток костного мозга не обнаружено их патологической дифференцировки.

Влияние цитомединов на  развитие органотипической культуры  миокарда новорожденных крыс. В группе, где в культуральную среду добавлялся  цитомедин кордиален, наблюдалась достоверная (p<0,05) стимуляция зоны роста: ИП увеличивался на 525 % по сравнению с ИП контрольной группы. Остальные  исследуемые  препараты вызывали незначительные вариации  значений ИП, практически не отличающиеся от ИП контрольной группы.

Результаты пилотного исследования интракардиальной трансплантации МФКАКМ в комплексном хирургическом лечении больных ПКС.

Результаты культивирования клеток костного мозга  в  сравниваемых возрастных группах  оказались  схожими и доказали  наличие как  ГСК, так и МСК. После 14 дневного культивирования клеток  костного мозга в  питательной среде на основе  метилцелюлозы  во всех случаях формировались типичные колонии  предшественников гемопоэза. Среднее количество колониеобразующих единиц (КОЕ ГМ и БОЕ Э) у больных ПКС  не отличалось в сравниваемых возрастных группах и соответствовало  показателям  здорового человека. Цитофлюориметрическим методом было показано, что среди ядросодержащих клеток костного мозга  число CD 34+ клеток составляло в среднем 2,10,6% и также  не различалось в сравниваемых возрастных группах больных ПКС. Культивированные стромальные клетки костного мозга 2-5 пассажа представляли собой гетерогенную популяцию адгезивных к пластику клеток, имеющих в суспензии после ферментативной обработки диаметр 15-80 мкм. Через 3 недели культивирования по данным иммунофенотипирования эксплантированные стромальные клетки  могли быть отнесены к МСК.

Интраоперационный период. Длительность процедуры миелоэксфузии составила в среднем 144 минуты. Ни в одном случае каких-либо осложнений, связанных с забором костного мозга, не отмечено. Время выделения  мононуклеарной фракции клеток костного мозга составило от 80 до 119 (в среднем 10019) минут, поэтому  подготовка трансплантата не требовала удлинения обычных сроков кардиохирургического вмешательства. Трансплантация клеток осуществлялась интрамиокардиально + в дистальный отдел  аорто- или маммарокоронарного анастомоза  у 3 пациентов,  интрамиокардиально + селективно в коронарные артерии -  у 7 пациентов. Длительность процедуры клеточной трансплантации составила от 4 до 8 (в среднем 62) минут. Гематом и кровотечения в зонах интрамиокардиальной клеточной трансплантации не отмечено. У 6 больных  наблюдалось самостоятельное восстановление сердечной деятельности, 4 больным  потребовалась дефибрилляция. Синусовый ритм  зарегистрирован у 8 пациентов (в том числе у одного  больного,  имевшего перед операцией  постоянную форму мерцательной аритмии),  фибрилляция предсердий  - у 2 пациентов (в том числе у одного больного с митральным пороком и дилатацией левого предсердия, имевшего перед операцией синусовый ритм). Адренергическая поддержка в связи с миокардиальной слабостью потребовалась 4 пациентам. Длительность оперативного вмешательства в обследуемой группе пациентов не отличалась от обычных  показателей.

Послеоперационный госпитальный период. Длительность пребывания  больных обследованной группы  в реанимационном отделении составила (в среднем 2,3 1,5 суток, а продолжительность всего  послеоперационного госпитального этапа в среднем 203суток. Необходимость в  применении симатомиметиков и (или) адреномиметиков в первые 1-3 суток после операции, в связи с признаками миокардиальной слабости левого желудочка сердца, имела место  у  4  пациентов. По данным инструментального исследования  отмечалось улучшение показателей внутрисердечной гемодинамики и перфузии миокарда в зонах клеточной интрамиокардиальной трансплантации,  не было выявлено заметных отрицательных отклонений от обычного течения,  хотя и обращало на себя внимание развитие транзиторных нарушений ритма  у 3 (30) % больных в период с 3 по 10 сутки: у  одного пациента - пароксизмальное трепетание предсердий, у двух - множественные предсердные или желудочковые экстрасистолы, которые были купированы  применением антиаритмических препаратов. Улучшение в самочувствии  перед выпиской из стационара отмечали  все пациенты. К этому моменту показатели у них  клинического и биохимического  анализа крови и мочи не отличались от нормальных.

Обследование в отдаленный срок  (1-3 года) после трансплантации. Из 10  пациентов живы 9 больных, одна больная умерла через 11 месяцев после операции от острого нарушения мозгового  кровообращения (со слов родственников). Улучшение состояния по сравнению с дооперационным периодом отмечали  все больные. 2 пациентов  относятся к  I ФК, 6 пациентов - ко II ФК, 1 пациент - к III ФК по классификации  NYHA. Стенокардия напряжения сохраняется у 2 больных, но выражена  меньше, чем перед операцией. Динамика показателей клинико-инструментального обследования представлена в таблице 3.

Таблица 3

Динамика показателей клинико-инструментального обследования у больных ПКС - участников  пилотного исследования через 12месяцев после

кардиохирургического вмешательства

Период	ФК по NYHA	Стенокардия напряжения	ЭКГ	ЭхоКГ	ОФЭКТ
Исходно перед операцией	3,00,4	n=7	Коронарная недостаточность n=4, нарушения реполяризации n=4	ФВ  55,216,4% ФУ  29,13,5%	Снижение перфузии миокарда в среднем  на 50,8 12,8,%; количество сегментов  с гипоперфузией в среднем 7,12,2
Через 12 месяцев после операций	2,10,5*	n=2*	улучшение  n=9	ФВ  66,57,4%* ФУ 36,13,5%*	Снижение перфузии  миокарда в среднем 36,8 11,3 %*; количество сегментов с гипоперфузией от 3,61,8*

Примечание: n-количество больных, ФВ - фракция выброса левого желудочка сердца, ФУ - фракция укорочения, * достоверность различия сравниваемых показателей  p<0,05

По данным ЭХоКГ функция искусственных клапанов сердца на  момент  обследования была  у всех пациентов удовлетворительной, не отмечалось признаков тромбоза, инфекционного (протезного) эндокардита или парапротезной фистулы. У всех больных по сравнению с предоперационным  периодом уменьшились размеры камер сердца и улучшились показатели внутрисердечной гемодинамики. Улучшение сократительной способности миокарда (возрастание ФВ и ФУ) зарегистрировано у 7 пациентов. Ни в одном случае в местах интрамиокардиальной трансплантации МФКАКМ не отмечено возникновения зон гипо- и акинезий или патологических  участков фиброза, кальциноза, оссификации. По данным ОФЭКТ улучшение перфузии миокарда по сравнению с дооперационным периодом  отмечено у 7 пациентов, что проявилось в снижении степени  и площади нарушения перфузии. В зонах интрамиокардиальной инъекций клеточных трансплантатов улучшение перфузии отмечено у всех больных, а в зонах интракоронарного введения клеток у 2 из 4 пациентов. Выраженная  положительная динамика  перфузии  миокарда наблюдалась после клеточной трансплантации даже в зонах рубцовых (постинфарктных) изменений миокарда (рис.3).

  А B C  0%  100%

Рис.3 Динамика перфузионных полярных томосцинтиграмм миокарда левого желудочка  у больного А.,55 лет после протезирования аортального клапана и интрамиокардиальной трансплантации МФКАКМ в зону постинфарктного рубца.

Обозначение: А- до операции, B- через  12 месяцев  , С - через 36 месяцев после операции. Стрелка указывает на резкий дефект перфузии задней стенки миокарда левого желудочка в зоне постинфарктного рубца. Шкала  перфузии от 0 % до 100%

 

Данные иммунологического исследования показали, что у всех больных к этому сроку отмечалась положительная динамика в показателях иммунограммы: в клеточном  звене иммунитета - повышение  CD4/CD8 (Т-хелперы /Т-цитотоксические лимфоциты)  и снижение CD4/CD8 было менее выражено, чем перед операцией и  сохранилось только  у 2 из 5  пациентов;  возросла  функциональная активность лейкоцитов (РТМЛ)- снижение спонтанной миграции гранулоцитов сохранилось у 3 из  8 пациентов, а  снижение  спонтанной миграции мононуклеаров - у 4 из 9 пациентов, снижение индекса торможения миграции гранулоцитов у 4 из 8  пациентов,  снижение индекса торможения миграции мононуклеаров у 3 из 9 пациентов; нормализовалась поглотительная активность нейтрофилов; перестали регистрироваться нарушения в гуморальном звене иммунитета.

Выводы

1. У больных  ПКС, до хирургической коррекции, выявлялось нарушение кровоснабжения миокарда преимущественно на уровне мелких сосудов: среди  пациентов, имевших клинико-электрокардиографические признаки хронической коронарной недостаточности,  лишь в 23% случаев по данным коронарографии отмечался гемодинамически значимый стеноз коронарных артерий, а по данным ОФЭКТ у всех обследованных пациентов зарегистрирована различной степени гипоперфузия миокарда,  которая  только у  8 % больных была обусловлена стенозированием проксимального отдела коронарных русла.

2. Клинически микрососудистая ишемия (гипоперфузия) миокарда у половины больных ПКС проявлялась как кардиальный синдром X, в остальных случаях протекала скрытно.

3. Возникновение микрососудистой ишемии миокарда у обследованных больных ПКС  объяснялось комплексом причин: снижением интрамурального кровотока, вызванного перенапряжением миокарда и нарушенной внутрисердечной и системной гемодинамикой вследствие ПКС, ремоделированием миокарда (гипертрофия, кардиосклероз), выявленного у  96 % больных, наличием метаболического синдрома (отдельные признаки  зарегистрированы у 64 % пациентов) и поэтому носило функционально-органический характер.

4.У обследованных больных с исходным выраженным и
резким снижением перфузии миокарда после стандартной хирургической коррекции ПКС было отмечено более тяжелое течение послеоперационного (госпитального) периода, чем у больных,  имевших исходно незначительную или умеренную гипоперфузию: в 2,8 раза чаще возникали нарушения  сердечного ритма,  в 2,2 раза чаще развивалась острая миокардиальная слабость, требующая медикаментозной коррекции, в 1,3 раза  дольше были сроки пребывания в реанимационном отделении и стационаре, только у этих пациентов имела место ранняя послеоперационная летальность.

5. В данном исследовании выполнение  гемодинамически эффективной  стандартной хирургической коррекция ПКС позитивно влияло на перфузию миокарда у большинства больных: через 1 год после операции у 65% обследованных пациентов выявлено ее улучшение вплоть до нормализации,  однако у 27%  пациентов динамики не отмечено и даже  было ее ухудшение у 8% пациентов; при этом улучшение перфузии в 100% случаев наблюдалось в участках миокарда с исходной незначительной и умеренной гипоперфузией и только в 10% случаев - в участках с исходной выраженной и резкой гипоперфузией.

6. В проведенных экспериментах в условиях моделирования острого инфаркта миокарда интрамиокардиальное  введение факторов роста сосудов, трансплантация МФКАКМ и культивированных ММСКАКМ достоверно, по сравнению с контролем и плацебо,  улучшали перфузию миокарда и усиливали васкуляризауцию в зоне повреждения, причем выраженнее эффект наблюдался после клеточной трансплантации. Системное внутривенное введение МФКАКМ и культивированных ММСКАКМ не влияло на указанные показатели. Только интрамиокардиальная трансплантация культивированных ММСКАКМ положительно влияла на ремоделирование миокарда в зоне повреждения, уменьшая размеры и глубину постинфарктного рубца, препятствуя дилатации левого желудочка, сохраняя его систолическую функцию, тогда как интрамиокардиальная трансплантация МФКАКМ, сопровождалась обратным эффектом.

7. В проведенных экспериментах в условиях моделирования хронической ишемии миокарда (постинфарктного кардиосклероза) у кроликов интрамиокардиальная трансплантация МФКАКМ оказывала достоверно выраженный терапевтический эффект по сравнению с контролем и плацебо: улучшала перфузию и васкуляризацию поврежденного миокарда, его сократительную способность, уменьшала дилатацию левого желудочка, сопровождалась репарацией рубцовой зоны.

8.  В указанных экспериментах интрамиокардиальная трансплантация  кроликам как МФКАКМ, так  и культивированных ММСКАКМ была безопасна: не повышала интраоперационной, послеоперационной летальности и частоты послеоперационных аритмий по сравнению с контрольной и плацебо контролируемыми группами, а количество гнойно-воспалительных осложнений было достоверно меньше. При длительном (до 2 лет) наблюдении за животными, которым выполнена интрамиокардиальная трансплантация  клеток костного мозга,  не зарегистрировано возникновения в миокарде зон патологической клеточной дифференцировки (оссификации и т.д.), а также при макроскопическом осмотре не выявлено признаков злокачественных новообразований во внутренних органах.

9.        Среди исследованных цитомединов только кордиален,
полученный из тканей сердца, стимулировал развитие
органотипической культуры миокарда, тогда как действие
цитомединов, полученных из тканей других органов (тималин,
гепатилен, эпиталамин) не отличалось от контроля.

10. Костный мозг грудины у больных ПКС даже пожилого возраста сохраняет свою функциональную активность, содержит ГСК и МСК  и пригоден для целей клеточной трансплантации.

11. Результаты проведенного пилотного исследования и
проспективного (2,5- 3 года после трансплантации) наблюдения за
10 больными ПКС, которым выполнена интракардиальныая
трансплантация МФКАКМ в комплексном хирургическом
ечении порока, показали воспроизводимость, безопасность метода и возможность улучшения с его  помощью перфузии миокарда в зонах ишемии, не обусловленных стенозом (или окклюзией) проксимального отдела коронарного русла.

  ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. У больных ПКС перед хирургической коррекцией порока с целью выбора адекватного метода реваскуляризации миокарда необходима всесторонняя оценка его кровоснабжения, поэтому целесообразно данные коронарографии дополнять исследованием перфузии миокарда с помощью ОФЭКТ.

2. Исследование перфузии миокарда с помощью ОФЭКТ целесообразно использовать в комплексной клинико-инструментальной оценке отдаленных результатов хирургического лечения больных ПКС, т.к. это объективно отражает степень репарации кровоснабжения сердечной мышцы и может быть использовано при прогнозировании развития  у пациентов сердечной недостаточности.

3. У больных ПКС при наличии участков миокарда со снижением перфузии более чем  на 50% и не обусловленных стенозированием (или окклюзией) проксимального отдела коронарных артерий,  при проведении стандартной хирургической корреции порока целесообразно в зонах гипоперфузии дополнительно использовать методы стимуляции неоангиогенеза .

4. При разработке клинических аспектов использования клеточной терапии  в лечении острейшей фазы инфаркта миокарда для достижения лучшего репаративного эффекта  целесообразно применять интрамиокардиальную трансплантацию культивированных  ММСКАКМ и противопоказано интрамиокардиальное введение  МФКАКМ в зону повреждения.

5. При разработке клинических аспектов использования клеточной терапии в лечении хронической ишемии миокарда (постинфарктного кардиосклероза) для улучшения перфузии и репарации в зоны повреждения целесообразно применять интрамиокардиальную трансплантацию в нее МФКАКМ.

6. Использовать системное внутривенное введение клеток  аутологичного мозга в лечении острейшей фазе инфаркта миокарда  и хронической  его ишемии нецелесообразно, т.к. при этом  не отмечается терапевтический эффект.

7. Целесообразно изучить перспективу использования тканеспецифичного цитомедина кардиолен  и других цитаминов, полученных из тканей сердца,  при проведении клеточной кардиомиопластики для улучшения результатов.

8. Для дополнительной реваскуляризации миокарда в комплексное стандартное хирургическое лечение больных ПКС  по показаниям целесообразно включать интракардиальную трансплантацию МФКАКМ.

9. При одновременном использовании интракардиальной  клеточной трансплантации в комплексе со стандартным хирургическим лечением больных  ПКС миелоэксфузию удобнее выполнять из грудины.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1.Давыденко В.В., Мачс В.М. Стимулированный ангиогенез - новое направление в лечении ишемических состояний  // Вестник  хирургии. - 2000.- Т.159, №1.- С.117-120.

2. Чалисова Н.И., Хавинсон В.Х., Давыденко В.В., Доровский А.А., Вербовая Т.А., Пеннияйнен В.А. Влияние цитомединов на развитие органотипичесой культуры различных тканей внутренних органов крысы // Цитология.- 2000.- Т.42, №12.- С.1144-1147.

3. Давыденко В.В., Мачс В.М., Томсон В.В., Власов  Т.Д., Дымань Е.Н., Вербовая Т.А. Возможность стимуляции ангиогенеза при ишемии препаратом эмбриональной мозговой ткани человека (первые экспериментальные результаты) // Вестник хирургии.- 2001.-Т.160, №5.-С.37-40.

4. Давыденко В.В., Чалисова Н.И., Доровский А.А., Вашукова А.С. Трансплантация эмбрионального миокарда в эксперименте // Вестник хирургии.- 2001.-Т.160, №5.- С.41-44.

5. Давыденко В.В, Гриценко В.В., Орловский П.И., Азовцев Р.А., Дегтерева О.А., Астафьева О.В., Лапекин С.В., Матюков А.А., Урусова М.А Особенности  ишемии миокарда у больных пороками клапанов сердца // Регионарное кровообращение и микроциркуляция.- 2006.- №4.- С.64-68.

6. Матюков А.А., Цупкина Н.В., Давыденко В.В., Гриценко В.В., Власов Т.Д., Ялфимов А.Н., Пинаев Г.П. Сравнительное влияние интрамиокардиальной аутотрансплантации клеток костного мозга на репарацию миокарда кроликов после инфаркта // Клеточная трансплантология и тканевая  инженерия.- 2007.- Т.II, №1.- С.43-48.

7. Давыденко В.В. Динамика перфузии миокарда у больных пороками клапанов сердца после хирургической коррекции порока // Регионарное кровообращение и микроциркуляция.- 2007.- №2 .-С.38-44.

8. Давыденко В.В. Влияние состояния миокардиальной перфузии на течение раннего послеоперационного периода у больных, оперированных по поводу порока клапанов сердца // Вестн. хирургии .- 2007.- Т.166, №2.- С.11-15.

9. Давыденко В.В., Гриценко В.В., Афанасьев Б.В., Пизин В.М., Мочалов О.Ю., Дегтерева О.А., Матюков А.А. Интракардиальная трансплантация мононуклеарных клеток аутологичного костного мозга в комплексном лечении больных пороками  клапанов сердца // Вестн. хирургии .- 2007.- Т.166, №3.-С. 16-21.

10. Давыденко В.В., Матюков А.А., Цупкина Н.В., Власов Т.Д., Гриценко В.В., Кузнецов А.А., Аминева Х.К., Деев Р.В., Ялфимов А.Н., Пинаев Г.П. Влияние аутотрансплантации различных клеток костного мозга на морфофункциональное состояние миокарда кролика после инфаркта // Клеточная трансплантология и тканевая  инженерия.- 2007.- Т.II, №2.- С.52-61.

11. Николаенко Н.С., Зенин В.В., Цупкина Н.В., Чистякова И.А., Матюков А.А., Давыденко В.В., Пинаев Г.П. Характеристика культивируемых стромальных клеток костного мозга больных приобретенными  пороками клапанов сердца // Материалы международного симпозиума Стволовые клетки, регенерация. Клеточная терапия. Цитология.- 2004.-Т.46, №10.- С.930-931.

12. Гриценко В.В., Афанасьев Б.В., Давыденко В.В., Фрегатова Л.М., Ганапеев А.А., Бабенко Е.В.. Дегтерева О.А., Кузнецов А.А., Матюков А.А., Жирехина О.В. Трансплантация аутологичных клеток костного мозга в комплексном лечении больных  приобретенными пороками клапанов сердца // Бюл. НЦССХ им. А.Н.Бакулева.- 2005.- Т.6, №3 (Приложение). - С.181.

13. Гриценко В.В., Власов Т.Д., Давыденко В.В., Матюков А.А., Цупкина Н.В., Пинаев Г.П. Влияние интрамиокардиальной трансплантации аутологичных клеток костного мозга на течение экспериментального инфаркта миокарда // Бюл. НЦССХ им. А.Н.Бакулева.- 2005.- Т.6, №5 (Приложение). - С.298.

14. Цупкина Н.В., Матюков А.А., Ялфимов А.Н., Савченко О.Н., Тютин Л.А., Власов Т.Д., Гриценко В.В., Давыденко В.В., Пинаев Г.П. Влияние интрамиокардиальной  аутотрансплантации клеток костного мозга на кровоснабжение ишемизированного миокарда в эксперименте // Тезисы всероссийского симпозиума л Биология клетки в культуре. Цитология.-2006.-Т.48, №9.- С.809.

15. Матюков А.А., Гриценко В.В., Власов Т.Д.,  Давыденко В.В.,  Тютин Л.А., Ялфимов А.Н.,  Иванова А.А.,  Цупкина Н.В., Пинаев Г.П. Оценка степени перфузии ишемизированного миокарда с исполтьзованием ОФЭКТ в эксперименте // Бюл. НЦССХ им. А.Н.Бакулева.- 2006.-Т.7, №5 (Приложение). - С.267.

16. Давыденко В.В., Гриценко В.В., Матюков А.А., Аминева Х.К., Цупкина Н.В.,Ялфимов А.Н. Влияние интрамиокардиальной аутотрансплантации мононуклеарных клеток костного мозга на экспериментальную хроническую ишемию миокарда и постинфарктный кардиосклероз //  Бюл. НЦССХ им. А.Н.Бакулева.- 2007.-Т.7, №5 (Приложение). - С.267.

17.Давыденко В.В., Гриценко В.В., Матюков А.А. Способ лечения больных пороками клапанов сердца: Патент РФ № 2311140 // Бюл. изобрет. -2007.- №33 .

18. Davidenko V.V., Chalisova N.I., Dorovskij A.A., Rijov D.V. Survival of myocardial tissue organotypic culture in the mesenterium of rat // Pathophysiology.- 1998.-Vol.5 (Suppl 1).- P.29.

19. Давыденко В.В., Чалисова Н.И., Вербовая Т.А., Доровский А.А., Сонин Д.Л. Влияние цитомединов на органотипическую культуру тканей, используемых для трансплантации // Актуальные проблемы сердечно-сосудистой, легочной и абдоминальной хирургии.: Сб. трудов научной конф., посвященной 95-летию со дня рождения  академика  РАМН Ф.Г.Углова.- СПб., Изд-во СПбГМУ, 1999 .- С.48-49.

20. Давыденко В.В., Чалисова Н.И., Доровский А.А., Вербовая Т.А. Трансплантация эмбрионального миокарда в эксперименте // Актуальные проблемы сердечно-сосудистой, легочной и абдоминальной хирургии.:Сб. трудов научной конф., посвященной 95-летию со дня рождения  академика  РАМН Ф.Г.Углова. - СПб., Изд-во СПбГМУ, 1999 .- С.49-50.

21. Мачс В.М., Давыденко В.В. Стимуляция ангиогенеза  в условиях экспериментальной ишемии // Актуальные проблемы сердечно-сосудистой, легочной и абдоминальной хирургии.: Сб. трудов научной конф., посвященной 95-летию со дня рождения  академика  РАМН Ф.Г.Углова. - СПб., Изд-во СПбГМУ,1999 .- С.99..

22. Давыденко В.В., Мачс В.М. Перспективы  применения  лечебного ангиогенеза в сердечно-сосудистой хирургии // Актуальные вопросы  грудной, сердечно-сосудистой и абдоминальной хирургии.: Сб. тезисов юбилейной научно - практ.  конф., посвященной 100-летию кафедры госпитальной хирургии СПбГМУ им. акад.И.П.Павлова.- СПб., Человек, 2001 .- С.38-39.

23. Давыденко В.В., Мачс В.М., Томсон В.В., Власов  Т.Д., Вербовая Т.А. , Дымань Е.Н. Стимуляция ангиогенеза в ишемизированных тканях крыс// Актуальные вопросы  грудной, сердечно-сосудистой и абдоминальной хирургии.: Сб. тезисов юбилейной научно-практ. конф., посвященной 100-летию кафедры госпитальной хирургии СПбГМУ им. акад.И.П.Павлова.-СПб., Человек, 2001 .- С.39-40..

24. Гриценко В.В., Афанасьев Б.В., Давыденко В.В., Матюков А.А., Жирехина О.В. Трансплантация аутологичных клеток костного мозга в комплексном лечении больных  с приобретенными пороками клапанов сердца // Достижения и трудности современной кардиологии: Материалы научной конференции. М.: Анахарсис, 2005.- С.44-45..

25. Yaitskii N., Smirnov A., Gritsenko V., Afanasyev B., Davidenko V., Fregatova L., Ganapejev A., Babenko E., Kuznetsov A., Matyukov A., Zherekhina Intracardial transplantation of  bone marrow autologous cells - new approach to the treatment of patients with acquired valvular heart disease // 7th symposium of world artifical organ, immunology and transplantation society  (book of abstracts).- SPb., 2005 .- P.107-108.

26. Гриценко В.В., Давыденко В.В., Дегтерева О.А., Астафьева О.В.,  Шевякова Е.В., Жирехина О.В., Матюков А.А. Однофотонная эмиссионная компьютерная томография в оценке кровоснабжения миокарда у больных пороками клапанов сердца // Роль лучевой диагностики в многопрофильной клинике и лечебных учреждениях стоматологического профиля.: Сб. науч. работ юбилейной конференции, посвященной 60-летию кафедры рентгенологии и радиологии СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова.- СПб., Изд-во СПбГМУ, 2005- С.56-57.

27. Ялфимов А.Н., Тютин Л.А., Савченко О.Н., Матюков А.А., Давыденко В.В., Гриценко В.В., Власов Т.Д., Цупкина Н.В.,  Пинаев Г.П. Использование ОФЭКТ с 99mTc-тетрофосмином в оценке влияния трансплантации различных типов клеток на перфузию ишемизированного  миокарда в эксперименте // Новые технологии в ядерной медицине: Материалы науч. конф. с международным участием.- СПб., 2006.- С.59-60.

28. Давыденко В.В., Гриценко В.В., Афанасьев Б.В., Орловский П.И., Дегтерева О.А., Матюков А.А. Интракардиальная аутотрансплантация мононуклеарных клеток костного мозга в комплексном лечении больных пороками клапанов сердца // Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии: Материалы III- го Всероссийского симпозиума с международным участием.- М., 2007.- С.164.

29.  Давыденко В.В.,  Матюков А.А., Власов Т.Д., Цупкина Н.В., Пинаев Г.П., Ялфимов А.Н.  Влияние аутотрансплантации различных клеток костного мозга на состояние поврежденного миокарда в разные сроки после инфаркта // Стволовые клетки: законодательство, исследования и инновации. Международные перспективы сотрудничества: Материалы Британско-российского совещания в сотрудничестве с Европейской комиссией. - М., 2007. - С.10.

30.  Давыденко В. В., Гриценко В.В., Афанасьев Б.В., Орловский П.И., Матюков А.А. Интракардиальная  аутотрансплантация мононуклеарных клеток костного мозга в реваскуляризации миокарда у больных пороками клапанов сердца // Высокотехнологичные методы диагностики и лечения сердечно-сосудистых и эндокринных заболеваний: Материалы всероссийской научно-практической конференции с международным участием.- СПб., 2007.- С.37

СПИСОК ОСНОВНЫХ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ:

ГСК - гемопоэтическая стволовая клетка

МСК - мезенхимальная стволовая клетка

МФКАКМ - мононуклеарная фракция клеток аутологичного костного мозга

ММСКАКМ - мультипотентная мезенхимальная стромальная клетка  аутологичного костного мозга

ФРС - факторы роста сосудов

ЭКГ- электрокардиография

ЭхоКГ - эхокардиография

ОФЭКТ - однофотонная эмиссионная компьютерная томография

ПКС - порок клапанов сердца

МП - митральный порок

АП - аортальный порок

ИБС - ишемическая болезнь сердца

АКШ - аортокоронарное шунтирование

РФП - радиофармацевтический  препарат

ИКС - искусственный клапан сердца

ФК - функциональный класс

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине