Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
ФЕДОРОВА АНТОНИНА АЛЕКСАНДРОВНА
ИНАКТИВАЦИЯ ВИРУСОВ ИСКУССТВЕННЫМИ РИБОНУКЛЕАЗАМИ
03.01.04 - биохимия
Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук
Новосибирск - 2012
Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН
Научный консультант:
д.б.н., профессор Зенкова Марина Аркадьевна Научный консультант:
к.б.н. Гончарова Елена Павловна
Официальные оппоненты:
Волчо Константин Петрович, д.х.н.
Новосибирский институт органической химии им. Н. Н. Ворожцова СО РАН, в.н.с.
Булыгин Константин Николаевич, к.х.н.
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, с.н.с.
Ведущая организация:
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии Вектор Роспотребнадзора
Защита состоится л12 октября 2012 г. в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090 Новосибирск, проспект академика Лаврентьева,
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждении науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Автореферат разослан л16 августа 2012 г.
Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент Коваль В. В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В настоящее время проблема поиска новых высокоэффективных препаратов, обладающих широким спектром противовирусной активности, приобретает особую актуальность в связи с развитием у многих вирусов устойчивости к действию применяемых в медицинской практике лекарственных средств, а также их высокой токсичностью. Химические реагенты, обладающие противовирусной активностью, можно разделить на 2 типа: специфические реагенты, оказывающие влияние на какой-либо этап жизнедеятельности вируса и/или избирательно действующие на определенный вирусный компонент (ингибиторы вирусных ферментов и др.), и химические агенты, взаимодействующие с широким спектром типовых компонентов вирусной частицы и вызывающие инактивацию вируса (например, взаимодействие с липидной мембраной или поверхностными белками/гликопротеидами). Реагенты первого типа являются основой современной противовирусной терапии, а их неоспоримым преимуществом является высокий уровень специфичности, проявляемой по отношению к целевым вирусам. Однако их применение часто ограничено вследствие развития у вируса устойчивости к действию данного специфического реагента, что является результатом мутаций, характерных для вирусов некоторых семейств (вирусы гриппа и иммунодефицита человека и др.). Несмотря на успехи современной науки к настоящему моменту эффективные противовирусные средства найдены только против небольшого числа вирусов.
В связи с этим, искусственные рибонуклеазы (низкомолекулярные соединения, способные расщеплять фосфодиэфирные связи в РНК) представляют особый интерес, поскольку, наряду с высокой рибонуклеазной активностью in vitro, они обладают рядом уникальных свойств: а) проявляют высокую противовирусную активность по отношению к вирусу гриппа; б) не токсичны для человека, работают в водных условиях; в) являются низкомолекулярными соединениями и, следовательно, могут обладать возможностью проникать в капсиды вирусов.
Целью настоящей работы являлось исследование механизма противовирусной активности искусственных рибонуклеаз по отношению к вирусам с различной структурой. В ходе исследования решались следующие задачи:
- исследовать противовирусную активность аРНКаз по отношению к безоболочечным РНК-вирусам энцефаломиокардита мышей (EMCV) и острого паралича пчел (ABPV);
- изучить механизм противовирусной активности аРНКаз по отношению к оболочечному РНК-вирусу гриппа, а также EMCV и ABPV;
- исследовать способность аРНКаз взаимодействовать с липидными мембранами и белками;
- оценить вклад рибонуклеазной активности в противовирусную активность аРНКаз.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые установлено, что аРНКазы обладают способностью инактивировать безоболочечные РНК-вирусы ABPV и EMCV. Установлено, что механизм инактивации вирусов заключается в расщеплении их РНК-генома после проникновения аРНКаз в вирусные частицы, при этом морфология капсида безоболочечных вирусов после их инактивации остается неизменной.
Впервые установлено, что аРНКазы инактивируют ДНК-содержащий вирус осповакцины. Показано, что аРНКазы обладают способностью дестабилизировать структуру белковых молекул (хаотропная активность), что обеспечивает проникновение этих соединений в плотные рибонуклеопротеидные комплексы вирусов. Установлено, что аРНКазы обладают способностью взаимодействовать с липидными мембранами, что обеспечивает как их проникновение в вирусные частицы, содержащие мембраны, так и разрушение мембран, приводящее к инактивации вирусов.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты работы представлены на конференциях: Antivirals Congress (Амстердам, Нидерланды 2010); л8th RNase Congress (Неаполь, Италия 2010); Молекулярные основы инфекционных заболеваний (Новосибирск, Россия 2011); Influenza 2011. Zoonotic influenza and human health (Оксфорд, Англия 2011); IUBMB&FEBS Congress (Севилья, Испания 2012).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы.
Работа изложена на 150 страницах, содержит 41 рисунок и 8 таблиц.
Библиография содержит 219 литературных источника.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Искусственные рибонуклеазы, использованные в работе Искусственные рибонуклеазы (аРНКазы) являются синтетическими молекулами (700 - 1300 Да), которые обладают следующими свойствами: а) способны расщеплять фосфодиэфирные связи в РНК in vitro, а геном многих патогенных для человека и животных вирусов (вирусы гриппа, иммунодефицита человека, ящура и др.) представлен в виде РНК; б) не чувствительны к точечным изменениям последовательности РНК; в) расщепляют РНК в физиологических условиях.
В данной работе противовирусную активность исследовали для аРНКаз, проявляющих наибольшую рибонуклеазную активность (синтезированы ранее в лаборатории органического синтеза ИХБФМ СО РАН). Функционально аРНКазы имитируют РНКазу А: с наибольшей скоростью расщепляют РНК по фосфодиэфирным связям в Pyr-A мотивах (5-CЦA-3 и 5-UЦA-3), расположенным в одноцепочечных участках и в районах с лабильной вторичной структурой. По структуре исследованные аРНКазы относятся к трем сериям (Рис. 1):
1) соединения ABL3C3, ABL3C1, R-D-2 и K-D-1 содержат N-замещенный гидрофобным фрагментом остаток 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана (DABCO), обладающий сродством к межнуклеотидным фосфатам РНК, и функциональные группы, способные катализировать расщепление фосфодиэфирных связей в РНК (гистидин в ABL3C3 и ABL3C1; аргинин и глутаминовая кислота в R-D-2; лизин и глутаминовая кислота в K-D-1);
2) соединения серии Dxn (Dtr12, Dp12, D3-12 и Dp12F6) содержат два остатка N-замещенного гидрофобным фрагментом DABCO, соединенные линкерами различной степени жесткости; не содержат функциональных групп, способных катализировать реакцию трансэтерификации;
3) пептидоподобные соединения L2-3 и K-2, состоящие из аминокислот и гидрофобных фрагментов.
ABL3CCl 2Br 2Cl Br Dp12FH + + N + + + + (CH2)C14H29 N N N C6F13(CH2)3 N N N N (CH2)3C6FN O COOH ABL3C1 Cl H Br D3-H 4Cl + + N + + C14H29 N N (CH2)3 N N C12H25 N (CH2)5 N+ N+ C12HO N O H2N H 2Cl DtrBr K-D-1 HO + + + + N N C12HO O C12H25 N N O O 2 Br H + + N C10HC14H29 N N N 2Br N O Dp12 2Cl H H + + + + O H2N NH C12H25 N N N N C12HR-D-O NH L2-HO O 2Br O O O O H + + N C10H21 HO N N O C14H29 N N N H O H H O H H2N N C11H24 NHK-N H2N H O O HO O O O O H HO N N O C10HN H H O NHРис. 1. Структура аРНКаз, использованных в работе (названия указаны в рамочках).
Ранее установлено, что инкубации вируса гриппа с ABL3C3 приводит к его инактивации, а в липидной оболочке вируса происходит образование небольших разрывов, но целостность вирусной частицы сохраняется. В отличие от вируса гриппа, частицы безоболочечных вирусов, не содержащие липидной оболочки, представляют собой плотный рибонуклеопротеидный комплекс, поэтому возможность проникновения химических веществ в них ограничена. Изучение способности аРНКаз инактивировать безоболочечные РНК-вирусы проводили с использованием вирусов острого паралича пчел (ABPV, семейство Dicistroviridae) и энцефаломиокардита мышей (EMCV, семейство Picornaviridae).
2. Противовирусная активность аРНКаз по отношению к ABPV 2.1 In vivo скрининг на модели ABPV/личинки пчел Apis Mellifera Клеточная модель для работы с ABPV отсутствует. Но ранее была разработана методика культивирования личинок пчел in vitro, с использованием которой в настоящей работе оценивали противовирусную активность аРНКаз in vivo: после обработки ABPV аРНКазами проводили инъекции этих препаратов выращенным in vitro личинкам пчел, после чего наблюдали за изменением фенотипа модельных животных.
В течение первых 7 дней жизни личинки пчел увеличивают свой вес с 0.1 до 150 мг, а наиболее быстрое увеличение веса происходит в период с 4 по 7 день (Рис. 2А). Личинки с наименьшей массой собирали из сот и выращивали в течение 4 дней на питательной среде в инкубаторе при 35С (Рис. 2А) до достижения ими массы 40Ц60 мг, при которой особи способны переносить инъекции (1 мкл), производимые в их спинную область с использованием микрокапилляра (Рис. 2Б). После инъекций PBS личинки развивались нормально (Рис. 2В) и внешне не отличались от личинок без инъекции (Рис. 2А). Введение ABPV вызывало гибель особей в течение 24 ч, а цвет их кутикулы менялся на коричнево-черный или молочно-белый (Рис. 2Г).
Рис. 2. Культивирование личинок пчел in vitro. А.
Динамика изменения размера личинок. Б. При массе 40 - 60 мг личинки легко переносят инъекции, производимые микрокапилляром. Личинки через 24 ч п.и. PBS (В) и ABPV (Г).
2.2 Токсичность аРНКаз На первом этапе исследовали токсичность аРНКаз для личинок пчел. Для этого личинкам (8Ц10 особей в группе) вводили раствор аРНКазы в PBS (1 мкл).
Контрольную группу оставляли без инъекций (б.и.), другая группа получала инъекции PBS. Через 24 ч п.и. оценивали фенотип, уровень выживаемости и набор экспрессируемых в гемолимфе личинок белков. Как видно из Таблицы 1, аРНКазы малотоксичны для личинок: уровень их выживаемости после инъекций 0.4 мМ Dp12F6 составил 883% и был сопоставим с выживаемостью личинок п.и.
PBS (957%), а также личинок без инъекции (б.и., 100%). Сходные данные получены для K-D-1, D3-12 и L2-3 (100, 826 и 944, соответственно).
Таблица 1. Выживаемость личинок через 24 ч п.и. растворов аРНКаз.
аРНКаза [аРНКаза], мМ Уровень выживаемости, % Dp12F6 0.4 88D3-12 0.4 82K-D-1 1 1L2-3 1 94PBS - 95б.и. - 12.3 Противовирусная активность аРНКаз по отношению к ABPV ABPV в концентрации 100 LD50/мкл инкубировали in vitro в присутствии одной из аРНКаз (18 ч, 37C) или в отсутствие соединений (контроль), вирусную суспензию разводили в PBS 1:10, и проводили инъекции личинкам (10 LD50, 1вирусных частиц). Выживаемость особей через 24 ч п.и. PBS составила 957%, а после инъекций контрольного ABPV все личинки погибали (Таблица 2).
Три из пяти аРНКаз обладают противовирусным действием (Таблица 2).
Уровень выживаемости личинок через 24 ч п.и. 10 LD50 ABPV, инкубированного с 10 мкМ D3-12 или 4 мкМ Dp12F6, составил 954 и 8919%, соответственно.
Уровень выживаемости личинок через 24 ч п.и. ABPV, предварительно инкубированного с 1 мМ K-D-1, составил 7725%. L2-3 и ABL3C3 не проявляют противовирусную активность по отношению к ABPV (Таблица 2).
Таблица 2. Противовирусная активность аРНКаз по отношению к ABPV.
Инактивация ABPV аРНКаза [аРНКаза], мМ Уровень выживаемости личинок, % Dp12F6 0.004 89 D3-12 0.01 95 K-D-1 1 77 L2-3 1 ABL3C3 0.5 Контроль ABPV - PBS - 95 В дальнейших экспериментах наряду с личинками использовали молодых пчел. Зависимость выживаемости личинок (10 особей в группе) и пчел (20 особей в группе) от концентрации аРНКаз D3-12 и Dp12F6, использованных для инактивации вируса, показана на Рис. 3. Через 24 ч п.и. инкубированного c D3-(>40 мкМ) вируса личинкам (10 LD50) уровень выживаемости особей составил более 90%. При концентрации 1 мкМ D3-12 не обладает противовирусной активностью. Соединение Dp12F6 проявляет противовирусную активность в более широком диапазоне концентраций (Рис. 3): высокий уровень выживаемости наблюдали через 24 ч п.и. 10 LD50 ABPV, инкубированного с 4 мкМ Dp12F6. Сходные результаты получены на пчелах, которым проводили инъекции 100 LD50 ABPV, инкубированного в указанных условиях (Рис. 3).
Фенотип особей после инъекций инактивированного вируса (Рис. 4А, лунки в) совпадал с фенотипом личинок б.и. и п.и. PBS (Рис. 4А, лунки а, б).
Инъекции не полностью инактивированного вируса приводили к проявлению фенотипа у части личинок (Рис. 4А, лунки г), сходного с фенотипом инфицированных особей (Рис. 4А, лунки д-ж), а у других личинок фенотип совпадал с личинками б.и.
Анализ белков, экспрессируемых в гемолимфе личинок, подтвердил отсутствие инфекции в группах, где наблюдали наибольший уровень выживаемости особей (Рис. 4Б, личинки 1, 2). Но набор белков значительно менялся для личинок, которые погибали после инъекции не полностью инактивированного вируса (Рис. 4А, личинки 3, 4): в личинках индуцируется синтез белков, характерных для зараженных ABPV особей (Рис. 4А, личинки 4Ц10).
Рис. 3. Противовирусная активность Dp12F6 и D3-по отношению к ABPV.
ичинок (белые столбики) и пчел (серые столбики) оставляли без инъекций (б.и.), проводили инъекции PBS, ABPV нативного, ABPV, инкубированного без аРНКаз (Контроль ABPV), ABPV, инкубированного с D3-12 или Dp12F6 (18 ч, 37С); - P1 < 0.01; - P1 > 0.05; - P2 < 0.01; - P2 > 0.05, - P3 < 0.01, - P3 > 0.05.
Рис. 4. Эффективность инактивации ABPV аРНКазой Dp12F6. А. Фенотип личинок (группы обозначены буквами) через 24 ч п.и. PBS или ABPV, инкубированного с Dp12F6 (концентрация указана слева) или в отсутствие Dp12F(Контроль ABPV) и личинок без инъекции (б.и.). Б. Анализ набора белков, экспрессируемых в гемолимфе личинок (указаны цифрами в А) п.и. ABPV, инкубированного с аРНКазами. ABPV - положение белков капсида. Положение белков капсида, синтезируемых в инфицированных ABPV личинках показано стрелками. Молекулярные массы референтных белков стандартного размера указаны слева.
3. Противовирусная активность аРНКаз по отношению к EMCV Аналогичные исследования эффективности инактивации безоболочечного РНК-вируса проводили с использованием EMCV. Противовирусное действия аРНКаз оценивали на клеточной модели in vitro: после инкубации EMCV (105Ц108 БОЕ/мл) в присутствии или в отсутствие аРНКаз (37С, 0Ц48 ч) титр вируса определяли методом подсчета количества бляшкообразующих единиц.
Полученные результаты (Таблица 3) хорошо согласуются с данными по инактивации ABPV. Наибольшую активность проявляла аРНКаза Dtr12 (аналог Dp12F6 и D3-12): полную инактивацию наблюдали после инкубации вируса (~106 БОЕ/мл) c 0.05 мМ Dtr12 в течение 48 ч. Другие соединения серии Dxn были менее активны: инкубация EMCV в присутствии Dp12, Dp12F6, D3-12 хотя и приводила к снижению его инфекционности, однако полной инактивации вируса не наблюдали. Инкубация EMCV с 0.5 мМ ABL3C3 не только не приводила к инактивации вируса, но и способствовала сохранению его инфекционности: титр вируса значительно не менялся в течение 96 ч инкубации, в то время, как в контроле происходило его снижение не менее, чем на 3 log10.
Пептидоподобные аРНКазы L2-3 и K-2 показали отсутствие противовирусной активности.
Таблица 3. Противовирусная активность аРНКаз по отношению к EMCV.
Инактивация EMCV аРНКаза IC50, мМ Эффективная Титр вирусной суспензии, концентрация, мМ log10(БОЕ/мл ) ABL3C3 0.08 0.5 60.ABL3C1 0.125 0.5 60.L2-3 > 1 1 50.K-2 > 1 0.5 60.Dtr12 0.025 0.05 Рис. 5. Зависимость кинетики инактивации EMCV от концентрации Dtr12. EMCV инкубировали в присутствии Dtr12 (черные столбики) или в отсутствие соединения (белые столбики) в течение 0Ц72 ч, 37С. 4. Противовирусная активность аРНКаз по отношению к вирусу гриппа Ранее было показано, что аРНКаза ABL3C3 обладает способностью инактивировать вирус гриппа А WSN 33/H1N1 (семейство Orthomyxoviridae). В настоящей работе мы изучили эффективность инактивации вируса под действием аРНКаз Dtr12 и L2-3, а в качестве положительного контроля использовали инактивацию вируса аРНКазой ABL3C3 (Таблица 4). Таблица 4. Противовирусная активность аРНКаз по отношению к вирусу гриппа. Рибонуклеазная Инактивация вируса гриппа А аРНКаза активность in vitro, [аРНКаза], мМ Титр вируса, [аРНКаза], мМ log10(ФОЕ/мл) ABL3C3 0.1 0.4 Для исследования влияния рибонуклеазной активности ABL3C3 на ее противовирусную активность мы изучили зависимость эффективности инактивации вируса гриппа от концентрации соединения и сравнили ее с профилем рибонуклеазной активности соединения. Так, ABL3C3 обладает колоколообразным профилем рибонуклеазной активности in vitro: наибольшая эффективность расщепления модельной РНК (90% за 18 ч) достигается при концентрации 0.1 мМ, но при ее снижении или повышении наблюдается снижение эффективности расщепления РНК (Рис. 6А). Снижение рибонуклеазной активности ABL3C3 при концентрации выше 0.1 мМ объясняется образованием мицеллярных комплексов, однако при концентрации 0.1 мМ соединение не инактивирует вирус гриппа (Рис. 6Б), и его полная инактивация достигается только при концентрации 0.4 мМ. По всей видимости, ABL3C3 обладает ограниченной возможностью проникновения в вирусную частицу, и при необходимой для расщепления фосфодиэфирных связей концентрации (0.1 мМ), оптимальная концентрация аРНКазы вблизи РНК вируса не достигается. Рис. 6. A Зависимость эффективности расщепления РНК in vitro от концентрации ABL3C3. Б Зависимость эффективности инактивации вируса гриппа от концентрации ABL3C3 (18 ч, 37C). 5. Механизм инактивации вирусов аРНКазами Поскольку аРНКазы ABL3C3 и L2-3 не обладают противовирусной активностью в отношении безоболочечных ABPV и EMCV, однако обладают высокой противовирусной активностью по отношению к вирусу гриппа, то можно предположить, что данные соединения либо являются высокоспецифичными по отношению к этому вирусу, либо структурные особенности строения вирусных частиц гриппа (наличие липидной мембраны) вносят главный вклад в их противовирусную активность. С другой стороны, Dtr12 инактивирует как безоболочечный EMCV, так и оболочечный вирус гриппа, следовательно, наличие липидной мембраны не является лимитирующим фактором для проявления данным соединением противовирусной активности. Для установления механизма инактивации вирусов аРНКазам необходимо было определить: 1) происходит ли проникновение аРНКаз в вирусные частицы; 2) происходит ли расщепление вирусной РНК в процессе инактивации вирусов; 3) нарушается ли морфология капсида безоболочечных вирусов; 4) какое значение имеют разрывы, ранее детектированные в мембране оболочечного вируса гриппа после обработки аРНКазами. Исследование сохранности генома РНК-вирусов, инактивированных аРНКазами, проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР); исследование морфологии вирусных частиц проводили методом электронной микроскопии (ЭМ). 5.1 ОТ-ПЦР анализ вирусной РНК Амплификацию фрагментов геномов вирусов проводили для РНК, выделенных из образцов вирусных суспензий, которые предварительно инкубировали в присутствии Dp12F6 в случае ABPV, Dtr12, L2-3 и ABL3C3 в случае EMCV и вируса гриппа, а также вирусов, инкубированных в отсутствие аРНКаз. В случае EMCV и ABPV отсутствие потерь на этапах выделения РНК, проведения ОТ и ПЦР контролировали с помощью внутреннего стандарта - мРНК гена MDR1 человека, не имеющей гомологии с последовательностью геномов ABPV и EMCV (РНК MDR1 добавляли к вирусу непосредственно перед выделением вирусной РНК). Поскольку достоверные данные о структурной организации вирусных РНК ABPV и EMCV внутри капсидов вирусов отсутствуют, и невозможно предсказать какие участки будут наиболее чувствительны к действию аРНКазы, проводили амплификацию различных фрагментов вирусных РНК (Рис. 7A, Д). В отличие от EMCV и ABPV, геном вируса гриппа А представлен восемью молекулами РНК, поэтому при анализе РНК вируса гриппа проводили амплификацию полноразмерных фрагментов вирусных РНК. Инкубация ABPV в присутствии Dp12F6 приводила к значительному снижению эффективности амплификации продуктов длиной 779 и 773 нт (Рис. 7В, Г) по сравнению с контролем, но не продукта длиной 516 нт (Рис. 7Б). Поэтому снижение инфекционности вируса, наблюдаемое после обработки ABPV аРНКазой Dp12F6, является результатом разрушения вирусной РНК, что предотвращает репликацию вируса. Инкубация EMCV в присутствии 0.1 мМ Dtr12 приводила к полному исчезновению продукта длиной 999 п.о. (Рис. 4Ж), но не продуктов длиной 487 и 286 п.о. (Рис. 7Е, З). Поскольку инкубация EMCV в этих условиях приводила к полной инактивации вируса, то это подтверждает предложенный механизм инактивации, основанный на расщеплении геномной РНК вируса. Разная доступность определенных районов РНК ABPV и EMCV для действия аРНКаз, по всей видимости, объясняется разной плотностью упаковки РНК внутри вирусных частиц, наличием РНК-белковых взаимодействий, а также влиянием вторичной и третичной структур РНК. Инкубация EMCV в присутствии L2-3 и ABL3C3, не инактивирующих вирус, не влияла на эффективность амплификации продуктов ПЦР (Рис. 7ЕЦЗ). Рис. 7. Анализ вирусных РНК, выделенных из инактивированных аРНКазами вирусов. Расположение продуктов амплификации в геномных РНК ABPV (А) и EMCV (Д). Результаты ОТ-ПЦР анализа РНК ABPV, инкубированного с Dp12F(БЦГ), и EMCV, инкубированного с Dtr12, L2-3, ABL3C3 (ЕЦЗ), вируса гриппа, инкубированного с ABL3C3, Dtr12, L2-3 (И). мРНК MDR1 - внутренний стандарт. Цифры сверху - количество циклов амплификации и концентрация аРНКазы, использованная для инактивации. Контроль - вирус, инкубированный в условиях инактивации, но в отсутствие аРНКаз. УLФ - молекулярный маркер длин продуктов, указанных сбоку от каждого геля. Инкубация вируса гриппа в присутствии 1 мМ ABL3C3 приводила к исчезновению продуктов амплификации фрагментов генов NA и NP, а уровень амплификации продуктов, соответствующих генам M и NS, был понижен (Рис. 7И). После инкубации вируса гриппа в присутствии 0.1 мМ Dtrнаблюдали сходное снижение уровня амплификации продуктов, соответствующих генам M, NS, NA и NP вируса. Однако инкубация вируса в присутствии 1 мМ L2-3 (условия полной инактивации вируса) не приводила к разрушению вирусных РНК: уровень амплификации РНК был сравним с интенсивностью в контроле. Таким образом, для соединений ABL3C3 и Dtr12, но не для аРНКазы L2-3 подтвержден предложенный механизм инактивации вируса гриппа посредством разрушения его геномной РНК. Инактивация вируса гриппа аРНКазой L2-3 протекает по другому, возможно, более специфическому механизму, который требует специального изучения. 5.2 Морфология вирусных частиц после инактивации аРНКазами ОТ-ПЦР анализ подтвердил, что инактивация ABPV в присутствии Dp12F6, EMCV - в присутствии Dtr12, вируса гриппа - в присутствии Dtr12 или ABL3Cхарактеризуется расщеплением геномных РНК вирусов. Ранее показано, что при инкубации вируса гриппа с ABL3C3 происходит возникновение разрывов в мембране вирусных частиц, которые могут играть роль депо для молекул аРНКазы, позволяя им проникать в вирусные частицы и расщеплять РНК. Факт разрушения РНК безоболочечных вирусов позволяет предположить, что молекулы аРНКазы способны взаимодействовать с белками капсида, покрывающими РНК. Поэтому методом электронной микроскопии (ЭМ) исследовали морфологию частиц ABPV в процессе инактивации аРНКазой Dp12F6. Исследование образцов ABPV, инкубированного с Dp12F6 в течение 5, 8, и 18 ч при 37C, показало, что вирусные частицы сохраняют свой размер (диаметр 20Ц30 нм), сферическую симметрию (Рис. 8Д, Ж, И, Л), не обнаруживается видимых нарушений морфологии капсида в сравнении с нативным вирусом (Рис. 8А) и вирусом, инкубированным в отсутствие аРНКаз (Рис. 8Б, Г, Е, З, К). Были обнаружены вирусные частицы плотно прилегающие к аРНКазе Dp12F6, которая визуализируется в виде нитевидных сгустков и агрегатов размером до 1 мкм (Рис. 8В). Рис. 8. Электронные микрофотографии суспензий интактного ABPV и инактивированного Dp12Fвируса. A. Нативный вирус. Б. Контрольный вирус, инкубированный в отсутствие Dp12F6 (18 ч). В. аРНКаза Dp12F6. ГЦЛ. Морфология частиц ABPV после инкубации в отсутствие (Г, Е, З, К) и в присутствии Dp12F6 (Д, Ж, И, Л) в течение 5, 8, 12, 18 ч, соответственно. Бар 50 нм. Для того чтобы установить, происходит ли разрушение вирусных частиц во время их инкубации в присутствии Dp12F6, а фрагменты разрушенного вируса являются неразличимыми в негативно окрашенных образцах, мы оценили динамику изменения концентрации частиц ABPV в процессе инкубации в присутствии и в отсутствие Dp12F6 в течение 0, 8 и 24 ч с использованием латексных частиц с известной концентрацией. Концентрация частиц ABPV в контроле после инкубации в течение 0, 8 и 24 ч составила ~107 частиц/мл, а инкубация ABPV с Dp12F6 в течение 8 и 24 ч приводила к небольшому снижению концентрации вируса, которая составила ~5Ц7106 частиц/мл (в пределах экспериментальной ошибки метода). То есть после инкубации ABPV в присутствии Dp12F6 не происходит заметного изменения его концентрации. Таким образом, можно заключить, что Dp12F6 разрыхляет белки капсида и проникает в вирусную частицу, где взаимодействует с РНК и вызывает ее расщепление, что приводит к инактивации вируса. 6. Хаотропная и мембранолитическая активности аРНКаз Все исследованные соединения обладают высокой рибонуклеазной активностью in vitro, а для взаимодействия с вирусной РНК аРНКазы должны преодолеть физический барьер - плотную белковую оболочку капсидов или липидные мембраны. Можно предположить, что противовирусная активность аРНКаз по отношению к вирусам с различным строением (содержащим и не содержащим липидную мембрану) зависит от трех типов активностей: а) рибонуклеазной активности, обеспечивающей расщепление геномной РНК; б) хаотропной активности, которая нарушает взаимодействие белков капсида и обеспечивает доступ аРНКазы к генетическому материалу вируса; в) мембранолитической активности, которая обеспечивает локальное разрушение мембран оболочечных вирусов, что способствует проникновению аРНКаз в вирусные частицы. Для подтверждения наличия этих активностей и оценки вклада каждой из них в противовирусную активность аРНКаз использовали следующие модельные системы: - оценку хаотропной активности проводили с использованием системы, позволяющей изучить способность аРНКаз изменять третичную структуру и снижать каталитическую активность флэп-эндонуклеазы hFEN-1; - оценку мембранолитической активности проводили путем определения эффективности лизиса мембран эритроцитов барана в присутствии аРНКаз. 6.1 Определение хаотропной активности аРНКаз 6.1.1 Описание модельной системы Хаотропные агенты обладают способностью разрушать внутримолекулярные нековалентные взаимодействия (водородные связи, ван-дер-ваальсовы и гидрофобные взаимодействия), приводя к потере молекулами белков их пространственной структуры. В настоящей работе для оценки способности аРНКаз вызывать изменение пространственной структуры (далее - хаотропная активность) мы использовали систему, разработанную к.х.н. П.Е. Воробьевым (Лаборатория бионанотехнологий, ИХБФМ СО РАН): олигонуклеотид hобразует стабильную в стандартных условиях шпильку, а олигонуклеотид ONTчастично комплементарен одноцепочечному фрагменту этой шпильки и на своем 5'-конце содержит [32P]-метку, а hFEN-1 (hFEN-1 любезно предоставлена д.б.н. С.Н. Ходыревой, лаборатория БХФ, ИХБФМ СО РАН) за счет 5'-флэп эндонуклеазной активности вносит разрыв в ONT26, что приводит к отщеплению ON52 (Рис. 9). За хаотропную активность принимали снижение эффективности расщепления ONT26 ферментом после его инкубации в присутствии аРНКаз по сравнению с контролем - ферментом, инкубированным в тех же условиях, но в отсутствие аРНКаз. Рис. 9. Модельная система для оценки хаотропной активности аРНКаз. Расщепление 5'-[32P]-ONT26 флэпэндонуклеазой hFEN-1 приводит к образованию ON52, сайт расщепления указан красной стрелкой. Было установлено, что после инкубации hFEN-1 в течение 60 мин при 37С эффективность расщепления ONТ26 этим фермента снижается с 45 до 31%, в то время как инкубация hFEN-1 при 4С не приводит к потере активности фермента (Рис. 10). В связи с этим эффективность расщепления ONТ26 контрольным ферментом, инкубированным в отсутствие аРНКаз при 37С, принимали за 100%. Рис. 10. Кинетические зависимости эффективности расщепления 5'-[32P]-ONT26 флэп-эндонуклеазой hFEN-1 после ее инкубации при 4С ( ) или 37С ( ). 6.1.2 Инактивация hFEN-1 аРНКазами и мочевиной После инкубации hFEN-1 в присутствии аРНКазы (Dtr12, ABL3C3, ABL3C1, Dp12, Dtr12, Dp12F6, D3-12, L2-3 или K-2) или мочевины (положительный контроль) фермент добавляли к реакционной смеси, содержащей комплекс h2 / ONТ26, до концентрации 50 нМ и снимали кинетику расщепления ONT26. 6 М мочевина является типичным хаотропным агентом, разрушающим нековалентные взаимодействия в молекулах. Инкубация фермента в 6 М мочевине уже в течение 1 мин приводит к его полной инактивации (Рис. 11). 2 М мочевина не оказывает столь быстрого эффекта, но инкубация в течение 60 мин приводит к полной потере каталитической активности hFEN-1. Все аРНКазы можно разделить на три группы: 1) DABCO-содержащие аРНКазы, проявляющие высокую хаотропную активность; 2) пептидоподобная аРНКаза K-2, проявляющая умеренную хаотропную активность; 3) пептидоподобная аРНКаза L2-3, не проявляющая хаотропную активность. Степень инактивации фермента в присутствии аРНКаз серии Dxn (Dtr12, Dp12, Dp12F6, D3-12) возрастала с увеличением их концентрации, а также при увеличении времени экспозиции с 1 до 60 мин, когда достигалось плато. Инкубация hFEN-1 в присутствии 0.01 мМ Dtr12 в течение 60 мин приводила лишь к незначительному снижению активности фермента (Рис. 11), но при увеличении концентрации Dtr12 до 0.05 мМ инкубация в течение 60 мин приводила к значительному снижению эффективности расщепления ONT26, которая составляла 60%. Дальнейшее увеличение концентрации аРНКазы до 0.1 мМ приводило к снижению активности фермента уже после 1 мин инкубации (эффективность расщепления составила около 57%), а фермент, инкубированный в данных условиях в течение 60 мин, полностью терял свою активность. Сходные результаты были получены для аРНКаз Dp12F6, Dp12 и D3-12: данные соединения проявляли концентрационно-зависимую хаотропную активность, которая была максимальна при концентрации 0.5, 0.1 и 0.5 мМ, соответственно (Рис. 11). Рис. 11. Эффективность расщепления ONТ26 hFEN-1 (50 нМ,) инкубированной в присутствии аРНКаз, мочевины или в отсутствие соединений (1 мин Ц, 60 мин Ц, 37C). Хаотропная активность соединений серии ABLkCm (ABL3C3, ABL3C1) также возрастала при увеличении их концентрации, однако характерной особенностью этих соединений является высокая степень инактивации hFEN-1, наблюдаемая в первую минуту добавления к ферменту, которая практически не менялась через 60 мин инкубации (Рис. 11). Однозначно дискриминировать способность аРНКаз изменять третичную структуру фермента или действовать в качестве ингибитора невозможно, поэтому полученные данные о сходной эффективности расщепления ONТ26 ферментом после 1 и 60 мин инкубации в присутствии ABL3C3 и ABL3C1 не позволяют сделать однозначного вывода о характере их взаимодействия с ферментом. В свою очередь, пептидоподобная аРНКаза L2-3 не проявляла хаотропной активности (Рис. 11), что согласуется с отсутствием противовирусной активности в отношении безоболочечных вирусов. Пептидоподобная аРНКаза К-2 проявляла лишь незначительную хаотропную активность (Рис. 11), однако инактивация EMCV в присутствии 1 мМ К-2 не наблюдалась. Ранее, с использованием метода иммуноферментного анализа к.б.н. Е.П. Гончаровой (ЛБНК, ИХБФМ СО РАН) было установлено, что сродство моноклональных антител к инактивированному аРНКазами вирусу гриппа снижалось в порядке: контрольL2-3>Dtr12ABL3C3формальдегид>>Dp12. Эти данные согласуются с полученными в настоящей работе результатами: соединение L2-3 характеризуется наименьшей хаотропной активностью, хаотропная активность Dtr-12 и ABL3C3 примерно одинакова, а соединение Dp12 дестабилизирует третичную структуру белковых молекул с наибольшей эффективностью. На основании проведенных исследований можно заключить, что хаотропная активность аРНКаз убывает в ряду: 6 М мочевина>Dp12>Dtr-12 Dp12F6> ABL3C1> ABL3C3> D3-12>>K-2. Данные о хаотропной активности соединений хорошо коррелируют с противовирусной активностью аРНКаз по отношению к EMCV: Dtr12 в концентрации 0.01 мМ не проявляет хаотропной активности (Рис. 11) и не приводит к снижению титра EMCV. При увеличении концентрации Dtr12 до 0.05 мМ хаотропная активность возрастает, и наблюдается полная инактивация вируса. По-видимому, наличие у аРНКаз хаотропной активности является необходимым условием для их проникновения в вирусную частицу и последующего расщепления вирусной РНК и обуславливает их противовирусную активность. С другой стороны, инкубация EMCV и ABPV в присутствии любых концентраций ABL3C3 не приводила к инактивации вирусов, несмотря на высокую хаотропную активность аРНКазы. Возможно, ABL3C3 способствует образованию агрегатов, состоящих из вирусных частиц и молекул аРНКаз, что подтверждается стабилизацией вируса в процессе его инкубации с 0.5 мМ ABL3C3. 6.2 Мембранолитическая активность аРНКаз Для того чтобы оценить какую роль способность аРНКаз разрушать липидные мембраны играет в инактивации вирусов, исследовали мембранолитическую активность соединений: эритроциты барана (15106 шт) инкубировали (37С, 2 ч) в 100 мМ фосфатном буфере, pH 7.4, в присутствии одной из аРНКаз (ABL3C3, ABL3C1, K-D-1, Dp12, Dp12F6, D3-12, Dtr12, L2-3, K-2) и анализировали эффективность лизиса эритроцитов по изменению окрашивания раствора (550 нм). Положительным контролем являлся лизис эритроцитов в присутствии дистиллированной воды - 100%, а отрицательным контролем - инкубация в 100 мМ фосфатном буфере, pH 7.4. Как видно из представленных в Таблице 5 данных, 6 из 9 аРНКаз обладают мембранолитической активностью: инкубация эритроцитов с 0.5 мМ ABL3Cили ABL3C1 приводила к их полному лизису. В свою очередь, полный лизис эритроцитов наблюдали при концентрации 0.1 мМ в случае Dtr12, а также при концентрации 0.05 мМ в случае Dp12 и D3-12. L2-3 в концентрации 1 мМ не обладает ни мембранолитической (Таблица 5), ни хаотропной активностями, однако при этой концентрации наблюдается полная инактивация вируса гриппа в отсутствие расщепления геномной РНК. Следовательно, в основе противовирусной активности соединения лежит более специфичный тип взаимодействия с вирусом гриппа. К-2 также не обладает мембранолитической активностью, но инактивирует вирус гриппа при концентрации 0.2 мМ. Эта аРНКаза проявляет невысокую хаотропную активность только при высокой концентрации (1 мМ), но инактивации EMCV в ее присутствии не наблюдается. По-видимому, этому соединению также характерен более специфичный тип взаимодействия с частицами вируса гриппа, приводящий к его полной инактивации. На основании проведенных исследований можно заключить, что мембранолитическая активность аРНКаз убывает в ряду: Dp12>D3-12Dtr-12>ABL3C1>K-D-1ABL3C3. Таблица 5. Мембранолитическая активность аРНКаз. Концентрация аРНКазы, при Концентрация аРНКазы, при которой наблюдали максимальную которой наблюдали полную аРНКаза мембранолитическую инактивацию вируса гриппа, активность, мМ мМ ABL3C3 0.5 0.ABL3C1 0.5 не определяли K-D-1 0.5 0.Dtr12 0.1 0.Dp12 0.05 0.D3-12 0.05 0.K-2 - 0.L2-3 - Поскольку в концентрации 0.1 мМ ABL3C3 не инактивирует вирус гриппа (Рис. 6Б), можно заключить, что это связано с его низкой мембранолитической активностью в данных условиях, поскольку при увеличении концентрации соединения до 0.5 мМ наблюдали как полный лизис эритроцитов, так и полную инактивацию вируса. 7. Инактивация ДНК-вируса осповакцины Для того чтобы установить какой вклад в способность аРНКаз инактивировать вирусы вносит рибонуклеазная активность, мы использовали модель, позволяющую элиминировать вклад рибонуклеазной активности в противовирусную активность аРНКаз: изучали способность соединений инактивировать вирус осповакцины (ВОВ, семейство Poxviridae), геном которого представлен двуцепочечной молекулой ДНК, а капсид вируса покрыт липидной мембраной, на поверхности которой находятся плотно-расположенные друг к другу белковые комплексы (белковые колбочки). 7.1. Скрининг соединений, проявляющих анти-ВОВ активность Оценку противовирусной активности аРНКаз по отношению к ВОВ проводили путем инкубации вируса (~5105 БОЕ/мл) в присутствии одной из аРНКаз (ABL3C3, ABL3C1, KD-1, Dtr12, D3-12, Dp12, K-2, L2-3) или в отсутствие соединений (0Ц72 ч, 37C), а концентрацию инфекционного вируса определяли подсчетом количества бляшкообразующих единиц. Шесть из восьми исследованных аРНКаз, содержащих остаток DABCO и проявляющих высокую мебранолитическую и хаотропную активности (ABL3C3, ABL3C1, Dtr12, D3-12, Dp12 и KD-1), инактивируют ВОВ, а пептидоподобные L2-3 и K-2 не проявляют противовирусную активность по отношению к этому вирусу (Таблица 6). Таблица 6. Противовирусная активность аРНКаз по отношению к ВОВ и вирусу гриппа. Вирус осповакцины Вирус гриппа Эффективная Эффективная аРНКаза Титр вируса, Титр вируса, концентрация, концентрация, log10(БОЕ/мл) log10(ФОЕ/мл) мМ мМ ABL3C3 0.4 <1 0.4 а) соединения, у которых рибонуклеазная активность вносит менее значительный вклад в противовирусную активность, чем мембранолитическая и хаотропная активности (ABL3C3, ABL3C1, Dp12 - инактивация вируса гриппа и ВОВ наблюдается при одинаковой концентрации, но геном вирусов представлен в виде РНК и ДНК, соответственно, Таблица 6); б) соединения, рибонуклеазная активность которых вносит значительный вклад в их противовирусную активность (Dtr12, D3-12, K-D-1 - для полной инактивация вируса гриппа необходима концентрация значительно ниже концентрации, необходимой для полной инактивации ВОВ, следовательно, рибонуклеазная активность соединений обуславливает их противовирусную активность, в то время как хаотропная и мембранолитическая активности обеспечивают доступ аРНКаз к геному РНК-вирусов). в) соединения, противовирусное действие которых не обусловлено ни рибонуклеазной, ни хаотропной, ни мембранолитической активностями (K-2 и L2-3, для которых ранее была показана высокая противовирусная активность по отношению к вирусу гриппа в отсутствие расщепления вирусной РНК, а также отсутствие мембранолитической (для L2-3 и K-2) и хаотропной (для L2-3) активностей). 7.2. Исследование морфологии ВОВ в процессе инактивации аРНКазой Мы установили, что аРНКазы, обладающие высокой хаотропной и мембранолитической активностями, эффективно инактивируют ВОВ, при этом полная инактивация вируса достигается только при концентрации соединений, совпадающей с концентрацией, при которой они проявляют мембранолитическую и хаотропную активности. Поэтому с использованием метода ЭМ изучали морфологию ВОВ в процессе инактивации. Рис. 12. Морфология ВОВ после инактивации ABL3C3. ВОВ инкубировали с 0.1 мМ ABL3C3 или в отсутствие аРНКазы (контроль) в течение 30 мин (ГЦИ) и 18 ч (К, Л) при 37С. A. Интактная частица ВОВ. Б. Вирус в контроле. ВЦД. Нарушение структуры мембраны (указано стрелками). ЕЦИ. Слущивание липидной мембраны и разрыхление внутренней структуры капсида (указано стрелками). К, Л. Полное разрушение вирионов. Бар 100 нм. Метод негативного контрастирования позволил выявить нативные вирусные частицы, у которых отчетливо визуализирована поверхность вируса, включая поверхностные белковые колбочки (Рис. 12А), а инкубация ВОВ в отсутствие аРНКазы в течение 18 ч не приводила к заметным изменениям морфологии вирусных частиц (Рис. 12Б). Ультраструктурное исследование ВОВ после инкубации c 0.1 мМ ABL3C3 в течение 30 мин выявило отчетливое повреждение вирусных частиц: поверхностные колбочки теряли четкость, на поверхности частиц образовывались провалы (отверстия), в которые проникало контрастирующее вещество (Рис. 12 ВЦЕ), нарушалась структура вирусной мембраны, которая набухала и, формируя длинные выросты, отслаивалась от сердцевины вируса (Рис. 12ЖЦИ). Через 18 ч такие повреждения приводили к полному разрушению морфологии вирусных частиц (Рис. 12КЦЛ). ВЫВОДЫ 1) Исследована противовирусная активность аРНКаз по отношению к безоболочечным РНК-содержащим вирусам острого паралича пчел (ABPV) и энцефаломиокардита мышей (EMCV). Показано, что: - аРНКазы D3-12, Dp12F6 и K-D-1 инактивируют ABPV концентрационнозависимым способом; - аРНКазы D3-12, Dtr12, Dp12F6 и Dp12 инактивируют EMCV концентрационно-зависимым способом; - пептидоподобные аРНКазы L2-3 и K-2, а также соединения серии ABLkCm (ABL3C3, ABL3C1) не инактивируют данные вирусы; - инактивация ABPV и EMCV аРНКазами Dp12F6 и Dtr12, соответственно, сопровождается разрушением вирусных РНК, однако в процессе инактивации не наблюдается видимых изменений морфологии вирусных частиц и их количества. 2) Исследована противовирусная активность аРНКаз по отношению к оболочечному РНК-содержащему вирусу гриппа А. Показано, что при инактивации вируса аРНКазами Dtr12 и ABL3C3 происходит расщепление вирусной РНК, тогда как полная инактивация вируса гриппа аРНКазой L2-3 не сопровождается расщеплением вирусной РНК. 3) Исследована противовирусная активность аРНКаз по отношению к ДНКсодержащему вирусу осповакцины. Показано, что: - аРНКазы серии Dxn (Dtr12, Dp12, Dp12F6, D3-12), а также соединения серии ABLkCm (ABL3C3, ABL3C1, K-D-1) способны концентрационнозависимым способом инактивировать вирус, тогда как пептидоподобные аРНКазы L2-3 и K-2 вирус не инактивируют; - инактивация вируса аРНКазой ABL3C3 сопровождается изменениями морфологии вирусной частицы, которые характеризуются потерей пространственной организации поверхностных белковых комплексов, а также появлением разрывов и слущиванием мембран вируса. 4) Исследован спектр активностей аРНКаз. Установлено, что наряду с высокой рибонуклеазной активностью: - аРНКазы ABL3C3, ABL3C1, Dtr12, D3-12, Dp12, Dp12F6, K-2 обладают хаотропной активностью, которая убывает в ряду: 6 М мочевина >Dp12>Dtr-12 Dp12F6> ABL3C1> ABL3C3> D3-12>>K-2; - аРНКазы ABL3C3, ABL3C1, Dtr12, D3-12, Dp12, Dp12F6, K-D-1 обладают мембранолитической активностью, которая убывает в ряду: Dp12>D3-12Dtr12>ABL3C1>K-D-1ABL3C3; - аРНКаза K-2 не обладает мембранолитической активностью; - аРНКаза L2-3 не обладает ни хаотропной, ни мембранолитической активностями. 5) Исследованы структурно-функциональные особенности инактивации вирусов аРНКазами. Установлено, что: - сочетание хаотропной и рибонуклеазной активностей аРНКаз, содержащих в своей структуре два остатка 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана (Dtr12, D3-12, Dp12, Dp12F6), является достаточным для инактивации ABPV и EMCV; - наличие в структуре аРНКаз ABL3C3, ABL3C1, Dtr12, D3-12, Dp12, Dp12Fостатка 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана обеспечивает их мембранолитическую и хаотропную активности, проявление которых является достаточным для инактивации вируса осповакцины, структура которого включает липидную мембрану; - высокие хаотропная и мембранолитическая активности аРНКаз ABL3C3, ABL3C1 и Dp12 приводят к быстрой инактивации вируса гриппа, а рибонуклеазная активность соединений вносит незначительный вклад в эффективность инактивации вируса; - инактивация вируса гриппа аРНКазами Dtr12, D3-12, KD-1 в равной мере зависит от проявления соединениями как рибонуклеазная активности, так и хаотропной и мембранолитической активностей; - противовирусная активность L2-3 и К-2 в отношении вируса гриппа является высокоспецифичной и не обусловлена ни рибонуклеазной, ни хаотропной, ни мембранолитической активностью. Основные результаты диссертации опубликованы в работах: 1. Fedorova, A.A., Azzami, K., Ryabchikova, E.I., Spitsyna, Y.E., Silnikov, V.N., Ritter, W., Gross, H.J., Tautz, J., Vlassov, V.V., Beier, H., Zenkova, M.A. Inactivation of a nonenveloped RNA virus by artificial ribonucleases: honey bees and acute bee paralysis virus as a new experimental model for in vivo antiviral activity assessment // Antiviral Res. - 2011 - V. 91. - P. 267-277. 2. Fedorova, A.A., Goncharova, E.P., Kovpak, M.P., Vlassov, V.V., Zenkova, M.A. Influenza virus inactivated by artificial ribonucleases as a prospective killed virus vaccine // Vaccine. - 2012 - V. 30. - P. 2973-2980. 3. Fedorova, A.A., Goncharova, E.P., Ryabchikova, E.I., Vlasov, V.V., Zenkova, M.A. Novel amphiphilic compounds effectively inactivate the vaccinia virus // FEBS Letters. - 2012. - V. 586. - P. 1669-1673. 4. Федорова, А.А., Гончарова, Е.П., Королева, Л.С., Сильников, В.Н., Власов, В.В., Зенкова, М.А. Средство для инактивации ДНК-вирусов // Заявка на Патент РФ RU 2012107748. - Приоритет от 29.02.2012. 5. Федорова, А.А., Гончарова, Е.П., Буракова, Е.А., Сильников, В.Н., Власов, В.В., Зенкова, М.А. Средство, проявляющее противовирусную активность в отношении ДНК-вирусов // Заявка на патент РФ RU 2012107747. - Приоритет от 29.02.2012.