Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
ИЛЬИНА Елена Леонидовна
КЛЕТОЧНЫЕ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ИНИЦИАЦИИ БОКОВЫХ КОРНЕЙ У КАБАЧКА (Cucurbita pepo L.)
03.01.05 - физиология и биохимия растений
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
СанктПетербург - 2012
Работа выполнена в лаборатории анатомии и морфологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Ботанический институт им. В.Л. Комарова Российской академии наук Научный руководитель кандидат биологических наук Демченко Кирилл Николаевич Официальные оппоненты Шишова Мария Фёдоровна доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургский Государственный университет, профессор Цыганов Виктор Евгеньевич кандидат биологических наук, ГНУ ВНИИ Сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук, заведующий лабораторией Ведущая организация Государственное научное учреждение Агрофизический научно-исследовательский институт Российской академии сельскохозяйственных наук
Защита состоится л30 мая 2012 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 002.211.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Ботанический институт им. В.Л. Комарова Российской академии наук по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 2. Тел./Факс (812) 346-36-43. yudina_bin@mail.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Ботанический институт им. В.Л. Комарова Российской академии наук.
Автореферат разослан л29 апреля 2012 г.
Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук О.С. Юдина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Выяснение закономерностей ветвления тела высших растений, а также выявление клеточных и гормональных механизмов регуляции процессов роста, пролиферации и дифференциации клеток в ходе формирования его тканей является важной и актуальной проблемой современной биологии развития растений. Данная работа посвящена исследованию ключевых событий в инициации подземных органов растений - боковых корней.
Важнейшей функцией корня является обеспечение минерального питания растения. Почва является гетерогенной средой с неравномерным распределением питательных веществ. Необходимость компенсации неравномерности среды приводит к ветвлению главного корня и, впоследствии, к формированию корневой системы.
Выделяют две основные стратегии ветвления главного корня в зависимости от расположения зоны инициации примордиев боковых корней (ПБК) в кончике главного корня. К представителям первой стратегии относят большинство видов однодольных и двудольных травянистых растений, для которых характерна инициация ПБК выше зоны растяжения. Под влиянием стимула неизвестной природы (в качестве такого стимула чаще всего рассматривается фитогормон ауксин) клетки перицикла, вышедшие из митотического цикла в фазе G1 в конце меристемы, возобновляют пролиферацию и участвуют в инициации ПБК (Демченко, Демченко, 2001; Himanen et al., 2002). К представителям второй стратегии относят виды, у которых инициация ПБК происходит в апикальной меристеме главного корня. Такой тип закладки боковых корней характерен для видов семейства Тыквенные (Cucurbitaceae), Гречишные (Polygonaceae) и некоторых водных растений (Гуляев, 1964; O'Dell, Foard, 1969; Mallory et al., 1970; Дубровский, 1987; Демченко et al., 2001). В случае данной стратегии при инициации ПБК определение места инициации и инициальных для примордия клеток происходит в системе пролиферирующих клеток апикальной меристемы корня.
Исследования последнего десятилетия структурных, физиологических и молекулярно-генетических механизмов, определяющих ветвление главного корня, проводилось, в основном, на представителе первой стратегии ветвления - модельном объекте генетики развития Arabidopsis thaliana. На этой экспериментальной модели была показана важнейшая роль ауксина в регуляции инициации и развития боковых корней (Reed et al., 1998; Casimiro et al., 2003; Dubrovsky et al., 2008; Laskowski et al., 2008; Fukaki, Tasaka, 2009).
Полученные данные могут быть экстраполированы и на виды семейства злаковые, для которых также характерна инициация ПБК за зоной растяжения (Coudert et al., 2010; Sreevidya et al., 2010). Однако, практически ничего не известно о механизмах, определяющих ветвление корня, у видов с инициацией боковых корней в апикальной меристеме родительского корня.
Вовлечение клеток различных тканей материнского корня (перицикла, эндодермы, коры и т.д.) в инициацию бокового корня в случае обеих стратегий является примером переключения программы их развития. В случае первой стратегии ветвления клетки тканей переходят к инициации примордия на фоне возобновления пролиферации клеток, предположительно, под действием ауксина. При инициации ПБК в апикальной меристеме родительского корня все ещё остаётся неизвестной последовательность наиболее ранних морфогенетических событий, приводящих к формированию примордия.
Несмотря на многочисленные данные о роли ауксина в инициации и формировании боковых корней, остаётся неизученным вопрос, является ли ауксин необходимым и достаточным триггером, определяющим вовлечение клеток перицикла и других тканей в процесс инициации ПБК или для этого необходим другой механизм. Для второй стратегии не изучена гормональная регуляция процесса инициации ПБК: не известно, происходит ли локальное накопление ауксина в отдельных клетках перицикла или иной ткани, приводящее к смене программы развития этой клетки, или осуществляется другое пространственное распределение ауксина. Кроме того, не известно, влияют ли цитокинины на инициацию ПБК в апикальной меристеме родительского корня и не ингибируют ли они данный процесс.
Сравнительное изучение клеточных и физиологических основ инициации боковых корней и формирования корневых меристем de novo у представителей этих двух стратегий позволит выявить универсальные механизмы, обеспечивающие регуляцию клеточного цикла, пролиферации и дифференциации клеток растений.
Цель и задачи работы. Целью данной работы является выяснение клеточных и физиологических механизмов инициации боковых корней в меристеме родительского корня. Для реализации поставленной цели, в качестве модельного растения, у которого инициация и формирование бокового корня происходит в непосредственной близости к кончику корня, был выбран кабачок (Cucurbita pepo L. var. giromontina).
Для достижения поставленной цели исследования решались следующие задачи:
1. Выявить последовательности начальных структурных событий процесса инициации боковых корней в апикальной меристеме главного корня Cucurbita pepo.
2. Провести анализ пролиферативной активности клеток окружающих место инициации примордия бокового корня Cucurbita pepo.
3. Создать технологию получения композитных растений Cucurbita pepo с трансгенными корнями, позволяющими визуализировать локализацию клеточного ответа на ауксин и цитокинины.
4. Изучить распределение клеточного ответа на ауксин и цитокинины в связи с инициацией и развитием боковых корней путём локализации экспрессии репортерных генов под контролем синтетического ауксин-чувствительного промотора DR5 и промотора гена первичного ответа на цитокинины ARR6, соответственно.
5. Определить влияния экзогенного ауксина и блокатора транспорта ауксина на инициацию и развитие боковых корней у Cucurbita pepo.
Научная новизна диссертационной работы. Результаты данной работы вносят существенный вклад в наши знания о клеточных и физиологических механизмах ветвления корневых систем (инициации и развития боковых корней) у высших растений. В ходе выполнения данной работы были впервые выявлены первые анатомические события, приводящие к инициации бокового корня в меристеме родительского, а также показана последовательность вовлечения клеток различных тканей корня в формирование ПБК. Изучена пролиферативная активность клеток окружающих место инициации бокового корня и показано, что инициация ПБК происходит в окружении активно пролиферирующих клеток меристемы родительского корня. Впервые показано распределение максимумов клеточного ответа на ауксин и цитокинины в ходе инициации и формирования бокового корня в меристеме родительского, иллюстрирующее независимость места инициации бокового корня от максимума клеточного ответа на ауксин и при этом необходимость накопления ауксина в клетках примордия для его дальнейшего развития. Предложены новые модели для изучения ветвления корневой системы.
Научно-практическое значение. Результаты данной работы важны для практического использования, поскольку являются теоретической базой для создания основ инновационного сельского хозяйства в Российской Федерации.
Кроме того, результаты данной работы могут быть использованы в материалах курсов лекций Физиология и биохимия растений, а также Генетика развития растений. Созданная в ходе выполнения работы методика получения композитных растений и молекулярные конструкции могут быть использованы широким кругом исследователей для изучения молекулярно-генетических механизмов развития корневой системы.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на:
Международной конференции Modern Microscopy Techniques in Biology and Medicine (Санкт-Петербург, 2009); III Всероссийском симпозиуме Физиология трансгенного растения и фундаментальные вопросы биобезопасности (Москва, 2010); Международной конференции Plant Transformation Technologies II (Вена, Австрия, 2011); VII Съезде Общества физиологов растений России Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий и Международной научной школе Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции (Нижний Новгород, 2011); 7-м Международном Симпозиуме Structure and Function of roots (Novy Smokovec, Словакия, 2011); Второй Международной конференции АСТАНА БИОТЕХ 2011 (Астана, Казахстан, 2011).
Работа выполнена при финансовой поддержке: Российского фонда фундаментальных исследований (11-04-02022); Программ фундаментальных исследований Президиума РАН Биологическое разнообразие и Живая природа: современное состояние и проблемы развития, ФЦП Научные и педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы (П289, 14.740.11.1226), Фонда содействия отечественной науке.
Работа выполнена с использованием научного оборудования Центров коллективного пользования: Клеточные и молекулярные технологии изучения растений и грибов Отделения биологических наук Российской академии наук Ботанического института им. В.Л. Комарова, а также Геномные технологии и клеточная биология ГНУ ВНИИ Сельскохозяйственной микробиологии Отделения земледелия Россельхозакадемии (государственный контракт Министерства образования и науки 16.552.11.7047).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 1 статья в международном рецензируемом научном журнале.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 205 страницах текста, иллюстрирована 41 рисунком (в Приложении) и состоит из введения, глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (243 источника, в т.ч. 222 на иностранных языках).
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Глава I. Обзор литературы В обзоре литературы рассматриваются структурные аспекты и гормональная регуляция инициации ПБК у растений, контрастно различающихся удалением зоны инициации боковых корней от кончика родительского корня. Проанализированы данные о планах первых делений и их дистанции от кончика родительского корня. Рассмотрены факторы, определяющие положение примордия по отношению к группам проводящих тканей (Heidstra et al., 1997; Himanen et al., 2002; Dean et al., 2004). Приведены данные об участии рецептор-подобной протеин-киназы ACR4 в определении положения ПБК относительно окружающих его клеток (De Smet et al., 2008).
Основными фитогормонами, контролирующими инициацию и развитие боковых корней, являются ауксин и цитокинины. Ауксин рассматривается как ключевой фактор, обеспечивающий протекание всех стадий развития бокового корня - от инициации до выхода на поверхность родительского корня (Pret et al., 2009; Overvoorde et al., 2010), а цитокинины - как антагонисты ауксина.
Представлены данные о влиянии экзогенных ауксина и цитокининов на инициацию и развитие ПБК (Lloret, Casero, 2002; Casimiro et al., 2003; De Smet et al., 2006). Описаны механизмы ингибирования цитокининами инициации (Li et al., 2006) и дальнейшего развития ПБК (Laplaze et al., 2007).
Одним из основных и пока нерешённых вопросов является выявление факторов, детерминирующих клетки перицикла к инициации ПБК, поскольку не все клетки перицикла в зоне инициации боковых корней принимают участие в этом процессе. На компетентность клеток перицикла к участию в инициации ПБК влияет их положение в митотическом цикле (Beeckman et al., 2001;
Демченко, Демченко, 2001; Himanen et al., 2002; Casimiro et al., 2003; De Smet et al., 2006), а также отдельные участники белкового аппарата митотического цикла - циклины D-типа (Nieuwland et al., 2009; De Smet et al., 2010; Sanz et al., 2011). Существуют две гипотезы о влиянии ауксина на данный процесс. В соответствии с первой гипотезой накопление ауксина в отдельных клетках перицикла является необходимым и достаточным условием для направления клеток перицикла на путь инициации ПБК (Dubrovsky et al., 2008; Dubrovsky et al., 2011). Согласно второй гипотезе предетерминация группы клеток перицикла происходит в пределах базальной меристемы корня под действием флуктуации уровня ауксина в корне (De Smet et al., 2007) или осциллирующей экспрессии генов (Moreno-Risueno et al., 2010). В качестве независимого механизма инициации бокового корня выделяют механическую стимуляцию и гравитропическую реакцию корня (Ditengou et al., 2008; Laskowski et al., 2008;
Lucas et al., 2008).
В заключительной части обзора литературы рассматриваются данные по агробактериальной трансформации растений (Gelvin, 1990; de la Riva et al., 1998; Shanks, Morgan, 1999; Лутова, 2000). Детально рассмотрены технологии агробактериальной трансформации растений, в частности - представителей семейства Тыквенные - штаммами Agrobacterium rhizogenes (Smarelli et al., 1986; Katavi et al., 1991; Sanit di Toppi et al., 1997; Christey, 2001; Kereszt et al., 2007).
Таким образом, в литературе приведены многообразные данные по различным аспектам инициации и развития ПБК в случае их инициации за зоной растяжения, однако инициация ПБК в апикальной меристеме родительского корня остаётся малоизученной.
Глава II. Материалы и методы исследования Растительный материал и штаммы микроорганизмов. В работе использовали семена кабачка (Cucurbita pepo L. var. giromontina) сорта Белоплодный. Для наработки продуктов лигирования или плазмидной ДНК были использованы лабораторные штаммы Escherichia coli TOP10F, XL1.Blue и DB3.1 (Life Technologies). Для трансформации растений применяли штаммы Agrobacterium rhizogenes R1000 (ГНУ ВНИИСХМ) и MSU440 (Отдел Ботаники, Университет Стокгольма, Швеция), не имеющие устойчивости к антибиотикам.
Векторы и генетические конструкции. Продукты ПЦР клонировали в вектор pJET1.2. (Fermentas, Германия). Для промежуточной стадии клонирования промоторов использовали вектор pBlueScript II KS(+) (Stratagene, США). В качестве векторов GATEWAY-системы клонирования использовали entryвектор pUC18-entry8 (Hornung et al., 2005) и destination-векторы pMDC162-GFP (Dr. Laurent Laplaze (Institut de Recherche pour le Dveloppement, UMR DIADE, Франция) и pKGW-RR-MGW (Dr. Erik Limpens (Wageningen University, Wageningen, Голландия)). Плазмида pBI101.3, содержащая ауксинчувствительный промотор DR5 (Ulmasov et al., 1997), была предоставлена Dr.
Tom J. Guilfoyle (University of Missouri, Columbia, США). Плазмида pBT10, несущая промотор гена первичного ответа на цитокинины ARR6, была предоставлена Dr. Thomas Schmlling (Institute of Biology, Free University of Berlin, Германия).
Получение генетических конструкций для визуализации ответа на ауксин и цитокинины. DR5 амплифицировали на матрице pBI101.3, продукт ПЦР клонировали в векторе pJET1.2, переносили в pBluescript II KS(+) по сайтам EcoRI и далее - в pUC18-entry8 по сайтам рестрикции BamHI и XhoI.
Последовательность ARR6 была вырезана из pBT10 рестриктазами HindIII и XbaI, клонирована в вектор pBluescript II KS(+), а затем - в pUC18-entry8 по сайтам NotI и KpnI. Из вектора pUC18-entry8 промоторы DR5/ARR6 переносили в destination-векторы pKGW-RR-MGW и pMDC162-GFP путём LR-клоназной реакции (Gatewayо LRClonaseЩ II Enzyme Mix, Life Technologies). Наличие вставки DR5::Egfp-gusA, DR5::gusA или ARR6::Egfp-gusA было подтверждено методом ПЦР с праймерами к DR5/ARR6 и gusA; отсутствие замен нуклеотидов в последовательностях промоторов DR5/ARR6 было подтверждено секвенированием.
Агробактериальная трансформация растений штаммами Agrobacterium rhizogenes. Трансформацию 6-дневных проростков кабачка проводили по модифицированному протоколу для Arabidopsis thaliana и Medicago truncatula (Limpens et al., 2004). Использованное в работе сочетание штаммов A.
rhizogenes с векторами приведено в Таблице 1. Контрольные проростки инокулировали стерильной водой или агробактериями, содержащими исходные вектора pMDC162-GFP и pKGW-RR-MGW без вставки промоторов DR5/ARR6.
Ко-трансформированные корни отбирали по флуоресценции белка GFP или DsRED, соответственно, под флуоресцентным стереомикроскопом SteREO Lumar.V12 (Carl Zeiss, Германия) с наборами соответствующих узкополосных фильтров.
Гистохимическое окрашивание на активность -глюкоронидазы. Отрезки ко-трансформированных корней инфильтрировали раствором для GUSокрашивания (буфер TBS (pH 7,2), 1мМ X-Gluc, 0,25 мМ K3Fe(CN)6, 1мМ ЭДТА и 0,2% Твин-20 и Тритон Х-100) и инкубировали при 37oC до тех пор, пока синее окрашивание не становилось заметным (1Ц24 ч).
Таблица 1. Перечень сочетаний штамм-вектор и их использование в работе.
Штамм Вектор Назначение A. rhizogenes Контроль влияния pAtUBQ10 на pKGW-RR-MGW экспрессию Egfp-gusA Изучение клеточного ответа на ауксин;
pKGW-RR-MGW-DR5 оценка эффективности трансформации штаммом R10R10pKGW-RR-MGWИзучение клеточного ответа на цитокинины ARRpMDC162-GFP Контроль влияния p35S на экспрессию gusA Не использовали на заключительном этапе pMDC162-GFP-DRработы pKGW-RR-MGW- Оценка эффективности трансформации MSU4DR5 штаммом MSU4Методы микроскопии и пробоподготовки. Материал фиксировали в альдегидном фиксаторе (Stumpe et al., 2006) в течение 16Ц18 ч при +4оС, промывали буфером (15 мМ PIPES, 1,5мМ MgSO4, 1,5мМ ЭГТА) и обезвоживали в последовательных сменах этанола. Материал заключали в воск Стидмана или гистологическую смолу Technovit 7100. Продольные и поперечные срезы кончиков корней получали на автоматическом ротационном микротоме НМ360 (Microm, Германия). Препараты анализировали с использованием флуоресцентного микроскопа AxioImager.Z1, оснащенного цифровой камерой AxioCam MRc5 (Carl Zeiss, Германия).
Введение предшественника синтеза ДНК в проростки кабачка. Для изучения распределения синтезирующих ДНК клеток 6-дневные проростки кабачка подвергали импульсной инкубации с предшественником синтеза ДНК - 2-этинил-5-дезоксиуридином (50 мкМ, EdU) в течение 30 мин. Для определения сайта инокуляции агробактериями инкубацию 6-дневных проростков с EdU (100 мкМ) проводили в течение 4 ч.
Обработка проростков кабачка экзогенным ауксином или блокатором транспорта ауксина. Трехдневные проростки кабачка помещали в аэрируемую гидропонную культуру на среде Хоагланда с различными концентрациями синтетического ауксина нафтилуксусной кислоты (10 нМ, 25 нМ, 50 нМ) или ингибитора активного транспорта ауксина 1-нафтоксиуксусной кислоты (мкМ, 25 мкМ и 50 мкМ). Контрольные растения выращивали в гидропонной культуре без добавления фармакологических агентов. Через 96 ч корни растений фиксировали в фиксаторе Навашина. Для определения индекса инициации боковых корней (индекс ИБК, Dubrovsky et al., 2009) проводили подсчет числа клеток трех наружных слоев коры между примордиями на продольных (30-50 мкм) срезах кончиков корней, полученных на микротоме с вибрирующим лезвием HM-650V (Microm, Германия).
Статистические методы и компьютерные программы. Для статистической обработки данных и построения графиков использовали программы Sigma Plot v.12 (Systat Software Inc., США). Достоверность различия параметров между опытными группами и контролем производили с использованием однофакторного анализа ANOVA (P < 0.001) в модификации для неравных групп. Для обработки изображений использовали программное обеспечение AxioVision 4.8.2 и ZEN2011 (Carl Zeiss, Германия), а также Adobe Photoshop CS5.
Глава III. Результаты исследования 1. Изучение планов первых делений примордия бокового корня Cucurbita pepo и их удаления от инициальных клеток рядов В работе изучены корни трёх типов, различающихся по происхождению:
главные корни проростков дикого типа; ко-трансформированные корни (DR5::gfp-gusA), образующиеся при агробактериальной трансформации; и придаточные корни контрольных растений, инокулированных водой (Рис. 1А).
Анатомическое строение корней этих типов было единообразно. Прослеживали планы делений в рядах перицикла и эндодермы от инициальных клеток рядов до первого видимого ПБК. Выявлено, что первыми анатомическими событиями, приводящими к инициации ПБК, являются равные периклинальные деления в двух рядах клеток перицикла напротив рядов протоксилемы.
Наиболее ранние периклинальные деления обнаружены нами в наружном ряду перицикла (Рис. 1Г). Для всех типов корней результаты самых ранних периклинальных делений были отмечены на удалении 350Ц600 мкм. На удалении 150Ц200 мкм от места первого периклинального деления происходили вторые периклинальные деления, как правило, в клетках внешнего ряда перицикла (Рис. 1Б). На данной стадии ряды клеток эндодермы и внутренней коры не участвовали в формировании ПБК (Рис. 1Д). В начале зоны растяжения происходили периклинальные деления прилегающих клеток эндодермы и вовлечение их в формирование структуры ПБК (Рис. 1Е). Ещё позднее антиклинальными делениями начиналось вовлечение внутренних рядов коры в формирование структуры примордия (Рис. 1Е).
2. Распределение ДНК-синтезирующих клеток в зоне первого периклинального деления в главном корне Cucurbita pepo На протяжении апикальной меристемы родительского корня большинство клеток внешнего и внутреннего рядов перицикла, не принимавших участия в инициации ПБК, а также клетки стелярной паренхимы и эндодермы - проходили S-фазу митотического цикла (включали EdU) (Рис.
1В). На удалении 500 мкм от инициалей рядов в трёх внутренних рядах коры были отмечены единичные клетки, включившие EdU. В начале зоны растяжения синтез ДНК происходит только в клетках примордия бокового корня и в непосредственно примыкающих к нему клетках перицикла, эндодермы, стелярной паренхимы. В этом участке ПБК уже сформирован за счёт пролиферации клеток перицикла и вовлечения клеток эндодермы.
3. Создание модельных композитных растений Cucurbita pepo для визуализации ответа на ауксин и цитокинины 3.1. Создание генетических конструкций для визуализации ответа на ауксин и цитокинины Для визуализации ответа на ауксин были созданы конструкции на базе векторов pKGW-RR-MGW и pMDC162-GFP: pKGW-RR-MGW-DR5 и pMDC162-GFP-DR5, соответственно (Рис. 2Н). Оба типа конструкций содержали ауксин-чувствительный промотор DR5 (Ulmasov et al., 1997). Для визуализации ответа на цитокинины была создана конструкция pKGW-RRMGW-ARR6 на базе вектора pKGW-RR-MGW. Конструкция включала промотор гена первичного ответа на цитокинины ARR6 (D'Agostino et al., 2000).
3.2. Выбор участка проростка кабачка для инокуляции агробактериями Для выявления сегментов проростка, удобных для инокуляции агробактериями, анализировали распределение пролиферирующих клеток в различных участках проростка кабачка на продольных срезах. Значительная часть клеток стелярной паренхимы, перицикла и внутренних рядов коры нижнего сегмента гипокотиля проходили S-фазу клеточного цикла, в то время как в клетках наружных рядов коры были обнаружены единичные клетки, включивших метку EdU. Наличие большого числа синтезирующих ДНК клеток в зоне предполагаемой инфекции рассматривалось нами как подтверждение того, что нижний сегмент гипокотиля подходит для инокуляции агробактериями.
3.3. Получение композитных растений кабачка путём агробактериальной трансформации штаммами Agrobacterium rhizogenes Адаптированная методика получения композитных растений кабачка включала несколько стадий. Семена кабачка проращивали в культуре in vitro (Рис. 2А). Для инокуляции использовали 6-дневые асептические проростки с гипокотилем длиной 1,5-2,5 см. У проростков удаляли главный корень в области корневой шейки и инокулировали место среза биомассой A. rhizogenes (штаммы R1000 или MSU440), содержащей одну из полученных или исходных генетических конструкций, или водой в контроле (Материалы и методы, Таблица 1). Проводили совместную культивацию апикальных эксплантов с агробактериями при температуре, оптимальной для переноса Т-ДНК (21оС) в течение 5 суток (Рис. 2Б). Агробактерии элиминировали на среде MS, содержащей антибиотик цефотаксим и нитрат серебра в качестве антисептика.
Растения культивировали в течение 4-6 суток при оптимальной для выращивания кабачка температуре (25оС). Укоренившиеся композитные растения высаживали в вермикулит, пропитанный средой Хоагланда. По мере роста корней растения извлекали, отбирали ко-трансформированные корни по флуоресценции скрининговых белков DsRED1/GFP и возвращали в вермикулит. Как правило, растения выращивали в течение 4Ц5 недель, что позволяло набрать достаточную выборку корней для эксперимента.
3.4. Фенотип композитных растений кабачка и ко-трансформированных корней На 7 сутки после инокуляции проростков кабачка агробактериями общий вид трансформантов и контрольных растений, инокулированных водой, не отличался, за исключением небольшого каллуса, сформировавшегося в основании гипокотиля трансформантов (Рис. 2В). Через 10 суток после инокуляции у трансформантов и у контрольных растений, инокулированных водой, начинали развиваться придаточные корни (Рис. 2Д, Е). Композитные и контрольные растения кабачка через три недели после инокуляции выглядели как 2-недельные растения дикого типа (Рис. 2 Г). На этой стадии у трансформантов каллус в основании гипокотиля увеличивался в размерах и из него развивались первые ко-трансформированные корни, экспрессирующие DsRED1 (AtUbq10::DsRED1) или GFP (35S::gfp). Ко-трансформированные корни морфологически не отличались от придаточных корней, развивавшихся на контрольных растениях, инокулированных водой (Рис. 2З, И), что было подтверждено статистически достоверным отсутствием различий в значениях индекса ИБК, определённым для обоих типов корней. У DsRED1положительных корней, несущих конструкцию DR5::Egfp-gusA, наблюдали ответ на ауксин по флуоресценции белка GFP (Рис. 2К, Л, М). Придаточные корни, сформировавшиеся у контрольных растений в базальной части гипокотиля, не демонстрировали флуоресценцию скрининговых белков DsRED1 или GFP (Рис. 2З, И).
3.5. Подтверждение вставки Т-ДНК используемых генетических конструкций в геномную ДНК корней кабачка методом ПЦР ПЦР проводили на матрице общей ДНК из DsRED1-положительных корней и нефлуоресцирующих контрольных корней. Пригодность выделенной геномной ДНК для анализа подтвердили ПЦР с праймерами к гену убиквитина, в результате которой было амплифицировано несколько ПЦР-продуктов ожидаемого веса. В результате амплификации с праймерами DR5/Ec_GUS во всех пробах (растения, трансформированные pKGW-RR-MGW-DR5) образовывался ПЦР-продукт ожидаемой молекулярной массы (1115 п.о.). В результате амплификации с праймерами ARR6/Ec_GUS во всех пробах (растения, трансформированные pKGW-RR-MGW-ARR6) образовывался ПЦРпродукт ожидаемой молекулярной массы (1865 п.о.). При проведении ПЦР с праймерами DR5/ARR6 и Ec_GUS на матрице ДНК, выделенной из контрольных придаточных корней (отрицательный контроль), амплификат не образовывался. При ПЦР с праймерами к virC локусу Ri/Ti плазмиды (Sawada et al., 1995) на матрице ДНК из корней ПЦР-продукт не нарабатывался, что подтверждает отсутствие контаминации агробактериальной ДНК образцов геномной ДНК из ко-трансформированных и контрольных корней кабачка.
3.6. Изучение эффективности трансформации кабачка штаммами R1000 и MSU440 Agrobacterium rhizogenes Эффективность трансформации для штамма R1000 была выше по сравнению со штаммом MSU440. При трансформации штаммом R1000 доля трансформированных растений составила 85% (n=35), а в случае MSU440 - только 33% (n=20). В среднем, на каждом растении, инокулированном штаммом R1000, развивалось 6 (6.4 0.85) трансгенных корней, а в случае MSU440 - 2-3 корня (2.7 0.54). Соотношение числа трансгенных корней к общему числу развившихся придаточных корней также было выше при трансформации штаммом R1000 по сравнению с MSU440 (23% и 8% соответственно) (Рис. 2 Ж).
3.7. Изучение влияния промоторов AtUbq10 и 35SCaMV на экспрессию репортерных генов У 80% корней, несущих Т-ДНК вектора pMDC162-GFP (35S::gfp, gusA без промотора) было отмечено яркое окрашивание во всех тканях корня или только в центральном цилиндре. DsRED1-положительные корни, содержащие Т-ДНК вектора pKGW-RR-MGW (AtUbq10::DsRED1 и gfp-gusA без промотора), в 90% случаев остались неокрашенными и только приблизительно 10% корней продемонстрировали небольшое окрашивание в центральном цилиндре. На основании полученных данных для дальнейших исследований использовали только вектор pKGW-RR-MGW, поскольку в пределах Т-ДНК вектора промотор гена убиквитина не оказывал влияния на экспрессию репортерной части.
Рисунок 1. Последовательность клеточных событий при инициации и развитии ПБК в кончике родительского корня кабачка.
А. Общий вид продольных срезов кончиков корней Cucurbita pepo, различающихся по происхождению (главный корень у дикого типа, контрольный придаточный, котрансформированный (DR5::Egfp-gusA)). Б. Ряды перицикла с формирующимися примордиями (400 мкм от инициалей). Белая стрелка - первое периклинальное деление в наружном ряде перицикла, чёрная стрелка - периклинальные деления в нескольких клетках внутреннего и наружного ряда перицикла, формирующие ПБК.
В. Распределение синтезирующих ДНК и делящихся клеток (500 мкм от инициалей).
Г. Первое завершенное периклинальное деление в наружном ряду перицикла (4мкм от инициалей). Д. Вторые периклинальные деления во внешнем ряду перицикла, связанные с инициацией ПБК на удалении 700 мкм от инициалей перицикла.
Е. Вовлечение клеток коры в формирование структуры ПБК в начале зоны растяжения. Масштабная линейка: А - 200 мкм; Б, Д - 20 мкм; Г - 10 мкм; В - мкм; Е - 50 мкм.
Рисунок 2. Адаптация методики получения композитных растений кабачка.
А. Проращивание семян кабачка на водном агаре. Б. Ко-культивация инокулированных проростков с агробактериями. В. Развитие каллуса (стрелка) в месте инокуляции на 7 ДПИ. Г. Общий вид композитных растений на 21 ДПИ (стрелка - каллус в основании гипокотиля). Д, Е. Общий вид эксплантов на 10 ДПИ:
контрольных (Д) и трансформантов (Е). Ж. Сравнение эффективности трансформации штаммами R1000 и MSU440 A. rhizogenes. З, И. Котрансформированный (AtUbq10::DsRED1; DR5::Egfp-gusA) и контрольный (стрелка) корни. З - светлопольная микроскопия, И - флуоресценция DsRED1 в трансгенном корне, отсутствие свечения в контрольном корне. КЦМ. Общий вид кончика котрансформированного корня (AtUbq10::DsRED1, DR5::Egfp-gusA). К - светлопольная микроскопия, Л - флуоресценция белка DsRED1, М - распределение ответа на ауксин по флуоресценции белка GFP (чёрная стрелка - максимум ответа на ауксин в чехлике и зоне инициалей рядов клеток, белая стрелка - максимум ответа на ауксин в ПБК).
Н. Схема вектора pKGW-RR-MGW-DR5 (AtUbq10::DsRED, DR5::Egfp-gusA).
Масштабная линейка: А, Г - 2 см; Б, В, Д, Е - 1см; 3, И - 3 мм; К, Л, М - 1 мм. ДПИ - день после инокуляции агробактериями.
Рисунок 3. Распределение ответа на ауксин в ко-трансформированном (DR5::Egfp-gusA) корне кабачка при инициации и развитии ПБК.
А. Общий вид распределения ответа на ауксин в кончике корня кабачка. Б. Максимум ответа на ауксин в чехлике, зоне инициалей рядов клеток и ПБК. В. Повышение уровня клеточного ответа на ауксин в зоне первого периклинального деления во внешнем ряду перицикла на удалении 500 мкм от инициалей перицикла.
Г. Вовлечение группы клеток перицикла и эндодермы в инициацию ПБК (контур).
Д. Распределение ответа на ауксин в секторе закладки примордия в ходе периклинальных делений клеток перицикла и эндодермы (600 мкм от инициалей перицикла). Е. Локализация максимума ответа на ауксин в апикальной части примордия и в клетках коры родительского корня (стрелка) в зоне растяжения, на удалении 1300 мкм от инициалей перицикла.
Масштабная линейка: А - 1 мм, Б - 500 мкм; В, Г - 10 мкм; Д, Е - 50 мкм.
Ж З 11* * * * * контроль 10 нМ НУК 50 нМ НУК 50 мкМ 1-НОК 50 нМ НУК 25 нМ НУК контроль 25 мкМ 1-НОК 10 нМ НУК 50 мкМ 1-НОК 25 нМ НУК 25 мкМ 1-НОК Рисунок 4. Влияние экзогенного ауксина И (НУК) и блокатора активного индекс ИБК для 1 слоя коры транспорта ауксина (1-НОК) на индекс ИБК для 2 слоя коры индекс ИБК для 3 слоя коры инициацию и развитие ПБК у кабачка.
А. Общий вид кончика контрольного корня проростка, не обработанного НУК или 1-НОК.
Корневая система проростка в результате экспозиции с 25 нМ НУК (Б), 50 нМ НУК (В- Г), 5 мкМ 1-НОК (Д), 25 мкМ 1-НОК (Е).
10 нМ НУК 50 нМ НУК 50 мкМ 1-НОК контроль Г. Появление дополнительных ПБК на 25 нМ НУК 25 мкМ 1-НОК главном корне проростка вне акропетальной серии при экспозиции с 50 нМ НУК (стрелка);
кора удалена. Ж. Изменение прироста длины главного корня после воздействия НУК или 1-НОК. З. Среднее число боковых корней на главном корне после воздействия НУК или 1-НОК. Л. Индекс инициации боковых корней после воздействия НУК или 1-НОК. Время экспозиции - 4 суток.
Концентрации: НУК - 10нМ, 25нМ, 50 нМ; 1-НОК - 5 мкМ, 25 мкМ, 50 мкМ.
Достоверно значимые различия между экспериментальной группой и контролем обозначены звездочкой (однофакторный анализ ANOVA (P = <0.001)). Масштабная линейка: А - 5 мм; Б, Д, Е - 2 мм; В - 1,5 мм; Г - 7 мм.
Прирост корня, мм Количество боковых корней, шт.
Индекс инициации боковых корней 4. Распределение ответа на ауксин и цитокинины при инициации и развитии примордия бокового корня Cucurbita pepo 4.1. Анализ распределения ответа на ауксин при инициации и развитии примордиев бокового корня в тканях ко-трансформированных корней кабачка (DR5::gfp-gusA) При анализе распределения ответа на ауксин в корне максимум ответа на ауксин был выявлен в чехлике и в области инициалей рядов клеток. На расстоянии 2 мм от кончика корня наблюдались локальные максимумы ответа на ауксин в подошедших к поверхности родительского корня ПБК. (Рис. 3А).
При окрашивании на активность GUS контрольных корней (возникших у инокулированных водой растений, либо несущих Т-ДНК вектора без целевой вставки) не было отмечено образования индиго. При прижизненном анализе распределения флуоресценции репортерного белка GFP была получена сходная картина: максимум ответа на ауксин локализовался в кончике корня и в развивающихся примордиях (Рис. 2М). По результатам иммунолокализации распределение GFP и -глюкуронидазы в пределах апикальной меристемы было идентичным (оба репортерных белка локализовались в колумелле чехлика и в области инициалей рядов клеток), что совпадало с результатами GUSокрашивания и флуоресценцией GFP. Для дальнейшего изучения ответа на ауксин применяли только GUS-окрашивание, позволяющее выявить локализацию даже слабого клеточного ответа на ауксин.
На продольных срезах (50 мкм) ко-трансформированного корня (DR5::gfp-gusA) максимум ответа на ауксин имелся в чехлике, в области инициалей рядов клеток и в центральном цилиндре на протяжении примерно 500 мкм от инициалей рядов клеток. На этом же удалении находился первый визуально детектируемый локальный максимум ответа на ауксин, связанный с развитием ПБК (Рис. 3Б).
Детальное изучение распределения ответа на ауксин было проведено на продольных и поперечных срезах кончиков ко-трансформированных корней кабачка толщиной 7 и 10 мкм соответственно. На удалении 350-500 мкм от инициалей рядов были обнаружены завершившиеся периклинальные деления в клетках наружного ряда перицикла (Рис. 3В). В клетках перицикла, образовавшихся в результате периклинальных делений, а также в соседних клетках обоих рядов перицикла, в прилегающих к ПБК клетках эндодермы, стелярной паренхимы и протоксилемы - наблюдали наиболее сильный ответ на ауксин (Рис. 3В, Г). Нами не было выявлено локального накопления ответа на ауксин в клетках, локализованных ближе к инициалям рядов клеток, и предваряющего первые периклинальные деления.
На протяжении участка 500Ц1000 мкм от инициалей рядов клеток происходило несколько раундов последовательных антиклинальных и периклинальных делений в клетках перицикла и эндодермы, формирующих ПБК. На этой стадии ответ на ауксин наблюдался во всех клетках, вовлечённых в формирование развивающегося примордия, а также в тканях центрального цилиндра: в клетках прото- и метаксилемы и стелярной паренхимы (Рис. 3Д).
В зоне растяжения родительского корня после вовлечения нескольких рядов коры в развитие ПБК, максимум ответа на ауксин смещался в апикальную часть ПБК. Также ответ на ауксин наблюдался напротив кончика развивающегося ПБК в клетках наружных слоев коры, которые будут позднее подвергаться сминанию при выходе ПБК из родительского корня (Рис. 3Е). В конце зоны растяжения (3 мм от инициалей рядов), ПБК подходил к поверхности родительского корня. На этом этапе развития локальный максимум клеточного ответа на ауксин наблюдался в самых апикальных клетках примордия.
После формирования зоны инициалей и настоящего чехлика, в боковом корне наблюдалось такое же распределение ответа на ауксин, как и в родительском корне, с максимумом в чехлике, в зоне инициалей рядов клеток и в ПБК второго порядка.
4.2. Анализ распределения ответа на цитокинины при инициации и развитии примордиев бокового корня в тканях ко-трансформированных корней кабачка (ARR6::gfp-gusA) В масштабе целого корня и на продольных срезах кончика корня (7 мкм) максимум ответа на цитокинины локализовался в дистальной и латеральной частях чехлика и в зоне инициалей рядов клеток. Также ответ на цитокинины детектировался в центральном цилиндре на протяжении 400 мкм, начиная от инициалей рядов клеток. Локальные максимумы ответа на цитокинины при инициации ПБК и на ранних стадиях его развития отсутствовали. Локальный ответ на цитокинины выявлен в клетках коры родительского корня, сдавливаемых выходящим боковым корнем. Вскоре после выхода бокового корня из тканей родительского в новой меристеме корня устанавливалось характерное для меристемы родительского корня распределение цитокининов.
5. Влияние экзогенного ауксина и блокатора транспорта ауксина на инициацию и развитие примордиев бокового корня Cucurbita pepo 5.1. Влияние экзогенного ауксина нафтилуксусной кислоты (НУК) на инициацию и развитие примордиев бокового корня кабачка Общий вид корневых систем проростков, подвергшихся экспозиции с НУК, отличался меньшей длиной главного и боковых корней, а также увеличением плотности боковых корней. У контрольных корней такие изменения не наблюдались (Рис. 4А, Б, В). При 50 нМ НУК у 37% проростков появлялись дополнительные серии ПБК, закладывающиеся между уже вышедшими на поверхность боковыми корнями (Рис. 4Г). Величина прироста главного корня проростка кабачка снижалась в зависимости от концентрации НУК. При воздействии 10 нМ НУК прирост снижался более чем в 2 раза по сравнению с приростом в контрольной группе. При воздействии 25 нМ и 50 нМ НУК величина прироста снижалась более чем в 4 раза (Рис. 4Ж). Общее число боковых корней при воздействии НУК статистически достоверно не отличалось от контрольной группы и не зависело от применённой концентрации НУК (нМ, 25 нМ, 50 нМ) (Рис. 4З). Плотность боковых корней возрастала с повышением концентрации НУК.
5.2. Влияние блокатора транспорта ауксина 1-нафтоксиуксусной кислоты (1-НОК) на инициацию и развитие примордиев бокового корня кабачка При воздействии 5 мкМ 1-НОК величина прироста главного корня не изменялась, однако в среднем на 2 см увеличивалось удаление первого, вышедшего на поверхность бокового корня от кончика главного корня (Рис. 4Д, Ж). При воздействии 25 мкМ 1-НОК величина прироста статистически достоверно снижалась. 25 мкМ 1-НОК ингибировала выход ПБК на поверхность корня, за исключением ПБК, заложившихся до обработки 1-НОК (Рис. 4Е, Ж). При воздействии 50 мкм 1-НОК наблюдалось снижение прироста главного корня примерно в 4 раза по сравнению с приростом в контрольной группе (Рис. 4Ж); все боковые корни останавливались на стадии примордиев и не выходили из тканей родительского корня. Общее число боковых корней при воздействии 1-НОК статистически достоверно не отличалось от контрольной группы и не зависело от применённой концентрации 1-НОК (25 мкМ, 50 мкМ) (Рис. 4З). Плотность боковых корней возрастала пропорционально повышению концентрации 1-НОК.
5.3. Оценка частоты индекса инициации боковых корней (ИБК) при воздействии экзогенного ауксина или блокатора транспорта ауксина Для оценки изменения частоты инициации боковых корней при воздействии на корни НУК и 1-НОК, была определена величина индекса ИБК (Рис. 4И). Индекс ИБК рассчитывался как число примордиев на 100 клеток коры для каждого из трёх внешних слоёв коры, не участвующих в инициации примордиев боковых корней. Статистически значимых различий индекса ИБК при расчёте для каждого из этих слоёв коры не было выявлено. Значения индекса ИБК для корней, обработанных НУК и 1-НОК, достоверно не отличались от значений индекса ИБК для контрольной группы.
Глава IV. Обсуждение результатов 1. Анализ первых анатомических событий, ведущих к инициации примордия бокового корня кабачка Антиклинальные деления клеток перицикла и эндодермы при инициации ПБК были обнаружены у большинства представителей первой стратегии инициации ПБК (на значительном удалении от кончика корня) (Van Tieghem, Douliot, 1889; McCully, 1975; Blakely et al., 1982; Lloret et al., 1989). У представителей второй стратегии план первых делений, приводящих к инициации ПБК, остаётся малоизученным. В нашей работе мы показали, что инициация ПБК у кабачка начинается с периклинальных делений в клетках перицикла на удалении 350-500 мкм от инициалей перицикла.
Представлялось необходимым выяснить для Cucurbita pepo, относится ли расположение места инициации ПБК к апикальной меристеме родительского корня кабачка. Апикальная меристема корня является ростовой зоной, для которой характерна постоянная скорость роста клеток и сто процентный пул пролиферирующих клеток (Иванов, 1974; Иванов, 1987). На основании анализа изменения длины клеток трёх наружных рядов коры Демченко с соавторами (2001) показали, что длина апикальной меристемы корня у кабачка составляет 1,0-1,2 мм. В зоне инициации ПБК клетки стелярной паренхимы, перицикла и внутренних рядов коры активно пролиферировали, что подтверждалось включением предшественника синтеза ДНК и фигурами митоза. Совокупность этих данных подтверждает, что инициация бокового корня у Cucurbita pepo происходит в апикальной меристеме родительского корня.
Поиск первых анатомических событий по инициации ПБК часто бывает затруднён из-за отсутствия чётких морфологических признаков, свидетельствующих об изменении программы развития клеток перицикла/эндодермы и их вовлечения в инициацию бокового корня. Первым достоверным свидетельством участия группы клеток в инициации ПБК является изменение плана деления клетки или его симметричности. По нашим данным, при инициации ПБК у кабачка происходит смена плана деления клеток перицикла с антиклинального на периклинальный, хотя у большинства видов при инициации бокового корня происходят антиклинальные деления в клетках перицикла (Charlton, 1991; Lloret, Casero, 2002). Возможно, антиклинальные деления, особенно неравные, необходимы при инициации ПБК за зоной растяжения, где клетки перицикла имеют значительную длину. Инициация ПБК в апикальной меристеме, т.е. в зоне, где клетки имеют относительно небольшие размеры, может начинаться как с антиклинальных, так и с периклинальных делений. Антиклинальные деления показаны при инициации ПБК у Ipomoea purpurea (Seago, 1973), а периклинальные деления обнаружены нами у Cucurbita pepo.
Как показано для Triticum aestivum, инициация ПБК за зоной растяжения происходит на фоне последовательного возобновления пролиферации клеток стелярной паренхимы и перицикла, вышедших из митотического цикла в Gфазе в базальной части меристемы (Демченко, Демченко, 2001). В апикальной меристеме корня Cucurbita pepo инициация ПБК происходит в системе пролиферирующих клеток, которые никогда не выходили из цикла.
2. Адаптация протокола получения композитных растений кабачка путём агробактериальной трансформации штаммами Agrobacterium rhizogenes В результате проведённой работы для Cucurbita pepo была адаптирована методика агробактериальной трансформации штаммами Agrobacterium rhizogenes, позволяющая воспроизводимо получать композитные растения кабачка. Композитные растения кабачка состоят из надземной части дикого типа и различающихся по генетическому статусу корней: котрансформированных, химерных и придаточных. Чтобы отобрать корни, прошедшие ко-трансформацию и содержащие целевую вставку Т-ДНК, нужна надёжная система скрининга. Антибиотики и гербициды не позволяют провести эффективный отбор между трансгенными и химерными корнями. Для отбора трансгенного материала мы использовали флуоресценцию белка DsRED1 (Limpens et al., 2004). Мы не выявили автофлуоресценции тканей корня кабачка в красной области спектра, которая могла бы искажать результаты отбора. Ко-трансформированные корни по морфологии и анатомическому строению не отличались от контрольных придаточных корней или корней дикого типа. Статистический анализ не выявил достоверных различий между анализируемыми типами корней по индексу инициации боковых корней, что подтверждает идентичность распределения ПБК в обоих типах корней. Распределение ответа на ауксин было возможно изучать как по флуоресценции GFP, так и по гистохимическому окрашиванию на активность -глюкуронидазы По результатам иммуннолокализации, распределение репортерных белков GFP и -глюкуронидазы в апикальной меристеме родительского корня кабачка было идентично. Выявленное распределение репортерных белков согласовалось с данными по распределению ответа на ауксин в апикальной меристеме корня Arabidopsis thaliana, что позволило нам сделать вывод о корректной работе системы визуализации ответа на ауксин.
Для изучения процессов, регулируемых внешней средой, очень важно правильно подобрать условия культивирования растений. В нашей работе мы использовали мелкозернистый субстрат вермикулит для выращивания композитных растений кабачка. Вермикулит в наибольшей степени имитирует естественную среду обитания корня, обеспечивает достаточную аэрацию и сопротивление частиц среды растущему корню. Таким образом, мы исключили артефакты, связанные с культивированием растений в сугубо искусственной системе.
3. Роль ауксина и цитокининов в инициации и развитии примордиев боковых корней В рамках данной работы были впервые проведены исследования по изучению роли ауксина в инициации и развитии примордиев боковых корней в пределах апикальной меристемы родительского корня. В литературе содержится крайне мало информации о механизмах, обеспечивающих такой тип закладки боковых корней. Мы наблюдали максимум ответа на ауксин в клетках внешнего и внутреннего рядов перицикла, в которых уже завершились периклинальные деления, т.е. уже совершилось первое анатомическое событие при инициации ПБК. Представлялось необходимым выяснить, предваряет ли усиление ответа на ауксин первые деления, приводящие к инициации примордия бокового корня. Мы не обнаружили значительного накопления ответа на ауксин, достоверно отличающегося от фонового уровня ответа на ауксин, в зоне событий, предваряющих первые периклинальные деления при инициации ПБК, на удалении 200-250 мкм от инициалей перицикла.
Известны растения, у которых обработка корней экзогенным ауксином или блокатором транспорта ауксина не влияет на инициацию ПБК, но приводит к изменению роста главного корня (например, Ceratopteris richardii (Hou et al., 2004) и Pontederia cordata (Charlton, 1991)). Однако запуск пролиферации во всех клетках перицикла корня Arabidopsis вызываемый нанесением экзогенного ауксина (Laskowski et al., 1995), и данные об увеличении числа боковых корней у мутантов и трансгенных растений с повышенным уровнем эндогенного ауксина (Klee et al., 1987; Boerjan et al., 1995), свидетельствуют об ауксинзависимой инициации ПБК у тех видов, у которых инициация боковых корней происходит за зоной растяжения (De Smet et al., 2007).
По мнению Dubrovsky и Forde (2012) единственным достоверным критерием, позволяющим оценить изменения непосредственно в инициации боковых корней, является индекс инициации боковых корней (индекс ИБК), предложенный Dubrovsky с соавторами (2009). Изменения индекса ИБК достоверно показывают, влияет ли изучаемый фармакологический агент на инициацию боковых корней или нет. Влияние 1-НОК и НУК на инициацию ПБК оценивали путём статистического анализа различий между значениями индекса ИБК для корней из контрольных и опытных групп.
Подавление активного транспорта эндогенного ауксина экспозицией проростков кабачка с 1-НОК не оказывало влияние на инициацию ПБК. Более того, повышение концентрации ауксина в тканях корня за счёт экспозиции корней с НУК не приводило к изменению частоты инициации боковых корней.
Общее число боковых корней, включая ПБК, также не изменялось при обоих видах воздействия экзогенных агентов, несмотря на закладку дополнительных внеакропетальных ПБК при воздействии 50 нМ НУК.
Таким образом, совокупность данных, свидетельствующих об отсутствии локального видимого повышения ответа на ауксин, предваряющего первые анатомические события по инициации ПБК, и отсутствие влияния экзогенного ауксина или блокатора его активного транспорта непосредственно на инициацию ПБК, позволяют сделать заключение об ауксин-независимой инициации ПБК в родительском корне кабачка.
Согласно полученным нами данным, у кабачка ауксин необходим для протекания всех стадий развития ПБК, следующих за инициацией. Так, при экспозиции с блокатором ауксина 1-НОК заложившиеся ПБК задерживались в развитии и не выходили из тела родительского корня. Ответ на ауксин сначала наблюдался во всех клетках ПБК, а затем происходило смещение максимума ответа на ауксин в апикальную часть ПБК. Сходная картина распределения ответа на ауксин в ходе развития ПБК была описана для Arabidopsis (Benkova et al., 2003). По-видимому, ауксин оказывает комплексное действие на пролиферацию и рост клеток в процессе развития примордия бокового корня.
Данные, касающиеся роли цитокининов в развитии бокового корня, не столь обширны, и зачастую противоречивы. В литературе имеются единичные работы, в которых изучали распределение цитокининов в различных зонах корня. В работе Полевого и Полевого (1992) было показано максимальное накопление цитокининов в кончике корня кукурузы и постепенное снижение по мере удаления от него. Такая же тенденция наблюдалась при иммуногистохимическом выявлении цитокининов в работе Высоцкой с соавторами (2011).
В родительском корне кабачка максимум ответа на цитокинины локализовался в дистальной и латеральной частях чехлика и в зоне инициалей рядов клеток, т.е. в месте биосинтеза данного фитогормона (Letham, 1994), что полностью согласуется с данными литературы. Мы не обнаружили накопления ответа на цитокинин при инициации или в течение развития бокового корня, хотя очевидно, что некоторое количество цитокининов, необходимое для пролиферации клеток примордия, присутствовало, но было недостаточным для индукции экспрессии конструкции ARR6::gusA.
Таким образом, нами получены новые данные о роли фитогормонов - ауксина и цитокининов - в процессах инициации и развития ПБК в апикальной меристеме родительского корня. Распределение повышенного уровня клеточного ответа на цитокинины выявило, что цитокинины не принимают участие в инициации ПБК. Полученные данные о локализации ответа на ауксин в процессе первых инициальных делений в клетках перицикла, а также данные по воздействию экзогенного аналога ауксина и блокатора транспорта эндогенного ауксина свидетельствуют о том, что ауксин не принимает непосредственного участия в ранних событиях инициации ПБК, но при этом необходим для протекания всех последующих стадий развития.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ В процессе проведённых исследований получены новые данные о малоизученных структурных и физиологических основах инициации боковых корней в апикальной меристеме родительского корня кабачка (Cucurbita pepo L.).Впервые показано, что первые деления, приводящие к инициации ПБК в апикальной части меристемы родительского корня, являются периклинальными и происходят во внешнем и внутреннем рядах перицикла (на расстоянии 350500 мкм от инициальных клеток ряда). Установлено, что в зоне первых периклинальных делений, инициирующих развитие ПБК, синтез ДНК и деление клеток происходят не только в перицикле, но и в рядах клеток стелярной паренхимы, эндодермы и коры.
Для большинства видов цветковых растений ауксин и цитокинины являются главными регуляторами инициации ПБК. Для изучения роли этих фитогормонов в инициации и развитии боковых корней у кабачка, впервые была разработана методика получения композитных растений c надземной частью дикого типа и трансгенными корнями. Распределения клеточного ответа на ауксин и цитокинины изучены по флуоресценции репортерного белка GFP или гистохимической активности -глюкуронидазы под контролем синтетического ауксин-чувствительного промотора DR5 или промотора гена первичного ответа на цитокинин ARR6.
Анализ распределения ответа на цитокинины в трансгенных корнях кабачка несущих ARR6::gfp-gusA не выявил существования локальных максимумов клеточного ответа на этот фитогормон в зоне инициации ПБК. На этом основании мы полагаем, что цитокинины не принимают непосредственного участия в инициации ПБК у кабачка.
В нашей работе показано, что локальные максимумы клеточного ответа на ауксин в трансгенных корнях кабачка, несущих DR5::gfp-gusA, наблюдались только после завершения первых периклинальных делений клеток перицикла, инициирующих развитие ПБК. В ходе дальнейшего развития ПБК происходит вовлечение нескольких внутренних слоев коры. Ответ на ауксин наблюдался во всех клетках примордия и в стелярной паренхиме напротив него. В процессе дальнейшего развития ПБК максимум ответа на ауксин смещался в апикальную часть примордия, а также обнаруживался в окружающих его клетках коры родительского корня.
Установлено, что воздействие экзогенного синтетического ауксина (нафтилуксусной кислоты) и блокатора активного транспорта ауксина (1нафтоксиуксусной кислоты) не приводило к изменению индекса инициации боковых корней (Dubrovsky et al., 2009), а также среднего числа формируемых боковых корней. Отсутствие различий индекса инициации боковых корней у контрольных растений и у растений, подвергнутых действию экзогенного ауксина или подавлению активного транспорта ауксина, подтверждает неизменность паттерна инициации боковых корней при изменении активного транспорта и концентрации ауксина в тканях материнского корня.
Совокупность полученных нами данных позволяет заключить, что начальный этап инициации ПБК у кабачка не зависит от локального повышения уровня ауксина (или ответа на него) в клетках, вовлекаемых в этот процесс.
Клеточный ответ на ауксин присутствует во всех клетках, вовлечённых в формирование тела примордия бокового корня, но не наблюдается до момента завершения первых периклинальных делений, инициирующих его развитие.
Вероятно, у кабачка ауксин необходим не для инициации примордия бокового корня, а только для прохождения более поздних стадий его развития.
окальный максимум ответа на ауксин в апикальной части развивающегося примордия бокового корня создаёт условия для становления центробежного осевого вектора роста бокового корня.
Таким образом, в ходе эволюции высших растений так же был сформирован иной тип инициации бокового корня - в меристеме родительского корня с отсутствием зависимости от локальных максимумов ауксина.
Полученные данные вносят новые представления о физиологических механизмах инициации ПБК у представителей альтернативной стратегии ветвления корня с инициацией ПБК в апикальной меристеме родительского корня.
ВЫВОДЫ 1. В меристеме родительского корня кабачка (Cucurbita pepo L.), в участке, где происходит инициация бокового корня, все клетки коры, эндодермы, перицикла и стелярной паренхимы пролиферируют. В рядах перицикла и эндодермы, клетки которых участвуют в инициации боковых корней, пролиферация продолжается и в выше расположенных участках меристемы.
2. Наиболее ранним признаком инициации боковых корней кабачка являются периклинальные деления в клетках двух соседних слоёв перицикла. Вовлечение в формирование примордия клеток эндодермы происходит позже, также периклинальными делениями. Клетки нескольких внутренних слоев коры вовлекаются в формирование примордия за счёт антиклинальных делений.
3. Впервые разработана технология получения композитных растений кабачка, позволяющая визуализировать ответ на ауксин и цитокинины в тканях его корня.
4. Ауксин не участвует на начальных этапах инициации примордия бокового корня кабачка, что подтверждается отсутствием локального повышения клеточного ответа на ауксин, а также отсутствием влияния на этот процесс как повышенных доз экзогенного ауксина, так и блокатора его активного транспорта.
5. Участие ауксина в инициации примордиев боковых корней кабачка начинается только после завершения первых периклинальных делений перицикла, инициирующих формирование примордиев боковых корней.
В ходе вовлечения других тканей корня в развитие примордия в них происходит запуск локального ответа на ауксин.
6. Ингибирование полярного транспорта ауксина не оказывает существенного влияния на определение числа и места инициации примордиев боковых корней, но подавляет выход примордиев на поверхность материнского корня кабачка.
7. При повышении концентрации экзогенного ауксина (НУК) до 50 нМ формируются дополнительные серии боковых корней между уже сформированными ранее в акропетальной серии боковыми корнями.
8. Цитокинины не оказывают определяющего воздействия на инициацию и развитие примордиев боковых корней кабачка. В зоне инициации бокового корня отсутствуют максимумы клеточного ответа на цитокинины.
ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:
1. Ilina E.L., Logachov A.A., Laplaze L., Demchenko N.P., Pawlowski K., Demchenko K.N. Composite Cucurbita pepo L. plants with transgenic roots as a tool to study root development. Annals of Botany (Special Issue on Root Biology). 2012. 109: 1Ц11. doi: 10.1093/aob/MCS086.
Тезисы конференций:
2. Ilina E.L., Logachov A.A., Demchenko N.P., Demchenko K.N.
Agrobacterium rhizogenes mediated transformation of cucurbitaceous as a tool to study root development. 7ht International Symposium on Structure and Function of roots. NovySmokovec, Slovakia, September 5-9, 2011, Copycentrum PACI. 2011. 78-79.
3. Demchenko K.N., Ilina E.L., Demchenko N.P., Logachov A.A. Structural and molecular genetic aspects of lateral root initiation and formation in the main root meristem. 7ht International Symposium on Structure and Function of roots. Novy Smokovec, Slovakia, September 5-9, 2011, Copycentrum PACI.
2011. 44-45.
4. Демченко К.Н., Ильина Е.Л., Демченко Н.П. Пространственная и временная организация функционирования меристем-специфичных генов в ходе инициации латеральных меристем корней растений. Биологическое разнообразие: Генофонды и генетическое разнообразие. Сборник материалов отчетной конференции. Захаров-Гезехус И.А., Кудрявцев А.М. Москва, ИОГен. 2011. 245-248.
5. Ильина Е.Л., Логачёв А.А., Демченко Н.П., Демченко К.Н.
Агробактериальная трансформация тыквенных как подход к изучению физиологических механизмов инициации боковых корней. VII Съезд Общества физиологов растений России Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий и Международная научная школа Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции. Материалы докладов.
Нижний Новгород, Россия. 4-10 июля 2011, Издательство НГУ. 2011. 288289.
6. Ильина Е.Л., Логачёв А.А., Демченко Н.П., Демченко К.Н. Роль ауксина и цитокининов в инициации боковых корней в апикальной меристеме родительского корня. VII Съезд Общества физиологов растений России Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий и Международная научная школа Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции. Материалы докладов. Нижний Новгород, Россия. 4-10 июля 2011, ИздательствоНГУ. 2011. 287-288.
7. Ilina E.L., Demchenko N.P., Demchenko K.N. Agrobacterium rhizogenes mediated transformation of squash (Cucurbita pepo) as a tool to study lateral root development. The International Conference Plant Transformation Technologies II. Vienna, Austria (19-22 February, 2011). 2011. 103.
8. Ильина Е.Л., Демченко Н.П., Демченко К.Н. Трансформация кабачка штаммами Agrobacterium rhizogenes как модель для изучения механизмов инициации боковых корней в апикальной меристеме материнского корня.
III Всероссийский симпозиум Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности, 18-21 октября 2010. Москва. 2010. 51.
9. Ilina E.L., Demchenko K.N. A high-throughput method to study cell proliferation during lateral root initiation in higher plants. International conference Modern Microscopy techniques in Biology and Medicine 9-November 2009 Saint-Petersburg, Saint-Petersburg University. 2009. 61.
Подписано в печать л27 апреля 2012 г. Формат 60х84/Бумага офсетная. Печать офсетная.
Усл. печ. л. 1,6. Тираж 200 экз. Заказ № 3213/дкн Типография Восстания - 1 191036, Санкт-Петербург, ул. Восстания, д. 1.