Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине  

На правах рукописи

ПАВЛОВ

Роман Владимирович

Клинико-экспериментальное обоснование использования иммуномодуляторов в комплексной терапии наружного генитального эндометриоза

14.00.01 - акушерство и гинекология

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Санкт-Петербург - 2009

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта Российской академии медицинских наук

Научные консультанты:

академик РАМН, заслуженный деятель

науки РФ, доктор медицинских наук,

профессор                                        Айламазян Эдуард Карпович

доктор медицинских наук,

профессор                                        Сельков Сергей Алексеевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор                                        Савицкий Геннадий Александрович

доктор медицинских наук,

профессор                                        Гайдуков Сергей Николаевич

доктор медицинских наук,

профессор                                        Назаров Петр Григорьевич

Ведущая организация: Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии

Защита диссертации состоится л___ ____________200 г в ___ часов на заседание диссертационного совета Д 001.021.01 при ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН (199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д.3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН

Автореферат разослан л_____________________200  г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат медицинских наук        Кузьминых Татьяна Ульяновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы наметился рост в заболеваемости генитальным эндометриозом. Согласно современным данным, наружный генитальный эндометриоз (НГЭ) диагностируется у 30 % женщин репродуктивного возраста, при этом на аутопсийном материале частота его выявления достигает 53,7 %. Среди пациенток, страдающих синдромом тазовых болей, эндометриоз выявляется в 38,8 % случаев, среди больных с бесплодием - в 50 %. По данным Американского общества фертильности, за последние 10 лет экономические затраты на лечение больных эндометриозом увеличились на 61 % (Л.В. Адамян, В.И. Кулаков 1998, В.П. Баскаков, Ю.В. Цвелев, Е.Ф. Кира 2002, Г.А. Савицкий, С.М. Горбушин 2002, P. Vigano, F. Parazzini, E. Somigliana, P. Vercellini 2004, X. Gao, et al. 2006).

Наиболее распространенная схема лечения НГЭ в виде хирургического удаления очагов эндометриоза с последующей гормональной терапией, при ее высокой себестоимости и частоте побочных эффектов, не обладает достаточной эффективностью в снижении рецидивов заболевания, полной ликвидации его клинических проявлений и в наступлении беременности у больных с бесплодием. Подобное положение определяет актуальность разработки новых методов лечения этого заболевания с учетом всех сторон его патогенеза, в том числе роли иммунной системы и ангиогенеза (Э.К.аАйламазян, С.А. Сельков, М.И. Ярмолинская 1997, М.И. Ярмолинская 1997, A.W. Nap, et al. 2004, D.L. Olive, S.R. Lindheim, E.A. Pritts 2004, A.K.аSchroder, K. Diedrich, M. Ludwig 2004).

С учётом современных представлений о характере иммунных нарушений при НГЭ применение иммуномодулирующих препаратов является важным этапом в комплексной терапии этой патологии. Исследование роли иммунной системы на качественно новом уровне позволило рекомендовать использование селективной стимуляции иммунной системы с применением активирующих цитокинов и их ансамблей, а благодаря технологии рекомбинантных ДНК некоторые цитокины стали доступны в количествах, достаточных для их клинического изучения и последующего медицинского применения, в том числе для лечения НГЭ (М.И. Ярмолинская 1997, В.С. Корсак, с соавт. 2002, С.А. Сельков, М.И.аЯрмолинская 2004, T.M.аD'Hooghe, et al. 2004, D.L. Olive, S.R. Lindheim, E.A. Pritts 2004).

В то же время селективная иммунотерапия применялась в качестве дополнения к стандартному послеоперационному гормональному лечению НГЭ в немногочисленных исследованиях, что не позволяет объективно оценить все ее достоинства и недостатки в терапии этого заболевания. По нашему мнению, комплексное изучение роли иммунной системы и ангиогенеза в патогенезе НГЭ позволит не только получить новые данные о механизме возникновения этого заболевания, но и разработать качественно новую схему лечения эндометриоза с использованием селективной иммунотерапии.

Цель исследования. Экспериментальная и клиническая разработка патогенетически обоснованных схем цитокинотерапии в комплексном лечении наружного генитального эндометриоза.

Задачи исследования

1. Оценить особенности клинического течения НГЭ с учетом макроскопических особенностей эндометриоидных гетеротопий.
2. Определить пролиферативную активность клеток эктопического эндометрия (площадь ядер, плоидность клеток, активность областей ядрышковых организаторов) в эндометриоидных очагах с разными макроскопическими особенностями.
3. Изучить особенности васкуляризации (диаметр и площадь капилляров, пролиферативная активность клеток эндотелия) и клеточного состава лейкоцитарных инфильтратов эндометриоидных гетеротопий с различной пролиферативной активностью эктопического эндометрия.
4. Изучить субпопуляционный состав иммунокомпетентных клеток периферической крови и перитонеальной жидкости (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD25) больных НГЭ в зависимости от пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия.
5. Определить продукцию цитокинов (ИЛ1, ИЛ2, ИЛ4, ИЛ6, ИЛ8, ФНО, ИФН) мононуклеарными клетками периферической крови и перитонеальной жидкости больных НГЭ, а также уровень этих цитокинов в нативной перитонеальной жидкости и ткани эндометриоидных гетеротопий в зависимости от пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия.
6. Оценить эффективность рекомбинантного интерферона-α2 и интерлейкина-2 в терапии экспериментального эндометриоза у крыс. Изучить влияние этих препаратов на пролиферативную активность эпителия очагов экспериментального эндометриоза, степень их васкуляризации, особенности лейкоцитарной инфильтрации и клеточного состава перитонеальной жидкости экспериментальных животных.
7. Оценить ближайшие (течение послеоперационного периода и иммунокоррегирующий эффект) и отдаленные (клинический эффект, снижение уровня СА125, наступление беременности и рецидива заболевания) результаты противорецидивной терапии НГЭ интерфероном-2b (Реафероном-ЕС) и генноинженерным аналогом эндогенного интерлейкина-2 (Ронколейкином) в клинике.

Научное значение настоящего исследования. Изучены показатели общего и местного иммунитета у больных НГЭ, особенности цитокинового обмена и активность ангиогенеза в эндометриоидных гетеротопиях в зависимости от пролиферативной активности клеток их эпителия. Подтверждена роль иммунной системы и ангиогенеза в возникновении и прогрессировании НГЭ, выявлены возможные точки приложения селективной иммунотерапии для профилактики рецидивов заболевания. Впервые в эксперименте in vivo изучена эффективность и механизм действия интерферона-α2 и генноинженерного аналога эндогенного интерлейкина-2 (ИЛ2) в отношении экспериментального эндометриоза у крыс. Предложена патогенетически обоснованная и экспериментально подтвержденная комплексная схема лечения наружного генитального эндометриоза с использованием интерферона-2 (Реаферона-ЕС) и генноинженерного аналога эндогенного интерлейкина-2 (Ронколейкина), проведена оценка ее эффективности. Доказано, что предлагаемые схемы селективной иммунотерапии НГЭ улучшают течение послеоперационного периода, в отношении противорецидивного и клинического эффекта не уступают гормональной терапии с использованием агонистов ГнРГ, не обладая побочными эффектами последней, а в отношении восстановления фертильности у больных с бесплодием превосходят общепринятую схему лечения в два раза.

Теоретическое и практическое значение результатов работы. Полученные иммунологические и морфологические данные углубляют имеющиеся сведения о роли иммунной системы и ангиогенеза в патогенезе наружного генитального эндометриоза. Полученные экспериментальные данные расширяют представления о механизме действия цитокинов в отношении регресса очагов эндометриоза и обосновывают целесообразность использования селективной иммунотерапии в комплексном лечении этого заболевания. Полученные клинические данные позволяют предлагать к широкому применению эффективные и безопасные схемы комплексного лечения наружного генитального эндометриоза с использованием селективной иммунотерапии, не уступающие по эффективности общепринятым методам, а по восстановлению фертильности у больных с бесплодием превосходящие их в два раза.

Апробация работы и внедрение результатов в практику. Основные результаты исследований вошли в отчет по научно-исследовательской работе Ставропольской государственной медицинской академии и ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.аОтта РАМН за 2005 - 2008 гг. Материалы исследований используются в учебном процессе при чтении лекций, проведении лабораторно-практических занятий и научных исследований в Ставропольской государственной медицинской академии и в ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.аОтта РАМН.

Основные положения работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием Актуальные аспекты жизнедеятельности человека на севере (Архангельск, 2006), на итоговых конференциях молодых ученых и студентов Ставропольской государственной медицинской академии (Ставрополь, 2006, 2007, 2008), на краевой клинической конференции акушеров-гинекологов (Ставрополь, 2007, 2008), на 9-м Всероссийском научном форуме Мать и дитя (Москва, 2007), на 3-м Международном научном конгрессе Новые технологии в акушерстве и гинекологии (Ст-Петербург, 2007), на II-м региональном научном форуме Мать и дитя (Сочи, 2008), на Объединенном иммунологическом форуме (Ст-Петербург, 2008), на III-м международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2009).

Предлагаемая схема лечения НГЭ применяется на практике в гинекологических отделениях Ставропольского краевого клинического перинатального центра и Ставропольского краевого клинического центра специализированных видов медицинской помощи.

Основные положения диссертации изложены в 21 научной работе (11 из них опубликованы в изданиях, входящих в перечень ВАК РФ), в практических рекомендациях, а также в материалах российских и международных конференций и форумов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Клинические проявления наружного генитального эндометриоза и частота ассоциированного с ним бесплодия определяются не только степенью распространения заболевания, но и пролиферативной активностью эпителия эндометриоидных гетеротопий.
2. Пролиферативная активность эпителия эндометриоидных гетеротопий находится в прямой зависимости от степени их васкуляризации, активности перитонеальных макрофагов и уровня провоспалительных цитокинов в перитонеальной жидкости и ткани гетеротопий.
3. ечение экспериментального эндометриоза у крыс с применением монотерапии интерфероном-α и генноинженерным аналогом ИЛ2 ведет к полному регрессу очагов эндометриоза более чем в половине случаев.
4. В основе регресса очагов эндометриоза на фоне проводимой селективной иммунотерапии лежит увеличение активности Т-лимфоцитов и естественных киллеров при одновременном снижении активности макрофагов и степени васкуляризации эндометриоидных гетеротопий.
5. Селективная иммунотерапия, включенная в комплексное лечение наружного генитального эндометриоза, улучшает течение послеоперационного периода, не отличается по противорецидивному и клиническому эффекту от терапии НГЭ агонистами ГнРГ, не обладает побочными эффектами последних, позволяет в 3 раза снизить частоту возникновения спаечного процесса малого таза после хирургического вмешательства, в 2 раза увеличить частоту наступления беременностей у пациенток с бесплодием и значительно снизить себестоимость лечения больных.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, пять глав собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и список литературы, содержащий 103 работы отечественных и 372 работы зарубежных авторов. Диссертация изложена на 290 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 91 таблицей, 34 фотографиями и 5 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Общее количество больных НГЭ, находившихся под нашим наблюдением с 1999 по 2008 гг., составило 835 человек. С целью подбора клинически однородной группы для проведения основной части исследования всем больным проводилось общеклиническое обследование и лечебно-диагностическая лапароскопия. Клиническое обследование больных включало в себя сбор анамнеза, проведение гинекологического исследования, УЗИ органов малого таза, определение в периферической крови уровня СА125. Лечебно-диагностическая лапароскопия проводилась с помощью оборудования фирмы Karl Storz (Германия). Степень распространения НГЭ определялась в баллах по пересмотренной классификации Американского общества фертильности r-AFS.

На основании полученных клинических и эндоскопических данных было отобрано 150 больных НГЭ, сопоставимых по возрасту, жалобам, анамнезу, гинекологической и экстрагенитальной патологии, у которых проводилось морфометрическое исследование удаленных очагов эндометриоза и иммунологическое исследование периферической крови (ПК), перитонеальной жидкости (ПЖ) и ткани эндометриоидных гетеротопий.

В ходе изучения пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия, степени васкуляризации и характера лейкоцитарной инфильтрации все очаги ЭБ были разделены на три группы: I группа - 30 гетеротопий красного цвета, II группа - 44 гетеротопии черного цвета, III группа - 26 гетеротопий белого цвета. Эндометриоидные кисты яичников (ЭКЯ) в зависимости от их микроскопического строения были разделены на две группы: I группа - железисто-кистозный вариант (ЖКВ) (35 препаратов) и II группа - кистозный вариант (КВ) (45 препаратов).

Для проведения морфологического исследования гистологические препараты, фиксированные в 10 % нейтральном формалине и 96 % охлажденном этаноле, окрашивались гематоксилином-эозином, по Ван-Гизону, Романовскому-Гимзе, акридиновым оранжевым и азотнокислым серебром. Системный морфометрический анализ удаленных препаратов выполнялся с помощью микротелефотометрического анализатора изображения с использованием программы ВидеоТест-Морфо (Истра-ВидеоТест, Россия).

Пролиферативная активность клеток эктопического эндометрия и эндотелия капилляров оценивалась на основании критериев, предложенных Г.Г. Автандиловым (1996): высота эндометриоидных клеток, средняя площадь ядер эндометриоидных и эндотелиальных клеток, плотность распределения ДНК в ядрах клеток, параметры активности областей ядрышковых организаторов (ОЯОР) (среднее количество, средняя площадь, суммарная площадь ОЯОР в ядре клетки). Степень васкуляризации очагов эндометриоза оценивалась на основании подсчета процента площади просвета сосудов в 1 мм2 образца ткани, средней площади просвета капилляра и показателей пролиферативной активности эндотелиальных клеток капилляров. В лейкоцитарных инфильтратах очагов ЭБ и ЭКЯ подсчитывалось количество нейтрофилов, эозинофилов, плазматических, тучных клеток, лимфоцитов и макрофагов.

Перед проведением иммунологического исследования все больные II - III степени распространения НГЭ (100 женщин) в зависимости от степени пролиферативной активности эктопического эндометрия гетеротопий были разделены на две группы: I группа - 30 больных с высокой пролиферативной активностью клеток эндометриоидных гетеротопий и II группа - 70 больных с низкой пролиферативной активностью клеток эктопического эпителия. Контрольную группу составили 30 женщин репродуктивного возраста, без признаков НГЭ и сопутствующей гинекологической патологии, с двухфазным менструальным циклом, поступивших для выполнения хирургической стерилизации.

Объем иммунологического исследования включал: изучение относительного и абсолютного количества основных субпопуляций иммунокомпетентных клеток в ПК и ПЖ (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD25 - лимфоциты) методом проточной цитометрии на проточном цитометре Bio Rad (лBrute-HS, США), с использованием антител, конъюгированных с флуоресциинизотиоционатом (FITC) и фикоэритрином (PE) (лCaltag Laboratories, США). Изучение продукции ИЛ1β, ИЛ2, ИЛ4, ИЛ6, ИЛ8, ФНОα, ИФНγ изолированными МНК ПК и ПЖ, тканью эндометриоидных гетеротопий in vitro, а также определение уровня этих цитокинов в нативной ПЖ осуществлялось методом твердофазового иммуноферментного анализа (ИФА) на планшетном фотометре Labsystems iEMS Reader MF (Финляндия) с использованием наборов ВекторБест и Протеиновый контур (Россия) согласно прилагаемым к наборам методикам.

Перед использованием селективной иммунотерапии НГЭ в клинике, с целью оценки ее эффективности и безопасности, а также для уточнения возможного механизма действия, предлагаемая схема с применением рекомбинантного крысиного интерферона-2 и генноинженерного аналога ИЛ2 (Ронколейкина) была апробирована в эксперименте in vivo на 40 крысах линии Vistar с моделированным экспериментальным эндометриозом (ЭЭ). В качестве контрольной группы использовались 20 животных с ЭЭ, не получавших специфического лечения.

Модель ЭЭ была воспроизведена путем аутотрансплантации фрагментов левого маточного рога на внутреннюю поверхность передней брюшной стенки. Через 10 дней после трансплантации маточного рога все животные были разделены на 3 группы: I группе (20 животных) в асептических условиях в брюшную полость вводился генно-инженерный аналог ИЛ2 Ронколейкин (Биотех, Россия), в дозировке 8 000 ЕД на 1 кг, трехкратно, с интервалом через 1 день; II группе (20 животных) в асептических условиях в брюшную полость вводился рекомбинантный крысиный α2-интерферон (лSigma-Aldrich, США), в дозировке 15 000 ЕД на 1 кг, трехкратно, с интервалом через 1 день; III группе (20 животных) в асептических условиях в брюшную полость по обозначенной схеме вводился стерильный физиологический раствор.

Оценка эффективности проводимой терапии ЭЭ осуществлялась через 40 дней от начала эксперимента на основании сравнения следующих морфологических критериев: наличие эндометриоидных желез в трансплантате, объем трансплантата, площадь эндометриоидных желез, пролиферативная активность клеток эндометриоидного эпителия.

Кроме этого, с цель уточнения возможного механизма действия селективной иммунотерапии на очаги ЭЭ оценивались: клеточный состав ПЖ, степень васкуляризации очагов ЭЭ, интенсивность и состав лейкоцитарной инфильтрации очагов ЭЭ.

После апробации селективной иммунотерапии в эксперименте была проведена оценка эффективности интерферона-2b (Реаферона-ЕС, Вектор-Медика, Россия) и генноинженерного аналога ИЛ2 (Ронколейкина, Биотех, Россия) у 80 больных НГЭ, составивших основную группу. В качестве группы сравнения использовались 40 больных НГЭ, получавших в послеоперационном периоде агонист ГнРГ (Бусерелин-депо, ЗАО Фарм-Синтез, Россия).

Все больные основной и контрольной группы были сопоставимы по возрасту, анамнезу, предъявляемым жалобам, данным иммунологического исследования ПК, объему хирургического вмешательства и равноценности общего медикаментозного комплекса. У всех больных диагноз НГЭ был подтвержден гистологически. Обязательным условием включения больных в эксперимент было предварительное удаление очагов эндометриоза во время выполнения лечебно-диагностической лапароскопии, а также отсутствие у них аутоиммунных заболеваний и аллергических реакций.

После удаления очагов НГЭ все больные были разделены на две основные и контрольную группу: I группе (40 больных) после хирургического удаления очагов НГЭ в брюшную полость вводился Ронколейкин в количестве 500а000 ЕД. В дальнейшим этим больным Ронколейкин вводился на 2-е, 4-е, 8-е, 12-е, 16-е, 20-е, 24-е, 28-е сутки после операции внутривенно, капельно в количестве 500а000 ЕД на одно введение. Таким образом, курс лечения Ронколейкином составлял 1 месяц, а суммарная доза препарата 4а500а000 ЕД. II группе (40 больных) после хирургического удаления очагов НГЭ в брюшную полость вводился Реаферон-ЕС в количестве 1 000а000 ЕД. В дальнейшим этим больным Реаферон-ЕС вводился на 2-е, 4-е, 7-е, 10-е, 13-е, 16-е, 19-е, 22-е, 25-е, 28-е сутки после операции внутримышечно, в количестве 1 000а000 ЕД на одно введение. Таким образом, курс лечения Реафероном-ЕС составлял 1 месяц, а суммарная доза препарата 11а000а000 ЕД. III контрольной группе (40 больных) после хирургического удаления очагов НГЭ получали Бусерелин-Депо, каждые 28 дней по 3,75 мг внутримышечно в течение 6 месяцев.

Оценка эффективности терапии НГЭ проводилась по следующим критериям: иммунокорригирующий эффект (иммунограммы ПК через 1 и 6 месяцев после операции); особенности течения послеоперационного периода; наличие осложнений, связанных с применением иммунокорригирующий и гормональной терапии (в течение 1 и 6 месяцев соответственно); клинический эффект в отношении болевого синдрома, нарушений менструального цикла, психоэмоциональной сферы и уровня СА125 в периферической крови на протяжении 12 месяцев наблюдения после завершения противорецидивной терапии НГЭ; частота наступления беременностей у пациенток с бесплодием в течение 12 месяцев после завершения иммунокорригирующей и гормональной терапии; наличие рецидива НГЭ по данным контрольной лапароскопии, выполняемой в случае отсутствия беременности через 12 месяцев после завершения иммунокорригирующей и гормональной терапии.

Статистическая обработка полученных данных проводилась на компьютере PENTIUM IV с использованием программ Primer Biostatistic 4.03. for Windows и Microsoft Excel 97 for Windows. Для всех изучаемых показателей определялось среднее значение и ошибка среднего; сравнение качественных параметров в исследуемых группах проводилось с помощью непараметрических методов χ2, χ2 с поправкой Йетса; сравнение количественных показателей - с помощью критерия Манна-Утни и Стьюдента, сравнение показателей до и после лечения проводилось с помощью критерия Вилкоксона. Критерием статистической достоверности получаемых выводов считали общепринятую в медицине величину р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Клиническая и эндоскопическая характеристика больных наружным генитальным эндометриозом

В ходе проведения лапароскопического вмешательства было установлено, что наиболее часто эндометриоидные гетеротопии локализовались на брюшине маточно-прямокишечного углубления (68,9 %), крестцово-маточных связках (59,3 %) и яичниках (71,7 %). Сочетание различных локализаций эндометриоидных очагов при НГЭ наблюдалось в 86,7 % случаев, у 7 пациенток был диагностирован эндометриоз толстого кишечника. В 64,8 % случаях ЭБ сочетался с ЭКЯ, у 312 (37,4 %) больных был выявлен выраженный спаечный процесс в малом тазу.

Макроскопически эндометриоидные гетеротопии выглядели в виде петехий, пузырьков, папул и пятен. Размеры поверхностных гетеротопий варьировали от 1 до 5 мм в диаметре. Для инфильтративных форм были характерны более обширные поражения и инвазивный рост в подбрюшинную клетчатку.

Несмотря на большое разнообразие визуальных проявлений НГЭ, в зависимости от цвета очаги ЭБ и яичников можно было условно разделить на белые, красные и черные, а также их различные сочетания. Среди монохромных очагов ЭБ наиболее часто встречались черные (30,5 %), на втором месте по частоте распространения были красные (10,9 %) очаги, и наиболее редко встречались гетеротопии белого (1,6 %) цвета. Среди комбинаций очагов эндометриоза разного цвета наиболее часто встречалось сочетание красных и черных (26,8 %) и черных и белых (20,6 %) гетеротопий. Комбинации красных, черных и белых (8,26 %), а также красных и белых очагов (1,3 %) встречались достаточно редко.

При определении проходимости маточных труб у пациенток с бесплодием, ассоциированным с НГЭ, было установлено, что отсутствие проходимости обеих маточных труб наблюдалось только в 23,3 % случаев. В 26,8 % случаев была непроходима только одна маточная труба, а в 49,8а% обе маточные трубы были проходимы.

На основании количества, локализации, глубины инвазии эндометриоидных гетеротопий, а также с учетом степени выраженности спаечного процесса и проходимости маточных труб у 492 больных НГЭ (58,9 %) была выявлена I - II степень распространения заболевания, а у 343 (41,1 %) диагностирован НГЭ III - IV степени.

При изучении влияния макроскопических особенностей очагов эндометриоза брюшины на клинические проявления НГЭ установлено, что в случае наличия красных эндометриоидных гетеротопий частота выявления болевого синдрома в виде дисменореи, тазовой боли, не связанной с менструацией, боли в крестце и диспареунии, была достоверно выше (94,4а%), чем у больных с черными и белыми очагами (77,3 %, р<0,001). При наличии красных гетеротопий достоверно возрастала и интенсивность болевого синдрома. Боль как линтенсивную расценивали 42,4 % пациенток с красными очагами НГЭ в отличие от 22,7 % больных с черными и белыми гетеротопиями (р<0,001). Кроме увеличения интенсивности болевого синдрома, у больных с красными очагами НГЭ частота бесплодия была достоверно выше (37,9 %), чем у больных с белыми и черными очагами (31,1 %, p<0,05).

Таким образом, на тяжесть клинических проявлений НГЭ оказывает влияние не только степень распространения заболевания, но и макроскопические особенности эндометриоидных гетеротопий. В пользу этого предположения указывает и тот факт, что наличие красных очагов эндометриоза и их сочетаний с гетеротопиями другого цвета достоверно чаще наблюдалось при распространенных формах НГЭ (54,8 %), чем при I - II степени заболевания (42,1 %, р<0,001).

Согласно полученным данным, в группе пациенток с красными очагами эндометриоза уровень СА125 выше 35 МЕ/мл определялся в 55,7 % случаев, а в группе больных с черными и белыми гетеротопиями в 46,8 % (р<0,05).С учетом того, что СА125 - маркер пролиферации эпителиальных клеток, полученные данные являются дополнительным подтверждением высокой активности НГЭ именно при наличии красных очагов.

Морфологическая характеристика очагов эндометриоза брюшины и эндометриоидных кист яичников

В процессе морфометрического анализа показателей пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия установлено, что при ЖКВ эндометриоза яичников эпителиальные клетки имеют достоверно большую высоту (14,051,20 мкм) и площадь ядер (15,431,34 мкм2), чем при КВ (9,121,25 мкм и 8,281,14 мкм2, p<0,05). Эпителиальные клетки красных и черных очагов ЭБ имели одинаковую высоту (14,431,19 мкм и 13,431,08 мкм) и площадь ядер (15,811,22 мкм2 и 14,751,34 мкм2), которая достоверно не отличалась от ЖКВ эндометриоза яичников и была достоверно выше, чем у эпителия белых очагов ЭБ (9,481,21 мкм и 10,141,87 мкм2) и КВ эндометриоза яичников (9,12±1,25 мкм и 8,281,14 мкм2).

При определении показателей активности ОЯОР было установлено достоверное увеличение их количества, средней и суммарной площади в ядрах эпителиальных клеток ЖКВ эндометриоза яичников (2,870,13, 1,290,06 мкм2, 3,700,17 мкм2) по сравнению с КВ (1,600,11, 1,090,03 мкм2, 1,740,11 мкм2). Средняя площадь одного ОЯОР и суммарная площадь ОЯОР в ядрах клеток эпителия красных очагов ЭБ (1,320,06 и 3,850,18 мкм2), не отличаясь от клеток ЖКВ эндометриоза яичников, была достоверно выше, чем в черных (1,180,04 и 3,320,15 мкм2) и белых очагах ЭБ (1,120,03 и 2,350,12 мкм2).

При анализе площади сосудистого русла в строме ЭКЯ установлено ее достоверное снижение при КВ (7,161,02 %) по сравнению с ЖКВ (13,400,80 %). Площадь микроциркуляторного русла в красных очагах ЭБ (13,781,08 %) достоверно не отличалась от ЖКВ эндометриоза яичников и была достоверно выше, чем в черных (10,970,68 %), белых очагах ЭБ (8,050,74 %) и КВ эндометриоза яичников. При определении средней площади просвета капилляров в строме ЭКЯ установлено его уменьшение при КВ (72,065,70 мкм2) по сравнению с ЖКВ (118,908,38 мкм2). Средняя площадь просвета капилляра в красных гетеротопиях (120,106,75 мкм2) достоверно не отличалась от ЖКВ эндометриоза яичников, превышая таковую в черных (98,126,60 мкм2), белых (75,127,25 мкм2) очагах ЭБ и КВ эндометриоза яичников.

При морфометрическом определении пролиферативной активности клеток эндотелия капилляров установлено достоверное увеличение площади их ядер в ЖКВ эндометриоза яичников (11,800,80 мкм2), красных (11,940,76 мкм2) и черных (10,630,43 мкм2) очагах по сравнению с КВ эндометриоза яичников (8,950,51 мкм2, p<0,01) и белыми очагами ЭБ (8,780,74 мкм2, p<0,01). Средняя и суммарная площадь ОЯОР в ядрах эндотелия ЖКВ эндометриоза яичников (0,810,06 и 1,680,15 мкм2) и красных очагах ЭБ (0,840,08 и 1,720,17 мкм2) была достоверно выше, чем в черных (0,640,06 и 1,250,12 мкм2), белых (0,560,06 и 1,070,09 мкм2) очагах и КВ эндометриоза яичников (0,520,05 и 0,960,08 мкм2).

При изучении интенсивности лейкоцитарной инфильтрации эндометриоидных очагов установлено, что количество лейкоцитов в строме ЭКЯ и очагов ЭБ достоверно не зависело от их варианта. При анализе популяционного состава лейкоцитарных инфильтратов эндометриоидных гетеротопий установлено, что в строме ЖКВ эндометриоза яичников и красных очагах ЭБ достоверно больше макрофагов (6,460,36 и 7,120,42 %) и меньше лимфоцитов (89,900,55 и 80,570,64 %), чем в строме КВ эндометриоза яичников (3,510,57 и 88,981,15 %), черных (5,220,28 и 85,140,98 %) и белых очагах ЭБ (2,950,31 и 90,630,66 %).

Таким образом, наибольшей высотой клеток, площадью ядер, количеством, средней и суммарной площадью ОЯОР на одно ядро клетки, а следовательно, и пролиферативной активностью, обладают клетки эпителия красных очагов ЭБ и ЖКВ эндометриоза яичников, а наименьшими морфологическими показателями пролиферативной активности обладают клетки КВ эндометриоза яичников и белых очагов ЭБ. Наибольшая степень васкуляризации характерна для красных очагов ЭБ и ЖКВ эндометриоза яичников. В несколько меньшей степени васкуляризированы черные очаги ЭБ, и наименьшие показатели васкуляризации характерны для белых очагов ЭБ и КВ эндометриоза яичников. В составе лейкоцитарных инфильтратов очагов эндометриоза с высокой пролиферативной активностью эпителия достоверно возрастает количество макрофагов и снижается количество лимфоцитов. Анализируя полученные морфологические данные, можно утверждать, что увеличение степени васкуляризации и количества макрофагов в строме эндометриоидных очагов сопровождается увеличением пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия.

Особенности иммунного статуса и обмена цитокинов у больных наружным генитальным эндометриозом

Согласно полученным данным, в ПК больных НГЭ, по сравнению со здоровыми женщинами, достоверно снижается относительное количество CD3, CD4, CD8, СD16 и CD25-лимфоцитов, а количество моноцитов достоверно возрастает. При этом изменение количества всех перечисленных субпопуляций МНК ПК достоверно более выражено у пациенток с высокой пролиферативной активностью клеток эктопического эндометрия (табл. 1).

Таблица 1

Субпопуляционный состав МНК ПК больных НГЭ, (M±m)

Показатель	Здоровые женщины (n=30)	Больные НГЭ II Ц III степени
		Высокая пролиферативная активность (n=30)	Низкая пролиферативная активность (n=70)
№ группы	1	2	3
Моноциты, %	2,40±0,23	4,27±0,14	4,07±0,08
Достоверность отличий	P1-2=0,001 P1-3=0,001	P2-3=0,193
CD3, %	63,70±1,05	39,30±1,37	48,34±0,76
Достоверность отличий	P1-2=0,001 P1-3=0,001	P2-3=0,001
CD4, %	38,40±0,75	25,77±0,54	28,74±0,56
Достоверность отличий	P1-2=0,001 P1-3=0,001	P2-3=0,002
CD8, %	29,27±0,66	17,43±0,54	23,59±0,59
Достоверность отличий	P1-2=0,001 P1-3=0,001	P2-3=0,001
CD16, %	15,23±0,50	9,20±0,23	10,77±0,43
Достоверность отличий	P1-2=0,001 P1-3=0,001	P2-3=0,022
CD25, %	7,13±0,27	4,47±0,25	5,84±0,25
Достоверность отличий	P1-2=0,001 P1-3=0,003	P2-3=0,001

Таблица 2

Уровень продукции цитокинов in vitro МНК ПК больных НГЭ, (M±m)

Показатель	Здоровые женщины (n=30)	Больные НГЭ II Ц III степени
		Высокая пролиферативная активность (n=30)	Низкая пролиферативная активность (n=70)
№ группы	1	2	3
ИЛ1, пкг/мл	130,10±6,92	162,40±7,79	148,30±4,68
Достоверность отличий	P1-2=0,003 P1-3=0,034	P2-3=0,111
ФНО, пкг/мл	156,20±9,22	221,50±10,95	198,50±6,99
Достоверность отличий	P1-2=0,001 P1-3=0,001	P2-3=0,077
ИФН, пкг/мл	65,07±4,08	28,11±1,44	44,59±2,77
Достоверность отличий	P1-2=0,001 P1-3=0,001	P2-3=0,001
ИЛ6, пкг/мл	3404,00±30,89	6055,00±72,05	4913,00±58,85
Достоверность отличий	P1-2=0,001 P1-3=0,001	P2-3=0,001
ИЛ8, пкг/мл	1285,00±37,35	7048,00±128,00	5840,00±98,05
Достоверность отличий	P1-2=0,001 P1-3=0,001	P2-3=0,001

При изучении особенностей продукции цитокинов МНК ПК было установлено, что они продуцируют достоверно большее количество ИЛ1β и ФНО. Продукция ИЛ6 и ИЛ8 МНК ПК больных НГЭ достоверно выше, чем у здоровых женщин, при этом она возрастает с увеличением пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия. Уровень секреции ИЛ4 и ИЛ2 МНК ПК больных НГЭ не отличается от показателей нормы, а продукция ИФНγ достоверно снижается (табл. 2).

Таблица 3

Субпопуляционный состав МНК ПЖ больных НГЭ, (M±m)

Показатель	Здоровые женщины (n=30)	Больные НГЭ II Ц III степени
		Высокая пролиферативная активность (n=30)		Низкая пролиферативная активность (n=70)
№ группы	1	2		3
Макрофаги, %	37,82±2,25	65,26±2,71	52,00±2,89
Достоверность отличий	P1-2=0,001         P1-3=0,003	P2-3=0,006
CD3, %	72,50±5,50	53,75±3,19		60,33±2,53
Достоверность отличий	P1-2=0,005 P1-3=0,023	P2-3=0,138
CD4, %	53,00±1,00	40,75±2,48		43,00±2,81
Достоверность отличий	P1-2=0,001 P1-3=0,024	P2-3=0,626
CD16, %	24,00±2,00	11,75±1,32		17,50±1,77
Достоверность отличий	P1-2=0,033 P1-3=0,001	P2-3=0,046
CD25, %	32,10±3,70	17,40±2,72		25,50±2,14
Достоверность отличий	P1-2=0,002 P1-3=0,05	P2-3=0,043

При изучении ПЖ у больных НГЭ было установлено увеличение ее клеточности за счет макрофагов, прогрессирующее с увеличением пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия. Количество CD3, CD4, CD16 и CD25-лимфоцитов в ПЖ больных НГЭ достоверно снижается. При этом если количество CD3 и CD4 лимфоцитов в ПЖ больных НГЭ не зависит от пролиферативной активности эндометриоидных клеток гетеротопий, то количество CD16 и CD25-лимфоцитов достоверно снижается с ее увеличением. Необходимо отметить, что в отличие от ПК в ПЖ больных НГЭ изменение относительного количества иммунокомпетентных клеток сопровождается изменением их абсолютного содержания (табл. 3).

Таблица 4

Уровень продукции цитокинов in vitro МНК ПЖ больных НГЭ, (M±m)

Показатель	Здоровые женщины (n=30)	Больные НГЭ II Ц III степени
		Высокая пролиферативная активность (n=30)	Низкая пролиферативная активность (n=70)
№ группы	1	2	3
ИЛ1, пкг/мл	64,12±3,21	89,05±4,04	75,16±3,34
Достоверность отличий	P1-2=0,001 P1-3=0,049	P2-3=0,018
ФНО, пкг/мл	78,98±2,46	296,10±25,90	150,50±12,69
Достоверность отличий	P1-2=0,001 P1-3=0,001	P2-3=0,001
ИФН, пкг/мл	39,69±1,04	14,80±2,05	22,32±1,56
Достоверность отличий	P1-2=0,001 P1-3=0,001	P2-3=0,007
ИЛ2, пкг/мл	49,54±4,16	29,89±3,97	30,22±2,85
Достоверность отличий	P1-2=0,001 P1-3=0,001	P2-3=0,948
ИЛ6, пкг/мл	234,60±33,8	2301,00±40,6	1947,00±72,60
Достоверность отличий	P1-2=0,001 P1-3=0,001	P2-3=0,003
ИЛ8, пкг/мл	528,80±28,40	1560,00±12,24	941,00±11,25
Достоверность отличий	P1-2=0,001 P1-3=0,001	P2-3=0,001

Согласно полученным данным, МНК ПЖ больных НГЭ in vitro продуцируют большее количество ИЛ1, ФНО, ИЛ6 и ИЛ8 и меньшее количество ИЛ2 и ИФН, чем МНК ПЖ здоровых женщин. При этом, если степень снижения продукции ИЛ2 не зависит от пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия, то увеличение продукции ИЛ1, ФНО, ИЛ6, ИЛ8 и снижение ИФН прогрессирует с увеличением пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия (табл. 4).

При изучении уровня цитокинов в нативной ПЖ больных НГЭ и в ткани эндометриоидных гетеротопий было установлено достоверное увеличение уровня ИЛ1, ФНО, ИЛ4, ИЛ6, ИЛ8 и снижение ИЛ2 и ИФН, прогрессирующее с увеличением пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия.

Таким образом, в ПК и ПЖ больных НГЭ отмечается активация макрофагального звена иммунитета, на что указывает увеличение количества макрофагов, а также уровня продукции МНК ПК и ПЖ ИЛ1β, ФНОα, ИЛ6 и ИЛ8 при одновременном снижении активности Т-клеточного звена иммунитета и ЕК, подтверждением чего является уменьшение относительного количества CD3, CD4, CD8, CD16 и CD25-лимфоцитов, а также уровня продукции ИФНγ и ИЛ2. Согласно полученным данным, в ПЖ больных НГЭ отмечается более выраженное угнетение активности Т-клеточного звена иммунитета и ЕК, на что указывает снижение не только относительного, но и абсолютного количества основных субпопуляций лимфоцитов.

Необходимо отметить, что при НГЭ не только МНК ПЖ продуцируют высокое количество ИЛ1, ФНО, ИЛ6, ИЛ8 и низкое количество ИЛ2 и ИФН, но и сама ткань эндометриоидных гетеротопий характеризуется аналогичным цитокинообразованием. Изменение в продукции цитокинов МНК ПЖ и тканью эндометриоидных гетеротопий закономерно сопровождается увеличением уровня провоспалительных цитокинов, обладающих проангиогенных действием (ИЛ1β, ФНОα, ИЛ6 и ИЛ8), и снижением уровня противоопухолевых цитокинов (ИЛ2 и ИФНγ) в нативной ПЖ. Подобные изменения в цитокиновом составе ПЖ, наряду с уменьшением количества иммунокомпетентных клеток, обладающих противоопухолевой цитотоксичностью, определяют увеличение ее проангиогенной и снижение противоопухолевой активности, что может являться одной из причин прогрессирования НГЭ.

Оценка эффективности селективной иммунотерапии экспериментального эндометриоза у крыс

Учитывая обнаруженное снижение активности Т-клеточного и ЕК звена противоопухолевого иммунитета, а также дефицит в продукции ИФНγ и ИЛ2 у больных НГЭ, патогенетически обоснованным подходом в селективной иммунотерапии этого заболевания представляется использование интерферонотерапии или применение экзогенного ИЛ2 человека, в частности, в форме отечественных препаратов Реаферона-ЕС и Ронколейкина. Кроме этого, принимая во внимание преимущественно локальный характер иммунных нарушений при НГЭ, целесообразно проведение селективной иммунотерапии на местном уровне.

Для подтверждения этого заключения на доклиническом этапе, в эксперименте in vivo, нами оценивалась эффективность, безопасность и возможный механизм действия местного применения Ронколейкина и крысиного 2-интерферона в качестве селективной иммунотерапии экспериментального эндометриоза (ЭЭ) у крыс.

Согласно полученным данным, при аутотрансплантации фрагмента маточного рога на внутреннюю поверхность передней брюшной стенки ЭЭ развивается в месте трансплантации в 100 % случаев. При этом макроскопически очаги ЭЭ на поверхности париетальной брюшины выглядят как участки красного (8 из 20 случаев) или черного (12 из 20 случаев) цвета с кистами, заполненными прозрачным или геморрагическим содержимым.

При визуальном сравнении участков трансплантатов у крыс, получавших селективную иммунотерапию, красные участки встречались в 4 случаях из 40, в 14 случаях выявлялись белые очаги, которых не было у животных контрольной группы.

При обзорной микроскопии на фоне лечения α2-интерфероном у 10 крыс (50,0 %), а на фоне лечения Ронколейкином у 12 (60,0 %) в области места трансплантации маточного рога эктопический эндометрий отсутствовал, что позволило нам сделать вывод о полном регрессе эндометриоидных гетеротопий у этих животных.

Основными гистологическими вариантами регресса очагов ЭЭ были полное его замещение соединительной тканью (9 крыс, получавших Ронколейкин, и 5 - α2-интерферон) или мультикистозная дегенерация (3 крысы, получавшие Ронколейкин, и 2 - α2-интерферон). Некроз очага ЭЭ не развился ни у одной крысы, получавшей Ронколейкин, зато наблюдался у 2 животных, получавших α2-интерферон.

В случае сохранения эндометриоидных желез на фоне проводимой иммунотерапии происходит достоверное уменьшение их площади, степень выраженности которой не зависит от используемого препарата. Так, средняя площадь эндометриоидных желез у животных, не получавших лечение, составляла 11,29±1,94 % от площади трансплантата, на фоне применения Ронколейкина она уменьшалась до 6,01±1,06 %, а на фоне приема α2-интерферона - до 5,96±1,47 % (р<0,001).

Высота эпителия очагов ЭЭ животных, не получавших лечение, составляла 14,10±0,74 мкм, площадь ядер - 19,97±0,76 мкм2, количество ОЯОР в ядре - 2,63±0,16, средняя площадь одного ОЯОР - 1,61±0,09 мкм2, суммарная площадь ОЯОР в ядре - 3,17±0,32 мкм2. На фоне применения цитокинотерапии все эти показатели пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия, в случае его наличия, достоверно уменьшаются, и степень этого уменьшения также не зависит от используемого препарата. Так, после применения Ронколейкина высота эктопического эпителия уменьшается до 8,68±0,58 мкм, площадь ядер - до 15,58±1,44 мкм2, количество ОЯОР в ядре - до 2,05±0,07, средняя площадь одного ОЯОР до Ц1,06±0,04 мкм2, суммарная площадь ОЯОР в ядре - до 2,11±0,10 мкм2 (р<0,05). На фоне введения α2-интерферона высота эктопического эпителия уменьшается до 10,90±0,86 мкм, площадь ядер - до 15,00±0,97 мкм2, количество ОЯОР в ядре - до 2,10±0,12, средняя площадь одного ОЯОР - до 1,36±0,08 мкм2, суммарная площадь ОЯОР в ядре - до 2,42±0,08 мкм2 (р<0,05).

При анализе степени васкуляризации очагов ЭЭ было выявлено достоверное снижение всех ее параметров у животных, получавших селективную иммунотерапию. В участках трансплантатов маточного рога крыс, не получавших лечение, процент площади просвета сосудов от площади трансплантата составлял 10,79±0,70 %, средняя площадь просвета капилляра составляла 107,97±9,73 мкм2, площадь ядер эндотелиальных клеток - 10,33±0,64 мкм2, средняя площадь одного ОЯОР в ядрах эндотелиальных клеток была 0,74±0,09 мкм2, а суммарная площадь ОЯОР в ядре - 1,35±0,08 мкм2. После применения Ронколейкина процент площади сосудов от площади трансплантата уменьшался до 8,11±0,95 %, средняя площадь просвета капилляра - до 77,30±6,00 мкм2, площадь ядер эндотелиальных клеток - до 8,69±0,36 мкм2, средняя площадь одного ОЯОР - до 0,53±0,05 мкм2, суммарная площадь ОЯОР в ядре - до 0,86±0,11 мкм2 (р<0,05). На фоне введения α2-интерферона процент площади сосудов от площади трансплантата уменьшался до 8,00±1,00 %, средняя площадь просвета капилляра - до 63,38±5,53 мкм2, площадь ядер эндотелиальных клеток - до 7,91±0,41 мкм2, средняя площадь одного ОЯОР - до 0,54±0,04 мкм2, суммарная площадь ОЯОР в ядре - до 0,83±0,05 мкм2 (р<0,05).

Согласно полученным данным, на фоне проводимой иммунотерапии в участках трансплантации маточного рога возрастает интенсивность лейкоцитарной инфильтрации за счет лимфоцитов, а количество макрофагов в составе лейкоцитарных инфильтратов достоверно снижается. Так, у животных, не получавших лечение, на долю лимфоцитов, инфильтрирующих область трансплантата, приходится 91,69±0,95 % клеток, а на долю макрофагов - 2,00±0,25 %. После применения Ронколейкина процент лимфоцитов увеличивается до 95,80±0,85 %, а макрофагов снижается до 0,83±0,17 % (р<0,05). На фоне введения α2-интерферона процент лимфоцитов увеличивается до 93,99±0,57 %, а макрофагов снижается до 1,29±0,14 % (р<0,05).

На фоне проводимого лечения изменяется не только состав лейкоцитарных инфильтратов участков трансплантации маточного рога, но и состав ПЖ экспериментальных животных. Так, у животных, не получавших лечение, на долю лимфоцитов в ПЖ приходилось 45,74±0,69 % клеток, а на долю макрофагов - 33,61±1,16 %. После применения Ронколейкина процент лимфоцитов в ПЖ увеличился до 57,98±0,96 %, а макрофагов снизился до 25,37±0,88 % (р<0,05). На фоне введения α2-интерферона процент лимфоцитов в ПЖ увеличился до 55,88±1,08 %, а макрофагов снизился до 28,62±0,84 % (р<0,05).

Таким образом, на фоне внутрибрюшного введения α2-интерферона полный регресс очагов ЭЭ у крыс происходит в 50 % случаях, а на фоне введения Ронколейкина - в 60 %. В случае сохранения эндометриоидных желез на фоне проводимой иммунотерапии происходит достоверное уменьшение их площади и снижение пролиферативной активности клеток эндометриоидного эпителия.

Выявленные изменения в составе лейкоцитарных инфильтратов очагов ЭЭ и ПЖ животных, получавших иммунотерапию, позволяют предположить, что возможным механизмом действия α2-интерферона и Ронколейкина, ведущим к регрессу ЭЭ, может являться увеличение противоопухолевой активности лимфоцитов и уменьшение проангиогенной активности макрофагов. Дополнительным подтверждением этого предположения можно считать снижение степени васкуляризации очагов ЭЭ и уменьшение активности эндотелиальных клеток на фоне проводимого лечения.

Эффективность комплексного лечения наружного генитального эндометриоза с использованием селективной иммунотерапии

Учитывая положительные результаты селективной иммунотерапии эндометриоза, полученные в эксперименте, на завершающем этапе диссертационного исследования нами была проведена апробация предлагаемого метода комплексной терапии НГЭ в клинике.

Согласно нашим данным, в группе больных, получавших Ронколейкин, интенсивность и продолжительность болевого синдрома в послеоперационном периоде была меньше, чем в группах больных, получавших Реаферон-ЕС и Бусерелин-депо. Так, если в группе, получавшей Ронколейкин, в первые сутки после операции болевой синдром, требующий медикаментозного вмешательства, наблюдался у 17 больных, то в группах, получавших Реаферон-ЕС и не получавших иммунотерапию, - у всех пациенток.

Для больных, получавших Ронколейкин и Реаферон-ЕС, в послеоперационном периоде характерно наличие температурной реакции, которая была более выраженной как по продолжительности (в контрольной группе 1-2 дня, в основной - 2-4 дня), так и по интенсивности (в контрольной группе максимальное повышение температуры до 370,5 С, в основной, получавшей Ронколейкин, - до 380,1 С, Реаферон-ЕС - до 380,6 С). Подобная температурная реакция являлась побочным эффектом цитокинотерапии и существенно не влияла на общее самочувствие больных.

В течение месяца селективной иммунотерапии Ронколейкином и Реафероном-ЕС у части больных наблюдались лцитокиновые реакции в виде гипертермии, озноба и боли в месте инъекции, все они носили кратковременный характер, как правило, не требовали медикаментозной коррекции, не оказывали существенного влияния на общее состояние больных и прекращались сразу после завершения лечения.

В отличие от лцитокиновых реакций клинические проявления, характерные для гипоэстрогении, развивающейся в течение 6 месяцев на фоне приема Бусерелина-депо (аменорея, чувство приливов жара, снижение либидо, эмоциональная лабильность, сухость влагалища, боли в спине при физической нагрузке), негативно сказывались на общем состояние больных.

До начала лечения показатели иммунной системы ПК между группами достоверно не отличались и полностью соответствовали ранее выявленной иммунной дисфункции. В ПК больных НГЭ всех групп было выявлено увеличение количества моноцитов, снижение относительного количества CD3, CD4, CD8, CD16 и CD25-лимфоцитов, увеличение продукции МНК ПК in vitro ФНОα, ИЛ1β, ИЛ6 и ИЛ8 и снижение продукции ИФНγ.

Через 1 месяц после операции у больных, получавших Бусерелин-депо, не наблюдалось существенных изменений в клеточном составе и цитокинпродуцирующей активности иммунокомпетентных клеток ПК. У женщин, получавших во время и после лапароскопии селективную иммунотерапию, сразу после завершения курса лечения относительное количество CD3, CD4, CD8-лимфоцитов ПК не отличалось от нормальных значений, а относительное количество CD16 и CD25-лимфоцитов достоверно возрастало. При этом увеличение относительного количества CD16-лимфоцитов было более выраженным в группе, получавшей Реаферон-ЕС, а CD25-лимфоцитов - в группе, получавшей Ронколейкин.

После завершения иммунотерапии уровень продукции МНК ПК in vitro ФНОα не отличался от нормальных значений. В группе, получавшей Ронколейкин, уровень ИЛ6 снижался на 27,0 %, а ИЛ8 - в 3,1 раза. В группе, получавшей Реаферон-ЕС, уровень продукции ИЛ6 снижался на 10,0 %, а ИЛ8 - в 2,8 раза. У больных, в комплексной терапии которых использовался Ронколейкин через 1 месяц после лапароскопии, отмечалось увеличение продукции ИЛ1β в 2 раза, ИЛ2 - в 4,1 раза и ИФНγ - в 3,5 раза. У пациенток, получавших Реаферон-ЕС, уровень продукции ИЛ1β превышал норму в 1,6 раза, ИЛ2 - в 3,5 раза, зато уровень продукции ИФНγ возрастал в 5 раз по сравнению с нормой.

Через 6 месяцев после операции у больных, получавших Бусерелин-депо, клеточный состав иммунокомпетентных клеток ПК не отличался от исходных показателей. В группах, получавших селективную иммунотерапию, через 6 месяцев после операции относительное количество CD3, CD4, CD8-лимфоцитов в ПК не отличалось от нормальных значений. В группе, получавшей Ронколейкин, количество CD16-лимфоцитов и моноцитов не отличалось от нормы, а количество CD25-лимфоцитов оставалось повышенным; в группе, получавшей Реаферон-ЕС, в ПК сохранялось повышенное количество CD16-лимфоцитов, а количество CD25-лимфоцитов не отличалось от нормы.

Через 6 месяцев после операции в группе больных, получавших Бусерелин-депо, сохраняется достоверное увеличение, по сравнению с нормой, продукции МНК ПК in vitro ИЛ1β на 20,9 %, ФНОα - на 40,3 %, ИЛ6 - в 1,5 раза, ИЛ8 - в 4,2 раза, а уровень продукции ИФНγ остается пониженным на 28,4 %. МНК ПК больных, получавших Ронколейкин и Реаферон-ЕС, через 6 месяцев после лапароскопии продуцировали нормальное количество ИЛ1β, ИЛ6, ИЛ8, ФНОα и ИФНγ вне зависимости от используемого препарата. Обращает на себя внимание, что в группе, получавшей Ронколейкин, уровень продукции ИЛ2 оставался повышенным в 1,7 раза по сравнению с нормальным значением.

Таким образом, на фоне приема Ронколейкина и Реаферона-ЕС у больных НГЭ отмечается существенное увеличением активности клеток, реализующих Th1 иммунный ответ, а также формируется тенденция к нормализации повышенной активности макрофагов. Через 5 месяцев после завершения курса лечения Ронколейкином и Реафероном-ЕС наблюдается нормализация основных иммунологических показателей, нарушения которых были зарегистрированы у больных НГЭ до начала лечения, при этом в группе больных, получавших Ронколейкин, сохранялась повышенная активность Th1-иммунного ответа. Полученные данные позволяют утверждать, что селективная иммунотерапия НГЭ с применением Ронколейкина и Реаферона-ЕС обладает иммунорегуляторным действием в отношении именно тех звеньев иммунной системы, нарушения в которых регистрируются у больных до начала лечения.

До начала терапии болевой синдром в виде дисменореи, тазовых болей, не связанных с менструацией, диспареунии и боли в крестце имел место у 38 (95,0 %) больных, получавших Ронколейкин; у 37 (92,5 %), получавших Реаферон-ЕС, и у 39 (97,5 %) больных, получавших Бусерелин-депо. Через 1 месяц после операции болевой синдром отсутствовал у всех больных основных и контрольной групп. В течение 12 месяцев после завершения иммуноориентированной и гормональной терапии количество рецидивов болевого синдрома в группе, получавшей Ронколейкин, составило 17,5 %, в группе получавшей, Реаферон-ЕС, - 22,5 % и в группе, получавшей Бусерелин-депо, - 32,5 % (рис. 1).

Рис. 1. Динамика болевого синдрома у больных НГЭ после хирургического удаления очагов эндометриоза с последующим проведением иммуноориентированной или гормональной терапии

До начала лечения нарушения менструальной функции в виде гиперполименореи и мажущих кровянистых выделений до и после менструации отмечались у 21 (52,5 %) больной, получавшей после лапароскопии Ронколейкин; у 20 (50,0 %), получавших Реаферон-ЕС, и у 21 (52,5 %), получавшей Бусерелин-депо. Через 1 месяц после операции жалобы на нарушения менструального цикла сохранялись у 1 (2,5 %) больной в каждой группе, получавшей иммунотерапию, а в группе, получавшей Бусерелин-депо, таких жалоб не было. В течение 12 месяцев после завершения иммуноориентированной и гормональной терапии  количество рецидивов нарушений менструальной функции в группе, получавшей Ронколейкин, составило 12,5 %, в группе, получавшей Реаферон-ЕС, - 15,0 % и в группе, получавшей Бусерелин-депо, - 12,5 %.

Резюмируя полученные клинические данные, можно утверждать, что частота возврата клинических проявлений НГЭ в случае его рецидива не зависит от используемого метода лечения, а отличается между группами только временем возникновения рецидива.

С целью контроля возможных бессимптомных рецидивов НГЭ в послеоперационном периоде у всех пациенток основных и контрольной групп оценивался уровень СА125 в ПК.

Рис. 2. Динамика уровня СА125 у больных НГЭ после хирургического удаления очагов эндометриоза с последующим проведением иммуноориентированной или гормональной терапии

До операции уровень СА125 выше 35 МЕ/мл определялся у 28 (70,0 %) больных, получавших Бусерелин-депо, у 29 (72,5 %) больных, получавших Ронколейкин, и у 30 (75,0 %) больных, получавших Реаферон-ЕС. Через 1 месяц после завершения лечения уровень СА125 выше 35 МЕ/мл был зарегистрирован у 2 (5,0 %) больных, получавших Ронколейкин и Реаферон-ЕС, и у 3 (7,5 %) больных, получавших Бусерелин-депо. Через 12 месяцев после завершения иммуноориентированной и гормональной терапии  количество больных с уровнем СА125 выше 35 МЕ/мл составило 25,0 % в группе, получавшей Ронколейкин, 27,5 % в группе, получавшей Реаферон-ЕС, и 37,5 % в группе, получавшей Бусерелин-депо (рис. 2).

До начала лечения жалобы на бесплодие предъявляли 24 больные, получавшие впоследствии Ронколейкин, 22, получавшие Реаферон-ЕС и 22, получавшие Бусерелин-депо. Через 12 месяцев после завершения лечения беременность наступила у 17 (70,8 %) больных, получавших Ронколейкин, у 15 (68,2 %), получавших Реаферон-ЕС, и у 8 (36,4 %), получавших Бусерелин-депо (рис. 3).

Таким образом, частота наступления беременностей у пациенток с бесплодием была в 2 раза выше в группах, получавших Ронколейкин и Реаферон-ЕС (р<0,05). Необходимо отметить, что частота наступления беременности после хирургического удаления очагов НГЭ была максимальной в течение первых 6 месяцев после операции, и именно в это время на фоне гормонального лечения наблюдается медикаментозная аменорея. В дальнейшем вероятность наступления беременности снижалась.

Рис. 3. Частота наступления беременности у больных НГЭ после хирургического удаления очагов эндометриоза с последующим проведением иммуноориентированной или гормональной терапии

Из 17 женщин, беременность которых наступила на фоне приема Ронколейкина, беременность доносили 13 (76,5 %), из 15, получавших Реаферон-ЕС, - 11 (73,3 %), а из 8 беременных, получавших в послеоперационном периоде Бусерелин-депо, - 6 (75,0 %).

В соответствие с разработанным протоколом клинических испытаний через 12 месяцев после завершения лечения (13 месяцев после операции у больных, получавших иммунотерапию, и 18 месяцев после операции у больных, получавших Бусерелин-депо) у всех небеременных женщин с НГЭ была выполнена контрольная лапароскопия. При выполнении диагностической лапароскопии очаги эндометриоза на брюшине малого таза или яичниках были обнаружены у 13 больных, получавших Ронколейкин, (32,5 %), у 14 (35,0 %), получавших Реаферон-ЕС, и у 15 (37,5 %), получавших Бусерелин-депо.

При повторной лапароскопии наличие спаечного процесса было выявлено у 4 (10,0 %) больных, получавших Ронколейкин, у 6 (15,0 %), получавших Реаферон-ЕС, и у 15 (37,5 %) больных, получавших Бусерелин-депо. Двухсторонняя непроходимость маточных труб наблюдалась у 1 (2,5 %) больной, получавшей Ронколейкин и Реаферон-ЕС, и у 5 (12,5 %) больных контрольной группы.

Таким образом, частота рецидивов НГЭ после проведения в послеоперационном периоде селективной иммунотерапии Ронколейкином и Реафероном-ЕС не отличалась от частоты рецидивов НГЭ на фоне терапии агонистами ГнРГ. При этом в группах больных, получавших Ронколейкин и Реаферон-ЕС, частота выявления спаечного процесса и непроходимости маточных труб была ниже, чем в группе больных, получавших Бусерелин-депо, практически в три раза.

Предлагаемая схема применения Ронколейкина в комплексной терапии наружного генитального эндометриоза: после лапароскопического удаления или коагуляции очагов НГЭ, разъединения спаек и хромосальпингоскопии следует ввести в брюшную полость 500 000 ЕД Ронколейкина, разведенного в 10 мл физиологического раствора. На 2-е, 4-е, 8-е, 12-е, 16-е, 20-е, 24-е, 28-е сутки послеоперационного периода внутривенно вводить по 500 000 ЕД Ронколейкина, разведенного в 400 мл физиологического раствора, в течение 3-4 часов. Для предотвращения потери биологической активности препарата при длительности инфузии более 4 часов во флакон с Ронколейкином целесообразно вводить 6 мл 10 % человеческого сывороточного альбумина. Таким образом, лечение Ронколейкином продолжается в течение 1 месяца, а курсовая доза препарата составляет 4 500 000 ЕД.

Предлагаемая схема применения Реаферона-ЕС в комплексной терапии наружного генитального эндометриоза: после лапароскопического удаления или коагуляции очагов НГЭ, разъединения спаек и хромосальпингоскопии следует ввести в брюшную полость 1 000 000 ЕД Реаферона-ЕС, разведенного в 10 мл физиологического раствора. На 2-е, 4-е, 7-е, 10-е, 13-е, 16-е, 19-е, 21-е, 24-е, 27-е сутки послеоперационного периода внутримышечно вводить по 1 000 000 ЕД Реаферона-ЕС, разведенного в 5,0 мл физиологического раствора. Таким образом, курс лечения Реафероном-ЕС составляет 1 месяц, а суммарная доза препарата 11а000а000 ЕД.

ВЫВОДЫ

1. Клинические проявления НГЭ, а также частота ассоциированного с ним бесплодия связаны не только со степенью распространения заболевания, но и с пролиферативной активностью клеток эндометриоидных гетеротопий. При наличии активно пролиферирующих очагов эндометриоза красного цвета тяжесть клинических проявлений и частота бесплодия выше, чем при наличии черных и белых гетеротопий.
2. Возникновение и прогрессирование НГЭ сопровождается развитием иммунной дисфункции, преимущественно на уровне перитонеального микроокружения, которая характеризуется увеличением активности макрофагов и снижением активности Т-лимфоцитов и естественных киллеров.
3. Увеличение количества макрофагов в составе лейкоцитарных инфильтратов очагов НГЭ и перитонеальной жидкости больных женщин сопровождается увеличением степени их васкуляризации и пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия. При этом максимальной пролиферативной активностью обладают клетки эктопического эндометрия в красных очагах эндометриоза брюшины и железисто-кистозном варианте эндометриоза яичников, а минимальной - в белых очагах эндометриоза брюшины и кистозном варианте эндометриоза яичников.
4. Мононуклеарные клетки перитонеальной жидкости больных НГЭ и клетки эндометриоидных гетеротопий продуцируют повышенное количество провоспалительных цитокинов, обладающих проангиогенным действием (ФНОα, ИЛ1β, ИЛ6 и ИЛ8), и сниженное количество цитокинов, обладающих противоопухолевым (ИЛ2 и ИФНγ). Подобное изменение в цитокиновом обмене на уровне перитонеального микроокружения, наряду со снижением количества иммунокомпетентных клеток, обладающих противоопухолевой цитотоксичностью, ведет к увеличению ее проангиогенной и снижению противоопухолевой активности, что создает благоприятные условия для возникновения и прогрессирования НГЭ.
5. Внутрибрюшное введение рекомбинантного ИЛ2 ведет к полному регрессу 60 %, а α2-интерферона - к регрессу 50а% очагов экспериментального эндометриоза у крыс. В остальных случаях отмечается снижение пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия и уменьшение площади эндометриоидных желез. Регресс очагов экспериментального эндометриоза на фоне проводимой селективной иммунотерапии сопровождается уменьшением васкуляризации зоны трансплантатов, а также увеличивается количество лимфоцитов и снижается количество макрофагов в зоне трансплантата и перитонеальной жидкости экспериментальных животных.
6. Селективная иммунотерапия НГЭ с применением Ронколейкина и Реаферона-ЕС ведет к увеличению противоопухолевой активности Th1 иммунного ответа, а также к нормализации повышенной проангиогенной активности макрофагов, что может являться возможным механизмом действия предлагаемых схем лечения в отношении регресса очагов НГЭ.
7. Проводимая в послеоперационном периоде селективная иммунотерапия НГЭ по частоте рецидивов заболевания не отличается от терапии агонистами ГнРГ (частота рецидивов НГЭ на фоне применения Ронколейкина - 32,5 %, Реаферона-ЕС - 35,0 %, Бусерелина-депо - 37,5 %), при значительном снижении себестоимости, продолжительности лечения и отсутствии побочных эффектов, связанных с гипоэстрогенией.
8. На фоне селективной иммунотерапии Ронколейкином и Реафероном-ЕС частота возникновения спаечного процесса, связанного с хирургическим вмешательством, снижается в 3 раза, а частота наступления беременности у женщин с бесплодием увеличивается практически в 2 раза по сравнению с гормональным лечением.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Иммунологическое исследование периферической крови больных НГЭ необходимо включить в стандартный объем предоперационного обследования. Снижение количества CD3, CD4 и CD25-лимфоцитов в периферической крови больных является неблагоприятным признаком в отношении наличия распространенной формы заболевания, а снижение количества CD16-лимфоцитов - в отношении высокой пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия. Выявленные изменения в иммунитете являются показанием к проведению селективной иммунотерапии.
2. Во время лапароскопического вмешательства по поводу НГЭ рекомендуется проводить забор перитонеальной жидкости у больных НГЭ для последующего определения в ней уровня цитокинов. Увеличение в перитонеальной жидкости больных НГЭ уровня ИЛ1β, ФНОα, ИЛ6, ИЛ8 и снижение уровня ИЛ2 и ИФНγ указывает на высокую активность заболевания и является показанием для проведения селективной иммунотерапии.
3. Гистологическое исследование удаленных препаратов эндометриоза брюшины и яичников с целью уточнения активности заболевания необходимо дополнять гистохимической оценкой областей ядрышковых организаторов в ядрах клеток эндометриоидного эпителия. Увеличение количества и размеров областей ядрышковых организаторов в ядрах эндометриоидных клеток указывает на их высокую пролиферативную активность.
4. Полученные данные позволяют рекомендовать крысиную модель экспериментального эндометриоза для изучения эффективности медикаментозных и хирургических методов его лечения в условиях in vivo.
5. Селективная иммунотерапия НГЭ Ронколейкином и Реафероном-ЕС по предлагаемым схемам рекомендуется больным репродуктивного возраста с бесплодием, ассоциированным с НГЭ, и в качестве дополнения к стандартной гормональной терапии всем больным НГЭ. Обязательным условием проведения селективной иммунотерапии НГЭ является предварительное лапароскопическое удаление эндометриоидных очагов и разъединение спаек.
6. Учитывая наличие бессимптомных рецидивов эндометриоза, селективную иммунотерапию необходимо проводить под динамическим контролем уровня СА125 в периферической крови. При отсутствии беременности, возврате клинических проявлений или увеличении уровня СА125 в периферической крови в течение 12 месяцев после завершения иммунотерапии больным НГЭ показана повторная диагностическая лапароскопия с последующим назначением гормонального лечения по общепринятым принципам.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Павлов, Р.В. Особенности популяционного состава и функциональной активности иммунокомпетентных клеток периферической крови у женщин с наружных генитальным эндометриозом / Р.В. Павлов, Д.В. Аксененко, И.А. Жукова, Н.В. Анисимова, М.А. Слеткова // Экология человека. - 2006. - Приложение 4/2. - С. 26-27.
2. Павлов, Р.В. Особенности популяционного состава и функциональной активности иммунокомпетентных клеток перитонеальной жидкости у женщин с наружных генитальным эндометриозом / Р.В. Павлов, Н.В. Анисимова, Д.В. Аксененко, И.А. Жукова // Экология человека. - 2006. - Приложение 4/2. - С. 208-209.
3. Павлов, Р.В. Особенности клеточного микроокружения и неоангиогенеза гетеротопий в прогрессировании экспериментального эндометриоза у крыс / Р.В. Павлов // Журнал акушерства и женских болезней. - 2006. - Том. LV, № 1. - С. 80-84.
4. Павлов, Р.В. Эффективность внутрибрюшного применения интерферона в терапии экспериментального эндометриоза у крыс / Р.В. Павлов, С.А. Сельков // Медицинская иммунология. - 2006. - Том. 8, № 5-6. - С. 721-726.
5. Павлов, Р.В. Оценка эффективности внутрибрюшного применения ронколейкина в лечение экспериментального эндометриоза у крыс / Р.В. Павлов, С.А. Сельков // Журнал акушерства и женских болезней. - 2006. - Том. LV, № 3. - С. 54-60.
6. Павлов, Р.В. Сравнительная эффективность внутрибрюшного введения интерлейкина-2 и -интерферона при экспериментальном эндометриозе у крыс / С.А. Сельков, Р.В. Павлов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - № 3. - С. 335-339.
7. Павлов, Р.В. Оценка эффективности внутрибрюшного применения ронколейкина в лечение экспериментального эндометриоза у крыс / Р.В. Павлов, Д.В. Аксененко // Материалы 9-го Всероссийского научного форума Мать и дитя, Москва, 2007. - С. 482.
8. Павлов, Р.В. Роль сосудистого фактора и особенностей клеточного микроокружения в прогрессировании экспериментального эндометриоза у крыс / Р.В. Павлов, Д.В. Аксененко // Материалы 9-го Всероссийского научного форума Мать и дитя, Москва, 2007. - С. 483.
9. Павлов, Р.В. Экспериментальное и клиническое обоснование включения Ронколейкина в комплексную терапию наружного генитального эндометриоза / Р.В. Павлов, С.А. Сельков, Л.Н Можейко // Журнал акушерства и женских болезней. - 2007. - Том. LVII, специальный выпуск. - С. 128-129.
10. Павлов, Р.В. Влияние Ронколейкина на течение послеоперационного периода у больных наружным генитальным эндометриозом / Р.В. Павлов, Д.В. Аксененко, Л.Н. Можейко // Материалы II-го регионального научного форума Мать и дитя, Сочи, 2008 - С. 187.
11. Павлов, Р.В. Эффективность Ронколейкина в комплексной терапии бесплодия, ассоциированного с наружным генитальным эндометриозом / Р.В. Павлов, Д.В. Аксененко // Материалы II-го регионального научного форума Мать и дитя, Сочи, 2008 - С. 187-188.
12. Павлов, Р.В. Особенности местного иммунитета у больных наружным генитальным эндометриозом / Р.В. Павлов, Н.В. Анисимова, Д.В. Аксененко // Научно-практический журнал Акушерство, ГУЗ СККПЦ. - Ставрополь, 2007. - С. 68-69.
13. Павлов, Р.В. Морфологическая оценка эндометриоидных поражений брюшины и яичников / Р.В. Павлов, Н.В. Анисимова, Д.В. Аксененко // Научно-практический журнал Акушерство, ГУЗ СККПЦ. - Ставрополь, 2007. - С. 69-70.
14. Павлов, Р.В. Селективная иммунотерапия в комплексном лечение наружного генитального эндометриоза / Р.В. Павлов, Н.В. Анисимова, Д.В. Аксененко // Научно-практический журнал Акушерство, ГУЗ СККПЦ. - Ставрополь, 2007. - С. 70-71.
15. Павлов, Р.В. Пролиферативная активность эпителия, особенности васкуляризации и лейкоцитарной инфильтрации очагов перитонеального эндометриоза / Р.В. Павлов // Журнал акушерства и женских болезней. - 2007. - Том. LVI, № 3. - С. 65-69.
16. Павлов, Р.В. Использование Ронколейкина в комплексной терапии генитального эндометриоза: Пособие для врачей / С.А. Сельков, Р.В. Павлов, В.А. Аксененко - СПб: Н-Л., 2008. - 83 с.
17. Павлов, Р.В. Применение Ронколейкина в комплексной терапии наружного генитального эндометриоза / Р.В. Павлов, С.А. Сельков // Журнал акушерства и женских болезней. - 2008. - Том. LVII, № 2. - С. 68-72.
18. Павлов, Р.В. Применение Ронколейкина в противорецидивной терапии наружного генитального эндометриоза / Р.В. Павлов, С.А. Сельков, Д.В. Аксененко // Российский иммунологический журнал. - Том 2, № 2-3. - С. 294.
19. Павлов, Р.В. Особенности популяционного состава и функциональной активности клеток перитонеальной жидкости у женщин с наружным генитальным эндометриозом / Р.В. Павлов, С.А. Сельков // Журнал акушерства и женских болезней. - 2008. - Том. LVII, № 3. - С. 67-71.
20. Павлов, Р.В. Использование Ронколейкина в комплексной терапии бесплодия, ассоциированного с наружным генитальным эндометриозом / Р.В. Павлов, Д.В. Аксененко, Д.Б. Куртвили // Проблемы репродукции. - 2009. - Специальный выпуск. - С. 286-287.
21. Павлов, Р.В. Использование Реаферона в комплексной терапии бесплодия, ассоциированного с наружным генитальным эндометриозом / Р.В. Павлов, Д.Б. Куртвили // Проблемы репродукции. - 2009. - Специальный выпуск. - С. 287-288.

   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине