Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

Прушинский Алексей Петрович

Микробиологическая и молекулярно-генетическая

характеристика штаммов Haemophilus influenzae,

выделенных у детей с туберкулезной инфекцией

03.02.03 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Владивосток - 2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Владивостокский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, ГБУЗ Приморская детская краевая клиническая туберкулезная больница, г. Владивосток

Научный руководитель:  доктор медицинских наук, доцент

Мартынова Алина Викторовна

Официальные оппоненты:

Тимченко Нелли Фёдоровна, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ НИИЭМ СО РАМН, руководитель лаборатории молекулярных основ патогенности бактерий

Холодок Галина Николаевна, кандидат медицинских наук, Хабаровский филиал ФГБУ ДН - ФПД СО РАМН - НИИ ОМиД, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится 4 мая  2012 г. в  13.00 часов на заседании диссертационного совета ДМ208.007.02 при ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития РФ по адресу: 690002 г. Владивосток, ГСП, проспект Острякова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития РФ

Автореферат разослан 3 мая 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета  Шаркова Валентина Александровна

Общая характеристика работы

Актуальность темы: До сих пор, несмотря на достигнутые результаты в диагностике и лечении этой инфекции, заболеваемость туберкулезом среди детского населения продолжает оставаться на достаточно высоком уровне. Несмотря на постоянно совершенствующиеся схемы лечения с применением противотуберкулезных химиопрепаратов, течение туберкулезной инфекции обладает значительным клиническим полиморфизмом, сопровождаясь выраженным снижением иммунного статуса, что, в свою очередь, как осложняет течение основного заболевания, так и характеризуется развитием различных интеркуррентных инфекций, несмотря на активно применяемые противотуберкулезные химиопрепараты.

Основными сопутствующими инфекциями, развивающимися у детей, находящихся на длительной противотуберкулезной химиотерапии, являются инфекции верхних и нижних дыхательных путей. В связи с этим немаловажное значение приобретает изучение особенностей их микробиоценоза, в первую очередь микробиологических и эпидемиологических характеристик основных возбудителей инфекций дыхательных путей нетуберкулезной этиологии. Установлено, что лидирующие позиции в заболеваемости инфекциями верхних и нижних дыхательных путей занимают инфекции, вызванные Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella cattarrhalis. Наименее изученным аспектом данной проблемы являются особенности распространения гемофильной инфекции у детей с туберкулезом, в том числе вопросы носительства штаммов рода Haemophilus у таких пациентов. Не менее важным оказывается и отсутствие информации о микробиологических характеристиках: особенностях факторов патогенности и антибактериальной устойчивости штаммов гемофил, выделенных у пациентов с туберкулезной инфекцией. Не охарактеризованы микробиологические и молекулярно-генетические аспекты формирования микробиоценоза дыхательных путей у детей с туберкулезной инфекцией.

Таким образом для организации противоэпидемических мероприятий, а также для совершенствования основных фармакологических формуляров лечения детей c туберкулезной инфекцией, важным является изучение сопутствующих бактериальных инфекций дыхательных путей среди данной группы пациентов, в первую очередь эпидемиологических и микробиологических особенностей распространения штаммов H. influenzae  и S. pneumoniae. Учитывая ограниченность информации в отношении микробиологических характеристик H. influenzae, выделенных от детей с туберкулезом, перспективным представляется именно этого возбудителя, что позволит, в конечном итоге охарактеризовать микробиоценоз дыхательных путей у детей с туберкулезом и организовать проведение профилактических мероприятий.

Цель исследования: изучение микробиологических и молекулярно-генетических особенностей штаммов H. influenzae, выделенных у детей с туберкулезом, с целью разработки рекомендаций по рациональной антимикробной химиотерапии и обоснования профилактических мероприятий

Задачи исследования:

1. Оценить этиологическую структуру микробиоценоза респираторного тракта у детей с туберкулезом, определить роль H. influenzae в развитии сопутствующих респираторных инфекций.
2. Оценить популяционную структуру штаммов H. influenzae, выделенных у детей с туберкулезной инфекцией.
3. Оценить чувствительность к антибактериальным химиопрепаратам штаммов H. influenzae, выделенных у детей с туберкулезной инфекцией.
4. Изучить особенности факторов патогенности штаммов H. influenzae, выделенных у детей с туберкулезной инфекцией и у носителей.
5. Провести сравнительный геномный анализ основных возбудителей сопутствущих респираторных инфекций для характеристики и дальнейшего прогнозирования формирования микробиоценоза дыхательных путей у детей с туберкулезной инфекцией.

Научная новизна исследований:

1. Определена этиологическая структура носительства бактериальных возбудителей сопутствующих респираторных инфекций у детей с туберкулезной инфекцией, отмечены различия в частоте выявляемости бактериальных патогенов респираторного тракта в сравнении с детьми без туберкулезной инфекции.
2. Проведен эпидемиологический анализ заболеваемости сопутствующими респираторными инфекциями, вызванными H. influenzae  и другими бактериальными патогенами респираторного тракта у детей с туберкулезной инфекцией и без нее.
3. Проведен клинико-микробиологический и молекулярно-генетический мониторинг штаммов H. influenzae, выделенных от детей с туберкулезной инфекцией и без нее с оценкой экспрессии факторов патогенности и основных генов, обусловливающих ее развитие.
4. Охарактеризовано состояние чувствительности к антибактериальным химиопрепаратам штаммов H.  influenzae, выделенных от детей с туберкулезной инфекцией и без нее.
5. Охарактеризованы молекулярно-генетические особенности формирования микробиоценоза дыхательных путей у детей с туберкулезной инфекцией и у носителей штаммов гемофил без туберкулеза.

Практическая ценность работы

Данные об этиологической структуре возбудителей сопутствующих респираторных инфекций у детей с туберкулезом позволили получить представление об эпидемиологической ситуации по заболеваемости инфекциями дыхательных путей нетуберкулезной этиологии у детей с туберкулезной инфекцией. Проведенный мониторинг антибиотикорезистентности выделенных штаммов H. influenzae, доминирующих в структуре возбудителей инфекций дыхательных путей, позволил получить представление об эффективности общепринятой и проводимой антибиотикотерапии, а также, учитывая механизм формирования  устойчивости к антибактериальным средствам, определить возможность коррекции фармакологического формуляра лечения инфекций дыхательных путей у детей с туберкулезной инфекцией. Изучение популяционной структуры возбудителей сопутствующих респираторных инфекций у детей с туберкулезом с определением видовой и серотиповой характеристики штаммов гемофил позволило корригировать противоэпидемические мероприятия в отношении данных инфекций у детей с туберкулезной инфекцией.

По материалам диссертации выпущены методические рекомендации Микробиологическая характеристика штаммов H. influenzae  у детей с туберкулезной инфекцией и Эпидемиологические особенности циркуляции штаммов H. influenzae  у детей с туберкулезной инфекцией. Результаты исследования использованы при организации мероприятий инфекционного контроля в государственных учреждениях здравоохранения Приморская детская краевая клиническая туберкулезная больница и Краевой детский противотуберкулезный санаторий №1. Материалы диссертации используются в учебном процессе при подготовке врачей на кафедре эпидемиологии ВГМУ.

Апробация научных материалов диссертации

Материалы научно-исследовательской работы изложены на постоянно действующих семинарах Актуальные вопросы госпитальной эпидемиологии (2008 год); на заседании Приморского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов; на  8-й, 10-й и 11-й Тихоокеанской международной научно-практической  конференции студентов и молодых ученых с международным участием лАктуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины (апрель, Владивосток, 2007, 2009, 2010 гг); на Европейском конгрессе клинических микробиологов (ESCMID, 2009, Helsinki);  Первом Европейском конгрессе по изучению биопленок (EUROBIOFILMS 2009, Rome, Italy); на VI-й  Международной конференции Молекулярная медицина и биобезопасность (Москва, 2009); на конференции Лабораторная медицина в свете концепции развития здравоохранения России до 2020 года (28-30 сентября, Москва 2009 года); на III международной конференции по инфекционным заболеваниям DITAN (Пекин, июль 2009); на IV международной конференции по инфекционным заболеваниям DITAN (Пекин, 2010); на Всероссийской научной конференции Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций (Санкт-Петербург, Военно-медицинская академия, 2009); на Всероссийской научной школе для молодежи Перспективы развития инноваций в биологии (ноябрь, 2009, ДВГУ, Владивосток); на V-й научно-практической конференции Инфекционная патология в Приморском крае (19-20 мая 2010 года, Владивосток); на Международном симпозиуме по изучению пневмококков и пневмококковых инфекций (ISPPD 7, Tel-Aviv, Israel, 2010); на Европейском Респираторном Конгрессе (сентябрь, 2010, Барселона); на Третьем  Съезде военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных сил РФ Достижения науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия ВС РФ (декабрь, 2010).

ичный вклад автора

Автором осуществлен сбор, систематизация и анализ материала по частоте сопутствующих респираторных инфекций у детей с туберкулезной инфекцией в Приморском крае. Лично автором проведено клиническое обследование, сбор биологического материала от больных и лиц контрольной группы. При непосредственном участии автора осуществлено выделение, идентификация и оценка чувствительности к антибиотикам полученных штаммов, проведена статистическая обработка полученных результатов.

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работы, из них статей в журналах, рекомендованных ВАК - 2.

Объем и структура диссертации традиционная. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 35 таблицами, 22 рисунками. Список литературы содержит 265 источников, из них 109 - отечественных авторов, 156 - зарубежных.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В микробиоценозе дыхательных путей у детей с туберкулезной инфекцией значительную роль играет H. influenzae, определяемый у 26,6% таких пациентов, наиболее часто выявлямый в монокультуре - в 79,16% случаев, с преобладанием типируемых штаммов (68,18%).
2. Штаммы H. influenzae, циркулирующие среди детей с туберкулезной инфекцией, характеризуются устойчивостью к антибактериальным химиопрепаратам ряда макролидов, фторхинолонов, цефалоспоринов,  с высокой долей полирезистентных штаммов - 54,1%. Выделенные штаммы, преобладающие среди нетипируемых изолятов H. influenza, характеризуются гипермутабельностью по отношению к рифампицину и фторхинолонам.
3. Среди штаммов, выделенных у детей с туберкулезом, преобладают штаммы, у которых обнаруживаются гены, определяющие колонизационную способность микроорганизмов  в дыхательных путях - lic2a и lic2b.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Контингент, материалы и методы исследования:

Контингентом для клинико-лабораторного обследования явились 90 больных детского возраста с различными проявлениями туберкулезной инфекции, находящихся на лечении в ГБУЗ Приморская детская краевая клиническая туберкулезная больница. Контрольную группу составили 40 детей с соматической патологией, находящиеся на лечении соматическом отделении МУЗ Городская детская больница №3 г. Владивостока, которые не состояли ранее в группах диспансерного учета по туберкулезу, не получали последние 3 месяца терапию антибиотиками и были корректно сопоставимы по возрасту и полу с группами наблюдения.

Материалом для изучения общей структуры респираторных инфекций среди детей с туберкулезом послужили данные медицинских карт стационарных больных 2822 пациентов. Был проведен оперативный и ретроспективный эпидемиологический анализ заболеваемости сопутствующими респираторными инфекциями детей с туберкулезной инфекцией с расчетом средней многолетней заболеваемости и показателя плотности инцидентности согласно методике Зуевой Л.В.

Основным материалом для проводимых исследований у обследуемых лиц являлось отделяемое носоглотки. Забор клинического материала осуществлялся при госпитализации пациента в стационар в течение первых суток до проведения лечения. Исследование материала проводили согласно требованиям Приказа МЗ СССР от 22.04.1985 г. №535. В работе использовались эталонные штаммы культур, полученные кафедрой эпидемиологии ВГМУ в Государственном контрольном институте биологических препаратов им. В.Г. Тарасевича.

Основными направлениями микробиологических исследования явилось выделение чистых культур микроорганизмов и их ассоциации в динамике (82 штаммов, выделенных от больных туберкулезом и 34 штамма - от здорового контингента), их идентификация, биологическая характеристика (факторы патогенности, профили чувствительности к антибиотикам). Определение антибиотикочувствительности проведено диско-диффузионным методом и методом серийных разведений у 116 штаммов в соответствии МУ 4.2.1890-04 Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам.  Определение частоты мутаций проведено  по методике Luria and Delbruck. Для подтверждения видовой принадлежности выделенных штаммов H. influenzae, генотипирования их по капсульному полисахариду и их последующего серотипирования и исследования генетических детерминант факторов их патогенности, был использован молекулярно-генетический метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

При проведении геномных исследований последовательности геномов H.ifnfluenzae, M. tuberculosis, S. pneumoniae были получены из GenBank. Получение, анализ и обработка данных были проведены при помощи специального программного обеспечения - модуля BioPerl. Определение групп гомологичных белков среди рассматриваемых штаммов было проведено с использованием программы анализа и выравнивания нуклеотидных последовательностей BlastP. Последующее сравнение геномов выполнялось с помощью пакета программ локального парного выравнивания BLAST 2.0.9.

Статистическая обработка полученной базы данных проводилась методами описательной и параметрической статистики с использованием программы Statistica 6.0, Whonet 5.1, Bionumerics 2.0,  MEGA 3.1, Agilent Bioanalyzer 2.5, LIAN 3.5. В ходе статистической обработки материалов главными показателями служили: средняя арифметическая (М), ее средняя ошибка (±m), ошибка к проценту относительной величины; кроме того, указывались точки экстремумов исследуемых величин (Аmax и Аmin), рассчитывался доверительный интервал (ДИ) с достоверностью 95%. Совокупность полученных данных проверялась на нормальность распределения (1=2, 12) с использованием критерия Колмогорова-Смирнова (K-S), критерия Лиллиефорса (L) и критерия Шапиро-Вилкса (Sh-W), а также графическим методом с построением ожидаемой кривой распределения величин. Статистическая достоверность различий параметрических величин подтверждалась парным критерием Стьюдента (Т) для изучения различий между связанными совокупностями; критерием Стьюдента (t) для одной совокупности, двусторонним критерием z c поправкой по Йетси. Для исследования непараметрических величин использовался 2 и критерий (F) Фишера (для малых выборок).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ  И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенного эпидемиологического анализа заболеваемости сопутствующими респираторными инфекциями ГБУЗ ПДККТБ в период с 2003 по 2010 годы  было установлено, что показатель заболеваемости данными инфекциями находится на уровне 284,2%оо (на 1000 пролеченных). В структуре заболеваемости преобладают острые процессы в верхних дыхательных путях - 84,3%. В динамике исследуемых лет отмечена слабовыраженная тенденция заболеваемости к росту с темпом 1,1% за счет роста заболеваемости сопутствующими респираторными инфекциями верхних дыхательных путей (темп прироста 2,7%), инфекции нижних отделов дыхательной системы, наоборот, имеют тенденцию к снижению с темпом 7,7% (рис. 1).

Рис.1. Многолетняя динамика заболеваемости сопутствующими респираторными инфекциями

В структуре сопутствующих респираторных инфекций стабильно преобладают заносные инфекции (в среднем 58,3%), заболеваемость  которыми находится на среднем уровне 165,3%оо и имеет выраженную тенденцию к росту с темпом 3,4%. Уровень заболеваемость сопутствующими внутрибольничными респираторными инфекциями находился на уровне 118,4%0, колеблясь от 94,9 до 164,9 на 1 тысячу пролеченных пациентов и имея слабовыраженную тенденцию к снижению (2,1%), в основном за счет инфекций нижних дыхательных путей с темпом снижения 5,2%.

Скорость развития данных заболеваний у детей с туберкулезной инфекций была изучена с использованием показателя плотности инцидентности, который составляет 3,63 случаев госпитальных инфекций дыхательных путей на 1000 койко-дней пребывания в специализированном стационаре. Лидирующие позиции в структуре заболеваемости респираторными инфекциями, в том числе и гемофильной инфекцией, занимают такие нозоформы, как острый ринофарингит и острый средний отит, характеризующиеся наибольшей плотностью инцидентности - 2,53 и 0,19 случая на 1000 дней госпитализации соответственно.

У  82 детей (91 %) с туберкулезом были выделены следующие виды микроорганизмов: S. pneumoniae, H. influenzae, S. pyogenes, S. galacticae, S. agalacticae, Enterococcus faecalis,  Staphylococcus spp., Candida spp., Acinetobacter baumani, Corynebacteria xerosis  В контрольной группе у 34 детей (85 %) были выявлены аналогичные по видовому составу микроорганизмы. Нами установлено, что вторым по значимости возбудителем у детей с туберкулезом являлся H. influenzae: всего было выделено 24 штамма (29,27%). При этом пневмококков в составе монокультуры было идентифицировано 24 штамма (44,4%), а штаммов H. influenzae  - 19 (35,2%) (табл. 1).

Таблица 1

Монокультура и ассоциации выделенных возбудителей

Результат микробиологического исследования	Группа 1		Группа 2
	абс	%	Абс	%
Монокультура	54	60,0	21	52,5
Ассоциации	28	31,1	13	32,5
Не выявлено	8	8,9	6	15,0
Всего исследований:	90	100	40	100

p<0,05, распределение нормальное; критерии K-S 0,18, p>0,2, L >0,2

Микробиологическая структура носительства возбудителей респираторного тракта у детей контрольной группы характеризовалась менее значительным преобладанием штаммов S. pneumoniae - их было выделено 14 (41,2%), тогда как H. influenzae выделялась относительно реже, чем в структуре носительства патогенов исследуемой группы - 6 штаммов (17,6%). При этом в составе монокультуры в контрольной группе было идентифицировано всего 8 штаммов пневмококков (38,09%), а гемофил выделено 4 штамма (19,04%). В качестве других монокультур (всего 9 штаммов) были идентифицированы: Streptococcus pyogenes - 3 штамма (14,28%), Acinetobacter baumanii - 1 штамм (4,76%), Moraxella catarrhalis - 1 штамм (4,76%), Staphylococcus aureus - 2 штамма (9,52%), Staphylococcus epidermidis - 1 штамм (4,76%), Klebsiella pneumoniae - 1 штамм (4,76%).

Среди ассоциаций микроорганизмов, выделенных у исследуемой группы детей с туберкулезом (у 28 человек) выделялись ассоциации микроорганизмов - S. pneumoniae + S. pyogenes, H. influenzae  + S.pneumoniae, H. influenzae  + S.pyogenes, S.pneumoniae + Acinetobacter baumanii, S.pneumoniae + Candida spp. При этом более чем в половине случаев (17 человек, 60,7%) в микробных ассоциациях в диагностически значимом разведении было выделено одновременно 3 и более микроорганизма, тогда как у 11 человек (39,3%)  микробная ассоциация была представлена 2 патогенами.

При анализе результатов серотипирования выделенных штаммов  H. influenzae  методом полимеразной цепной реакции было установлено, что штаммы H. influenzae  типа В составляют 33,3% в структуре всех выделенных штаммов (табл. 2). В группе штаммов, выделенных от пациентов с туберкулезом, штаммы H. influenzae типа В имеют весомое значение, хотя и не являются лидирующими. Обращает на себя внимание тот факт, что большее значение в структуре всех изолятов составляют изоляты других серотипов, а также нетипируемые штаммы (29,2%). В группе штаммов гемофил, выделенных от носителей без туберкулеза, наблюдается выделение гемофил других серотипов, а также нетипируемых гемофил в 33,3%.

Таблица 2

Серотиповая характеристика выделенных штаммов H. influenzae

Серотиповая группа	1 группа		2 группа
	Абс.	%	Абс.	%
Типируемые	15	62,5	3	50
в т.ч. тип В	8	33,3	1	16, 6
Нетипируемые	7	29,2	2	33,3
Нетипированные	2	8,3	1	0
Всего:	24	100	6	100
P<0,05

При проведении изучения устойчивости к антимикробным химиопрепаратам выделенных нами штаммов H. influenzae  в исследуемой и в контрольной группе диско-диффузионным методом нами были получены результаты, представленные в таблице 3.

Таблица 3

Резистентность к антибиотикам штаммов H. influenzae, выделенных у больных туберкулезом (всего 24 штамма)

Анти- бактериальный перепарат	Количество штаммов (% штаммов)
	1 группа			2 группа
	S, %	I, %	R, %	S, %	I, %	R, %
Ампициллин	16 (66,6)	3 (12,5)	5 (20,8)	5 (83,3)	1 (16,6)	0 (0)
Медоцеф (цефоперазон)	12 (50,0)	7 (29,1)	5 (20,8)	5 (83,3)	0 (0)	1 (16,6)
Аксетин (цефуроксим)	11 (45,83)	7 (29,1)	6 (25)	6 (100)	0 (0)	0 (0)
Медаксон (цефтриаксон)	13 (54,1)	6 (25)	5 (20,8)	6 (100)	0 (0)	0 (0)
Селемицин	15 (62,5)	5 (20,8)	4 (16,6)	5 (83,3)	0 (0)	1 (16,6)
Эритромицин	11 (45,83)	7 (29,1)	6 (25)	3 (50)	2 (33,3)	1 (16,6)
Тетрациклин	13 (54,1)	6 (25)	5 (20,8)	2 (33,3)	2 (33,3)	2 (33,3)
Норфлоксацин	19 (79,1)	2 (8,3)	3 (12,5)	3 (50)	2 (33,3)	1 (16,6)
Ципрофлоксацин	19 (79,1)	3 (12,5)	2 (8,3)	4 (66,6)	2 (33,3)	0 (0)
Рифампицин	20 (83,3)	2 (8,3)	2 (8,3)	5 (83,3)	1 (16,6)	0 ( 0)

Примечание: S-чувствительные, I-умеренно-резистентные, R-резистентные

Как видно из представленных данных, в популяции штаммов H. influenzae, полученных от детей, больных туберкулезом, значительную долю занимают штаммы, устойчивые к бета-лактамным антибиотикам. Данные результаты представляют интерес, поскольку антибиотики этой группы хотя и не входят в схему антибактериальной химиотерапии у пациентов с туберкулезом, но широко применяются у данной группы пациентов при возникновении сопутствующих респираторных заболеваний.

Изучение устойчивости H. influenzae  к препаратам фторхинолонового ряда представляет интерес, поскольку данные антибактериальные средства являются препартами резерва в лечении туберкулеза. Чувствительность к фторхинолонам у детей стуберкулезом сохраняется на достаточно высоком уровне - к ципрофлоксацину чувствительны 79,1% гемофил, к норфлоксацину также 79,1%. Среди популяции микроорганизмов, выделенных от пациентов без туберкулеза, чувствительность к фторхинолонам носит схожие тенденции.

Также необходимо отметить выявление 2 штаммов (8,3%), имеющих устойчивость к такому антибиотику, как рифампицин, а также двух штаммов (8,3%) умеренно-устойчивых штаммов.  Несмотря на то, что среди популяции микроорганизмов, выделенных от контрольной группы, таких штаммов не выявлено, наличие их в исследуемой группе позволяет предположить, что противотуберкулезная химиотерапия является достаточно сильным селективным фактором для появления полирезистентных штаммов среди возбудителей бактериальных инфекций респираторного тракта.

При характеристике антибиотикочувствительности  микроорганизмов не меньший интерес представляют и интервал минимальной подавляющей (ингибирующей) концентрации, значения которого могут колебаться даже в пределах одного вида, что может быть связано как с внутривидовой вариабельностью, так и с фармакокинетикой и фармакодинамикой  антибактериального химиопрепарата, характер предшествующего употребления антибактериальных химиопрепаратов. Одной из особенностей минимальной инигибирующей концентрации у штаммов гемофил, выделенных от носителей без туберкулеза, является более узкий диапазон минимальной подавляющей концентрации, и более низкая, чем в штаммах, выделенных от пациентов с туберкулезом, минимальная ингибирующая концентрация.

Нами установлено наличие значительной части полирезистентных изолятов в исследуемой группе, что может быть опять же объяснено селективным действием длительного применения антибактериальных химиопрепаратов (табл. 4).. Особенно актуальным является то, что полирезистентность в таких штаммах характеризуется довольно частым развитием устойчивости к более чем двум антибактериальным препаратам, тогда как в штаммах, выделенных от больных без туберкулеза - это сравнительная редкость.

Таблица 4

Распространенность полирезистентных штаммов H. influenzae

Наблюдаемая группа	Всего полирезистентных штаммов	Из них
		к 2 антибиотикам	более 2 антибиотиков
1 группа	13 (54,2%)	7 (29,2%)	6 (25%)
2 группа	1 (16,6%)	1 (16,6%)	0 (0%)

Т=7.07, p=0,00001

Для изучения скорости развития полирезистентности в штаммах исследуемых групп была изучена динамика развития мутаций, обусловливающих полирезистентность по отношению к тем или иным антибактериальным химиопрепаратам. Нами установлено, что гипермутирующие штаммы выявляются в материале, выделенном от детей с туберкулезом. Одним из возможных объяснений может служить  тот факт, что чаще всего гипермутирующими оказываются нетипируемые микроорганизмы (57,14%). Особенно актуальной гипермутабельность культуры H. influenzae  является для пациентов с туберкулезной инфекцией, равно и со всеми инфекциями дыхательных путей, потому, что ген, кодирующий устойчивость к рифампицину, ортологичен генам, кодирующим устойчивость к рифампицину таких бактериальных возбудителей дыхательных путей, как S. pneumoniae, M. tuberculosis и некоторых других.  Среди детей с туберкулезом нами было выявлено 7 штаммов H. influenzae, гипермутирующих по отношению к рифампицину, среди которых доля нетипируемых составила 57,14%,  в контрольной группе было выделено лишь 2 подобных штамма. Количество гипермутирующих штаммов по отношению к фторхинолонам составило 6 в исследуемой группе и 2 - в контрольной. Среди детей с туберкулезом пять из шести штаммов (71,4%) также относились к нетипируемым.

При анализе генома секвенированных штаммов гемофил были выявлены различия, которые определяют колонизационную способность штаммов H. influenzae. Установлено, что не все штаммы обладают одними и теми же аллелями lic-оперона: в штаммах, выделенных от детей с туберкулезной инфекцией, ген lic2a, в частности, обнаруживается в 95,83%, а в штаммах контрольной группы всего в 66,6%, по другому аллелю гена lic - гену lic2b - подобное соотношение составляет 45,83% и 16,6% соответственно. Среди гипермутириующих штаммов, выделенные от пациентов с туберкулезом в 100% случаев выявлен гены lic2a и ifE, в 57,14% - ген lic2b, в 85,7% - ген mw.

При изучении наличия и распространенности гомологичных генов у таких отдаленно родственных микроорганизмов как H. influenzae  установлено наличие гомологичных генов между такими отдаленно родственными микроорганизмами как H. influenzae  и M.tuberulcosis. К ним относятся гены, кодирующие субъединицу D фумарат редуктазы (МT1606 и NTHI0998), гены, кодирующие субъединицы C фумарат редуктазы (MT1605 и NTHI0999), субъедницу белка фумарат редуктазы, утилизирующую серно-железистые соединения (MT1604 и NTHI1000), флавопротеиновую субъединицы фумарат редуктазы (MT1603 и NTHI1002). Также установлено наличие гомологичных генов у H. influenzae  и S.pneumoniae: 30S рибосомальная субъединица (участок S10, S19, S3, S17, S14, S8,S5,S13, S11), 50S рибосомальная субъединица (участок L3, L4, L23, L2, L22, L16, L29,L14, L24, L5,L6,L18,L30, L15, L36, L17), а также субъединица SecY белка-транслоказы, альфа-субъединицы РНК-полимеразы.

Способность к формированию микробиоценоза среди трех микроорганизмов (H. influenzae, Mycobacteria tuberculosis и S.pneumonia) подтверждена и анализом белковой гомологии предполагаемых штаммов. Так, при анализе данных генов, кодирующих гомологичные белки H. influenzae, M. tuberculosis и S. pneumoniae, было выявлено наличие гомологичных генов между такими отдаленно роственными микроорганизмами как H. influenzae  и M. tuberulcosis.

Таким образом, наличие гомологичных белков подтверждает не только общность вертикальных эволюционных процессов рассматриваемых микроорганизмов, что собственно и привело их к формированию единого микробиоценоза в такой нише как дыхательные пути

ВЫВОДЫ

1. В этиологической структуре носительства  микроорганизмов у детей с туберкулезной инфекцией H. influenzae  является одним из наиболее распространенных видов.
2. В структуре штаммов H. influenzae  значительное место занимают типируемые штаммы, однако треть всех изолятов являются нетипируемыми, что позволяет их считать штаммами с высокой трансформационной способностью, определяющей высокую вероятность латеральных переносов генетическго материала в микробиоценозе.
3. Характеристика антимикробной чувствительности штаммов гемофил, циркулирующих среди детей с туберкулезной инфекцией, свидетельствует о том, что среди них выражено снижение чувствительности к цефалоспоринам, фторхинолонам и рифампицину. При анализе гипермутабельности штаммов по отношению к фторхинолонам (на примере ципрофлоксацина) также выявлено преобладание гипермутирующих штаммов среди нетипируемых изолятов H. influenzae 
4. Выявлены различия, которые определяют колонизационную способность в штаммах, выделенных в одном и том же биотопе (дыхательных путях), но в составе микробиоценоза с различными характеристиками (микробиоценоз дыхательных путей у детей с туберкулезом и у детей из контрольной группы).
5. Наличие общего гомолога у таких эволюционно достаточно отдаленных микроорганизмов, как H. influenzae, Mycobacteria tuberculosis, Streptococcus pneumonia, позволяет предполагать наличие и других гомологичных и ортологичных генов в геноме, экспрессия которых приведет к выработке гомологичных белков, взаимодействие которых в микробиоценозе может привести к реализации событий латерального обмена генетическим материалом.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ВНЕДРЕНИЯ В МЕДИЦИНСКУЮ НАУКУ И ПРАКТИКУ

1. В рамках эпидемиологического надзора за внутрибольничными инфекциями необходима организация мероприятий, направленных на специфическую профилактику сопутствующих респираторных инфекций бактериальной этиологии у пациентов детского возраста в максимально короткие сроки от госпитализации в специализированные  стационары.
2. Необходимо ввести  в стандарты оказания медицинской помощи пациентам детского возраста специализированных стационаров микробиологический мониторинг  микробного пейзажа возбудителей дыхательных путей.
3. Необходимо ввести  в стандарты оказания медицинской помощи и формулярные перечни лекарственных средств для лечения  сопутствующих респираторных инфекций бактериальной этиологии у пациентов детского возраста с туберкулезом препараты амоксициллина в качестве прпаратов выбора.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Прушинский А. П. Особенности формирования носительства Haemophilus influenzae у детей с туберкулезом / А. П. Прушинский, А. В. Мартынова, О. М. Олексенко //аВопросы практической педиатрии. Ц 2011. -аТ. 6, № 4. - С. 33-36.
2. Мартынова А. В. Эпидемиологические аспекты заболеваемости оппортунистическими инфекциями дыхательных путей детей с туберкулезной инфекцией / А. В. Мартынова, Л. А. Балабанова, А. П. Прушинский // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2011. - № 1 (56). - С. 25-27.
3. Прушинский А. П. Микробиологические особенности штаммов Haemophilus influenzae, выделенных у детей с туберкулезной инфекций / А. П. Прушинский, А. В. Мартынова // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2010. - № 4 (42) - С. 96-97.
4. Прушинский А. П. Сравнительный геномный анализ штаммов H. influenzae и других бактериальных патогенов респираторного тракта / А.В. Мартынова,  А.П. Прушинский // Журнал инфектологии. - 2010. - Т. 2, № 4. - С. 101.
5. Скурихина Ю. Е. Заболеваемость инфекциями верхних дыхательных путей и носительство возбудителей у детей с внелегочным туберкулезом /  Ю. Е. Скурихина, А.В. Мартынова, А. П. Прушинский, Л. Н. Лебедева, А. И. Заярный // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. - 2008. - № 13. - С. 157-161.
6. Прушинский А. П. Сопутствующие инфекционные заболевания у детей с внелегочным туберкулезом / А.П. Прушинский, Ю.Е. Скурихина // Тезисы докладов VIII Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием, Владивосток, 19-20 апреля 2007. - Владивосток: 2007. - С.230.
7. Мартынова А. В. ПЦР диагностика бактериальных инфекций дыхательных путей у пациентов с латентным туберкулезом / А. В. Мартынова, А.П. Прушинский // VI Международная конференция Молекулярная медицина и биобезопасность (сборник материалов), Москва, 10-11 ноября 2009. - М.: 2009 - С. 151-152.
8. Мартынова А. В. Применение молекулярно-генетических методов в диагностике инфекций респираторного тракта / А. В. Мартынова, А. П. Прушинский, Е. С. Носач, О. А. Чулакова, Е. В. Сокурова // Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до 2020 года (Труды научно-практической конференции), Москва, 28-30 октября 2009. - М.: 2009 - С. 233-234.
9. Мартынова А. В. Опыт применения ПЦР в диагностике инфекций респираторного тракта в практическом здравоохранении / А. В. Мартынова, А. П. Прушинский, Е. С. Носач, О. А. Чулакова, Е. В. Сокурова // Всероссийская научная конференция Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций (труды конференции), СПб, 19-20 ноября 2009. - СПб.: 2009. - С. 99.
10. Мартынова А. В. Разработка метода идентификации и генотипирования микроорганизмов-возбудителей инфекций респираторного тракта / А.В. Мартынова, А. П. Прушинский, Е. С. Носач, О. А. Чулакова //Материалы Всероссийской научной школы для молодежи Перспективы развития инноваций в биологии. - Владивосток. - 2010. - С.70-72.
11. Мартынова А. В. Резистентность штаммов Haemophilus influenzae, выделенных у детей с туберкулезной инфекцией / А.В. Мартынова, А. П. Прушинский // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тезисы докладов ХI Тихоокеанской  науч-практич конф студентов и молодых ученых с международным участием, Владивосток, 21-22 апреля 2010. - Владивосток: 2010. - С. 268
12. Pruschinsky A. P. Bacterial respiratory tract infections as the sequalae of tuberculosis  / A.P. Pruschinsky., Yu. E. Skurihina, E. V. Sokurova, K. Smirnov // Clinical Microbiology and Infection. - 2009. - Vol. 15, № 4.- P. 2083.
13. Martynova A. Carriage of the respiratory tract bacterial pathogens in children with latent tuberculosis / Alina Martynova, Alexei Pruschinskyi // International Journal of Infectious Diseases.  - 2009. -  Vol. 13, P.S34.
14. Pruschinsky A.P. Biofilm formation by respiratory tract bacterial pathogens isolated in children with tuberculosis / Alina Martynova, Alexei Pruschinskyi  // Programm and Abstract book of the 1st Eurobiofilms Congress, Rome, Italy, 2-5 September 2009. - Rome: 2010. -  P. 149.
15. Martynova A. V. Emergence of Haemophilus influenzae strains in the nasopharynx of children with tuberculosis / A. V. Martynova, L. A. Balabanova,аA. P. Pruschinskyi // Pulmonary Medicine. - 2011. -  Vol. 2011, P. 420284.
16. Martynova A. V. Respiratory tract bacterial pathogens isolated in children with tuberculosis / A. V. Martynova, A. P. Pruschinsky // Program and Abstract Book of ERS Congress,  Barselona 18-22 september 2010. -  Barselona: 2010. - P. 670.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

- ВДП - верхние дыхательные пути

- НДП - нижние дыхательные пути

- СРИ - сопутствующие респираторные инфекции

Прушинский Алексей Петрович

Микробиологическая и молекулярно-генетическая

характеристика штаммов Haemophilus influenzae,

выделенных у детей с туберкулезной инфекцией

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Уч. изд. л. 1,0  Формат 60 × 84/16

Тираж 100 экз.  Заказ № 478

Отпечатано в типографии ИПК МГУ им. адм. Г.И. Невельского

690059 г. Владивосток, ул. Верхнепортовая, 50а

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии