Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии

На правах рукописи

Кумскова Елена Михайловна

МЕХАНИЗМЫ АТЕРОГЕННОЙ МОДИФИКАЦИИ ЛИПОПРОТЕИДОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ КАРБОНИЛЬНЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва- 2012

Работа выполнена в лаборатории биохимии свободнорадикальных процессов НИИ клинической кардиологии им.А.Л.Мясникова ФГБУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздравсоцразвития РФ Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Ланкин Вадим Зиновьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, академик РАН и РАМН, профессор Ткачук Всеволод Арсеньевич доктор биологических наук профессор Панасенко Олег Михайлович

Ведущая организация: Институт биохимической физики им. Н.М. Эммануэля РАН

Защита состоится л21 марта 2012 г. в 13.30 на заседании диссертационного совета Д 208.073.01 по присуждению учёной степени кандидата биологических наук в ФГБУ Российский Кардиологический Научно-Производственный Комплекс Минздравсоцразвития РФ (121552 Москва, ул.3-я Черепковская, д.15а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ РКНПК Минздравсоцразвития РФ Автореферат разослан ___________________ 2012 года Учёный секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор В.Е.Синицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Атеросклероз и ишемическая болезнь сердца - одни из наиболее частых причин смертности в развитых странах, причём основные осложнения этих заболеваний вызваны повреждением стенки сосудов. В настоящий момент не вызывает сомнений тот факт, что модифицированные липопротеиды низкой плотности (ЛНП), значительно отличающиеся от нативных частиц по физико-химическим свойствам, играют важную роль в атерогенном повреждении сосудов. Несмотря на то, что агенты, способные принимать участие в модификации ЛНП, достаточно разнообразны, наибольшую роль в этом процессе, как полагают, играют низкомолекулярные природные дикарбонилы [Меньщикова и соавт., 2008].

В процессе окислительного стресса низкомолекулярные карбонилы могут накапливаться в качестве вторичных продуктов свободнорадикального окисления липидов, при этом образуется малоновый диальдегид (МДА) и др. альдегиды [Ланкин и соавт., 2000-2004]. В последние годы в качестве возможных модификаторов ЛНП рассматриваются также альдегиды, образующиеся при карбонильном стрессе в реакциях автоокисления глюкозы, сопровождающих развитие сахарного диабета, причём основными карбонильными продуктами являются глиоксаль, метилглиоксаль и др. [Меньщикова и соавт., 2008]. Структуры альдегидов, генерируемых в процессе свободнорадикального окисления липидов и в процессе автоокисления глюкозы и триозофосфатов, весьма схожи, более того, метилглиоксаль и МДА являются структурными изомерами.

Известно, что больные сахарным диабетом имеют повышенную склонность к развитию атеросклероза, причём при этом заболевании выявлена прямая корреляция между уровнем гипергликемии и выраженностью сосудистых поражений [Bucala, 1997]. При этом соединения, способные связывать накапливающиеся в кровотоке дикарбонилы, могут рассматриваться как наиболее перспективные лекарственные препараты для лечения сахарного диабета. Таким образом, исследование, посвященное изучению молекулярных механизмов атерогенной модификации ЛНП под действием различных природных альдегидов, представляется весьма актуальным. Настоящее исследование посвящено изучению сравнительного биологического действия природных альдегидов различного происхождения и его возможных патогенетических последствий.

Цель исследования Целью настоящего исследования является выяснение особенностей механизмов атерогенной модификации ЛНП под действием низкомолекулярных природных альдегидов, образующихся при свободнорадикальном окислении липидов (на примере МДА) и автоокислении глюкозы и триозофосфатов (на примере метилглиоксаля), а также определение патогенетического значения карбонильной модификации ЛНП.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительное исследование роли первичных (липогидропероксиды) и вторичных (низкомолекулярные дикарбонилы) продуктов свободнорадикального окисления липидов в увеличении атерогенности ЛНП (усилении захвата частиц ЛНП моноцитами-макрофагами стенки сосуда).

2. Сравнить изменение физико-химических свойств ЛНП (по изменению суммарного поверхностного заряда частиц, накоплению флуорофоров в ЛНП и окисляемости ЛНП) при модификации ЛНП под действием МДА и метилглиоксаля.

3. Изучить особенности агрегации ЛНП после их модификации природными низкомолекулярными альдегидами различного происхождения.

4. С использованием различных методов (спектрофотометрия, хемилюминесценция, ЭПР-спектроскопия) исследовать возможность образования активных форм кислорода и органических свободнорадикальных интермедиатов в ходе реакции Мэйларда (реакции аминогруппы апобелка с альдегидной группой).

5. С помощью иммуноферментного анализа (моноклональные антитела к МДА-модифицированным и метилглиоксаль-модифицированным ЛНП) исследовать антигенные свойства эпитопов, образующихся в апопротеине В-1при его взаимодействии с природными низкомолекулярными альдегидами различного происхождения.

Научная новизна Впервые показано, что усиленный захват ЛНП культивируемыми макрофагами человека происходит при альдегид-зависимой модификации апопротеина В-100, но не при накоплении ацилгидропероксидов в наружном фосфолипидном слое частиц.

При сравнительном исследовании физико-химических свойств ЛНП установлено, что МДА в большей степени влияет на изменение структуры апопротеина В-100 и поверхностного заряда частицы, тогда как модификация метилглиоксалем провоцирует интенсификацию свободнорадикального окисления липидной компоненты ЛНП и значительное усиление агрегации частиц. Впервые с помощью различных методов (хемилюминесценция, спектрометрия) обнаружено генерирование активных форм кислорода при реакциях аминогруппы апобелка с метилглиоксалем. На основании качественного анализа образующихся свободнорадикальных интермедиатов, регистрируемых методом ЭПР, предложен механизм автокаталитического усиления окислительного стресса в процессе метилглиоксаль-зависимой модификации ЛНП. С использованием иммуноферментного анализа выявлены принципиальные различия в антигенной структуре образующихся эпитопов в апопротеине В-100 при модификации ЛНП в присутствии МДА и метилглиоксаля. Установлено, что атерогенные (обогащённые холестерином) ЛНП являются одновременно и наиболее окисленными.

Практическая значимость Полученные результаты уточняют молекулярные механизмы взаимодействия лизиновых остатков белков с МДА и метилглиоксалем и позволяют связать выявленные различия в молекулярных механизмах со степенью атерогенности ЛНП. Кроме того, полученные результаты свидетельствуют о важной роли карбонильной модификации ЛНП в атерогенезе, и позволяют рассматривать уровень карбонил-модифицированных ЛНП в качестве независимого фактора риска развития атеросклероза. Выявленные в работе различия в антигенной специфичности различных моноклональных антител к модифицированным ЛНП могут служить основой для разработки подходов к селективной экспрессдиагностике атеросклероза и сахарного диабета.

Апробация работы Результаты диссертационной работы были представлены на нескольких научных конференциях: IV - VII Международные крымские конференции Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии (Судак, Украина, 20082011), IV Конгресс биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), 12я Международная Пущинская школа-конференция Биология - наука XXI века (Пущино, Россия, 2008), Научно-практический симпозиум с международным участием Свободнорадикальная медицина и Антиоксидантная терапия (Волгоград, Россия, 2008), Всероссийская конференция молодых учёных Окисление, Окислительный стресс, антиоксиданты (Москва, Россия, 2008), 6-th National Scientific Practical Conference with International Participation УReactive oxygen species, nitric oxide, antioxidants and human healthФ (Smolensk, Russia, 2009), Российский национальный конгресс кардиологов (Москва, 2009), VIII Международная конференция Биоантиоксидант (Москва, Россия, 2010), а также на межлабораторном семинаре НИИ экспериментальной кардиологии ФГБУ РКНПК Минздравсоцразвития РФ 19 января 2012 г.

Публикации По результатам работы опубликовано 6 статей и 18 тезисов, ещё 2 статьи находятся в печати.

Структура работы Диссертация имеет стандартную структуру и содержит следующие разделы:

введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение, выводы, заключение и список литературы, содержащий 158 ссылок.

Работа содержит 25 рисунков и 2 таблицы МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы Для выделения ЛНП использовали сыворотку крови доноров из центра переливания крови РКНПК. Также в работе использовались образцы сыворотки крови участников клинических исследований CINDI (Таллинн. Эстония, 2009-20гг.) и программы ЗАО (Москва, Россия, 2010-2011 гг.). Для получения культуры моноцитов-макрофагов человека использовали цельную кровь здоровых доноров.

При проведении экспериментов применяли биохимические реактивы фирмы Sigma Aldrich (США). При проведении иммуноферментного анализа использовали моноклональные антитела к апоВ-100, полученные методом гибридизации, любезно предоставленные лабораторией клеточной инженерии РКНПК МЗ РФ (рук.Т.

Н.Власик). Моноклональные антитела к метилглиоксаль-модифицированному апоВ100 были получены тем же методом совместно с лабораторией клеточной инженерии. Антитела козы к иммуноглобулинам мыши, коъюгированные с пероксидазой хрена, фирмы ИМТЕК (РФ) или же реактивы, посталяемые фирмой Mercodia (Швеция) в составе набора для определения окисленных ЛНП.

Биохимические методы Выделение ЛНП. К сыворотке добавляли NaBr (0,5 г на 1 мл), разливали в поликарбоновые центрифужные пробирки Beckman и наслаивали сверху раствор NaBr-PBS (16,33 г NaBr на 1 л PBS рН 7,4). Пробы центрифугировали 2ч при 410об/мин на ультрацентрифуге L8-M (ротор 50 Ti, Beckman), затем отбирали слой с ЛНП. На образцы повторно наслаивали раствор NaBr-PBS и центрифугировали в о тех же условиях. Слой с ЛНП отбирали и диализовали при 4 С в течение ночи против 2000 объёмов PBS рН 7,4. После диализа ЛНП стерилизовали фильтрацией (диаметр пор - 0,45 мкм). Концентрацию белка в препаратах ЛНП определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951), используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта.

Модификация и анализ препаратов ЛНП. К препарату ЛНП (1 мг/мл) добавляли метилглиоксаль (10 мкмоль/мг белка) и инкубировали 3ч в темноте при 37 оС. Затем ЛНП диализовали при 4 оС в течение ночи против 2000 объёмов PBS рН 7,4. Для модификации ЛНП с МДА использовали свежеприготовленный МДА, получаемый методом кислотного гидролиза из 1,1,3,3-тетраэтоксипропана (Requena et al., 1997). Концентрацию МДА определяли по оптической плотности при 267 нм на спектрофотометре Hitachi 220A (kext 31800М-1см-1). Модификацию ЛНП МДА проводили в тех же условиях.

Определение конформационного состояния апоВ в препаратах ЛНП определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), используя буферную систему Лэммли (Laemmli et al., 1970), 4% концентрирующий и 6% разделяющий гели. Разделение проводили при силе тока 10 мА для концентрирующего геля и мА для разделяющего геля. Денситометрия элекрофореграмм, окрашенных Coumassie R-250, проводилась с помощью программы OneDScan.

Суммарный поверхностный заряд частиц ЛНП оценивали с помощью электрофореза в агарозном геле [Schalkwijk C. G. et al., 1998]. Для анализа использовали 1% агарозный гель. Разделение проводили в течение 1,5 часов при напряжении 90 В.

Накопление флуоресцирующих продуктов взаимодействия ЛНП с дикарбонилами регистрировали по изменению интенсивности флуоресценции в пробах на спектрофлуориметре F-3000 2500201-04 (Hitachi Inc., Япония).

Предварительно регистрировали спектры флуоресценции метилглиоксаль- и МДАмодифицированных ЛНП для определения длин волн экстинкции и эмиссии.

Нативные ЛНП (0,8 мг/мл) инкубировали с дикарбонилами (10 мМ) в темноте при +37С в PBS. Т.к. МДА приводит к тушению флуоресценции, определение интенсивности флуоресценции в пробах проводили после диализа (против 1объемов PBS в течение 30 мин). Интенсивность флуоресценции измеряли относительно твёрдого флуорофора-стандарта.

Для определения накопления гидроперекисей ЛНП (50 мкг/мл) инкубировали при 37С с 50 мкМ CuSO4. Измеряли увеличение оптической плотности при 220нм на спектрофотометре Hitachi 220A относительно начального значения. В качестве контроля использовали образец ЛНП в тех же условиях без добавления меди.

Определение продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК).

К образцу ЛНП (50 мкг/мл) объёмом 1 мл добавляли 0,5 мл 10% трихлоруксусной кислоты и 1 мл 0,67% ТБК, перемешивали и инкубировали при 100С 50 мин, затем образцы охлаждали, добавляли к пробам по 2 мл н-бутанола и интенсивно перемешивали. Пробы оставляли до расслоения фаз, оптическую плотность определяли в верхней бутанольной фазе при 532 нм на спектрофотометре Hitachi 557. Накопление вторичных продуктов выражали в пересчете на МДА (kext 1,56х1М-1см-1).

Выделение С-15 липоксигеназы из ретикулоцитов кролика. Ретикулоцитоз у кроликов вызывали путём подкожного введения гемолитика фенилгидразина (6,мг/кг) в течение 4-х суток. С-15 липоксигеназу из лизата обогащённой ретикулоцитами клеточной массы крови выделяли высаливанием 55%-ным (NH4)2SO4, [Ланкин и соавт., 1983], а затем подвергали последовательной очистке до гомогенного состояния (по данным электрофореза в ПААГ) [Ланкин и соавт., 1983].

Очистка грубого препарата С-15 липоксигеназы ретикулоцитов кролика до гомогенного состояния была проведена в Институте биохимии медицинского факультета Университета А.Гумбольдта (Берлин, Германия).

Ферментативное окисление ЛНП животной С-15 липоксигеназой в связи с самоинактивацией фермента инициировали при 37оС многократным внесением порций (1 ед/мл) С-15 липоксигеназы в среду, содержащую ЛНП (0,5 мг/мл), 0,1М NaCl и 20 мМ трис-НCl рН 7,4. Накопление первичных продуктов окисления - липогидропероксидов определяли по увеличению оптической плотности при 233 нм (kext 25000 М-1см-1) [Yagi, 1984], накопление вторичных продуктов - по образованию веществ, реагирующих с ТБК (см.выше).

Кинетические параметры образования супероксидного анион-радикала при реакции L-лизина с дикарбонилами определяли по восстановлению нитросинего тетразолия (НСТ) до формазана. Реакцию инициировали добавлением 10 мМ метилглиоксаля или МДА к среде, содержащей 100 мкМ НСТ и 10 мМ L-лизина в 100 мМ карбонатном буфере pH 9,5. Накопление формазана определяли по увеличению поглощения при 560 нм.

Биофизические методы Регистрацию спектров ЭПР проводили при комнатной температуре на спектрометре Е-109Е фирмы Varian (США), используя СВЧ-мощность 20 мВт, СВчастоту 9,15 ГГц, амплитуду высокочастотной модуляции - 0,2 мТл. Запись ЭПРспектров начинали через 1 мин после смешивания реакционных компонентов.

Реакционную смесь (120 мкл) вводили в газопроницаемые тефлоновые капилляры PTFE 22 (Zeus Industrial Products, Inc., США). Капилляры помещали в кварцевую трубку; в ходе измерения через неё постоянно продували азот или воздух.

Симуляцию спектров ЭПР проводили с использованием программы Simphonia (Brucker). В качестве стандарта использовали сигнал ЭПР дифенилпикрилгидразина [Thornalley, 1985].

Генерирование супероксидного анион-радикала (О2Х-) определяли на хемилюминометре Lum 5773 (Россия) в инкубационной смеси, содержащей 20 мкМ люцигенина, 15 мМ L-лизина; 15 мМ метилглиоксаля или 15 мМ МДА в100 мМ K,Na-фосфатном буфере рН 7,8 по индуцированной О2Х- хемилюминесценции.

о Инкубацию проводили в течение 10 мин при 37 С и постоянном перемешивании среды.

Степень ассоциации ЛНП оценивали по флуктуации светопропускания луча лазерного света (длина волны 780 нм) на двухканальном агрегометре LA220 (НПФ БИОЛА, Россия) (Tertov et al, 1992). Для изучения степени агрегации образцы ЛНП (0,5 мг/мл) инкубировали при 37оС в PBS pH 7,4 при постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки (100 об/мин) в присутствии дикарбонилов (2мМ).

Инкубацию ЛНП проводили в отсутствии супероксиддисмутазы (СОД) или с добавлением фермента (200 ед/мл).

Иммунологические методы Определение окисленных ЛНП проводили с помощью тест-наборов Mercodia Oxidized LDL ELISA (Швеция) в строгом соответствии с протоколом производителя.

Изучение структуры модифицированных ЛНП методом твердофазного иммуноферментного анализа. В лунки 96-луночного планшета вносили антиген (апоВ-100 ЛНП) по 10 мкг или с варьирующей концентрацией в 200 мкл PBS pH 7,и инкубировали при +4С в течение ночи. Затем лунки трижды промывали раствором Tween-20 в PBS (500мкл/л). Далее вносили моноклональные антитела (мкг в лунку или с варьирующей концентрацией) в PBS-Tween и инкубировали 1 час при постоянном перемешивании. После инкубации лунки промывали, затем вносили по 100 мкл меченых пероксидазой антител козы к иммуноглобулинам мыши (1 мкг/мл) и инкубировали 1 час при перемешивании. Планшет промывали, для проявления окраски вносили свежеприготовленный раствор 0,5 мг/мл ортофенилендиамина и 30% Н2О2 в 0,2 М цитратном буфере рН 5,0. Планшет инкубировали 15 мин, реакцию останавливали добавлением 25 мкл 50% H2SO4.

Оптическую плотность измеряли на планшетном спектрофотометре El808 (BIOTEK Instruments, США) при длине волны 490 нм.

Методы клеточной биологии Для получения культуры макрофагов человека производили забор крови доноров в стерильных условиях и выделяли моноцитарно-лимфоцитарную фракцию в градиенте фиколла-хипака [Биленко и соавт., 2003]. Подсчёт полученного количества клеток производили в счётной камере (Hemacytometer). Клетки помещали в пластиковую стерильную 24-луночную плашку для тканевых культур (Nuclon, Дания) по 5х105 клеток в мл и культивировали в СО2-инкубаторе (95% воздуха/5% СО2) при 37оС в течение 14 суток со сменой инкубационной среды на свежую через каждые 48 часов.

Для изучения поглощения ЛНП макрофагами культуральную среду заменяли на свежую среду 199, содержащую 10% липопротеид-дефицитной сыворотки, полученную ультрацентрифугированием (d>1,215 г/мл) [Tertov et al., 1992], а также по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина, 2,5 мкг/мл фунгизона и 2 мМ Lглутамина, после чего вносили исследуемые образцы ЛНП. Через 7 часов инкубирования в СО2-инкубаторе при 37оС удаляли среду инкубации с ЛНП, затем липиды из прикреплённых к субстрату макрофагов трижды экстрагировали смесью гексан-изопропанол (3:2, по объему) [Hara, Radin., 1978]. Экстракт липидов выпаривали в вакууме и определяли содержание общего холестерина с помощью тест-наборов Boehringer-Mannheim GmbH (Германия) на химическом анализаторе Multiscan MCC Labsystems Oy (Финляндия) при 492 нм.

Для статистического анализа данных, оценки достоверности различий с использованием t-критерия Стьюдента, определения корреляции между параметрами и пр. в работе использовалась программа Statictica 6.0 (StatSoft Inc., США) РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Поглощение макрофагами ЛНП, модифицированных первичными и вторичными продуктами свободнорадикального окисления полиеновых липидов Изменение свойств частиц ЛНП под действием различных агентов, в т.ч. при окислении, приводит к увеличению атерогенности частиц ЛНП, т.е. усилению их захвата моноцитами-макрофагами стенки сосуда и другими типами клеток. В большинстве случаев при окислении ЛНП первичные продукты окисления - липогидропероксиды ацилов фосфолипидов и вторичные продукты их окислительной деструкции, в т.ч. МДА, накапливаются практически одновременно [Ланкин и соавт, 2007]. Очевидно, что in vivo в кровотоке циркулируют ЛНП различной степени окисленности с разным соотношением первичных и вторичных продуктов окисления, что заметно усложняет оценку роли различных продуктов свободнорадикального окисления в увеличении атерогенности ЛНП.

В соответствии с этим, следует различать собственно локисленные (ацилгидропероксид-содержащие) ЛНП и ЛНП, модифицированные природными дикарбонилами. Тем не менее, разделить локисленные и модифицированные ЛНП при использовании широко употребимых модельных систем окисления ЛНП невозможно [см. выше]. Использование животной С-15 липоксигеназы [Lankin, 2003] позволяет получить локисленные (ацилгидропероксид-содержащие) ЛНП без существенной примеси вторичных продуктов. Таким образом, существует метод получения из одного и того же образца как локисленных ЛНП - путём мягкого ферментативного окисления, так и модифицированных ЛНП - при помощи химической реакции с дикарбонилами. Такой подход позволил нам изучить различия в поглощении ферментативно окисленных ЛНП и МДАмодифицированных ЛНП культивируемыми моноцитами-макрофагами человека.

По данным анализа, исходный препарат ЛНП содержал 0,2 нмоль липогидропероксидов (LOOH) и 0,1 нмоль МДА на 1 мг белка (молярное отношение LOOH/МДА= 2/1). После окисления ЛНП С-15 липоксигеназой ретикулоцитов содержание липогидропероксидов в препарате возросло до 48,нмоль/мг белка, а содержание МДА составило 0,6 нмоль/мг белка (молярное отношение LOOH/МДА= 80/1). Старение окисленных липоксигеназой ЛНП (инкубация в 0,154 М NaCl и 20 мМ трис-НCl рН 7,4 в течение 3-х часов) приводило к небольшому снижению содержания липогидропероксидов (47,нмоль/мг белка), тогда как уровень МДА в среде инкубации увеличивался более чем в 15 раз (9,4 нмоль МДА/мг белка, молярное отношение LOOH/МДА=5/1).

Содержание липогидропероксидов в препарате МДА-модифицированных ЛНП после диализа практически не отличалось от их содержания в препарате неокисленных ЛНП (0,3 нмоль/мг белка), тогда как содержание МДА возросло до 100,3 нмоль/мг белка (молярное отношение МДА/ LOOH = 1/334).

Окисленные животной С-15 липоксигеназой ЛНП захватывались культивируемыми моноцитами-макрофагами человека с такой же низкой эффективностью, что и нативные частицы (р>0,05; рис.2). МДА-модифицированные ЛНП, напротив, весьма активно поглощались культивируемыми моноцитамимакрофагами человека (рис.1). Накопление МДА в среде при старении ферментативно окисленных ЛНП сопровождалось резким увеличением захвата частиц ЛНП культивируемыми моноцитами-макрофагами человека (рис.1).

Следовательно, увеличение содержания липогидропероксидов в ЛНП не влияет на их захват культивируемыми макрофагами, тогда как поглощение макрофагами МДА-модифицированных ЛНП происходит весьма активно. Важная роль карбонильной модификации ЛНП в атерогенезе подтверждается также полученными ранее данными о том, что метилглиоксаль-модифицированные ЛНП захватываются культивируемыми макрофагами человека даже с большей эффективностью, чем МДА-модифицированные частицы [Ланкин и соавт., 2007].

Таким образом, необходимо чётко различать понятия локисленные и модифицированные ЛНП, характеризуя эти частицы по содержанию конкретных продуктов свободнорадикального окисления.

Рисунок 1. Поглощение макрофагами человека ЛНП с различным содержанием первичных и вторичных продуктов свободнорадикального окисления: 1 - неокисленные ЛНП, 2 - ЛНП, окисленные С-липоксигеназой ретикулоцитов кролика, 3 - те же ЛНП после трехчасовой аэробной инкубации, 4 - МДА-модифицированные ЛНП.

Характеристика препаратов нативных ЛНП и ЛНП, модифицированных МДА и метилглиоксалем Изменение суммарного поверхностного заряда модифицированных ЛНП можно оценить по изменению электрофоретической подвижности частиц ЛНП в агарозном геле по сравнению с нативными частицами. Увеличение электрофоретической подвижности ЛНП, модифицированных МДА и метилглиоксалем, в агарозном геле (рис. 2) свидетельствует о том, что взаимодействие с альдегидами приводит к уменьшению суммарного поверхностного заряда частиц, вероятно, вследствие модификации положительно заряженных аминогрупп под действием дикарбонилов.

Взаимодействие с МДА приводит к наибольшему изменению суммарного поверхностного заряда частиц, тогда как инкубация ЛНП с метилглиоксалем оказывает менее выраженное влияние на поверхностный заряд частиц ЛНП.

Использование SDS-электрофореза в ПААГ позволяет оценить изменения в структуре апоВ-100 под действием МДА и метилглиоксаля. Модификация ЛНП дикарбонильными соединениями может вызывать значительные изменения белковой компоненты частиц, приводя к тому, что не все молекулы апоВ-100 входят в относительно плотный разделяющий гель, очевидно, вследствие образования сшивок, значительно меняющих конформацию молекулы апоВ-100. В результате взаимодействия с исследованными дикарбонильными соединениями лишь около половины модифицированных метилглиоксалем частиц (50,3 6,7% относительно нативных ЛНП) входят в разделяющий гель, тогда как после модификации под действием МДА практически все частицы ЛНП остаются на границе концентрирующего и разделяющего гелей (рис.3) Данные, полученные при определении скорости накопления флуоресцирующих продуктов при модификации ЛНП дикарбонилами, также подтверждают тезис о более глубоких изменениях в частицах, происходящих под действием МДА.

Увеличение интенсивности флуоресценции при модификации ЛНП дикарбонилами происходит после продолжительной лаг-фазы (рис.4), причём наибольшее увеличение флуоресценции наблюдается при инкубации частиц ЛНП с МДА, тогда как модификация частиц под действием метилглиоксаля приводит лишь к незначительному увеличению содержания флуорофоров в частицах ЛНП.

Рисунок 3. Электрофореграмма нативных и Рисунок 2. модифицированных ЛНП (SDSэлектрофорез по Лэммли, 4% Электрофореграмма нативных концентрирующий и 6% разделяющий гель).

и модифицированных ЛНП в 1% (1) - нативные ЛНП, (2) - ЛНП, агарозном геле. (1) - нативные модифицированные метилглиоксалем, (3) - ЛНП, (2) - ЛНП, ЛНП, модифицированные МДА. Снизу модифицированные представлены результаты денситометрии, метилглиоксалем, (3) - ЛНП, показывающие, какой процент апоВ-1модифицированные МДА.

относительно нативных частиц (контроль) вошёл в разделяющий гель При образовании флуоресцирующих продуктов в ЛНП под действием МДА и метилглиоксаля нами выявлены не только количественные, но и качественные различия. Спектры флуоресценции частиц ЛНП, модифицированных МДА и метилглиоксалем, существенно различаются: (рис. 5). Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что в химической структуре образующихся флуорофоров также существуют различия. На основании представленных данных можно сделать заключение, что физико-химические свойства ЛНП, определяемые в использованных моделях, в наибольшей степени меняются при взаимодействии частиц с МДА, тогда как метилглиоксаль оказывает менее выраженное влияние на исследованные свойства модифицированных ЛНП.

Рисунок 5 Спектры испускания флуоресценции Рисунок 4. Изменение интенсивности ЛНП. (1) - нативные ЛНП, (2) - ЛНП, флуоресценции нативных ЛНП без модифицированные метилглиоксалем, (3) - добавления альдегидов (1), ЛНП с ЛНП, модифицированные МДА. Модификацию метилглиоксалем(2), ЛНП с МДА (3).

НП альдегидами проводили в темноте при Флуоресценцию нативных ЛНП и 37С в PBS рН 7,2. Интенсивность продуктов модификации ЛНП флуоресценции нативных ЛНП, а также ЛНП, метилглиоксалем регистрировали при модифицированных метилглиоксалем, испускании 430 нм (возбуждение регистрировали при возбуждении флуоресценции 350 нм). Флуоресценцию флуоресценции mах = 350 нм. Интенсивность продуктов модификации ЛНП МДА флуоресценции продуктов взаимодействия регистрировали при испускании 470 нм ЛНП и МДА регистрировали при возбуждении (возбуждение флуоресценции 425 нм) флуоресценции mах = 425 нм Кроме того, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что модификация частиц ЛНП дикарбонильными соединениями оказывает существенное влияние на их дальнейшее окисление. Как видно на рис.6, после модификации ЛНП метилглиоксалем наблюдается более интенсивное окисление липидной компоненты частиц ЛНП: наблюдается уменьшение продолжительности лаг-фазы по сравнению с контролем, возрастает максимальная скорость окисления и суммарная степень окисленности частиц. Модификация ЛНП в присутствии МДА, напротив, несколько снижает окисляемость частиц (рис.6). Таким образом, модификация под действием МДА, оказывающая более существенное влияние на структурные изменения в апоВ-100 по сравнению с метилглиоксалем, приводит к замедлению процессов свободнорадикального окисления липидов наружного слоя ЛНП. В то же время, метилглиоксаль, в меньшей степени модифицирующий апоВЛНП. В то же время, метилглиоксаль, в меньшей степени модифицирующий апоВ100, наоборот, вызывает значительное ускорение свободнорадикальных реакций в 100, наоборот, вызывает значительное ускорение свободнорадикальных реакций в ненасыщенных липидах модифицированных ЛНП (рис.6). Можно сделать ненасыщенных липидах модифицированных ЛНП (рис.6). Можно сделать предположение, что увеличение жёсткости белковой структуры ЛНП под предположение, что увеличение жёсткости белковой структуры ЛНП под действием МДА создаёт бльшие структурные препятствия дальнейшему действием МДА создаёт бльшие структурные препятствия дальнейшему окислению частиц, тогда как частичное сшивание молекул белка под действием окислению частиц, тогда как частичное сшивание молекул белка под действием метилглиоксаля облегчает перекисное окисление ненасыщенных липидов метилглиоксаля облегчает перекисное окисление ненасыщенных липидов наружного слоя ЛНП.

наружного слоя ЛНП.

Взаимодействие ЛНП с исследованными дикарбонилами приводит к усилению Взаимодействие ЛНП с исследованными дикарбонилами приводит к усилению агрегации частиц ЛНП (рис. 7). Присутствие МДА в среде инкубации оказывало агрегации частиц ЛНП (рис. 7). Присутствие МДА в среде инкубации оказывало меньшее влияние на скорость агрегации частиц, тогда как присутствие меньшее влияние на скорость агрегации частиц, тогда как присутствие метилглиоксаля ускоряло агрегацию в большей степени (рис. 7). Эти результаты метилглиоксаля ускоряло агрегацию в большей степени (рис. 7). Эти результаты хорошо согласуются с вышеприведёнными данными о влиянии этих дикарбонилов хорошо согласуются с вышеприведёнными данными о влиянии этих дикарбонилов на окисляемость частиц ЛНП (рис. 6). Действительно, при образовании агрегатов на окисляемость частиц ЛНП (рис. 6). Действительно, при образовании агрегатов ЛНП важную роль играют структурные изменения наружного липидного слоя ЛНП важную роль играют структурные изменения наружного липидного слоя частицы, в то время как модификация белковой части ЛНП имеет меньшее значение частицы, в то время как модификация белковой части ЛНП имеет меньшее значение [rni et al., 2000]. В результате окисления ненасыщенных липидов наружного слоя [rni et al., 2000]. В результате окисления ненасыщенных липидов наружного слоя может происходить потеря целостности частицы ЛНП, в результате чего может происходить потеря целостности частицы ЛНП, в результате чего происходит ускорение агрегации частиц [Hoff et al., 1992, rni et al., 2000].

происходит ускорение агрегации частиц [Hoff et al., 1992, rni et al., 2000].

Рисунок 6. Накопление диеновых Рисунок 7. Агрегация ЛНП в конъюгатов в процессе медь- присутствии и отсутствии альдегидов инициированного окисления нативных после 6-часовой инкубации: 1 - ЛНП и ЛНП, модифицированных нативные ЛНП, 2 - ЛНП + МДА, 3 - дикарбонилами. 1 - нативные ЛНП, 2 - ЛНП + метилглиоксаль. За 100% МДА-модифицированные ЛНП, 3 - принято значение флуктуации метилглиоксаль-модифицированные ЛНП. светопропускания нативных ЛНП в На рисунке представлен характерный начальный момент времени. * - график, отражающий форму кривых, достоверность отличия от контроля получаемых в серии экспериментов (р<0,05) ентов Следовательно, окислительные изменения в наружном липидном слое ЛНП и альдегид-зависимая модификация белковой компоненты частиц тесно взаимосвязаны. Более того, модификация белка под действием дикарбонилов способна инициировать дальнейшие окислительные превращения частиц ЛНП. Этот процесс может быть особенно значим при сахарном диабете, т.к. образующиеся при автоокислении глюкозы дикарбонилы, такие как метилглиоксаль, являются более мощными модифицирующими агентами, которые ускоряют дальнейшее окисление частиц и вызывают агрегацию ЛНП.

Генерирование супероксидного анион-радикала при взаимодействии карбонильных соединений с лизином (Генерирование АФК при карбонилзависимой модификации аминогрупп) Активные формы кислорода и карбонильные соединения способны вызывать модификацию аминокислотных остатков белковых молекул [Thorpe, Baynes, 2003], в том числе апоВ-100, входящего в состав частиц ЛНП. В литературе встречаются данные о генерировании свободных радикалов при взаимодействии метилглиоксаля с L-аланином [Yim et al., 1995], тем не менее, механизм этой реакции выяснен не до конца. Исходя из этого, мы исследовали процессы образования свободнорадикальных продуктов при взаимодействии аминокислот с МДА и метилглиоксалем. В качестве модельного объекта был выбран L-лизин, т.к. данная аминокислота является одной из основных мишеней действия активных карбонильных соединений в белковых молекулах [Suji, Sivakami, 2007].

На рис. 8 приведены результаты ЭПР-спектроскопии продуктов реакций Lлизина с метилглиоскалем и МДА. Видно, что при инкубации в анаэробных условиях свободнорадикальные интермедиаты удаётся зарегистрировать в реакции L-лизина с метилглиоксалем, но не с МДА. Спектры ЭПР свободнорадикальных интермедиатов, образующихся в ходе реакции L-лизина с метилглиоксалем, имеют многокомпонентную сверхтонкую структуру и, как предполагают авторы работы [Yim et al., 1995], могут являться суперпозицией спектров анион-радикала метилглиоксаля (МГХ-) и катион-радикала диалкилимина. Стоит отметить, что в присутствии кислорода нами были зарегистрированы лишь следовые количества свободнорадикальных интермедиатов (рис.8, спектр 2).

Замена газовой среды на азот при инкубации смеси метилглиоксаля с Lлизином приводит к значительному росту уровня свободнорадикальных интермедиатов, предположительно, диалкилимина и семидиона метилглиоксаля (рис. 9). Важно отметить, что при добавлении СОД к реакционной смеси содержание свободнорадикальных интермедиатов возрастало (рис. 9, кривая 2).

Вызываемый добавлением СОД эффект может быть связан с тем, что этот фермент способен удалять супероксидный анион-радикал (О2Х-), генерируемый в исследуемой модельной системе.

В исследованной нами модельной системе обнаружено также, что О2Х- интенсивно генерируется при взаимодействии L-лизина с метилглиоксалем.

Образование О2Х- оценивали по накоплению формазана при восстановлении НСТ в карбонатном буфере рН 9,5. Добавление СОД приводило к значительному (более чем в 4 раза) подавлению образования формазана в описанных условиях. В то же время, при взаимодействии L-лизина c МДА мы наблюдали лишь незначительное накопление формазана. Использование супероксид-зависимой хемилюминесценции люцигенина в качестве более чувствительного метода позволило зарегистрировать образование О2Х- в смеси метилглиоксаля с L-лизином при pH 7,8 (рис. 10), т.е. в условиях, близких к физиологическим. Добавление в среду инкубации СОД практически полностью ингибирует хемилюминесценцию люцигенина в этих условиях (рис. 10, кривая 2).

Рисунок 8. Спектры ЭПР свободнорадикальных интермедиатов реакции L-лизина и дикарбонильных Рисунок 9. Влияние аэрации и СОД соединений. 1- L-лизин + метилглиоксаль, (тёмные столбцы) на кинетику продувка азотом, 2- L-лизин + накопления свободнорадикальных метилглиоксаль,аэрация 3- L-лизин + интермедиатов 1-аэробные МДА, продувка азотом условия 2 - анаэробные условия.

Рисунок 10. Влияние СОД на супероксидзависимую хемилюминесценцию люцигенина. 1 Lлизин + метилглиоксаль; 2 - то же что и (1) + СОД (120 ед/мл).

Полученные нами результаты позволяют пересмотреть предложенный ранее в литературе механизм генерирования супероксидного анион-радикала при модификации аминокислот под действием метилглиоксаля [Yim et al., 1995]. В соответствии с нашими предположениями (рис. 11), продукция супероксида происходит при окислении кислородом свободных радикалов шиффовых оснований лизина и метилглиоксаля. При этом О2Х- может не только образовываться, но и расходоваться в реакциях с участием МГХ- (рис.11). Таким образом, весьма вероятно, что окислительная модификация белков и других биомолекул может быть следствием локального генерирования супероксида при взаимодействии остатков Lлизина (и, по-видимому, других аминокислот) с -кетоальдегидами.

Рисунок 11.

Предполагаемая схема генерирования супероксида при взаимодействии молекулярного кислорода с МГХ- и катионрадикалом диалкилимина метилглиоксаля с L лизином.

Важно отметить, что феномен неферментативного генерирования супероксида может влиять на физико-химические свойства частиц ЛНП, связанные с их атерогенностью, в частности, на скорость агрегации ЛНП. На рис.12 приведены результаты экспериментов, указывающие на влияние СОД на скорость агрегации ЛНП в присутствии МГл, но не МДА. Добавление СОД, которая дисмутирует О2Х-, в среду инкубации ЛНП не оказывало достоверного влияния на скорость агрегации ЛНП в присутствии МДА (рис.12А), однако существенно снижало скорость агрегации ЛНП в присутствии метилглиоксаля (рис.12Б).

Таким образом, вторичное образование супероксидного радикала в процессе модификации белка под действием метилглиоксаля может инициировать продолжение цепного свободнорадикального окисления ненасыщенных липидов ЛНП, приводя к дальнейшему накоплению МДА и других карбонильных соединений. Удаление супероксида из среды инкубации снимает некоторые негативные эффекты, возникающие при модификации апоВ-100 метилглиоксалем:

важно отметить, что при добавлении СОД в среду инкубации скорость агрегации частиц ЛНП под влиянием метилглиоксаля оказывается ниже уровня агрегации под действием МДА (рис. 12).

Рисунок12 Кинетические кривые изменения флуктуации светопропускания ЛНП под воздействием МДА (А) и метилглиоксаля (Б) в отсутствии (1) и присутствии супероксиддисмутазы (200 ед/мл) (2). Флуктуация светопропускания в начальный момент времени принята за 100%.

Использование иммуноферментного анализа для определения антигенной специфичности антител к модифицированным ЛНП и уровня окисленных ЛНП в популяции В процессе окислительной модификации ЛНП под действием дикарбонилов в молекуле апоВ-100 происходит образование новых эпитопов, что оказывает влияние на антигенные свойства частиц и их способность связываться с антителами различной специфичности. Для изучения антигенной структуры модифицированных ЛНП мы использовали моноклональные антитела к нативным и МДА-модифицированным ЛНП, любезно предоставленные лабораторией клеточной инженерии ФГУ РКНПК (руководитель Т.Н.Власик); кроме того, совместно с этой лабораторией нами были получены моноклональные антитела к метилглиоксальмодифицированным ЛНП. Также в ходе работы мы использовали коммерческие тест-наборы к окисленным ЛНП фирмы Mercodia (Швеция).

Результаты взаимодействия нативных и модифицированных ЛНП различной концентрации с панелью использованных антител представлены на рис.13. Как видно на рис. 13А, антитела 4C11, специфичные к нативным ЛНП, реагируют со всеми исследованными образцами с одинаковой эффективностью. В то же время, антитела 6D8, специфичные к ЛНП, модифицированным метилглиоксалем, взаимодействуют только с метилглиоксаль-модифицированными ЛНП и не реагируют с нативными и МДА-модифицированными ЛНП, а антитела 2G1, специфичные к МДА-модифицированным ЛНП, взаимодействуют только с ними, не реагируя с метилглиоксаль-модифицированными и нативными частицами (рис 13, Б и В, соответственно).

Таким образом, нами были выявлены существенные антигенные отличия частиц ЛНП после модификации МДА и метилглиоксалем. Полученные результаты хорошо согласуются с полученными нами данными (см. выше) о существовании различий в молекулярных механизмах реакций взаимодействия метилглиоксаля и МДА с лизиновыми остатками белков и влиянии этих альдегидов на физикохимические свойства ЛНП, несмотря на сходство химических структур данных дикарбонильных соединений.

Рисунок 13. Взаимодействие нативных и карбонил-модифицированных ЛНП с различными моноклональными антителами (зависимость оптической плотности от концентрации исследуемых ЛНП). А - антитела 4С11, специфичные к нативным ЛНП; Б - антитела 6D8, специфичные к метилглиоксальмодифицированным ЛНП; В - антитела 2G1, специфичные к МДАмодифицированным ЛНП, Г - антитела 4Е6, специфичные к окисленным и МДАмодифицированным ЛНП.

Кроме того, при изучении взаимодействия нативных и модифицированных ЛНП с тест-наборами Mercodia, нами было показано, что антитела, используемые при в наборах, наиболее эффективно связываются с МДА-модифицированными ЛНП (рис. 13Г). В то же время, при использовании высоких концентраций нативных и метилглиоксаль-модифицированных ЛНП наблюдается рост оптической плотности, свидетельствующий о связывании данных образцов ЛНП с антителами.

Антитела 4E6, используемые в тест-наборах Mercodia, специфичны как к МДАмодифицированным, так и к окисленным ЛНП (для 50% ингибирования связывания антител в ИФА необходимо 0,025мг/дл окисленных либо МДА-модифицированных ЛНП, в которых как минимум 60 лизиновых остатков замещены альдегидами) [Holvoet, 1999]. ЛНП, выделяемые из крови доноров, содержат небольшие количества окисленных частиц, которые, по всей вероятности, и определяются при использовании высоких концентраций нативных и метилглиоксальмодифицированных ЛНП в иммуноферментном анализе.

Исходя из различий в связывании нативных и метилглиоксальмодифицированных ЛНП антителами 2G1, полученными в лаборатории клеточной инженерии ФГУ РКНПК к МДА-модифицированным ЛНП, и антителами 4Е6, используемыми в тест-наборах фирмы Mercodia, можно заключить, что, несмотря на высокую аффинность к МДА-модифицированным ЛНП, антитела 2G1 и 4Есвязываются с различными антигенами на поверхности апоВ-100, тем не менее, ни один из этих антигенов не образуется при взаимодействии частиц ЛНП с метилглиоксалем, о чём свидетельствует примерно одинаковая эффективность связывания указанных антител с нативными и метилглиоксальмодифицированными частицами (рис. 13, В и Г) Тест-наборы Mercodia были использованы нами для определения содержания окисленных ЛНП в сыворотке крови людей, принимавших участие в клинических исследованиях в Эстонии (г.Таллинн) и России (г.Москва). Перед включением в исследование все участники подписывали информированное согласие; в ходе обследования для каждого участника регистрировались пол, возраст, наличие вредных привычек (курение), рост, вес, артериальное давление, наличие заболеваний (сахарный диабет, артериальная гипертония, инфаркт миокарда в анамнезе и т.п.). Образцы крови участников отбирались натощак, в сыворотке крови определялись такие биохимические показатели, как общий холестерин, холестерин ЛНП и ЛВП и некоторые другие.

Результаты измерения биохимических параметров крови и определения содержания окисленных ЛНП в обеих популяциях (эстонской и российской) представлены в таблице 1. Как видно из таблицы, значения биохимических параметров в обеих популяциях сопоставимы друг с другом. Уровени общего ХС и ХС ЛНП в исследованных популяциях близки к норме и сравнимы с опубликованными данными об уровне этих показателей у пациентов с ИБС [Johnston et al., 2006].

Статистический анализ полученных данных позволил нам обнаружить ряд зависимостей. Прежде всего, как и следовало ожидать, в обеих популяциях нами выявлена сильная положительная корреляция между уровнем общего ХС и ХС ЛНП (0, 87 и 0,90 для Москвы и Таллина, соответственно). Кроме того, нами обнаружена положительная корреляция между уровнем ХС ЛНП и уровнем окисленных ЛНП в образцах сыворотки крови как в таллиннской (r=0,61; p<0,05), так и в московской (r=0,56, p<0,05) популяциях (рис. 14). Следует отметить, что среднее значение содержания окисленных ЛНП одинаково в обеих группах (табл.1).

Можно заключить, что ЛНП, обогащённые холестерином, одновременно являются более окисленными. Таким образом, можно предположить, что окисленные ЛНП играют существенную роль в развитии атеросклероза. Кроме того, несмотря на присутствие выраженной корреляционной связи между содержанием ХС ЛНП и уровнем окисленных ЛНП, её невысокое значение (около 0,6) по сравнению с корреляцией между уровнями общего ХС и ХС ЛНП (приблизительно 0,9) позволяет рассматривать содержание окисленных ЛНП в сыворотке крови как возможный независимый фактор риска развития атеросклероза.

Таблица 1. Результаты измерения биохимических параметров (среднее стандартное отклонение) в сыворотке крови пробандов.

Эстонская популяция Российская популяция Параметры (г.Таллинн) (n=782) (г.Москва) (n=1433) Общий ХС, мМ 5.61.1 6.11.3* ХС ЛНП, мМ 3.61.0 3.71.1* Окисленные ЛНП, ед./л 70.622.0 72.422.7* ХС ЛВП, мМ 1,60,5 1,40,4** Рисунок 14. Корреляция между уровнем окисленных ЛНП и содержанием ХС ЛНП в сыворотке крови пробандов. Средние значения уровней окисленных ЛНП и ХС ЛНП приняты за единицу. А - Московская популяция, Б - Таллиннская популяция В исследовании московской популяции все пробанды были разделены на группы в соответствии со шкалой риска развития атеросклеротических повреждений сосудов SCORE. В первой группе оказались пробанды с низким или умеренным рисом развития сердечно-сосудистых заболеваний, во второй - пациенты со средним или высоким риском развития сердечно-сосудистых заболеваний, но без клинических проявлений ИБС. В третью группу были включены пациенты с клиническими проявлениями ИБС (стенокардия, инфаркт миокарда в анамнезе).

Показано, что уровни общего ХС и ХС ЛНП были значительно выше во второй группе по сранению с первой и третьей. В то же время, значение уровня окисленных ЛНП к уровню ЛВП (окЛНП/ЛВП) оказалось существенно ниже в первой группе, в то время как во второй и третьей группах оно приблизительно одинаково.

По всей видимости, уменьшение уровня общего ХС и ХС ЛНП в третьей группе может быть объяснено применяемой медикаментозной терапией атеросклероза, преимущественно приёмом статинов. В то же время, значение уровня окисленныеЛНП/ЛВП в третьей группе было повышено, что может быть связано с тем, что статины, снижающие уровень ХС в крови, одновременно с этим интенсифицируют ПОЛ in vivo [Lankin et al., 2007].

Таким образом, определение соотношения окисленных ЛНП к ЛВП можно рассматривать в качестве значимого показателя при диагностике и определении риска развития ИБС.

Исходя из представленных данных, можно заключить, что иммуноферментное определение окисленных и альдегид-модифицированных ЛНП может быть весьма перспективным направлением при диагностике сахарного диабета и атеросклероза, а также при оценке эффективности проводимой медикаментозной терапии этих заболеваний.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Атеросклероз и сахарный диабет в настоящее время занимают первое место в развитых странах среди неинфекционных заболеваний, причём около 80% больных сахарным диабетом погибают от сердечно-сосудистых осложнений. Важную роль в атерогенезе, как установлено, играет окислительный стресс и сопряжённые с ним процессы модификации ЛНП. В связи с этим, чрезвычайно важными являются исследования, направленные на понимание молекулярных механизмов первичного поражения стенки сосуда и на разработку методов ранней диагностики этих заболеваний. Исходя из этого, в настоящей работе было проведено сравнительное исследование физико-химических особенностей карбонильной модификации ЛНП, что может быть важным для понимания молекулярных механизмов первичного повреждения стенки сосуда.

Нами показано, что усиленный захват ЛНП культивируемыми макрофагами человека происходит при альдегид-зависимой модификации апопротеина В-100, но не при ферментативном окислении (накоплении ацилгидропероксидов) наружного фосфолипидного слоя частиц. Сравнительное исследование физико-химических свойств ЛНП (изменение суммарного поверхностного заряда частиц, накопление флуоресцирующих шиффовых оснований, окисляемость частиц ЛНП) выявило, что МДА способствуют большему образованию флуорофоров, а также в большей степени влияет на изменение структуры апопротеина В-100 и поверхностного заряда частицы, тогда как модификация метилглиоксалем провоцирует интенсификацию свободнорадикального окисления липидной компоненты ЛНП. С помощью различных физико-химических методов (спектрофотометрия, хемилюминесценция, ЭПР-спектроскопия) мы впервые обнаружили возможность генерирования активных форм кислорода в ходе реакции Мэйларда (реакция аминогруппы апобелка с альдегидной группой). На основании качественного анализа образующихся свободнорадикальных интермедиатов нами был предложен механизм автокаталитического усиления окислительного стресса в процессе метилглиоксаль-зависимой модификации ЛНП. С использованием иммуноферментного анализа (моноклональные антитела к МДАмодифицированным и метилглиоксаль-модифицированным ЛНП) нами были выявлены принципиальные различия в антигенной структуре образующихся эпитопов в апопротеине В-100 при модификации ЛНП в присутствии МДА и метилглиоксаля.

При анализе образцов сыворотки крови, полученных при проведении эпидемиологических обследований населения г. Таллинна и г.Москвы мы установили, что атерогенные (обогащённые холестерином) ЛНП являются одновременно и наиболее окисленными. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли карбонильной модификации ЛНП в атерогенезе, и позволяют рассматривать уровень карбонил-модифицированных ЛНП в качестве независимого фактора риска развития атеросклероза. Выявленные в работе различия в антигенной специфичности различных моноклональных антител к модифицированным ЛНП могут служить основой для разработки подходов к селективной экспрессдиагностике атеросклероза и сахарного диабета.

ВЫВОДЫ 1. Установлено, что усиление захвата частиц культивируемыми моноцитами макрофагами происходит в результате накопления вторичных продуктов свободнорадикального окисления липидов (карбонил-зависимая модификация апоВ-100 ЛНП), в то время как увеличение содержания первичных продуктов свободнорадикального окисления липидов (липогидропероксидов ацилов фосфолипидов) в ходе ферментативного окисления ЛНП не влияет на увеличение атерогенности частиц.

2. При сравнительном исследовании влияния низкомолекулярных дикарбонилов на физико-химические свойства ЛНП выявлено, что модификация под действием МДА в большей степени, чем метилглиоксаль-зависимая модификация, изменяет суммарный поверхностный заряд частиц, вызывает образование внутри- и межмолекулярных сшивок и накопление флуоресцирующих шиффовых оснований, в то время как модификация под действием метилглиоксаля усиливает дальнейшую окисляемость частиц ЛНП и значительно увеличивает скорость их агрегации.

3. С использованием различных методов (спектрофотометрия, хемилюминесценция, ЭПР-спектроскопия) обнаружено неферментативное генерирование супероксидного анион-радикала и органических свободнорадикальных интермедиатов в ходе реакции Мэйларда при взаимодействии аминогруппы лизина с метилглиоксалем, но не с МДА.

4. Показано, что добавление в среду инкубации СОД, дисмутирующей супероксидный анион-радикал, значительно снижает скорость метилглиоксальзависимой агрегации частиц ЛНП, но не оказывает влияния на скорость агрегации ЛНП под действием МДА.

5. С помощью иммуноферментного анализа показано, что моноклональные антитела, специфичные к МДА-модифицированным ЛНП, не взаимодействуют с метилглиоксаль-модифицированными частицами, а моноклональные антитела, специфичные к метилглиоксаль-модифицированным ЛНП не взаимодействуют с частицами, модифицированными МДА что свидетельствует о различной антигенной структуре эпитопов, образующихся при реакции апоВ-100 с данными дикарбонилами.

6. Установлено, что атерогенные (обогащённые холестерином) частицы ЛНП являются одновременно и наиболее окисленными, причём отношение уровня окисленных ЛНП к содержанию ЛВП повышено в группах с высоким риском развития атеросклероза и с клиническими проявлениями ИБС.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи 1. В.З.Ланкин, А.К.Тихазе, Е.М.Кумскова. Особенности модификации липопротеидов низкой плотности в развитии атеросклероза и сахарного диабета типа 2. Кардиологический вестник, 2008, том III (XV), №1: 60-2. К.Б. Шумаев, С.А. Губкина, Е.М. Кумскова, Г.С. Шепелькова,Э.К. Рууге, В.З. Ланкин. Механизм образования супероксидного радикала при взаимодействии L-лизина с дикарбонильными соединениями. Биохимия, 2009, 74: 568-53. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Кумскова Е.М., Коновалова Г.Г., Власик Т.Н., Виигимаа М. Карбонильный стресс и модификация липопротеидов низкой плотности: патофизиологическое и диагностическое значение. Здоровье.

Медицинская экология. Наука, 2009, 4-5(39-40): 99-101.

4. M. Viigimaa, J. Abina, G.Zemtsovskaya, A. Tikhaze, G. Konovalova, E.

Kumskova, V. Lankin. Malonyldialdehyde-modified low density lipoproteins as biomarker for atherosclerosis. Blood pressure, 2010, 19(3): 164-15. Тихазе А.К., Вийгимаа М., Коновалова Г.Г. Кумскова Е.М., Абина Е., Земцовская Г., Янушевская Е.В., Власик Т.Н., Ланкин В.З. Взаимосвязь между наличием малонилдиальдегидзависимой модификации и содержанием холестерина в липопротеидах низкой плотности. Бюлл.Эксп.Биол.Мед., 2010, 149(2): 143-16. V. Lankin, M.Viigimaa, A.Tikhaze, E.Kumskova,G.Konovalova, J.Abina, G.Zemtsovskaya, T.Kotkina,E.Yanushevskaya, T.Vlasik Cholesterol-rich low density lipoproteins are also more oxidized. Mol.Cell.Biochem., 2011, 355:187-1Тезисы 1. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Шумаев К.Б., Кумскова Е.М. Автокаталитический механизм модификации белков при карбонильном стрессе: возможная роль в прогрессировании атерогенеза при сахарном диабете. Тезисы IV Конгресса биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 11-15 мая 2008 года, с.42. Кумскова Е.М., Шумаев К.Б., Ланкин В.З. Роль неферментативной генерации супероксида при взаимодействии ЛНП с карбонильными соединениями в механизме развития сахарного диабета. Тезисы. Волгоград, 23-25 апреля 2008 года. Бюллетень Волгоградского научного центра РАМН и Администрации волгоградской области. Приложение 1(2008), с.16.

3. Кумскова Е.М., Матвеева Е.А., Шумаев К.Б., Ланкин В.З. Механизм образования супероксидного анион-радикала при взаимодействии L-лизина с дикарбонилами и его возможная роль в развитии сахарного диабета. Тезисы 12-й Международной пущинской школы-конференции молодых учёных.

Пущино, 10-14 ноября 2008 года, стр 137-138.

4. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Коновалова Г.Г., Кумскова Е.М., Беленков Ю.Н.

Роль липопротеидов низкой плотности в этиологии и патогенезе атеросклероза и сахарного диабета. Тезисы IV Международной Крымской Конференции Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии.

Судак, Крым. Украина, 1-8 июня 2008 года, с.5. Ланкин В.З.,Тихазе А.К., Шумаев К.Б., Кумскова Е.М., Панасенко О.М.,Коновалова Г.Г., Беленков Ю.Н. Окислительная модификация липопротеидов низкой плотности при окислительном и карбонильном стрессах. Доклады и тезисы Всероссиёской конференции молодых ученых и III школы им. академика Н.М. Эммануэля Окисление, окислительный стресс и антиоксиданты, Москва, 1-3 октября 2008 года, сс. 80-6. Кумскова Е.М. Шумаев К.Б., Ланкин В.З. Механизм образования супероксидного анион-радикала при взаимодействии L-лизина с дикарбонилами. Доклады и тезисы Всероссиёской конференции молодых ученых и III школы им. академика Н.М. Эммануэля Окисление, окислительный стресс и антиоксиданты, Москва, 1-3 октября 2008 года, сс.253-27. Коновалова Г.Г., Недосугова Л.В., Кумскова Е.М., Тихазе А.К., Ланкин В.З.

Эффекты природных дикарбонилов на ктивность антиоксидантных ферментов. Тезисы V Международной Крымской Конференции Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии. Судак, Крым.

Украина, 21-30 сентября 2009 года, с.8. Кумскова Е.М., Аксёнов Д.В., Шумаев К.Б., Ланкин В.З. Супероксидзависимая агрегация ЛНП под действием природных дикарбонилов. Тезисы V Международной Крымской Конференции Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии. Судак, Крым. Украина, 21-30 сентября 2009 года, с.9. Тихазе А.К., Виигимаа М. Коновалова Г.Г., Кумскова Е.М., Ланкин В.З.

МДА-модифицированные ЛНП как биомаркер атеросклероза. Тезисы V Международной Крымской Конференции Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии. Судак, Крым. Украина, 21-30 сентября 2009 года, с.10. Lankin VZ, Tikhaze AK, Konovalova GG, Kumskova EM, Viigimaa M. Low density lipoproteins modification under oxidative and carbonyl stress. Thesis. 6-th National Scientific Practical Conference with International Participation УReactive oxygen species, nitric oxide, antioxidants and human healthФ Smolensk, September 14-18, 2009, p. 90.

11. Shumaev KB, Kumskova EM, Lankin VZ. The mechanism of superoxide generation under carbonyl stress. Thesis. 6-th National Scientific Practical Conference with International Participation УReactive oxygen species, nitric oxide, antioxidants and human healthФ Smolensk, September 14-18, 2009, pp. 91-92.

12. Кумскова Е.М. Атерогенность природных дикарбонильных соединений.

Материалы Российского национального конгресса кардиологов. Москва, 6-октября 2009 года, с.213. Кумскова Е.М. Власик Т.Н., Янушевская Е.В., Ефремов Е.Е. Ланкин В.З.

Карбонил-модифицированные ЛНП: перспективы для диагностики. Тезисы VI Международной Крымской Конференции Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии. Судак, Крым. Украина, 20-29 сентября 2010 года, с.14. Ланкин В.З., Коновалова Г.Г., Тихазе А.К., Кумскова Е.М. Гипергликемия провоцирует свободнорадикальное окисление ЛНП. Тезисы VI Международной Крымской Конференции Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии. Судак, Крым. Украина, 20-29 сентября 2010 года, с. 15. Кумскова Е.М., Ланкин В.З., Аксёнов Д.В. Природа атерогенности дикарбонилов. Тезисы докладов VIII Международной конференции Биоантиоксидант, Москва, 4-6 октября 2010 г., сс.235-216. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Коновалова Г.Г., Кумскова Е.М., Шумаев К.Б., Аксёнов Д.В., Власик Т.Н., Ефремов Е.Е., Недосугова Л.В. Карбонилзависимая модификация липопротеидов: патофизиологические последствия.

Тезисы докладов VIII Международной конференции Биоантиоксидант, Москва, 4-6 октября 2010 г., сс.247-217. Кумскова Е.М., Тихазе А.К., Ланкин В.З. Роль окислительных процессов в увеличении атерогенности частиц липопротеидов низкой плотности. Тезисы VII Международной Крымской Конференции Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии. Судак, Крым. Украина, 22-30 сентября 2011 года, с. Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии