КЛИНИКО - ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ТОКСИНОВ В РАЗВИТИИ ОСОБЕННОСТЕЙ ТЕЧЕНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ 14.00.10 - инфекционные болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по медицине

На правах рукописи

ГЮЛАЗЯН

Наира Мартуновна

КЛИНИКО - ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

БАКТЕРИАЛЬНЫХ ТОКСИНОВ

В РАЗВИТИИ ОСОБЕННОСТЕЙ ТЕЧЕНИЯ

ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ

14.00.10 Ц инфекционные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва - 2009

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Научные консультанты:

Доктор медицинских наук, профессор Ольга Федоровна Белая

Доктор медицинских наук, профессор Валерий Анатольевич Малов

Официальные оппоненты:

Академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Валентин Иванович Покровский

Заслуженный деятель науки РФ,

член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Борис Павлович Богомолов

Доктор медицинских наук, профессор Наталья Михайловна Беляева

Ведущее учреждение:

ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов.

Защита состоится л_____________________2009 г. в 13.00 часов

на заседании Диссертационного совета Д.208.040.05 в Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (119992, г. Москва, Трубецкая ул., д.8, строение 2).

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНМБ ММА им. И.М. Сеченова

(117998, г. Москва, Нахимовский проспект, дом 49).

Автореферат разослан л________________________2009 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета:

доктор медицинских наук, профессор Елена Васильевна Волчкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Кишечные инфекционные заболевания имеют высокую социально-экономичеснкую значимость и продолжают оставаться актуальной проблемой здравоохранения во всем мире в связи с высокой заболеваемостью, смертностью, трудностями диагностики, а также триггерным действием на развитие патологических синдромов, иммунодефицитных, аллергических и аутоиммунных состояний. В структуре инфекционной патологии острые кишечные инфекции занимают одно из ведущих мест. В РФ ежегодно регистрируются 556-580 тыс. случаев заболеваний ОКИ, от 75 до 78% составляют ОКИ и ПТИ с неустановленным возбудителем (в 2006г. - 306,0 на 100000 населения), что свидетельствует о недостатках в организации диагностики этой группы заболеваний в лечебно-профилактических учреждениях (Доклады ВОЗ 2005-2008; Малеев В.В., Покровский В.И., 2004; Онищенко Г.Г., 2008; Пак С.Г. и соавт., 1986; Покровский В.И., Ющук Н.Д., 1994; Филатов Н.Н., Шаханина И.Л., 2005; Allos В.М.et al., 2004; Bunning V.K. et al., 1997; Fauci А.S., 2001; Guerrant R.L., 2001; Motto D.G. et al., 2005; Razzaq S., 2006; Sandler J.E et al., 2004; Taylor C.M., 2008).

Достижения современной молекулярной биологии, микробиологии, генетики и инфектологии в характеристике факторов патогенности бактерий и оценке их роли в осуществлении определенных фаз инфекционного процесса привели к пониманию полидетерминантности факторов патогенности и вызываемых ими заболеваний. Полиэтиологичность большинства ОКИ и присутствие у возбудителей целого спектра факторов обусловливают одновременное или последовательное воздействие на организм человека нескольких факторов патогенности с различным механизмом действия (Белая Ю.А., Белая О.Ф., 1986; Богомолов Б.П., Витковская В.А., 1982; Бондаренко В.М., 1999; Вертиев Ю.В., 1987; Пак С.Г. и соавт., 2008; Hatheway C.L., 1990; Finlay B.B., Falkow S., 1997; Schmidt H., Hensel M., 2004). Наиболее мощным эффектом среди них обладают ЛПС, подобные им по действию компоненты Гр+ возбудителей, а также экзотоксины.

Синдром интоксикации является отражением сложных скоординированных общепатологических реакций макроорганизма, инициированных бактериальной инвазией и/или поступлением в его внутренние среды структурных компонентов возбудителя, в том числе, экзо- и эндотоксинов и биологически активных метаболитов. Выраженность интоксикации является одним из основных объективных критериев оценки степени тяжести заболевания, определяет его течение и исход (Пак С.Г. и соавт.,1986; Покровский В.В, 1983; Покровский В.В., Ющук Н.Д., 1994).

Особенности воздействия возбудителей и их факторов патогенности (отдельных и в совокупности) на макроорганизм в конкретных условиях инфекционного заболевания изучены недостаточно в связи с ограниченными возможностями используемых методов, их сложностью и малой доступностью. Все большую значимость в современных условиях приобретает необходимость понимания того, каким образом энтеропатогенные возбудители способны вызывать развитие заболеваний и влиять на характер клинического течения, в том числе микст-инфекций, в условиях формирования и распространения клонов возбудителей с полирезистентностью к антимикробным препаратам, постоянного изменения этиологической структуры, роста числа смешанных бактериально-бактериальных, бактериально-вирусных инфекций и необходимости более осторожного и дифференцированного подхода к вопросам лечения и профилактики (Демин И.А., Брусина Е.Б., 2006; Лучшев В.И. и соавт., 1996; Онищенко Г.Г., 2008; Трунилина Р.А. и соавт., 2006).

Недостаток знаний о тонких регуляторных механизмах межклеточных взаимодействий в условиях интоксикации не позволяет однозначно определить факторы, влияющие на тяжесть течения и прогноз заболеваний и разработать на этой основе более совершенные подходы к лечению и профилактике ОКИ. В этой связи представляет несомненный интерес изучение экзотоксинов в биосредах организма больных при различных инфекционных заболеваниях, их присутствия, уровня и динамики в соотношении с выраженностью синдрома интоксикации, апоптоза, уровнями иммунных комплексов, спектром, уровнями и динамикой про- и противовоспалительных цитокинов и другими факторами клеточного и гуморального иммунного ответа.

Цель работы Ц изучить клинико-патогенетическое значение бактериальных токсинов в развитии особенностей течения острых кишечных инфекций.

Задачи исследования:

Установить закономерности выявления, частоту и уровень бактериальных экзотоксинов Шига токсина, энтеротоксина А и В C.difficile, энтеротоксина типа А C.perfringens, холероподобного энтеротоксина у больных острыми кишечными инфекциями при различной этиологии заболевания, вариантах клинического течения и в разные периоды болезни.
Определить частоту и динамику выявления О-антигенов возбудителей при заболеваниях различной этиологии и вариантах течения.
Исследовать частоту, уровни и динамику циркуляции провоспалительных ИЛ-1, ФНО- и противовоспалительных ИЛ-4, ИЛ-10 в крови у больных острыми кишечными инфекциями различной этиологии и клинических вариантах течения.
Изучить ЛПС-индуцированный апоптоз гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов в период реконвалесценции сальмонеллезной инфекции.
Выявить взаимосвязи Шига токсина, энтеротоксина А и В C.difficile, энтеротоксина типа А C.perfringens, холероподобного энтеротоксина (отдельных и в сочетании) с уровнями и спектром про- и противовоспалительных цитокинов, присутствием моно и микст О-антигенов возбудителей и уровнями иммунных комплексов.
Оценить влияние токсинов и О-антигенов на показатели интоксикации и диарейного синдрома в зависимости от уровня и спектра регуляторных цитокинов.
Определить значение в диагностике, оценке тяжести течения и прогнозе заболевания выявления широкого спектра бактериальных экзотоксинов и О-антигенов различной специфичности, в том числе микст.

Научная новизна исследования. Впервые у больных ОКИ проведено комплексное исследование в копрофильтратах маркеров Шига токсина, токсинов А и В C.difficile, энтеротоксина типа А C.perfringens, холероподобного энтеротоксина, О-антигенов шигелл, сальмонелл, йерсиний, кампилобактерий в совокупности с изучением спектра провоспалительных ИЛ-1, ФНО- и противовоспалительных ИЛ-4, ИЛ-10 цитокинов, показателями ЛПС-индуцированного апоптоза гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов, уровнями среднемолекулярных ИК при заболеваниях различной этиологии, клинических вариантах течения и в зависимости от тяжести синдрома интоксикации.

Благодаря использованию широкого спектра диагностикумов на основе рекомбинантных и натуральных белков установлено значительное присутствие в копрофильтратах больных ОКИ маркеров термолабильных экзотоксинов (67,8% случаев). Чаще выявлен энтеротоксин А C.perfringens, токсин А C.difficile и Шига токсин, реже найдены маркеры токсина В C.difficile и холероподобного энтеротоксина. У подавляющего большинства больных отмечено одновременное присутствие 2 - 5 маркеров токсинов (66,7%) (в основном - сочетание энтеротоксина А C.perfringens с токсином А/В C.difficile или с Шига токсином). При сочетании с Шига токсином титры маркеров токсинов клостридий у трети больных в динамике болезни достоверно повышались, в отсутствие Шига токсина в динамике заболевания у 2/3 больных токсины клостридий не выявлялись.

Впервые установлена положительная достоверная связь уровней маркеров токсинов между собой и с частотой их выявления. В разгар заболевания отмечены наиболее высокие уровни маркеров Шига токсина, токсина А C.difficile, энтеротоксина типа А C.perfringens, более низкие - токсина В C.difficile и холероподобного энтеротоксина. В динамике заболевания они снижались, однако, к моменту выписки из стационара сохранялись у 12,5 % больных. Высокие титры токсинов (1:512 и выше) отмечены всего у 1/5 больных.

Впервые установлены различия в уровнях токсинов в зависимости от этиологии заболевания, присутствия моно и микст инфекции, антигенной и токсигенной нагрузки.

Из числа изученных в сыворотке крови ФНОα, ИЛ-1β, ИЛ-4 и ИЛ-10 все четыре цитокина выявлены у 14,4%, три - у 6,7%, два - у 9,4%, один - у 16,7% больных. Наиболее часто выявлен ИЛ-4 (37,8%), в основном, в первые два дня от начала болезни, в различных концентрациях (от 5 до 800 пг/пл) и сочетаниях с другими цитокинами. Частота выявления остальных цитокинов была ниже.

По сочетанию выявленных в крови цитокинов выделены 5 групп больных, четко отличающихся спектром цитокинов и их концентрациями. У трети больных ЦК не определялись, что свидетельствовало, вероятно, о преимущественно их местной, в кишечнике, продукции. У 20,0% наблюдались только низкие концентрации ИЛ-4. При повышении уровня ИЛ-4 до 130 пг/мл в крови появлялись ИЛ-1 и ФНО-, а при концентрации ИЛ-4 выше 500 пг/мл Ц ИЛ-10. У 18,0% больных цитокины выявлены в высоких концентрациях.

Концентрация ИЛ-4 в крови четко коррелировала с концентрациями провоспалительных ЦК (ИЛ-1β и ФНОα) и отражали динамику уровней токсинов: рост титров токсинов у большинства больных в группе сопровождался высокой концентрацией ИЛ-4 и провоспалительных ЦК, а также появлением ИЛ-10 в высоких концентрациях, в то время как стагнация или снижение титров токсинов сопровождалось умеренной концентрацией ИЛ-4 и отсутствием ИЛ-10.

Впервые показано, что взаимообусловленное повышение концентраций ИЛ-4 и ИЛ-10 наблюдается у больных, у которых в копрофильтрате выявлены от одного до трех маркеров разных токсинов. При выявлении 4-5 маркеров токсинов отмечено резкое достоверное падение титров ИЛ-4 и ИЛ-10 и дискоординация их уровней.

Сочетанное выявление ИЛ-4 и ИЛ-10 в высоких титрах у больных ОКИ с диффузными изменениями ткани поджелудочной железы (по данным ультразвукового исследования) сопровождается высокой частотой сочетанного выявления О-антигенов и маркеров токсинов (микст инфекция в 92,0%), достоверным увеличением числа О-антигенов в динамике болезни, более высокими уровнями ИЛ-1β, ФНОα, ИЛ-4 и появлением ИЛ-10 на фоне нормальных показателей амилазы крови. Это может свидетельствовать о субклиническом течении воспалительного процесса в поджелудочной железе.

Сочетанное присутствие у больного О-антигенов и маркеров токсинов нескольких возбудителей приводит к более выраженным клиническим проявлениям болезни (длительной лихорадке, продолжительной и частой диарее, выраженному болевому синдрому, появлению патологических примесей в стуле) и к высоким показателям ЛИИ, в сравнении с больными, у которых обнаружен маркер одного токсина.

Впервые выявлены различия в уровнях, частоте и динамике маркеров токсинов в зависимости от этиологии и клинического варианта течения болезни: в разгар заболевания наиболее высокие уровни токсинов отмечены при шигеллезе и микст инфекции, средние уровни - при сальмонеллезе и йерсиниозе, низкие - в группе больных с О-антигенами кампилобактерий. При ГЭ и ЭК вариантах течения изначально высокие уровни маркеров токсинов и частота их выявления достоверно снижались, а при ГЭК варианте выявлено сначала повышение уровня и частоты выявления маркеров, а затем их снижение до исходных показателей.

Установлены различия в уровнях, частоте и динамике циркуляции про- и противовоспалительных ЦК при различной этиологии заболевания и вариантах клинического течения. В разгар болезни наиболее высокие концентрации ЦК в периферической крови, в первую очередь ИЛ-1β и ИЛ-10, выявлены при микст инфекции и сальмонеллезе, средние - при шигеллезе и кишечной инфекции неустановленной этиологии, наименьшие - при йерсиниозе. Наиболее высокие уровни ЦК определены в остром периоде ГЭК, а наиболее длительно они выявлялись при ГЭ варианте.

У больных ОКИ О-антигены шигелл Зонне, Флекснера, Ньюкастл, сальмонелл В, С1, С2, D, E серогрупп, йерсиний псевдотуберкулеза и , энтероколитика О3, О7,8, О9, О4,33, О6,30 и кампилобактерий выявлены в 90,1%, а в сочетании с токсинами - в 61,5% случаев.

При ГЭ и ЭК вариантах течения ОКИ наиболее часто выявлены О-антигены йерсиний, а при ГЭК - йерсиний и сальмонелл. При всех вариантах течения заболевания отмечена одинаковая средняя частота выявления маркеров токсинов в пробе копрофильтрата (лнагрузка токсинами), в то время как нагрузка О-антигенами была значительно выше при ГЭК, чем при ГЭ и ЭК вариантах течения.

Впервые у больных, перенесших гастроинтестинальную форму сальмонелллезной инфекции, в период реконвалесценции установлено изменение показателей ЛПС - индуцированного апоптоза гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов, что выражается в снижении количества клеток, вступающих в апоптоз на ранних стадиях воздействия токсина, повышении порога чувствительности к субоптимальным дозам ЛПС S. enteritidis, а также подавлении чувствительности апоптоза к воздействию оптимальных доз ЛПС. Выявленная у здоровых доноров закономерная иерархичность индукции апоптоза по ряду гранулоцит - моноцит - лимфоцит наблюдается у больных лишь при наличии низкой, субоптимальной дозы ЛПС.

Впервые с помощью математического анализа установлено значительное количество достоверных связей между изученными показателями, а также зависимость некоторых из них от двух и более независимых переменных. У больных ОКИ удалось установить связи между уровнями Шига токсина, энтеротоксина А C.perfringens. и числом О-антигенов разных возбудителей, выявленных в пробе копрофильтрата, что может свидетельствовать об одновременной активации продукции всех токсинов (из числа изученных) возбудителями кишечных инфекций.

Впервые методом множественного регрессионного анализа созданы математические модели в виде уравнения регрессии для расчета уровней прогнозируемых показателей ЦК (ФНО-, ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-10) и токсинов (А C.difficile. и холероподобного), показателей высоты и длительности лихорадки, частоты стула и числа лейкоцитов периферической крови, с помощью которых возможно решение задач ретро - и проспективного анализа и прогноза.

Практическая значимость. Выявление маркеров экзотоксинов (Шига токсина, энтеротоксина А и В C.difficile, энтеротоксина типа А C.perfringens, холероподобного энтеротоксина) позволяет уточнить степень интоксикации, а в сочетании с выявленными О-антигенами возбудителей характеризует токсическую нагрузку на клетки организма в целом. При этом наличие токсинов говорит о присутствии соответствующих возбудителей, обладающих рядом других факторов патогенности и свидетельствует о значительном нарушении микрофлоры кишечника.

Определение маркеров токсинов важно для оценки эффективности лечения, т.к. адекватная терапия способствует уменьшению численности возбудителя, прекращению или снижению продукции ими токсинов, прекращению их определения в организме.

Использование широкого набора однотипных диагностикумов для выявления антигенов различной специфичности и маркеров токсинов позволяет осуществить раннюю этиологическую диагностику ОКИ, расширить число тестируемых патогенов (прежде всего, трудно диагностируемых) и выявить микст инфекции. В результате проведенных исследований установлена высокая частота разнообразных по составу микст инфекций (83,9%). Информация о присутствии у больного моно или микст инфекции и их структуре является основой для выбора дополнительных методов обследования больных. При этом, у больных с О-антигенами кампилобактерий или йерсиний установлена наиболее низкая нагрузка экзотоксинами и поэтому при дальнейшем обследовании определение токсинов может быть признано нецелесообразным.

При выявлении большого числа О-антигенов и маркеров токсинов, особенно токсинов клостридий, усиливающих воспалительный процесс, не исключена сопутствующая реакция со стороны поджелудочной железы, что обусловливает необходимость применения ультразвукового исследования органов брюшной полости (поджелудочной железы) при микст инфекциях.

Так как у обследованных нами больных частота выявления маркеров токсинов клостридий в различных сочетаниях в копрофильтратах в остром периоде составляет 64,5%, к моменту выписки снижается, но при этом сохраняется у 12,4%, существует необходимость более широкого обследования больных ПТИ на энтеротоксины клостридий.

При отсутствии рутинных методов диагностики кампилобактериоза использование поливалентного диагностикума позволяет напрямую выявить присутствие кампилобактерий (C.coli, С.jejuni, C.lari) при ОКИ и других заболеваниях.

Своеобразная динамика всех токсинов (нарастание к 4-6 дню от начала болезни с последующим снижением, а также более длительное присутствие и более высокая антигенная нагрузка) и цитокинов при гастроэнтероколитическом варианте течения, в отличие от гастроэнтерита и энтероколита, свидетельствует о недостаточности защитных механизмов при поражении ЖКТ на всем протяжении и может быть предиктором развития различных иммунопатологических реакций и хронических заболеваний кишечника.

Основные положения, выносимые на защиту:

Сочетанное воздействие факторов патогенности нескольких возбудителей кишечных инфекций (О-антигенов и экзотоксинов) обусловливает более высокие уровни маркеров возбудителей, большую тяжесть интоксикационного и диарейного синдромов и более высокие уровни про- и противовоспалительных ЦК, что свидетельствует о мультипликации их биологических эффектов.
Среди ОКИ преобладают микст - инфекции (83,9%) над моно - инфекциями, наиболее часто выявлены сочетания нескольких О-антигенов и маркеров токсинов..
Частота выявления и уровни маркеров токсинов, про- и противовоспалительных ЦК и О-антигенов различаются в зависимости от этиологии заболевания, клинического варианта течения и периода болезни.
К периоду реконвалесценции при отсутствии клинических симптомов у больных сохраняются маркеры возбудителей (12,5%), а также наблюдается повышение порога чувствительности гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов к низким дозам ЛПС-индуцированного апоптоза и снижение - к воздействию оптимальных доз ЛПС.

Внедрение результатов работы. Апробированные в данной работе методики используются в научной деятельности лаборатории по изучению токсических и септических состояний отделения НИЦ при МПФ ММА им. И.М. Сеченова на базе ГИКБ № 2 г. Москвы и в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Результаты проведенной работы дополняют данные исследования синдрома интоксикации при ОКИ различной этиологии, полученные на кафедре инфекционных болезней МПФ ММА им. И.М. Сеченова, и используются в процессе преподавания курса инфекционных болезней.

Апробация работы. Основные положения и результаты работы доложены: на 7-ом Российском съезде инфекционистов Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней (Нижний Новгород, 25 - 27 октября 2006 г.); на Российской научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова (Санкт-Петербург, 22-24 марта 2006г.); на 7-й научной конференции РАЕН с международным участием (Дагомыс, Сочи, 4 -7 сентября 2006 г); на Юбилейной Российской научной конференции с международным участием, посвященной 75-летию со дня рождения С.П. Боткина (Санкт-Петербург, 29 мая-1 июня 2007 г.); на научно-практической конференции, посвященной 70-летнему юбилею больницы Соколиная гора (Москва, июль 2007 г.); в материалах Тринадцатой и Четырнадцатой Российской Гастроэнтерологической Недели (Москва, 22 - 24 октября 2007 г. и 6-8 октября 2008 г.); в материалах Тринадцатой и Четырнадцатой Российской конференции Гепатология сегодня (Москва, 17Ц 9 марта 2008 г., Москва 16-18 марта 2009 г); в материалах Евроазиатского конгресса инфекционистов (г. Витебск, Беларусь, 29-30 апреля 2008 г.); на Втором Санкт-Петербургском международном экологическом форуме "Окружающая среда и здоровье человека" (Санкт-Петербург, 1Ц4 июля 2008 г.); на V Международной конференции Идеи Пастера в борьбе с инфекциями (Санкт-Петербург, 2-4 июня 2008 г.). Отдельные фрагменты работы опубликованы в журналах Эпидемиология и инфекционные болезни, Клиническая лабораторная диагностика, Современные наукоемкие технологии, Успехи современного естествознания, Лечащий врач, Ремедиум-Приволжье, Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии.

Диссертация апробирована на совместном заседании кафедры инфекционных болезней МПФ и лаборатории по изучению токсических и септических состояний при кафедре ММА им. И.М. Сеченова 11 марта 2009 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 34 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 410 страницах и состоит из введения, обзора литературы, 8 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, приложений. Библиография включает 604 отечественных и зарубежных источников. Полученные результаты иллюстрированы 95 таблицами и 49 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В соответствии с поставленными задачами исследования проведено клиническое обследование 305 больных ОКИ различной этиологии и тяжести. Из них у 273 больных средней тяжести течения в остром периоде заболевания бактериологическое подтверждение диагноза получено у 14,7% пациентов: у 12,5 % обнаружены сальмонеллы, у 2,2 % - шигеллы, у остальных 85,3% больных диагноз бактериологически не подтвердился (БПОНЭ) - бактериальное пищевое отравление неустановленной этиологии. Исследования проводили в остром периоде (1-3 дни), в динамике болезни - на 4-6 день и в период ранней реконвалесценции (7-9 дни). У 32 больных с бактериологичеки подтвержденным диагнозом сальмонеллеза (10 больных с тяжелым течением, 14 - со среднетяжелым, 8 - с легким течением болезни) в период поздней реконвалесценции (15 - 25 дни от начала болезни) исследованы показатели ЛПС-индуцированного апоптоза.

В качестве дополнительного метода расшифровки этиологии ОКИ мы использовали РКА на стекле с набором антительных диагностикумов для выявления в качестве маркеров возбудителей О-Аг шигелл Зонне, Флекснера, Ньюкастл, сальмонелл В, С1, С2, D, E серогрупп, йерсиний псевдотуберкулеза и , энтероколитика О3, О7,8, О9, О4,33, О6,30, кампилобактерий (поливалентный), а также РКА на планшете для выявления маркеров - Шига токсина, токсинов А и В C.difficile, энтеротоксина типа А C.perfringens, холероподобного энтеротоксина (диагностикумы были изготовлены и любезно предоставлены ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН).

Материалом для исследования в РКА служили пробы КФ, сыворотки крови и ИК. В общей сложности исследовано 487 проб кала и 545 крови. Проводили иммуноферментный анализ определения количественного содержания ИЛ-1β, ФНОα, ИЛ-4 и ИЛ-10 в сыворотке крови (ООО Протеиновый контур С-Пб.), ЛПСЦиндуцированный апоптоз гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов с использованием тест-систем ApoAlertЩDNA (проточно-цитонфлюориметрический анализ фрагментации ДНК) (BD, Biosciences). Проводили традиционные бактериологические исследования, общеклинические анализы крови и мочи, по показаниям Ц копрологическое и биохимическое исследование, КОС крови, а также ультразвуковое исследование органов брюшной полости, гастроскопию, колоноскопию, ректороманоскопию и ЭКГ.

Статистическая обработка данных была выполнена по программам Microsoft Excel и Statistica 6.0, Biostat для IBM PC. Использованы параметрические и непараметрические критерии - тесты Левена, Пирсона, Шапиро-Уилка, Колмагорова - Смирнова, Уилкоксона-Манна-Уитни, критерий Стьюдента, корреляционный и множественный (линейный) регрессионный анализы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Этиологическая структура ОКИ (n=273) была подтверждена в общей сложности бактериологически и иммунологически всего у 94,9% больных: у 11,0% больных выявлен О-Аг одного возбудителя, либо маркер одного токсина клостридий, т.е. диагностирована моноинфекция, у 229 (83,9%) Ц смешанное инфицирование (микст Аг), у остальных пациентов (5,1%) этиология заболевания не выявлена.

В группе больных с бактериологически подтвержденным диагнозом сальмонеллеза О-Аг сальмонелл соответствующих серогрупп выявлены у 9 больных (26,5%). В 85,3% случаев были выявлены антигены нескольких кишечных возбудителей (два и более), т.е. установлено микст инфицирование. В группе больных бактериологически подтвержденного шигеллеза у всех пациентов были найдены О-Аг шигелл, и у 83,3% выявлены еще и О-Аг других возбудителей.

В целом, в результате исследования двух проб КФ от больных без бактериологического подтверждения диагноза (n=243) с одинаково высокой частотой выявлены О-Аг сальмонелл (63,0%) и О-Аг йерсиний (63,4%), реже Ц О-Аг шигелл (33,3%), необычно часто найдены О-Аг кампилобактерий (31,1%).

Из группы больных бактериологически неподтвержденным диагнозом у больных с О-Аг сальмонелл в первом анализе далее у всех были выявлены микст Аг, в группе с О-Аг шигелл Ц только у одного больного. В группе с О-Аг кампилобактерий отмечено редкое выявление Аг токсинов (16,7%). В группе с О-Аг йерсиний у 53,3% больных были выявлены Аг нескольких возбудителей, как и в группе с О-Аг кампилобактерий, отмечено редкое выявление Аг токсинов (25,9%).

В результате после исследования двух проб КФ у 83,9% больных были выявлены маркеры токсинов и О-Аг нескольких возбудителей.

В группе из 36 больных (13,2%) без высева и маркеров возбудителей (в 1-ой пробе КФ) при исследовании 2-ой пробы КФ также в 61,1% случаев выявлены разные маркеры

Таким образом, для этиологической расшифровки ОКИ очевидно преимущество метода РКА. Так, если по данным бактериологического исследования этиология заболевания была установлена у 14,7% больных, то при определении О-Аг или маркеров токсинов с использованием РКА в результате исследований двух проб КФ значительно увеличилась возможность подтверждения диагноза (94,9%). Даже при бактериологически подтвержденных сальмонеллезах (85,3%) и у всех больных шигеллезами были выявлены Аг нескольких кишечных возбудителей, т.е. имело место смешанное инфицирование.

В целом, О-Аг разных кишечных возбудителей выявлены в 90,1% случаев: в виде моно О-Аг Ц в 9,9% случаев, микст О-Аг Ц в 18,7%, в сочетании с токсинами Ц в 61,5% случаев.

Анализируя полученные данные по вариантам течения ОКИ в группе с бактериологически неподтвержденным диагнозом, отмечено, что маркеры различных возбудителей кишечных инфекций выявлены при ГЭ, ГЭК и ЭК течении болезни у 71,2 %, 71,0%, 76,5% больных. Пробы КФ одновременно с 3 и более Аг выявлены при ГЭ (29,9%, р1Аг<0,03), ГЭК (38,7%, р1Аг<0,05) и ЭК (33,3%) чаще, чем с одним Аг. Наиболее часто среди всех вариантов течения ОКИ О-Аг йерсиний и сальмонелл выявлены при ГЭК варианте, а при почти одинаковой нагрузке токсинами в пробе КФ нагрузка О-Аг была значительно выше при ГЭК (2,0).

Мы изучили также динамику уровней среднемолекулярных ИК в КФ больных ОКИ в зависимости от периода заболевания, клинического варианта течения и при различной этиологии заболевания. В общей группе больных отмечено достоверное с 1-3 днем нарастание уровней ИК к 4-6 дню заболевания (2,40 0,07, р1-3 < 0,02) и в период реконвалесценции (7 - 9 дни) (2,53 0,14, р1-3<0,02).

Уровни ИК в группах больных ОКИ различной этиологии достоверно не отличались, в динамике болезни в большинстве групп наблюдалось некоторое повышение уровня (р > 0,05), при кампилобактериозной и микст инфекции некоторое понижение уровней.

Анализ уровней ИК при различных вариантах течения болезни выявил, что в разгар болезни при ГЭК и ЭК титры были достоверно выше, чем при ГЭ течении (р < 0,01 и р < 0,02, соответственно), в динамике Ц не отличались, в период ранней реконвалесценции при ГЭ и ЭК варианте наблюдалось сохранение уровней, а при ГЭК отмечено незначительное повышение уровней ИК (р > 0,05).

В условно принятом нами диагностическом титре 1:8 маркеры токсинов были найдены всего у 67,8% больных. Маркеры ШТ найдены в 24,4 % проб КФ, токсина А C.dif. - в 29,4 %, токсина В C.dif. - в 23,2 %, энтеротоксина А C.perf. - в 32,9 % и ХЭТ Ц в 12,1% проб КФ. Достоверно чаще, чем остальные, были выявлены токсины А C.dif. и C.perf. (р<0,05) и реже - ХЭТ (р < 0,05) в сравнении с остальными токсинами. У 16,5 % из них титры были очень высокие (1:512 и выше)

Число одновременно выявленных 3 и более маркеров токсинов в одной пробе КФ составило 46,5%. В основном (66,7%), выявлены различные сочетания токсинов А и/или В C.dif. с C.perf. А и/или ШТ (в сочетании с токсинами клостридий у 64,5%). К моменту выписки из стационара (на 6 - 10 дни болезни) у 34 больных (12,5 %) в кале сохранялись Аг токсинов клостридий в повышенном титре.

С целью выявления клинических особенностей течения заболевания в зависимости от присутствия в организме того или иного возбудителя ОКИ, анализ симптомов интоксикации и диареи проводили в группах больных с различной этиологией заболевания.

Нами были исследованы основные объективные симптомы интоксикации и диарейного синдрома в разгаре болезни (1-3 день): максимальная высота и длительность лихорадки, частота стула и общая длительность диареи, а также число лейкоцитов и ЛИИ (Таблица 1).

Симптомы интоксикации и диарейного синдрома были наиболее выражены у больных сальмонеллезом, менее - при кампилобактериозной инфекции. При острой дизентерии наблюдалась большая частота стула, а при йерсиниозе - длительная диарея. При микст-инфекции интоксикация была менее выражена, чем при сальмонеллезной инфекции. Более яркие проявления интоксикации и диареи были выявлены у больных при сочетанном воздействии токсинов клостридий и ШТ, чем при клостридиальной моноинфекции, однако достоверных отличий в группах не было выявлено. У больных с неустановленной этиологией заболевания лихорадка была достоверно длительнее, чем при микст-инфекции, кампилобактериозной и клостридиальной моно инфекциях.

При ГЭК и ЭК, в сравнении с ГЭ, достоверно был более выражен диарейный синдром, - частота стула, длительность диареи, длительность лихорадки, а при ЭК еще и высота температуры (Таблица 2).

При ГЭК варианте с первого дня болезни был выявлен умеренный лейкоцитоз (р<0,05) и низкие значения ЛИИ (р > 0,05) в сравнении с ГЭ и ЭК вариантами. Начиная со 2 - 3 дня болезни при всех клинических вариантах было выявлено достоверное снижение числа лейкоцитов. В динамике болезни наблюдалось снижение во всех группах больных также показателей ЛИИ, но только при ЭК варианте до контрольных значений (2,6 0,7; р < 0,05) (Таблица 3).

Число лейкоцитов и ЛИИ были более выражены у больных при ГЭК варианте, менее - при ЭК и слабее - при ГЭ варианте ОКИ (Таблица 3).

Сравнительный анализ симптомов интоксикации и диареи у больных в зависимости от присутствия у них моно или микст токсинов и О-Аг кишечных возбудителей показал, что, высота температуры в сравниваемых группах достоверно не отличалась, лихорадка была несколько длительнее при воздействии лишь микст токсинов (р>0,05). Частота стула в группе больных с моно токсином в разгар болезни была достоверно выше, чем в группах с микст токсинами и токсином C.perf.А с О-Аг (5,9±0,9) (р<0,05). Диарея была длительнее в группе больных с микст О-Аг (р>0,05) (Таблица 4).

Интересен тот факт, что максимальное значение ЛИИ выявлено в группе с маркерами разных токсинов (35,319,4), что достоверно выше, чем при сочетанном влиянии токсинов и О-Аг разных возбудителей (р<0,03).

Детальный анализ показателей диарейного синдрома (боли в области живота, характер стула и присутствие в ней патологических примесей) показал, что во всех группах больных чаще отмечается обильный водянистый стул (р<0,05) и боли в животе различного характера и интенсивности, однако, более яркие проявления колита и гемоколита отмечены при микст О-Аг (Таблица 5).

Мы полагаем, что выявление маркеров токсинов клостридий даже в небольших титрах должно привлекать к себе внимание, так как, свидетельствует о присутствии в кишечнике клостридий токсинпродуцирующих бактерий, способных при благоприятных условиях (нарастание дисбиоза, антибиотикотерапия и др.) быстро увеличить продукцию токсина, с развитием псевдомембранозного колита (Hatheway C.L., 1990).

У 49 больных ОКИ различной этиологии средней тяжести течения было проведено УЗИ органов брюшной полости с целью выявления возможных изменений со стороны ПЖ. В результате обследования у 25 больных (51,0%) были обнаружены диффузные изменения ткани ПЖ различной степени выраженности (подгруппа А), в подгруппе Б Ц изменений не выявлено.

Таблица 1

Клинико-лабораторные особенности течения ОКИ в этиологически различных группах

Этиол. расшифровка	Число боль- ных	Высота температуры	Длительность лихорадки	Частота диареи	Длительность диареи	Число лейкоцитов	ИИ
Сальмонеллы	44	38,7 0,1	3,7 0,3	12,0 0,9	4,8 0,6	7,1 0,3	25,8 5,0
Шигеллы	10	38,1 0,2 **	2,5 0,2	14,1 3,4	3,0 0,3	6,3 0,6 *	36,2 24,4
Йерсинии	15	38,0 0,2 **	2,5 0,7	9,7 2,5	4,2 0,7	6,7 0,4	12,4 3,6
Капилобактерии	6	37,4 0,3 **	1,3 0,3 **	6,2 1,6 **	2,0 0,3	7,4 1,2	8,1 5,5
Клостридии	11	38,0 0,3 **	2,0 0,3 **	9,9 1,6	2,9 0,2	6,3 0,6 *	7,6 2,6
Клостридии и ШТ	22	37,8 0,2 *	2,5 0,4 **	6,7 1,1 **+	3,6 0,4	8,0 0,5	27,7 13,4
Микст-инфекция	129	37,9 0,1 **	2,4 0,1 **	8,0 0,6 ** +	3,3 0,2 **	6,9 0,3	16,8 8,0
КИНЭ	36	38,1 0,1 **	2,8 0,1 **	9,5 1,3	3,6 0,3	7,4 0,5	11,4 3,4

Примечание: достоверные различия в сравнении с группой * - Клостридий и ШТ,

**- сальмонеллеза, - КИНЭ-, - кампилобактерий, +- шигеллеза

Таблица 2

Клинические особенности течения ОКИ в группах больных (n=273)

по вариантам течения в разгаре болезни

Группы	Число больных	Высота температуры	Длительность лихорадки	Частота стула	Длительность диареи
ГЭ	173	38,0 0,1	2,4 0,1	8,1 0,5	3,3 0,1
ГЭК	43	38,1 0,1	3,4 0,3*	10,4 1,1*	4,7 0,4*
ЭК	57	38,4 0,1*	3,0 0,2*	11,1 1,1*	4,1 0,5*

Примечание: * - достоверность различий в сравнении с ГЭ (р<0,05)

Таблица 3

Число лейкоцитов и ЛИИ по дням болезни при различных вариантах течения болезни

Груп-пы	Показатели	Дни болезни
Груп-пы	Показатели	1	2	3	4	5	6
ГЭ	ейкоциты	8,9 0,6 **	7,5 0,3	6,4 0,4 *	5,7 0,5 *	6,3 1,9	4,8 0,6 *
ГЭ	ИИ	22,0 7,1	14,6 4,1	49,6 26,8	6,4 1,7	9,1 3,2	5,7 4,4
ГЭК	ейкоциты	12,8 1,1	7,2 0,5 *	7,2 0,6 *	5,3 0,6 *	8,1 1,7	6,5 0,6 *
ГЭК	ИИ	4,6 1,5	23,6 10,0	13,5 6,7	12,2 7,2	6,6 0,1	15,8 10,7
ЭК	ейкоциты	8,0 1,1 **	7,1 0,6	6,9 0,5	5,6 0,5 *	6,9 1,0	4,0 1,0
ЭК	ИИ	15,4 11,2	18,0 8,7	7,7 2,2	10,3 4,4	7,9 0,4	2,6 0,7+

Норма ЛИИ от 0,5 до 3,5 ЕД

Примечание: достоверные различия в сравнении *- с 1 днем болезни

** - с ГЭК в тот же день болезни, + - с 5 днем болезни (р < 0,05)

Таблица 4

Клинико-лабораторные особенности течения ОКИ в группах при наличии токсинов

и/или О-Аг и их сочетаний

Группы больных	Высота температуры	Длительность лихорадки	Частота диареи	Длительность диареи	Число лейкоцитов	ИИ
Моно токсин	38,2 0,2	2,2 0,3	10,5 1,9	2,6 0,3	6,5 0,7	7,5 2,6
Токсин C.dif. А с О - Аг	38,0 0,3	2,7 0,3	5,9 2,0	2,7 0,5	6,3 0,7	4,8 1,1
Токсин C.perf. А с О - Аг	38,0 0,2	2,0 0,3	5,9 0,9 **	2,9 ± 0,4	7,4 1,0	10,4 3,9
Микст - токсины	37,8 0,2	3,0 0,5	5,7 1,1 **	3,6 0,6	7,8 0,7	35,3 19,4 *
Микст - токсины с О-Аг	37,7 0,2	2,2 0,2	8,8 1,3	3,2 0,2	6,9 0,5	6,7 0,8
Микст О-Аг	37,8 0,1	2,4 0,2	10,3 1,1	4,0 0,4	6,9 0,3	26,7 13,8

Примечание: достоверность различий в сравнении с группой

* - микст токсины с О - Аг, ** - моно токсин (р < 0,05)

Таблица 5

Характер диарейного синдрома в зависимости от присутствия токсинов и/или О-Аг

Группы больных	Боли в области живота	Характер стула			Примеси в стуле
Группы больных	Боли в области живота	обильный водянистый	кашицеобразный	скудный	слизь или зелень	кровь и слизь
Моно токсин	36,4%	100%	-	-	-	-
Токсин C.dif. с О - Аг	50,0%	60,0%	40,0% Х	-	-	-
Токсин C.perf. с О - Аг	84,6%	53,9%	46,2% Х	7,7% *	7,7%	-
Микст токсины	76,2%	76,2%	14,3% *	4,8% *	4,8%	-
Микст токсины с О - Аг	61,5%	69,2%	9,2% *	20,0% *	16,9%	-
Микст О - Аг	60,0%	78,7%	9,3% *	12,0% *	9,3%	8,0%

Примечание: * - достоверность различий в сравнении с частотой выявления обильного водянистого стула , Х - с группой микст токсины с О-Аг и микст О-Аг (2 , р<0,05)

В подгруппе А больных максимальная температура была достоверно ниже, чем в подгруппе Б, остальные клинические показатели достоверно не отличались, динамика изменений маркеров токсинов в обеих подгруппах была незначительной, однако, в А подгруппе больных с изменениями ПЖ нагрузка токсинами была достоверно ниже, чем О-Аг (р<0,01).

У больных с изменениями УЗ картины ПЖ в 92,0 % случаев выявлены маркеры двух и более возбудителей, что выше аналогичного показателя в подгруппе больных без изменений ПЖ (62,5%) (р<0,03). В динамике заболевания у этих больнных на фоне незначительного увеличения нагрузки маркерами токсинов резко возросла О-Аг нагрузка (р<0,01): чаще выявлены О-Аг йерсиний и сальмонелл. В разгар заболевания уровни всех ЦК были выше, установлена сильная положительная связь между уровнями про- и противовоспалительных ЦК, в сравнении с подгруппой без изменений ПЖ. Суммарное воздействие факторов патогенности двух и более возбудителей ОКИ (в первую очередь, эндотоксинов), вероятно, способствует усиленной продукции ЦК, в первую очередь ИЛ-1, с соответствующим увеличением концентрации ИЛ-4, и, в конечном счете, ИЛ-10, разнвитию на этом фоне более выраженного воспаления, в том числе, и ткани поджелудочной железы. Выраженных клинико-лабораторнных признаков панкреатита (амилаза 44,2±8,4 Ед) не выявлено. Тем не менее, полученные результаты свидетельствуют о необходимости проведения у больных ОКИ УЗ исследования и последующего динамического наблюдения, с целью выявления возможных изменений со стороны ткани ПЖ, возможной коррекции терапии, что будет способствовать предупреждению затяжного и хронического течения болезни и осложнений.

Впервые мы изучили регуляцию ЛПС-индуцинрованного апоптоза гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов в период реконвалесценции сальмонеллезной инфекции разной тяжести течения. Клинические проявления болезни были изучены у 32 реконвалесцентов сальмонеллеза.

Изучение показателей раннего апоптоза в популяции гранулоцитов показало (Таблица 6), что при среднетяжелом течении на высокую дозу (1000 нг/мл) ЛПС S.Еnteritidis наблюдалось статистически достоверное снижение содержания ранних апоптотических клеток, а при тяжелом течении аналогичная картина - на обе использованные дозы ЛПС (100 и 1000 нг/мл). При легком течении разница с контролем не обнарунжена. Содержание поздних апоптотических клеток было статистически доснтоверно снижено во всех группах реконвалесцентов только на высокую дозу. Интенсивность апоптоза гранулоцитов не отличалась от аналогичных поканзателей контрольной группы.

Процент ранних апоптотических моноцитов достоверно снижен у больнных со среднетяжелым и тяжелым течением, причем, в отличие от гранулонцитов, - как на низкую (100 нг/мл), так и высокую дозы ЛПС. В то же время поздний апоптоз и интенсивность апоптоза не отличались от контроля.

Ранний апоптоз в популяции лимфоцитов не имел каких-либо отклоненний от контроля, однако, содержание поздних апоптотических лимфоцитов было достоверно снижено у реконвалесцентов с тяжелым течением при наличии высокой дозы ЛПС. В отличие от гранулоцитов и моноцитов, у лимфоцитов была подавленна интенсивность апоптоза при наличии высокой дозы, причем наиболее вынражена у реконвалесцентов с тяжелым течением, менее - со среднетяжелым и наименее - при легком течении.

Таблица 6

ПСЦиндуцированный апоптоз гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов здоровых доноров и больных в период реконвалесценции сальмонеллезной инфекции по тяжести течения

Группы	Доза ЛПС в 1мл цельнной крови	% ранних апоптотических клеток	% поздних апоптотических клеток	Интенсивность апоптоза (СНК)
Гранулоциты
Здоровые доноры	1000нг	6,2 1,2	90,6 1,6	1424 255,2
Здоровые доноры	100нг	5,5 1,3	84,7 3,7	1206 237,9
Тяжелое течение	1000нг	3,1 0,9*	84,0 3,4*	1231 294,2
Тяжелое течение	100нг	2,1 0,7*	82,9 4,9	1529 434,9
Среднетяжелое течение	1000нг	4,2 0,9Х	85,7 2,0*	1263 169,8
Среднетяжелое течение	100нг	4,7 1,0	86,3 3,0	1412 239,4
егкое течение	1000нг	4,9 1,3	82,7 3,7*	1583 230,3
егкое течение	100нг	4,5 0,7	86,1 3,0	1566 480,0
Моноциты
Здоровые доноры	1000нг	4,3 1,7	75,9 5,7	136,1 19,5
Здоровые доноры	100нг	3,5 1,3	78,1 4,0	124,9 20,3
Тяжелое течение	1000нг	1,4 0,4*	76,3 3,6	110,2 9,8
Тяжелое течение	100нг	0,7 0,3*	77,7 5,2	117,2 14,6
Среднетяжелое течение	1000нг	1,9 0,3*	83,2 2,6	118,4 9,2
Среднетяжелое течение	100нг	1,8 0,5Х	83,0 3,6	113,7 8,4
егкое течение	1000нг	2,1 0,8	83,4 3,4	136,8 13,0
егкое течение	100нг	2,8 0,6	85,1 2,9Х	136,9 11,5
имфоциты
Здоровые доноры	1000нг	1,5 0,6	63,8 6,4	62,3 7,6
Здоровые доноры	100нг	1,3 0,6	55,5 6,2	47,5 6,6
Тяжелое течение	1000нг	0,7 0,2	49,9 4,8*	44,4 2,9*
Тяжелое течение	100нг	0,7 0,2	52,5 4,7	49,5 4,3
Среднетяжелое течение	1000нг	0,8 0,3	55,3 4,7	47,5 2,7*
Среднетяжелое течение	100нг	0,6 0,2Х	52,1 3,3	45,4 2,3
егкое течение	1000нг	0,8 0,4	53,2 6,3	47,8 4,6Х
егкое течение	100нг	1,3 0,6	51,2 5,7	51,2 7,3

Примечание: *Pt < 0,05; ХPy< 0,05 в сравнении с апоптозом здоровых доноров.

Исследования показали, что у больных, перенесших гастроинтестинальную форму сальмонеллезной инфекции, на стадии ранней реконвалесценции наблюдаетнся изменение показателей ЛПС-индунцированнного апоптоза грануло-, моно- и лимфоцитов, что выражается в снижении количества клеток, вступающих в апоптоз на ранних стадиях воздействия токсина, повышении порога чувствинтельности к субоптимальнным дозам ЛПС S.enteritidis, а также подавнлении чувствительности апоптоза к воздействию оптимальных доз ЛПС. Наиболее значимые отклонения по всем исследованным параметрам наблюндались у реконвалесцентов тяжелого течения сальмонеллеза

Дозонзависимость индукции апоптотического ответа в популяции моно- и лимфоцитов не проявляло четкой связи с тяжестью клинического течения заболевания.

Следует отметить, что выявленная у здоровых доноров закономерная иерархичность индукции апоптоза по ряду гранулоцит - моноцит - лимфоцит наблюдается в группе больных лишь при наличии низкой, субоптимальной дозы ЛПС. Эти данные свидетельствуют о том, что во всех исследованных популяциях клеток в период реконвалесценции формируется память, изменяющая чувстнвительность клеток при повторном воздействии токсина. Об этом свидетельствуют также полученные нами данные корреляционного анализа интенсивности апоптоза при субоптимальных дозах токсина.

Впервые у больных ОКИ нами были изучены динамика изменений уровней и частота встречаемости маркеров ряда наиболее значимых токсинов, выступающих в качестве важных факторов патогенности в развитии кишечных инфекций - ШТ, токсинов А и В C.dif., энтеротоксин типа А C.perf., ХЭТ. ШТ считается наиболее распространенным токсином, встречающимся у S. dysenteriae 1 и их ОЦ мутантов, S. flexneri различных сероваров, кроме V, различных E. coli, сальмонелл и йерсиний псевдотуберкулеза, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Acinetobacter haemolyticus (Grotiuz G., et. al. 2006; Nataro J.P. et. al. 1998, OТBrien A.D. et. al. 1984) (Рисунок 1).

ХЭТ идентичен LT кишечной палочки и вырабатывается E.coli, представителями родов Escherichia, Salmonella, Campylobacter, Aeromonas, Vibrio. Продукция этих токсинов (ШТ и ХЭТ) может быть обусловлена также энтеробактериями, относящимися к группе условно патогенных бактерий, исследования, на наличие которых проводится у взрослых больных редко (Klebsiella oxytoca, Citrobacter freundii, K.pneumoniae str., E.cloacae str., E.aerogenes str. и др) (Bondarenko V.M. et. al., 1986, Jolivet-Gougeon A., 1997).

Детальное изучение динамики выявления маркеров токсинов в КФ свидетельствует об их высоких титрах, начиная с первых дней от начала заболевания, с последующим снижением частоты выявления к периоду ранней реконвалесценции, достоверным для C.perf. А и ШТ (р<0,05). Частота выявления всех токсинов в 1-3 дни болезни была также выше, чем в последующие сроки исследования, при этом на 4-6 день Аг C.perf. А был выявлен достоверно чаще, чем ШТ и C.dif. В (р<0,05) ().

Максимальные уровни ШТ и токсина А C.perf. были выявлены уже в первый день болезни, токсинов А (0,76±0,08) и В C.dif. - на 2 день и только ХЭТ - на 3 день . В динамике заболевания, начиная с 4 дня, средние уровни маркеров всех токсинов снижались. В период ранней реконвалесценции (на 7-9 день) наблюдалось достоверное снижение уровня ШТ (p4-6<0,01), ХЭТ (р1-3<0,05), токсинов А C.perf (р1-3<0,05) и C.dif. А (р1-3<0,05), кроме токсина В C.dif.

К моменту выписки из стационара Аг ШТ (4,0%), ХЭТ (2,2%) и токсинов клостридий (12,5%) сохранялись в кале в диагностическом титре.

В зависимости от этиологии заболевания средние уровни маркеров выявляемых токсинов значительно различались.

Высокие уровни Аг ШТ в разгаре заболевания выявлены в группах с кампилобактериозной инфекцией и микст-инфекцией, более низкие, в сравнении со всеми, Ц в группе с неустановленной этиологией (р<0,01), однако, в динамике болезни в этой группе с наблюдалось достоверное повышение уровня ШТ (р1-3<0,03). В группе с О-Аг кампилобактерий Аг ШТ быстро исчезал. Только в группе больных сальмонеллезом на 7-9 день уровни Аг ШТ были достоверно ниже, чем в начале болезни (р1-3<0,04).

Примечание: достоверность различий в сравнении + - с предыдущим сроком, - с 1-3 днем болезни

Рисунок 1. Частота выявления и динамика титров Шига токсина (А), энтеротоксина А C.difficile (В), цитотоксина В C.difficile (С), энтеротоксина A C.perfringens (D), холероподобного энтеротоксина (Е) в копрофильтратах больных ОКИ (lg10 обратного титра антигена) (n = 487).

Максимальный уровень Аг ХЭТ в разгаре болезни был выявлен в группе с микст инфекнцией, в динамике (4-6 дни) выявлены достоверно более высокие показатели в сравнении с шигеллезами (р<0,05), с группой КИНЭ (р<0,01). При кампилобактериозной инфекции в течение всего заболевания Аг ХЭТ не выявлены. Только в группе больных йерсиниозом в динамике выявлено достоверное снижение титров ХЭТ. В ранней реконвалесценции, после 7 дня болезни, Аг ХЭТ были выявлены только в группах больных с микст инфекцией, йерсиниозом и КИНЭ (Рисунок 2).

Максимальные показатели токсина А C.dif в 1-3 день болезни выявлены при острой дизентерии, минимальные Ц при кампилобактериозной инфекции и в группе КИНЭ. Во всех группах в разгар заболевания выявлены достоверно высокие титры в сравнении с КИНЭ и кампилобактериозной инфекцией (р<0,03); в группах с микст инфекцией и йерсиниозом уровень токсина был достоверно выше, чем при кампилобактериозной инфекции (р<0,05). В динамике болезни (4-6 день) при шигеллезах наблюдалось достоверное снижение уровня токсина; в группе КИНЭ Ц повышение (р<0,05); в группе с микст инфекцией уровень токсина был ниже, чем при шигеллезах (р<0,01), но выше, чем при йерсиниозе (р<0,02). В период ранней реконвалесценции во всех группах выявлено последовательное снижение титров C.dif. А, кроме группы с неустановленнной этиологией заболевания и шигеллеза.

Максимальные значения титров токсина В C.dif. в КФ в 1-3 день болезни выявлены в группе с микст-инфекцией, минимальные Ц при кампилобактериозной инфекции и КИНЭ. Уровень токсина в этот период группе КИНЭ был достоверно ниже, чем в остальных группах (р<0,03). В группе сальмонеллеза и при микст инфекции уровни токсина, как в динамике заболевания, так и в ранней реконвалесценции, почти не изменились.

Максимальный уровень энтеротоксина C.perf. А в КФ выявлен при шигеллезах, минимальный Ц при кампилобактериозной инфекции и в группе КИНЭ, уровни последних были достоверно ниже, чем в остальных группах (р<0,05). В динамике болезни (4-6 день) при шигеллезах наблюдалось достоверное снижение уровней токсина (р1-3<0,05),а в группе КИНЭ Ц повышение (р1-3<0,05); при микст инфекции и сальмонеллезах Ц титры не изменились; в при микст инфекции уровень токсина был достоверно выше, чем при йерсиниозе (р<0,02). В ранней реконвалесценции во всех группах выявлено снижение уровня энтеротоксина А C.perf..

Итак, в период разгара болезни высокие уровни токсинов А и В C.dif., энтеротоксина А C.perf. были выявлены в группе больных с шигеллезом и при микст инфекции, средние Ц при сальмонеллезе и йерсиниозе, низкие Ц при кампилобактериозной инфекции и в группе КИНЭ.

В зависимости от клинического варианта течения болезни средние уровни маркеров выявляемых токсинов также различались (Рисунок 3).

Изначально высокие уровни Аг ШТ при ГЭ и ЭК вариантах течения в динамике заболевания снизились (р<0,05), причем, при ГЭ Ц с одновременным сочетанным снижением частоты его выявления. При ГЭК варианте выявлено кратковременное повышение почти вдвое среднего уровня Аг ШТ в динамике болезни (р>0,05), что совпадает с увеличением частоты выявления Аг ШТ в этот период болезни, и снижение в период ранней реконвалесценции Ц до начальных уровней.

Примечание: * - достоверные различия в сравнении с 1 - 3 днем болезни

Рисунок 2. Динамика титров всех токсинов в копрофильтратах больных ОКИ при различной этиологии заболевания (lg10 обратного титра антигена) (n = 487)

Примечание: * - достоверные различия в сравнении с 1-3 днем болезни

Рисунок 3. Динамика титров всех токсинов в копрофильтратах больных ОКИ при различных клинических вариантах течения (lg10 обратного титра антигена)

Средние уровни Аг ХЭТ в разгар болезни при всех вариантах течения заболевания достоверно не отличались. В динамике болезни (4-6 день) при ГЭ и ЭК вариантах течения наблюдалось снижение, как средних уровней, так и частоты его выявления, а при ГЭК Ц повышение уровней токсина почти вдвое, что достоверно выше, чем при ГЭ и ЭК (р4-6<0,05), при той же частоте выявления в этом периоде.

Средние уровни Аг токсина А C.dif. в разгар болезни при ГЭ и ЭК варианте течения были достоверно выше, чем при ГЭК варианте (р<0,05), однако, в динамике при ГЭ и ЭК варианте наблюдалось снижение уровня токсина (р>0,05), а при ГЭК Цповышение (р<0,05). В период ранней реконвалесценции выявлено снижение уровня токсина при всех вариантах течения, достоверное Ц при ЭК (р<0,05).

Средние уровни Аг токсина В C.dif. в разгар болезни при всех вариантах течения достоверно не отличались. В динамике заболевания при ГЭК выявлено достоверное повышение уровня токсина, а при ГЭ Ц снижение (р<0,05); уровень токсина при ГЭ и ЭК был достоверно ниже, чем при ГЭК. В период ранней реконвалесценции при ГЭК и ЭК вариантах течения наблюдалось постепенное снижение уровня токсина, а при ГЭ Ц некоторое повешение. При ЭК течении уровень токсина В C.dif в разгар и в динамике заболевания был достоверно ниже, чем уровень токсина А C.dif.

Средние уровни энтеротоксина C.perf. А в разгаре болезни достоверно не отличались, в динамике при ГЭ и ЭК течении наблюдалось снижение, а при ГЭК Ц повышение уровня токсина (р>0,05). В период ранней реконвалесценции при ГЭ и ЭК вариантах течения наблюдалось достоверное снижение уровня токсина.

В зависимости от клинического варианта течения болезни частота выявления маркеров токсинов также значительно различалась: в группе больных с ГЭ вариантом течения частота выявления ШТ составила 26,2%, ХЭТ Ц 10,9%, маркеры всех токсинов клостридий - в 39,3%; при ГЭК - 18,8%, 18,8%, 41,9% и ЭК - 23,8%, 10,5%, 43,9% случаев, соответственно.

Анализ полученных данных показал, что при поражении преимущественно верхних (ГЭ) или нижних (ЭК) отделов кишечника у большего числа больных наблюдается снижение уровней Аг ШТ, в то время как при вовлечении в патологический процесс всех отделов ЖКТ (ГЭК) число больных с повышением или снижением уровней Аг ШТ было одинаковым.

В течение всего периода исследования Аг ХЭТ чаще выявлялись при поражении всех отделов кишечника (ГЭК): в 1-3 и 4-6 дни болезни выявлена одинаковая частота положительных проб (по 17,1%), а на 7-9 день Ц повышение частоты выявления почти вдвое (30,0%). При ГЭ и ЭК течении болезни маркеры токсина в период ранней реконвалесценции уже не определялись.

Полученные данные свидетельствуют, что из токсинов клостридий в большинстве случаев выявлены Аг C.perf. А, как в различных сочетаниях, так и изолированно, причем наиболее часто при поражении нижних отделов кишечника Ц при ГЭК (37,2%) и ЭК (36,8%), в то время как Аг C.dif. В Ц при поражении верхних отделов (22,0%), а C.dif. А Ц и нижних и верхних отделов ГЭ (25,4%) и ЭК (26,3%).

Одной из задач нашего исследования явилось изучение частоты, уровней и динамики циркуляции в периферической крови про- и противовоспалительных ЦК у больных ОКИ в завинсимости от этионлогии и при различных клинических вариантах течения болезни.

Количественное содержание ИЛ-1β, ФНОα, ИЛ-4 и ИЛ-10 определялось у 180 больных в периферической крови при поступлении больных в стационар, что соответствовало 1-6 дням заболевания.

В целом ЦК при концентрации 5 пг/мл выявлены у 70 % больных, в концентрациях 30 пг/мл всего у 47,2% больных, частота выявления ИЛ-1β составила 26,7%, ФНО-α Ц 30,6%, ИЛ-4 Ц 37,8% и ИЛ-10 Ц 18,3%, из числа обследованных больных.

У 16,7% обнаруживался тольнко один из изученных ЦК (в 7,8% случаев Ц ИЛ-4, по 4,4% Ц ФНО-α, и ИЛ-1β), у 9,4% больных Ц два (ИЛ-4 в сочетании с ИЛ-1β (5,6%) или с ФНО-α (3,9%), у 6,7% больных Ц три (ИЛ-4, ИЛ-1β и ФНО-α/ИЛ-10 Ц 2,8% и 3,9%, соответственно), все четыре ЦК Ц у 14,4% больных.

Максимальные уровни всех ЦК зафиксированы на 3 день болезни, кронме ИЛ-1β (на 2-ой день Ц 613,13130,34 пг/мл). Наиболее высокий уровень с первого дня и на протяжении всего исследования установлен для ИЛ-10 (640,89213,5 пг/мл). Концентрации ИЛ-1β и ИЛ-10 на 2 день были достоверно выше (р<0,05), чем ФНО-α и ИЛ-4. Уровень ИЛ-10 быстро падал, он не определялся уже с 4 дня болезни, в то время как ИЛ-1β и ФНО-αЦ с 5 дня, а ИЛ-4 продолжал выявляться на 5 и 6 день болезни, но в концентрациях ниже диагностического уровня (<30 пг/мл) (Рисунок 4).

ИЛ-4 наиболее часто был выявлен в сочетании с другими ЦК (30,0%), чем Ц изолированно (7,8%). Интерес представляет и тот факт, что из 24 больных, обследованных в 1 день болезни, ИЛ-4 выявлен у 58,3%. В 1-2 дни болезни ИЛ-4 уже был выявлен у 23,3% больных. Раннее присутствие ИЛ-4 у подавляющего числа больных, динамика его уровня, идентичная таковой ФНО-α, а также высокие уровни ИЛ-10 в 1-3 день болезни (соответствующие высокому уровню ИЛ-1β), свидетельствуют о важной роли этих противовоспалительных ЦК при благоприятном циклическом течении ОКИ, с последующим выздоровлением больных.

Мы провели анализ частоты выявления и динамики средних уровней ЦК при ОКИ различной этиологии, впервые были получены данные их исследования при моно и микст инфекциях.

Наиболее часто, вне зависимости от этиологии заболевания, в концентрации 30 пг/мл выявлен противовоспалительный ИЛ-4. При шигеллезе он найден чаще, в высоких концентрациях как в сочетании с другими ЦК (55,6%), так и изолированно (22,2%). При сальмонеллезе такая же картина, но с более низкими показателями частоты выявления (45,5% и 12,1%, соответственно) и концентраций. При микст инфекции и йерсиниозе ИЛ-4 чаще выявлен в различных сочетаниях с другими изученными ЦК (35,9% и 28,6, соответственно), чем изолированно (6,0% и 7,1%, соответственно), в группе КИНЭ Ц только лишь в сочетании с другими ЦК (40,0%). При кампилобактериозной инфекции ИЛ-4 не был выявлен.

Изолированно ИЛ-1β, ФНО- и ИЛ-10 выявлены в единичных случаях при различной этиологии заболеваний.

Высокий уровень ИЛ-1 был выявлен при микст-инфекции, более низкий Ц при сальмонеллезе и шигеллезах и наименьший Ц при йерсиниозе (Рисунок 5).

Примечание: достоверные различия в сравнении *Ц с 1-3 днем болезни (р<0,02), ** Ц с ИЛ-1 и ИЛ-10 (р<0,03), Х Ц с ФНО- (р<0,04)

Рисунок 4. Общий уровень отдельных ЦК Ц ИЛ-1, ФНО-, ИЛ-4 и ИЛ-10 Ц у больных ОКИ по дням болезни

Высокие уровни ФНО- были выявлены при шигеллезе, сальмонеллезах и микст инфекции и также наименьший Ц при йерсиниозе. Максимальный уровень ИЛ-10 был выявлен при сальмонеллезе и микст инфекции, средний Ц при шигеллезе и меньший Ц при йерсиниозе.

В литературе существует ограниченное количество клинических исследований, посвященных ЦК при различных ОКИ и результаты противоречивы (Мартынова Н.Н., 2006; Попова О.В. и соавт., 2004). Высказываются предположения, что при шигеллезах местная воспалительная реакция опосредуется увеличением продукции регуляторных ЦК и количества клеток, экспрессирующих ИЛ-1β, ФНО-а, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10 и др. (Дьяченко А.Г. и соавт. 2001; Ragib R. et. al. 1996). Описано, что при сальмонеллезной инфекции активизируется продукция ЦК, характерных для Th1 клеток, наблюдается выснвобождение Т-клетками ИЛ-2 и ИФН- при полном отсутствии ИЛ-4 и ИЛ-5 (Harrison L.M. et. al.1997, Wyant T.L. et. al. 1999), а затяжное течение йерсиниозной инфекции сопровождается пониженной продукцией ИЛ-2, IFN- и повышением уровня ИЛ-4 (Попова О.В. и соавт., 2004).

Примечание: *Ц достоверные различия в сравнении с ФНО- и ИЛ-4 (р<0,01).

Рисунок 5. Средние уровни отдельных цитокинов у больных в разгаре болезни (1-3 дни болезни) при ОКИ различной этиологии

Следует отметить, что исследования ЦК традиционно проводятся в группах больных инфекционными заболеваниями, сгруппированными в зависимости от выявленного бактериологическим методом возбудителя (как правило, моно инфекция), при этом возможность присутствия других возбудителей или их токсинов игнорируется. Между тем, как свидетельствуют данные литературы и наших собственных исследований, число микст инфекций намного превышает число моно инфекций, и у больных бактериологически подтвержденными заболеваниями возможно присутствие других возбудителей. Мы впервые провели исследования маркеров токсинов и О-Аг широкого спектра возбудителей у больных ОКИ, что позволило нам установить частоту выявления и динамику ЦК в крови в связи с присутствием указанных маркеров.

Предварительно была установлена частота выявления отдельных ЦК, их сочетания и уровни ЦК в сыворотке крови, как в целом, так и в подгруппах больных, сформированных в зависимости от этиологии заболевания и характера его течения

Впервые мы установили, что продукция ИЛ-4 при сальмонеллезе регистрируется, уже начиная с первых дней от начала заболевания (средний уровень в 1-3 дни болезни был высокий и составил 114,48 41,69 пг/мл). Выявленные нами низкие уровни всех ЦК при острой йерсиниозной инфекции подтверждают тот факт, что при йерсиниозе, как известно, наблюдается дисбаланс ЦК, антигенспецифического Т-клеточного иммунного ответа с развитием иммунопатологических реакций и угнетение возбудителями цитокинового ответа организма (Покровский В.И. и соавт. 1985; Шепелева Г.К. и соавт. 2006; Beuscher H.U. et. al. 1995) (Рисунок 5).

При всех вариантах течения болезни ИЛ-4 выявлен чаще, чем другие ЦК (изолированно Ц несколько чаще при ЭК варианте). Частота выявления ИЛ-1 и ФНО- была почти одинаковой при ГЭ и ГЭК вариантах течения. Обращает внимание, что в общей группе ИЛ-1 и ИЛ-4 выявлены достоверно чаще, чем ИЛ-10 (р<0,01). Нужно отметить, что при ГЭК варианте ФНО- и ИЛ-10, а также одновременно все четыре ЦК выявлены достоверно чаще в сравнении с ГЭ течением болезни (р<0,05), при ЭК варианте ИЛ-4 найден чаще, чем ИЛ-10 (р<0,001). У половины больных (52,8%) ни один из ЦК не обнаружен.

При ГЭ варианте течения болезни в 1-3 день болезни максимальным был уровень ИЛ-10, достоверно выше, чем ФНО-α (р<0,02) и ИЛ-4 (р<0,01), а наименьшим - уровень ИЛ-4. В динамике заболевания наблюдалось снижение уровней ИЛ-1, ФНО- и ИЛ-4, при этом ИЛ-10 перестал определяться с 4-го дня (Таблица 7).

Средние уровни ИЛ-1β (ргэ<0,02), ФНО-α (ргэ<0,02) и ИЛ-10 (ргэ<0,02) были достоверно выше в сравнении с ГЭ вариантом течения.

При ГЭК варианте в остром периоде болезни (1-3 день) средний уровень ИЛ-1 был выше, чем при ГЭ (р<0,01), ФНО- Ц достоверно ниже, чем ИЛ-1β (р<0,01). ИЛ-4 - достоверно ниже, чем ИЛ-1β и ИЛ-10 (р<0,04). На 4-6 день при ГЭК был определен только ИЛ-4 в концентрации ниже диагностического уровня.

При ЭК варианте в 1-3 день были выявлены высокие концентрации всех ЦК. Уровень ИЛ-4 был несколько выше, чем аналогичный показатель при ГЭ и ГЭК варианте течении (р>0,05). На 4-6 день при ЭК, как и при ГЭК, выявлен только ИЛ-4 (11,675,87 пг/мл) в пределах нормальных значений.

Наиболее высокие уровни ИЛ-1, ИЛ-10 и ФНО- определялись в остром периоде (1-3 дни) ГЭК, а наиболее длительно ЦК выявлялись при ГЭ варианте. При ЭК отмечен, в сравнении с ГЭ, достоверно более высокий уровень ИЛ-4. Таким образом, наибольшие изменения частоты выявления и уровня ЦК обнаружены при поражении ЖКТ на всем его протяжении (ГЭК).

В связи с тем, что состав выявленных ЦК у обследованных больных значительно варьировал, для анализа уровня изученных токсинов было сформировано 5 основных групп больных в соответствии со спектром, выявленных у них ЦК: в концентрации 30 пг/мл в 1 группе (9,4%) выявлены только провоспалительные ЦК (ИЛ-1 и ФНО-), во 2 группе Ц противовоспалительный ИЛ-4 (7,8 %), в 3 группе (11,7%) Ц провоспалительные ЦК (ИЛ-1 и ФНО-) вместе с ИЛ-4, в 4 группе больных (18,3%) выявлены и про- (ИЛ-1, ФНО-) и противовоспалительные ЦК (ИЛ-4, ИЛ-10), в 5 группе больных (52,8%) ни один из ЦК не был выявлен (Таблицы 8).

В 4 группе больных зафиксированы максимальные уровни всех ЦК, однако, с 4 дня болезни они не определялись; наиболее высокий уровень в течение трех дней установлен для ИЛ-10; средние уровни ИЛ-1 и ИЛ-10 были выше, чем уровни ФНО- и ИЛ-4 (р<0,05). В 3 группе больных (провоспалительные ЦК вместе с ИЛ-4), концентрации выявленных ЦК были средние, но определялись они длительнее, в отличие от других групп. В остальных группах больных концентрации ЦК были низкие, достоверно ниже, чем в 4 группе (р<0,05).

Некоторые отличия были выявлены по лабораторным данным. Средние показатели ЛИИ были высокими во всех группах и не различались в изучаемых группах ввиду индивидуального разброса значений, но при этом максимальное значение ЛИИ (23,4 8,4) было выявлено в 3 группе больных, минимальное Ц в 1 группе (5,5 0,8), что достоверно ниже, чем во 2 группе (20,3 ± 6,9, р<0,05).

Интоксикация наиболее ярко была выражена в 2 группе больных с моно ИЛ-4 (в концентрации 30 пг/мл), средний уровень которого составил 64,54±29,2 пг/мл. В динамике заболевания наблюдалась тенденция к снижению уровней всех токсинов и токсигенной нагрузки, изначально высокая нагрузка О-Аг и уровень ИК оставались без изменений.

На втором месте по степени интоксикации можно было поставить группу больных с четырьмя ЦК (4 группа), где показатель ЛИИ и ее частота были чуть ниже, но температурная реакция и диарейный синдром Ц такой же выраженности. Нагрузка маркерами токсинов в и пробах была достоверно ниже, чем нагрузка О-Аг, и далее снижалась (Рисунок 6).

Таблица 7

Средние уровни цитокинов (пг/мл) при различных клинических вариантах течения ОКИ

Цитокины	Уровни цитокинов (Средние СОС) (пг/мл)
Цитокины	1-3 день болезни	4-6 день болезни	Общая группа (всего)
Гастроэнтерит
	n = 107	n = 7	n = 114
ИЛ Ц 1	322,39 82,78	183,57 174,58	313,87 78,37
ФНО	118,08 32,24 *	42,86 40,41	113,47 30,39 *
ИЛ Ц 4	94,15 25,4 *	37,71 17,46	90,68 23,89 *
ИЛ Ц 10	477,8 142,89	0	448,47 134,51
Гастроэнтероколит
	n = 25	n = 2	n = 27
ИЛ Ц 1	991,6 268,93**	0	918,15 253,79 **
ФНО	221,6 75,54 +	0	205,19 70,7 ** +
ИЛ Ц 4	126,72 37,65 *+	2,5 2,5	117,52 35,39 * +
ИЛ Ц 10	971,6 398,23	0	899,63 371,53**
Энтероколит
	n = 33	n = 6	n = 39
ИЛ Ц 1	453,15 161,15	0	383,44 138,59
ФНО	176,33 72,17	0	149,21 61,79
ИЛ Ц 4	202,52 76,36	11,67 5,87	173,15 65,42 **
ИЛ Ц 10	549,24 268,61	0	464,74 229,01

Примечание достоверные различия в сравнении * - с ИЛ-10, + - с ИЛ-1, ** - ГЭ (р<0,04)

Таблица 8

Динамика уровней цитокинов по дням болезни у больных ОКИ в основных группах,

в соответствии со спектром цитокинов

№ групп Цитокины	Уровень цитокинов в пг/мл (средние СОС)
№ групп Цитокины	1 день бол.	2 день бол.	3 день бол.	4 день бол.	Средние уровни
1 группа	Провоспалительные ЦК (ХООО, ХХОО)
ИЛ-1	16,3±16,3*	16,7±16,7*	63,5±44,4*	0	44,2±26,5*
ФНО-	184,0±95,0	32,0±16,0	66,2±32,4*	0	87,8±30,7*
ИЛ-4	8,0±6,0*	5,0±5,0	5,4±1,4	0	6,0±1,7*
ИЛ-10	0	0	0	0	0
2 группа	Моно ИЛ-4 (ООХО)
ИЛ-1	0	0	0	0	0
ФНО-	0	0	0	0	0
ИЛ-4	34,0±10,7*	120,0,0±66,3	86,25±50,0	0	64,54±29,2*Х
ИЛ-10	0	0	0	0	0
3 группа	Провоспалительные с ИЛ-4 (ХХХО, ХОХО, ОХХО)
ИЛ-1	0	861,0±382*	299,4±133,5*	34,0±10,7	588,3±215*
ФНО-	180,0±84,0	77,0±41,5*	40,0±32,0*	150,0±135	90,24±28,2*
ИЛ-4	40,0±9,3	69,1±8,7*	65,8±18,4*	94,0±33,5	66,43±7,2*Х
ИЛ-10	0	0	0	0	0
4 группа	Все ЦК (Про- и противовоспалительные) (ХХХХ)
ИЛ-1	252,0±178	2393±263+	2109,0±323+	0	2030,0±213
ФНО-	435,0±300	552,0±134	832,0±17,8	0	640,2±101
ИЛ-4	394,0±211	471,0±115	725,0±177	0	554,4±91,5
ИЛ-10	2220±997	2498,0±618	3520,0±755	0	2927,0±446
5 группа	Нет ЦК (ОООО)
ИЛ-1	0	0	0	0	0
ФНО-	0	0	0	0	0
ИЛ-4	3,09±1,9	4,3±0,92	5,03±1,4	5,0±1,67	4,43±0,67
ИЛ-10	0	0	0	0	0

Спектр цитокинов Ц ИЛ-1 :ФНО- :ИЛ-4: ИЛ-10.

Примечание: достоверные различия в сравнении * - с 4 группой (р<0,05), Х - с 1 группой,

+ - с 1 днем болезни, - с ФНО- и ИЛ-4, - со всеми группами, кроме 1 группы.

Уровни свободных токсинов падали, а общий уровень токсинов и уровни ЦИК достоверно повышались (р<0,05). Средний уровень ИЛ-1β составил 2030,0± 213,0 пг/мл, ФНОα Ц 640,2±101,0 пг/мл, ИЛ-4 Ц 554,4±91,5 пг/мл и ИЛ-10 Ц 2927,0±446,0 пг/мл, концентрации ИЛ-1β и ИЛ-10 были достоверно выше, чем ИЛ-4 и ФНО- (р<0,05), что свидетельствует о том, что своевременная продукция двух провоспалительных ЦК способствует более адекватному иммунному ответу и менее выраженной интоксикации.

В 3 группе больных (провоспалительные ЦК вместе с ИЛ-4) интоксикация чуть более выраженная, чем в предыдущей группе с четырьмя ЦК. В динамике болезни титры токсинов не изменялись, изначальные уровни ИК были выше, чем во 2 и 4 группах, а нагрузка О-Аг ниже, чем в этих группах, но проявляли тенденцию к увеличению, токсическая нагрузка Ц более низкая и далее снижалась. Средний уровень ИЛ-1β составил 588,3± 215,0 пг/мл, ФНОα Ц 90,24±28,2 пг/мл и ИЛ-4 Ц 66,43±7,2 пг/мл, ИЛ-10 не выявлен: уровни всех ЦК были достоверно ниже, чем в группе с четырьмя ЦК. В этой группе больных стабильно высокий уровень токсинов, и отсутствие значимого связывания токсинов в ИК (при повторном анализе Ц без изменений), вероятно, обуславливает более длительную продукцию ЦК в этой группе в сравнении с остальными группами.

В 5 группе больных (5/1 и 5/2 подгруппы), в подгруппе 5/2 -ООХО (ИЛ-4 в концентрации 5-29,9 пг/мл) показатели интоксикации схожи с таковыми с 4 группой (все ЦК). Изначально уровни ИК идентичны с 4 группой и в динамике не изменяются, однако, при повторном анализе достоверно ниже, чем уровни ИК в 4 группе больных (р<0,05). В динамике болезни наблюдалось достоверное снижение уровней токсинов C.perf. A и ХЭТ. Нагрузка О-Аг во пробе росла, токсическая Ц оставалась без изменений, хотя была достоверно ниже, чем нагрузка О-Аг (р<0,01). В этой подгруппе 5/2 появление ИЛ-4 в циркуляции соответствует достоверно более высокой температурной реакции и ЛИИ, в сравнении с подгруппой 5/1, где наблюдаются подпороговые концентрации ИЛ-4 (средний уровень 4,43±0,67 пг/мл) и тенденции к снижению уровня токсинов.

Полученные данные, свидетельствуют о том, что в каждой данной группе больных уровень циркулирующего в крови ИЛ-4 реагирует, вероятнее всего, на изменение у данного больного общих уровней токсинов в КФ, и достоверный рост титров токсинов вызывает значительную продукцию всех ЦК.

Рост общих титров токсинов в КФ связан с неэффективностью местных защитных реакций по отношению к возбудителям, продолжением продукции ими токсинов, неадекватным связыванием токсинов в ИК. К сожалению, невозможно оценить роль токсинов in situ в сравнении с их циркуляцией, для выявления токсинов в крови и in situ требуются дополнительные исследования. Как бы то ни было, вероятно, следует расценивать моно ИЛ-4 (в крови), в основном, как избыток ИЛ-4 in situ.

Примечание: достоверные различия при сравнении: * - с пробой, + - с 5 группой,

Х - в той же группе с О-Антигенами (р<0,05)

Рисунок 6. Число выявленных О-Аг и маркеров токсинов в пробе КФ (антигенная нагрузка) у больных, с различным спектром цитокинов

В связи с близкими показателями, группы 1, 2, 3 были объединены. В этой объединенной группе (С) уровни всех токсинов были такие же, как и в исходных 3-х группах, уровни ИЛ-4 составил от 30 - 100 пг/мл. Кроме того, группа 5 (без ЦК) была разделена на 2 подгруппы; 5/1 Ц концентрации ИЛ-4 0 - 4,9 пг/мл и 5/2 - концентрации ИЛ-4 5 - 29,9 пг/мл (Таблица 9).

Сравнительный анализ некоторых показателей в 4 вышеуказанных группах больных, сформированных по уровню ИЛ-4, показал, что более высокие средние концентрации ИЛ-4 наблюдается в группах больных с достоверным преобладанием числа проб с ростом титра токсинов, над количеством проб с падением титров токсинов (р<0,05). Уровень ИЛ-4 коррелирует с уровнями ИЛ-1β и ФНОα. В соответствии с этим мы наблюдаем снижение числа лейкоцитов в периферической крови (р<0,02) и увеличение показателя ЛИИ, которое превышает нормальные показатели, уже при концентрации ИЛ-4 выше 30 пг/мл (р<0,04), а также достоверное повышение уровней ИК при концентрации ИЛ-4 свыше 501пг/мл (р<0,05). При одинаковой нагрузке О-Аг, токсическая нагрузка в группе с подпороговыми уровнями ИЛ-4 (5-29,9 пг/мл) растет, а в группе с уровнем ИЛ-4 свыше 501 пг/мл и высоких уровнях других ЦК Ц падает (р<0,05).

Учитывая то, что с увеличением числа проб с ростом титра токсинов наблюдается увеличение концентраций ФНО-, ИЛ-1 и ИЛ-4, а ИЛ-10 с высоким уровнем найден только при концентрации ИЛ-4 выше 500 пг/мл, представляло интерес проследить корреляции уровней различных ЦК с ИЛ-4.

Уровни ИЛ-4 коррелировали с увеличением числа ЦК в пробе. При одновременном выявлении ИЛ-4 и ИЛ-1 корреляция их уровней была прямой и достоверной, а ИЛ-4 с ФНО- Ц не достоверна. При высоких уровнях ИЛ-4 и ИЛ-1 отмечена достоверная корреляция ИЛ-4 со всеми ЦК и отсутствие корреляции ИЛ-10 с ИЛ-1, т.е. создавалось впечатление, что ИЛ-4 выступает в качестве сторожевого маркерного ЦК, уровень которого отражает присутствие уровнней провоспалительных ЦК (ФНО- и ИЛ-1), а также влияет на уровень ИЛ-10 (Таблица 10).

В этих группах, при анализе уровней и динамики токсинов, антигенной нагрузки, показателей ЛИИ и числа лейкоцитов, были отмечены следующие тенденции. При подпороговых концентрациях ИЛ-4 уровни всех токсинов практически не изменились в динамике заболевания. При сочетании ИЛ-4 с ИЛ-1 и ФНО- в диагностических концентрациях их средние уровни колебались в небольшом диапазоне, уровни токсинов имели тенденцию к понижению. В группе, где были выявлены все четыре ЦК, включая ИЛ-10, и средние концентрации ИЛ-4 были высокими, общие уровни всех токсинов в КФ достоверно повышались.

Средняя О-Аг и нагрузка токсинами была сравнительно одинаковая во всех группах больных, при этом, исходные показатели ЛИИ были высокими во всех группах, а умеренный лейкоцитоз наблюдался только в группе при отсутствии всех ЦК крови, как и большее число больных с повышенными показателями ЛИИ (Рисунок 7).

Полученные данные свидетельствуют, что уровень циркулирующего в крови ИЛ-10 связан, вероятнее всего, с изменениями общих уровней токсинов, чем О-Аг. Возможно, рост общих титров токсинов в КФ связан с неэффективностью местных защитных реакций по отношению к возбудителям, продолжением продукции ими токсинов, неадекватным связыванием токсинов в ИК

Анализ уровней и соотношений ИЛ-4 и ИЛ-10 мы провели также в небольших подгруппах больных, отличающихся присутствием в КФ одного, двух, трех и более токсинов. При отсутствии свободных токсинов, или при их подпороговых концентрациях (до 1:4) уровень ИЛ-4 был средний (до 211,9±85,83 пг/мл), ИЛ-10 Ц высокий (до 988,8±447,2 пг/мл), при этом между ними выявлена положительная достоверная корреляция (r=0,61, р=0) (Рисунок 8).

При наличии в КФ одного из токсинов в титре более 1:8 показатели были сопоставимы с предыдущими группами, как по концентрации ИЛ-4 и ИЛ-10 так и по корреляции (r=0,82, р=0). При обнаружении 2 или 3 токсинов в титре более 1:8 концентрации ИЛ-4 слегка ниже, а концентрации ИЛ-10 практически не изменились, однако, достоверность связи между ними остается.

Таблица 9

Сравнительный анализ некоторых лабораторных показателей в группах больных с различными уровнями ИЛ-4

Показатели	Тренд	Группы больных по уровню ИЛ-4
Уровень ИЛ-4 (средний в пг/мл)		Нет (0)	5,0-29,9 (10)	30-100 (65)	501 и выше (558)
ейкоцитоз		7,3 ±0,3	7,6±0,4	6,7±0,5	6,2±0,3*+
ИИ		9,0±1,0	12,0±1,2	21,0±7,0*	16,3±4,4*
Уровень ЦИК		без изменений	без изменений	без изменений	Растет
нагрузка О-Аг в динамике		одинаковая	одинаковая	одинаковая	одинаковая
нагрузка токсинами в динамике		одинаковая	Растет	Падает	Падает
Уровень ФНО-		0	1 Ц 67,0	0 Ц 93	640
Уровень ИЛ-1		0	0 Ц 64,0	0 Ц 583	2030
Уровень ИЛ-10		0	0/37	0	2927
Число проб с ростом титров токсинов (в %)		28 +	41,5	35,5	44,6*
Число проб с падением титров токсинов (в %)		25,5	24	26,1	10,0*+

Примечание: достоверные различия в сравнении: * - с группой без ИЛ-4,

+ - с группой ИЛ-4 в подпороговых концентрациях (5-29,9пг/мл) (р<0,05)

Таблица 10

Корреляция уровней цитокинов между собой в зависимости от уровня ИЛ-4

Подгруппы	Тренд	Число цитокинов
Подгруппы	Тренд	0-1	2		3	4
Число больных		n=95	n=18	n=15	n=4	n=33
Уровни ИЛ-4 (пг/мл)		0-4,9	5	>29,9	>29,9	>29,9
Характеристика групп по ЦК		Нет ЦК или ИЛ-4 (мин. ур.)	ИЛ-4 и ИЛ-1 (сред. ур.)	ИЛ-4 и ФНО- (сред. ур.)	ИЛ-4 + ИЛ-1+ ФНО-	Все ЦК, включая и ИЛ-10
Средние уровни ИЛ-4 (колебания)		4,43	43,83 (7-137)	28,2 (27-90)	(мало наблюдений) (71-93)	554 (30-1810)
Присутствие других ЦК		нет	ИЛ-1	ФНО-	ИЛ-1 ФНО-	ИЛ-1, ФНО- ИЛ-10
Корреляция ИЛ-4 с ИЛ-1		нет	r= 0,48 р=0,02	нет	(мало наблюдений)	r= 0,43 р=0,012
Корреляция ИЛ-4 с ФНО-		нет	нет	r= 0,22 р=0,38	(мало наблюдений)	r= 0,8 р=0
Корреляция ИЛ-1 с ИЛ-10		нет	нет	нет	нет	r= 0,22 р=0,2
Корреляция ИЛ-4 с ИЛ-10		нет	нет	нет	нет	r= 0,49 р=0,004

Рисунок 7. Совокупность различных показателей по группам

Примечание: достоверные различия в сравнении: * - с ИЛ-4 в группе с 5 токсинами,

+ - с ИЛ-10 в группе с 5 токсинами

Рисунок 8. Соотношение уровней ИЛ-4 и ИЛ-10 в зависимости от числа выявленных токсинов у больного

При наличии в КФ 4 или 5 токсинов в титре 1:8 и более, уровни ИЛ-4 падают, снижаются и концентрации ИЛ-10, наиболее резкое снижение, достоверное с показателями соответствующих ИЛ в группах, кроме группы с 4 токсинами (р<0,05). При этом исчезает достоверность связи между уровнями ИЛ-4 и ИЛ-10 (р>0,05), присутствовавшая в других группах, что свидетельствует о том, что воздействие большого количества токсинов, отличающихся, различными механизмами действия на сигнальные системы клетки, приводит к дискоординации ее функциональной активности, что в применении к Т хелперам, резко снижает продукцию ИЛ-4 и, возможно, ИЛ-10 Т регуляторными клетками.

Таким образом, можно полагать, что выявленная разница уровней ЦК и токсинов, среднемолекулярных ИК, показателей интоксикации и диареи, ЛИИ и числа лейкоцитов в группах больных, с различным спектром ЦК, отражает особенности воздействия различных сочетаний токсинов и О-Аг на различные клетки (включая иммунокомпетентные), органы и системы организма, что приводит к различному уровню иммунного ответа организма на патогенные возбудители, в целом, и на отдельные факторы патогенности возбудителей, в частности. В результате слабого или неадекватного реагирования, может продолжаться жизнедеятельность возбудителей в кишечнике, продолжают синтезироваться токсины на фоне недостаточно эффективного их связывания антителами с формированием ИК, что, в свою очередь, поддерживает интоксикацию и воспаление и усугубляет угнетение ими ответа.

Как известно, ИЛ-4 является плейотропным ЦК с регуляторными эффектами на рост В-клеток, рост и функции Т-клеток, переключение Ig, на гемопоэтические и опухолевые клетки (Mearns H. et. all., 2008; Paul W.E., 1991; Patton E.A. et. all. 2002).

В то же время существует небольшое число работ, свидетельствующих о том, что ИЛ-4 поддерживает поражение в кишечнике в качестве провоспалительного медиатора. В сравнении с колитом, вызванным ИЛ-12, поражение, вызываемое ИЛ-4, менее тяжелое, с меньшей длительностью и не зависит от Т-клеток. Избыточная экспрессия ИЛ-4, как и ИЛ-12, вызывает у экспериментальных мышей в течение 24 часов дозо- и штаммозависимые фатальные колиты. ИЛ-4 обусловленный колит сопровождается локальной экспрессией в кишечнике ИЛ-4 и ФНО- и инфильтрацией кишечной стенки мононуклеарами и гранулоцитами, при этом, ФНО- является важным медиатором колита, вызванного ИЛ-4 (van Kampen С. et. al., 2005).

Обусловленная ИЛ-4 генерация периферических Т рег. клеток зависима от антиген-специфической реакции. Наиболее важным аспектом Т рег. клеток является регуляция изотипов антител и супрессия провоспалительных клеток. Т рег. клетки могут также напрямую угнетать такие эффекторные клетки как базофилы и эозинофилы. ИЛ-10, секретируемый Т рег. клетками, сдвигает продукцию IgЕ (обусловленное действием ИЛ-4 на базофилы, тучные клетки слизистой оболочки, моноциты/макрофаги, нейтрофилы, В-клетки) в сторону невоспалительных изотипов IgG. Таким образом, индукция антиген-специфинческих Т рег. клеток может переправлять ненадлежащий иммунный ответ (в частности, к аллергену или аутоантигену) с помощью широкого спектра супрессорных механизмов (Taylor. A., 2004). Так, экспериментально показано, что отсутствие ИЛ-10 оказывает огромное влияние на колит, обусловленнный C.jejuni: увеличивается степень колонизации и тяжесть энтерита, создаются возможности для экстраинтестинального распространения возбудителя (Мansfild LS., 2008).

В целом, стимуляция ИЛ-4 формирования Т рег. клеток из периферических T хелперов является закономерным физиологическим процессом, направленным на завершение инфекционного процесса, ограничение функций Т и В клеток, избыточной продукции ими межклеточных регуляторов, и формирование долговременных Т клеток памяти. Изучение этих заключительных этапов инфекционного процесса и различных отклонений, в том числе развитие толерантности, в настоящее время ведется очень активно (Patton E.A at. all, 2002; Mearns H. et. al. 2008 ).

Повторные микст инфекции не только способны увеличить Т - клеточный иммунитет через генерацию Т клеток памяти, но могут также усиливать супрессивую активность эндогенных Т рег. CD4+ CD25+ клеток. Эти клетки селективно экспрессируют TLR -2, -4, -5, -7, -8. В нормальных условиях Т рег. анергичны, но способны к распознаванию и к прямой пролиферации в ответ на TLR - лиганды, экспрессированные на микробах и паразитах. Удаление Т рег. клеток в определенной степени усиливает протективный иммунный ответ к бактериям, вирусам и грибам, что ведет к элиминации патогенна из организма, может помочь завершить элиминацию инфекционного патогенна и уменьшить воспаление за короткое время.

Активность Т рег. клеток не всегда благоприятна, они могут также подавлять иммунные ответы к антигенам опухолей и патогенам, однако, высокие уровни ИЛ-10 и TGF- опосредуют способность Т рег. клеток угнетать патологический иммунный ответ при трансплантации, аллергии и аутоиммунных заболеваниях. Макрофаги, но не дендритные клетки, повышают транскрипцию ИЛ-10 mRNA, это подтверждает, что они имеют способность снижать или уменьшать начальный провоспалительный ответ (Normatsu L., 2003).

Однако, представленные в литературе исследования свидетельствуют, что многие вопросы биологии Т рег. клеток остаются не выясненными (Toiti L.G. et. al. 2008), в том числе, касающиеся возбудителей и токсинов кишечных бактерий.

Прямой единично-нуклеотидный полиморфизм промоутера ИЛ-10 ассоциируют с высокой, промежуточной или низкой продукцией ИЛ-10. Показано, что LT изменяет иммунный ответ слизистой в сторону увеличения ИЛ-10 (Flores J. Et al., 2008) и при высокой продукции ИЛ-10 наблюдалось развитие диареи в присутствии в организме СТ и ST ETEC (Flores J. et al., 2008).

Для определения взаимосвязей между всеми изученными показателями мы провели корреляционный анализ и множественный регрессионный (линейный) анализ. Корреляционный анализ выявил значительное количество достоверных связей, большую часть которых составили связи между клиническими показателями: показатели выраженности диареи коррелируют между собой и с длительностью лихорадки, а высота температуры Ц только с длительностью диареи. В разгаре болезни мы не наблюдали достоверных связей между уровнями ЦК и клиническими показателями. Однако, мы выявили достоверную обратную зависимость показателя высоты температуры с уровнями токсина А C.dif. и ШТ (r=-0,17, р<0,02) и близкую к достоверности, слабую обратную связь между токсином В C.dif. и частотой стула (r=-0,13, р=0,086). Результаты корреляционного анализа выявили достоверные положительные связи (от умеренных до сильных) между выявленными уровнями токсинов в КФ (r=0,23 Ц 0,75, р=0,05). Также установлена положительная достоверная связь (сильной и умеренной силы) между про- (r=0,71, р=0,000) и противовоспалительными ЦК (r=0,75, р=0,000), а также между ними (r=0,63-0,89, р=0,000). Однако мы не выявили достоверных связей между уровнями изученных ЦК и токсинов.

Благодаря использованию нового доступного метода выявления токсинов в КФ, у больных ОКИ удалось установить связи между уровнями Шига токсина, токсина А C.perf. и числом О-Аг разных возбудителей, выявленных в пробе КФ, что, вероятно, свидетельствует об одновременной активации продукции всех токсинов (из числа изученных) возбудителями кишечных инфекций. Учитывая то, что большинство больных из числа обследованных на ЦК (59,4%) в КФ имели от 2 до 7 О-Аг разных возбудителей в 2-х пробах КФ и почти половина из них (30,6%) имели еще и маркеры нескольких истинных токсинов, и, таким образом, подвергались значительному токсическому воздействию, полученные нами данные о слабой достоверной обратной связи ШТ и C.dif. А с высотой лихорадки свидетельствуют об угнетающем воздействии токсинов (на макрофаги, ИКК, ЦНС и другие системы).

Регрессионный (линейный) анализ выявил зависимость некоторых показателей от двух и более независимых переменных.

Впервые для всех клинических данных в качестве независимых исследовались показатели уровней ЦК (ФНО-, ИЛ-1, ИЛ-4,ИЛ-10), титры токсинов (ШТ, энтеротоксин А C.difficile, цитотоксин В C.difficile, энтеротоксин А C.perfringens и ХЭТ) и число О-АГ в пробе КФ.

В результате регрессионного анализа для показателей высоты и длительности лихорадки, частоты стула, а также числа лейкоцитов удалось установить модель прогнозируемого показателя с двумя или более независимыми переменными. Для показателей высоты и длительности лихорадки получены вполне информационно способные и статистически знанчинмые модели (p<0,01) уравнения регрессии, а для прогнозируемых показателей частоты стула и числа лейкоцитов Ц модели, значимые в пределах 70% уровня надежности (р>0,3).

Также впервые для прогнозируемых показателей ЦК (ФНО-, ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-10) в качестве независимых исследовались клинические показатели интоксикации (высота и длительность лихорадки) и диареи (частота и длительность диареи), лабораторные данные (ЛИИ и число лейкоцитов), все детектированные токсины и количество О-АГ в КФ. В модели удалось включить только клинические показатели, так как взаимосвязь с остальными параметрами (даже в пределах 70% надежности) не была установлена. Для прогнозируемого уровня ИЛ-1 в сыворотке крови у больных ОКИ нами получена статистически знанчинмая модель (p<0,02) зависимости его уровня от длительности лихорадки и показателя числа лейкоцитов. Для остальных ЦК (ФНО-, ИЛ-4, ИЛ-10) были получены модели, значимые в пределах 70% уровня надежности (р>0,3).

Впервые регрессионный анализ проведен для уровней отдельных токсинов (ШТ, энтеротоксин А C.difficile, цитотоксин В C.difficile, энтеротоксин C. Perfringens А и ХЭТ) в КФ у больных ОКИ. В качестве независимых исследовались высота и длительность лихорадки, частота и длительность диареи, лабораторные данные (ЛИИ и число лейкоцитов), ЦК (ФНО-, ИЛ-1, ИЛ-4,ИЛ-10) и количество О-АГ в КФ. Однако, удалось получить модели в виде уравнения регрессии только для энтеротоксина А C.difficile и ХЭТ. Для прогнозируемого значения уровня энтеротоксина А C.difficile у больных ОКИ нами получена статистически знанчинмая модель (p<0,02), а для показателя уровня ХЭТ Ц значимость модели колеблется в пределах 70% уровня надежности (р>0,3).

Главное, о чем свидетельствуют результаты анализа - это адекватность выбранных токсинов (Шига токсин, токсины А и В C.difнficile, энтеротоксин А C.perfringens, ХЭТ), цитокинов (ИЛ-1β, ФНОα, ИЛ-4 и ИЛ-10), клинических (высота и длительность лихорадки, частота и длительность диареи) и лабораторных показателей (число лейкоцитов и ЛИИ).

Таким образом, комплекс полученных нами данных свидетельствует, что присутствие токсинов в организме больного, несомненно, влияет на клинические показатели интоксикации, равно как и на уровень циркулирующих ЦК. Так, уровень циркулирующего ИЛ-4 в крови реагирует скорее на изменение у данного больного уровней токсинов в копрофильтрате.

Для более четкого определения роли и значения бактериальных токсинов и О-антигенов в патогенезе острых кишечных заболеваний, учитывая то, что механизмы развития патологических состояний различных органов и систем, ранее рассматриваемых как неинфекционные (синдром Гийена-Барре, артропатии, включая реактивной артрит и синдром Рейтера, хроническая почечная недостаточность, хроническая патология органов желудочно-кишечного тракта и ряд других состояний), во многом остаются пока не ясными, хотя практически всеми признается их иммунопатологических характер, особого внимания, по нашему мнению, требует в дальнейшем продолжение исследовательской работы по изучению ИЛ-10 как регулятора воспалительного ответа, сдвигающего продукцию антител в сторону не воспалительных изотипов, учета присутствия в организме маркеров токсинов и О-антигенов, что откроет принципиально новые возможности для разработки профилактики, методов диагностики, лечения, и предотвращения развития хронических заболеваний.

Изучение в организме человека факторов патогенности, в первую очередь, экзотоксинов, включая самого факта их присутствия, сочетаний, уровня циркуляции в различных биосредах, является чрезвычайно важным и новым направлением исследований в инфекционной патологии, а полученные данные являются необходимой базой для оценки особенностей продукции про- и противовоспалительных цитокинов, разработки методов диагностики, антитоксической терапии и профилактики.

Полученные нами данные чрезвычайно важны для понимания регуляторных механизмов в процессе и при завершении инфекционного заболевания, в случае различных отклонений в его циклическом течении, в данном случае - при кишечных инфекциях различной этиологии, в том числе микст. Однако, остается неясной роль опережающей продукции ИЛ-4, который выявляется у части больных пусть и в невысоких концентрациях, но уже с первого дня болезни, при отсутствии других ЦК. Трудно представить, что уже к 1-2 дню заболевания в крови произошло падение до неопределяемых концентраций уровней других ЦК. Как бы то ни было, в этих случаях неадекватная и несвоевременная продукция провоспалительных ЦК, вероятно, изменяет нормальное течение иммунных реакций и санацию организма.

ВЫВОДЫ

1. Установлено присутствие в копрофильтратах больных ОКИ маркеров термолабильных экзотоксинов в 67,8% случаев: энтеротоксин А C.perнfrinнgens выявлен в 32,9% , энтеротоксин А C.difнficile - в 29,4%, Шига токсин - в 24,4%, цитотоксин В C.difficile - в 23,2%, реже найден маркер холероподобного энтеротоксина - в 12,1% случаев. Одновременное выявление маркеров 2 - 5 токсинов отмечено у 66,7% больных (часто - сочетание энтеротоксина А C.perfringens с токсином А/В C.difficile или с Шига токсином). К моменту выписки из стационара маркеры сохранялись у 12,5 % больных.

2. В разгар ОКИ отмечены наиболее высокие уровни маркеров Шига токсина, энтеротоксина А C.difficile, энтеротоксина А C.perfringens, более низкие - токсина В C.difficile и холероподобного энтеротоксина. Уровни маркеров токсинов коррелировали между собой (r=0,32-0,89, р<0,01) и частотой их выявления, в динамике заболевания снижались. Высокие титры токсинов (1:512 и выше) отмечены всего у 16,5% больных. При сочетании с Шига токсином титры маркеров токсинов клостридий у 1/3 больных в динамике болезни достоверно повысились, у 11,8 % остались без изменения, у остальных снизились. В отсутствие Шига токсина токсины клостридий не выявлялись у 2/3 больных, а у остальных их уровни в динамике заболевания не изменялись.

3. Выявлены различия в уровнях, частоте, динамике маркеров токсинов в зависимости от этиологии и клинического варианта течения болезни: в разгар заболевания наиболее высокие уровни токсинов выявлены при шигеллезе и микст инфекции, средние уровни - при сальмонеллезе и йерсиниозе, низкие - в группе больных с О-антигенами кампилобактерий. При ГЭ и ЭК вариантах течения изначально высокие уровни и частота маркеров токсинов достоверно снижались. При ГЭК варианте выявлено сначала повышение, а затем снижение уровня и частоты выявления маркеров к периоду клинического выздоровления.

4. У больных ОКИ О-антигены шигелл Зонне, Флекснера, Ньюкастл, сальмонелл В, С1,С2, D, E серогрупп, йерсиний псевдотуберкулеза и , энтероколитика О3, О7,8, О9, О4,33, О6,30 и кампилобактерий выявлены в 90,1%, а в сочетании с токсинами - в 61,5% случаев, что значительно превышает диагностические возможности бактериологического исследования.

5. При ГЭ и ЭК вариантах течения ОКИ наиболее часто выявлены О-аннтингены йерсиний, а при ГЭК - йерсиний и сальмонелл. При всех вариантах заболевания отмечена одинаковая средняя частота выявления маркеров токсинов в пробе копрофильтрата (лнагрузка токсинами), в то время как нагрузка О-антигенами была значительно выше при ГЭК, чем при ГЭ и ЭК вариантах течения.

6. Сочетанное присутствие у больных О-антигенов и маркеров токсинов нескольких возбудителей приводит к более выраженным клиническим проявлениям болезни (длительной и частой диарее, лихорадке, выраженному болевому синдрому, появлению патологических примесей в стуле), высокому ЛИИ, в сравнении с больными, у которых обнаружен маркер одного токсина.

7. Из числа изученных в сыворотке крови ИЛ-1β, ФНОα, ИЛ-4 и ИЛ-10 все четыре цитокина выявлены у 14,4%, три - у 6,7%, два - у 9,4%, один - у 16,7% больных. Наиболее часто выявлен ИЛ-4 - 37,8% (23,3% - в 1-2 день болезни), в том числе в 30,0 % - в сочетаниях с другими цитокинами. Частота выявления ФНО-α составила 30,6%, ИЛ-1β - 26,7% и ИЛ-10 - 18,3%.

8. В разгар болезни наиболее высокие концентрации цитокинов в периферической крови, в первую очередь ИЛ-1β и ИЛ-10, установлены при микст-инфекции и сальмонеллезе, средние Ц при шигеллезе и кишечной инфекции неустановленной этиологии, наименьшие Ц при йерсиниозе. Наиболее высокие уровни цитокинов определены в остром периоде ГЭК, а наиболее длительно они выявлялись при ГЭ варианте.

9. Концентрации ИЛ-4 в крови в разгар болезни коррелировали с концентрациями провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β и ФНОα) и отражали динамику уровней токсинов: рост титров токсинов у большинства больных в группе сопровождался высокой концентрацией ИЛ-4 и провоспалительных цитокинов, а также появлением ИЛ-10 в высоких концентрациях. Стагнация или снижение титров токсинов сопровождалось умеренной концентрацией ИЛ-4 и отсутствием ИЛ-10.

10. В качестве факторов патогенности возбудителей Шига токсин, токсины А и В C.difficile, энтеротоксин типа А C.perfringens, холероподобный токсин имеют большое самостоятельное и дополнительное к О-антигенам значение в иммунопатогенезе, клиническом течении и диагностике ОКИ.

11. Мультипликация биологических эффектов факторов патогенности О-антигенов и токсинов нескольких возбудителей кишечных инфекций обусловливает более высокие уровни про- и противовоспалительных цитокинов, повышение ЛИИ, большую тяжесть интоксикационнного и диарейного синдромов, изменение динамики формирования среднемолекулярных иммунных комплексов.

12. В период реконвалесценции гастроинтестинальной формы тяжелого течения сальмонеллеза при индукции апоптоза отмечено повышение порога чувствинтельности гранулоцитов к субоптимальнным дозам ЛПС S.Еnteritidis и снижение чувствительности к оптимальной дозе. У больных легкого течения сальмонеллеза, как и в группе здоровых доноров, наблюдается положительнная корреляция интенсивности апоптоза гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов при действии высокой дозы ЛПС, при низкой дозе ЛПС корреляций не выявлено.

13. Выявление диффузных изменений ткани поджелудочной железы по результатам УЗИ сопровождается высокой частотой сочетанного обнаружения О-антигенов и маркеров токсинов (92%), достоверным увеличением числа выявляемых О-антигенов, более высокими уровнями ИЛ-1β, ФНОα, ИЛ-4 и появлением ИЛ-10 на фоне нормальных показателей амилазы крови.

14. С помощью математического анализа установлено значительное количество достоверных связей между изученными показателями, а также зависимость некоторых из них от двух и более независимых переменных. Созданы математические модели в виде уравнения регрессии для расчета уровней ИЛ-1β, стула и числа лейкоцитов периферической крови, с помощью которых возможно решение задач ретро- и проспективного анализа.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. С целью верификации диагноза ОКИ, выявления бактериально - бактериальных микст-инфекций и трудно диагностируемых заболеваний (йерсиниозы, кампилобактериозы, клостридиозы) целесообразно использовать широкий спектр диагностических тест-систем для выявления маркеров экзотоксинов (Шига токсина, энтеротоксина А и В C.difficile, энтеротоксина типа А C.perfringens, холероподобного энтеротоксина) и О-антигенов (шигелл Зонне, Флекснера, Ньюкастл, сальмонелл В, С1, С2, D, E серогрупп, йерсиний псевдотуберкулеза и и энтероколитика О3, О7,8, О9, О4,33, О6,30, кампилобактерий).

2. Больные острыми кишечными инфекциями, у которых к моменту выписки из стационара в кале продолжают определяться маркеры токсинов возбудителей в диагностическом титре, представляют собой группу риска, требующих проспективного наблюдения с целью предотвращения хронизации процесса и развития осложнений со стороны различных органов и систем.

3. Прекращение выявления в копрофильтрате О-антигенов и токсинов может служить показателем эффективности проведенного лечения.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации:

Гюлазян Н.М., Саркисянц Н.К. Дифференциальная диагностика диарей. Учебное пособие. Ереван: Авторское издание, 2004. - 60 С.
Белая О.Ф., Гюлазян Н.М., Пак С.Г. и соавт. Шига и шигаподобные токсины в патогенезе, клинике и диагностике кишечных инфекций // Российская научно-практическая конференция, посвященная 110-летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова. - Санкт-Петербург. - 2006. - С. 43 - 44.
Гюлазян Н.М., Пак С.Г., Давтян Т.К. Эндотоксин - индуцированный апоптоз гранулоцитов

периферической крови больных, перенесших сальмонеллезную инфекцию //Российская научно-практическая конференция, посвященная 110-летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова. - Санкт - Петербург. - 2006. - С. 92 - 93.

Гюлазян Н.М., Белая О.Ф., Пак С.Г., Белый Ю.Ф. Маркеры токсинов возбудителей кишечных инфекций - значение в патогенезе, диагностике, оценке эффективности лечения и прогнозе заболевания // 7-ой Российский съезд инфекционистов Новые технологии в диагностике и течении инфекционных болезней. - Нижний Новгород. - 2006. Журнал Ремедиум - Приволжье - специальный выпуск для врачей. - С. 54.
Гюлазян Н.М., Пак С.Г., Мхитарян Л.М., Давтян Т.К. Оценка результатов корреляционного анализа апоптоза гранулоцитов периферической крови больных в периоде реконвалесценции сальмонеллезной инфекцией // 7-ой Российский съезд инфекционистов Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней. - Нижний Новгород. - 2006. Журнал Ремедиум - Приволжье - специальный выпуск для врачей. - С. 76.
Гюлазян Н.М., Пак С.Г., Давтян Т.К. Апоптоз лимфоцитов периферической крови у реконвалесцентов сальмонеллезной инфекцией // 7-ой Росс. съезд инфекционистов Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней. ЦН.Новгород, 2006. Ремедиум - Приволжье - специальный выпуск для врачей. - С. 57.
Гюлазян Н.М., Пак С.Г. Взаимосвязь между клиническим течением сальмонеллеза и чувствительностью гранулоцитов к ЛПС - индуцированному апоптозу // 7-ой Росс. съезд инфекционистов Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней. - Н. Новгород. -2006. Ремедиум - Приволжье - специальный выпуск для врачей. - С.79-80.
Гюлазян Н.М., Пак. С.Г., Мхитарян Л.М. Особенности пищевой вспышки сальмонеллеза в закрытом коллективе //7-ой Росс. съезд инфекционистов Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней. - Н. Новгород, 2006. Ремедиум-Приволжье - С.94 - 95.
Гюлазян Н.М., Пак С.Г., Давтян Т.К. Индуцированный липополисахаридами апоптоз гранулоцитов периферической крови больных, перенесших сальмонеллезную инфекцию // Клиническая лабораторная диагностика. - 2006. -№ 8. - С. 25 - 28.
Гюлазян Н.М., Давтян Т.К., Пак.С.Г. Иеархичность ЛПС - индуцированного апоптоза граннулоцитов, моноцитов и лимфоцитов периферической крови у реконвалесцентов сальмонеллезной инфекцией в зависимости от тяжести течения // 7-ая научная конференция с международным участием. Дагомыс (Сочи). Материалы конференции 4-7 сентября 2006. Журнал Успехи современного естествознания. - 2006. - № 12. - С. 52.
Гюлазян Н.М., Пак С.Г. Показатели эндотоксин - индуцированного апоптоза периферической крови у больных, перенесших сальмонеллезную инфекцию //7-ая научная конференция с международным участием Дагомыс (Сочи). Материалы конференции. 4-7 сентября 2006. Журнал Современные наукоемкие технологии. -2007. -№ 1. - С. 75-76.
Гюлазян Н.М., Мхитарян Л.М., Пак С.Г. и соавт. Распространенность ОКИ в Республике Армения //7-ая научная конференция с международным участием Дагомыс (Сочи). Материалы конференции 4-7 сентября 2006. Журнал Современные наукоемкие технологии - 2007. -№ 1. - С.82.
Гюлазян Н.М., Пак С.Г. Мхитарян Л. М. и соавт. Динамика заболеваемости ОКИ в Армении и особенности течения пищевой вспышки сальмонеллеза в закрытом коллективе //Эпидемиология и инфекционные болезни. -2007. -№ 1. - С. 9 - 11.
Гюлазян Н.М., Пак С.Г., Давтян Т.К. Дифференциальная чувствительность гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов периферической крови к эндотоксин - индуцированному апоптозу у больных, перенесших сальмонеллезную инфекцию //Клиническая лабораторная диагностика. - 2007. - № 2. - С. 20 - 23.
Гюлазян Н.М. Влияние клинического течения сальмонеллезной инфекции в период ранней реконвалесценции на эндотоксин-индуцированный апоптоз клеток периферической крови //Клиническая лабораторная диагностика. - 2007. -№ 4. - С. 22 - 24.
Гюлазян Н.М. Некоторые изменения эндотоксин-индуцированного апоптоза клеток периферической крови в зависимости от тяжести клинического течения сальмонеллезной инфекции в периоде ранней реконвалесценции // Юбилейная Российская научная конференция с международным участием, посвященная 175-летию со дня рождения С.П.Боткина. -Санкт-Петербург. 29 мая - 1июня 2007. - С. 233 - 234.
Гюлазян Н.М., Белая О.Ф., Юдина Ю.В. и соавт. Профили про- и противовоспалительных цитокинов у больных острыми кишечными инфекциями // Юбилейная Российская научная конференция с международным участием, посвященная 175-летию со дня рождения С.П.Боткина. -Санкт-Петербург, 29 мая - 1июня 2007. - С. 234.
Белая О.Ф., Гюлазян Н.М., Мартынова Н.Н., и соавт. Клиническое, диагностическое и прогностическое значение выявления маркера Шига-токсина у больных острыми кишечными инфекционными заболеваниями // Сборник научных трудов. Инфекционная клиническая больница № 2. - С. 11 - 15.
Малов В.А., Гюлазян Н.М. Микробиоценоз желудочно-кишечного тракта: современное состояние проблемы // Лечащий врач. - 2007. - № 6. - С. 10 - 13.
Гюлазян Н.М., Белая О.Ф., Малов В.А., Беликов Д.В. Уровень ЦИК у больных кишечными инфекциями при различных вариантах течения болезни // Российский журнал Гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. Прилож. № 30. Материалы Тринадцатой Российской Гастроэнтерологической Недели. - Москва 22-24 октября 2007. - № 5. -Том 17. - С. 43.
Гюлазян Н.М., Белая О.Ф. Профиль цитокинов у больных различными по этиологии острыми кишечными инфекциями // Российский журнал Гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. Приложение № 30. Материалы Тринадцатой Российской Гастроэнтерологической Недели. - Москва 22 - 24 октября 2007. - № 5. - Том 17. - С. 43.
Гюлазян Н.М., Белая О.Ф., Юдина Ю. В., Пак С.Г. Особенности профиля про- и противовоспалительных цитокинов при острых кишечных инфекциях // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2008. - № 1. - С. 22 - 26.
Гюлазян Н.М., Белая О.Ф., Малов В.А., Пак С.Г. Изменение профиля некоторых цитокинов при различных вариантах течения острых кишечных инфекций // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2008. - № 2. - С. 40-44.
Гюлазян Н.М., Белая О.Ф., Белый Ю.Ф., Пак С.Г. Выявление маркеров токсинов клостридий при различных вариантах течения острых кишечных инфекций // Эпидемиология и инфекционные болезни. -2008. -№ 3. - С. 46 - 49.
Гюлазян Н.М., Белая О.Ф., Малов В.А. и соавт. Роль отдельных возбудителей в развитии сопутствующих поражений поджелудочной железы (по данным УЗИ) у больных ОКИ // Российский журнал Гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. Приложение № 1. Матер. Тринадцатой Российской конференция УГепатология сегодняФ.17-19 марта 2008. - № 1. - Т. 18. - С. 25.
Гюлазян Н.М., Белая О.Ф., Пак С.Г. Частота и уровень выявления маркера Шига - токсина при различных вариантах течения острых кишечных инфекций // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2008. - № 4. - С. 42 - 45.
Гюлазян Н.М. Особенности клинического течения острых кишечных инфекций при выявлении клостридиальных токсинов // Материалы 4-ой Международной конференции Идеи Пастера в борьбе с инфекциями. - Санкт-Петербург 2 - 4 июня 2008. - С. 115.
Гюлазян Н.М., Дмитриева Л.Н. Уровни маркеров клостридиальных токсинов при сальмонеллезе и острой дизентерии // Материалы 4 - ой Международной конференции Идеи Пастера в борьбе с инфекциями. - Санкт - Петербург 2 - 4 июня 2008. - С. 115.
Гюлазян Н.М., Белая О.Ф., Малов В.А., Пак С.Г. Клинические и диагностические особенности смешанных острых кишечных инфекций // Международный Евро-Азиатский конгресс по инфекционным болезням. -Витебск, Беларусь 5 - 6 июня 2008. - С. 130.
Гюлазян Н.М., Белая О.Ф., Пак С.Г. Возможности этиологической расшифровки кишечных инфекций неустановленной этиологии // Вестник Российской Военно-Медицинской Академии. Прилож. № 2 (Ч. ). Материалы Второго Санкт- Петербургского международного экологического форума "Окружающая среда и здоровье человека". 1- 4 июля 2008. - № 3 (23). - С.322 - 323.
Белая О.Ф., Гюлазян Н.М., Пак С.Г. и соавт. Интоксикационный синдром в клинике инфекционных болезней //Вестник Российской Военно-Медицинской Академии. Приложение № 2 (Ч. ). Материалы Второго Санкт - Петербургского международного экологического форума "Окружающая среда и здоровье человека". 1 - 4 июля 2008. - № 3 (23). - С. 15 - 16.
Гюлазян Н.М., Белая О.Ф. Динамика циркуляции О-антигенов возбудителей у больных кишечными инфекциями неустановленной этиологии // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. Приложение № 32. Материалы Четырнадцатой Российской Гастроэнтерологической Недели. 6 - 8 октября 2008. - Москва. - № 5. - Т.17. - С.42.
Гюлазян Н.М., Белая О.Ф., Малов В.А. Частота выявления антигенов токсинов клостридий при бактериальном пищевом отравлении неустановленной этиологии // Российский журнал Гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. Приложение № 32. Материалы Четырнадцатой Российской Гастроэнтерологической Недели. 6-8 октября 2008. -Москва. -№ 5. - Т.17. - 2008. - С. 38.
Белая О.Ф., Гюлазян Н.М., Юдина Ю. В., Пак С.Г. Значение выявления маркеров токсинов возбудителей у больных ОКИ для диагностики и прогноза течения заболевания // Материалы Российской научно-практической конференции Инфекционные болезни: современные проблемы диагностики и лечения. - Санкт - Петербург 3 - 4 декабря 2008. - С. 25.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Аг антиген

ГЭ гастроэнтерит

ГЭК гастроэнтероколит

ЖКТ желудочно-кишечный тракт

ИК иммунные комплексы

ИЛ интерлейкины

КИНЭ кишечная инфекция неустановленной этиологии

КФ копрофильтрат

ИИ лейкоцитарный индекс интоксикации

ПС липополисахарид

О-Аг О-антигены

ОКИ острая кишечная инфекция

ПЖ поджелудочная железа

ПТИ пищевая токсикоинфекция

РКА реакция коагглютинации

Т рег. Т - регуляторные клетки

ФНО- фактор некротизирующий опухоль-альфа

ХЭТ холероподобный энтеротоксин

ЦК цитокины

ШТ Шига токсин

ЭК энтероколит

C.dif. A энтеротоксин А C.difficile

C.dif. B цитотоксин B C.difficile

C.perf.A энтеротоксин типа А C.perfringens

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по медицине

Blog