Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

Муравенко Ольга Викторовна

Хромосомная организация геномов растений

с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком дифференциального окрашивания.

Специальности: 03.01.03 Ц молекулярная биология

  03.01.15 - генетика

Диссертация в виде научного доклада

на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва  2010

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной кариологии и основ клеточной терапии Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор,

академик Юрий Викторович Ильин

Доктор биологических наук, профессор Юрий Федорович Богданов

Доктор биологических наук, профессор Владимир Юрьевич Поляков

Ведущая организация Учреждение Российской академии наук

Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита состоится " " 2010 г.  в "  " часов

на заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Институте

молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу:

119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Диссертация в виде научного доклада разослана "  "  2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

кандидат химических наук А.М. Крицын

общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Цитогенетика растений менее чем за столетие прошла путь от описания числа и морфологии хромосом в геноме и кариотипе вида (в понимании Г. Винклера, Л.Н. Делоне и Г.А. Левитского) до молекулярного кариотипирования (идентификации хромосом с помощью физического картирования на них различных ДНК-зондов методами флуоресцентной гибридизации in situ). Важнейшим этапом в развитии цитогенетики растений стало внедрение в 70-е годы прошлого столетия в широкую практику Т. Касперсоном, K. Воза и другими учеными методов диффренциального окрашивания хромосом (бэндинга). Метод С-бэндинга, основанный на выявлении участков конститутивного гетерохроматина, на долгие годы занял ведущее место в исследованиях хромосом растений, что связано с чрезвычайной обогащенностью их геномов повторяющимися последовательностями ДНК. В 70-80-х г.г. прошлого века были изучены рисунки С-бэндинга хромосом у многих видов возделываемых и дикорастущих растений. Следующий этап в развитии цитогенетики растений, приведший к серьезному расширению ее возможностей, связан с разработкой и началом широкого использования  в 80-90-х годах прошлого столетия флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). В качестве маркерных ДНК-зондов начали применять участки генов рибосомных РНК и другие ДНК-последовательности. В результате за прошедшие десятилетия был накоплен огромный багаж знаний, касающихся особенностей хромосомной организации геномов растений, получены важнейшие сведения об их изменчивости, происхождении и эволюции, что послужило базисом для разработки цитогенетических основ селекции. Стал возможен многопараметрический сравнительный анализ кариотипов в природных популяциях, а также у сортов и линий культурных растений и их гибридов. Цитогенетический мониторинг селекционных образцов, исследование селекционной истории и контроль чистоты сортов прочно вошли в практику селекции. В это же время возник широкий спектр методов молекулярного анализа генома, который также внедрился в генетические исследования многих культурных видов растений и их дикорастущих сородичей, а также в селекционную практику. Объединение цитогенетического и молекулярного подходов открыло новые перспективы для изучения геномов растений. В частности, физическое картирование последовательностей ДНК на хромосомах является необходимым этапом при тотальном секвенировании крупных эукариотических геномов.

Однако большинство из перечисленных выше исследований были выполнены на объектах, метафазные хромосомы которых имеют размеры не  менее 5 мкм (большинство злаков, лилейные, многие бобовые). Это связано с тем, что изучение рисунка дифференциального окрашивания небольших  хромосом (длиной  1-4 мкм) часто представляет значительные трудности вследствие недостаточной разрешающей способности светооптического микроскопа. Кроме того, геномы мелкохромосомных растений, как правило, имеют небольшие размеры (на один-два порядка меньше, чем геномы злаков или лилейных) и содержат сравнительно мало повторяющихся последовательностей ДНК различных классов, а, следовательно, и конститутивного гетерохроматина. Это обуславливает бедность рисунков С-бэндинга мелких хромосом, что еще в большей степени затрудняет их распознавание. В связи с этим, для изучения кариотипов растений, имеющих небольшие хромосомы, возникла необходимость разработки новых подходов, повышающих разрешение методов хромосомного анализа, а также поиск дополнительных хромосомных маркеров. Важность решения этой задачи связана с тем, что кариотипы значительного числа хозяйственно-ценных культур: технических, масличных, овощных и т.п. представлены хромосомами малых размеров. Для большинства таких растений задача соотнесения молекулярной, генетической и цитологической классификаций хромосом остается весьма актуальной. Особое место среди таких растений занимает лен - культура, имеющая для нашей страны не только большое хозяйственное, но и стратегическое значение. Именно поэтому исследование хромосомной организации генома этого ценного растения и его дикорастущих сородичей представляет собой задачу первостепенной важности.

Цель работы.

Разработка новых и усовершенствование существующих методов молекулярно-цитогенетического исследования для повышения разрешающей способности анализа геномов растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком дифференциального окрашивания. Изучение кариотипов таких растений (низших и высших) с целью идентификации индивидуальных хромосом, выявления структурных перестроек, изучения внутривидового хромосомного полиморфизма, а также сравнения геномов родственных видов для уточнения их таксономического статуса и филогенетических взаимосвязей.

Основные задачи исследования:

       1. Разработка комплекса методов, повышающих разрешающую способность анализа хромосомной организации геномов растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком С-бэндинга на модельных объектах (человек, ячмень, пшеница) и объектах исследования (ромашка, лен, горох).

       2. Поиск дополнительных молекулярных и цитогенетических маркеров для FISH-картирования хромосом и геномов растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком С-бэндинга:

• применение универсальных маркеров - генов рибосомных РНК и теломерной последовательности ДНК,
• маркеры из тотальной геномной ДНК,

• оптимизация методов выявления флуорохромного бэндинга на хромосомах растений после процедуры FISH.

       3. Повышение информативности хромосомного анализа с помощью последовательного или одновременного сочетания несколько методов выявления на хромосомах различных молекулярных и цитогенетических маркеров, а также применения специализированных компьютерных технологий и методов геномного анализа.

       4. Исследование с помощью разработанных подходов кариотипов растений с хромосомами малых размеров или с неинформативным рисунком дифференциального окрашивания с целью точной идентификации их хромосом, выявления структурных перестроек, определения родственных взаимоотношений, уточнения таксономического статуса и филогенетических взаимосвязей изученных видов. Особое внимание предполагается уделить растениям, имеющим хозяйственную ценность (хлопчатник, лен, горох, ромашка) или используемым в качестве модельных объектов.

Научная новизна.

       Экспериментальная часть работы представляет собой исследование приоритетного характера, так как основные результаты получены впервые и/или на объектах, не исследовавшихся ранее.

На модельном объекте - ячмене разработана модификация метода, позволяющая выявлять рисунок ранней репликации хромосом у растений. Показано, что у растений, также как и у животных, наблюдается высокая консервативность последовательности репликации районов хромосом в родственных геномах. Подобно млекопитающим, у растений выявляется сходство рисунков ранней репликации и G-подобного окрашивания хромосом после обработки трипсином.

Разработана методика получения препаратов митотических метафазных хромосом низкой степени конденсации с помощью предобработки делящихся клеток интеркалятором ДНК 9-аминоакридином. Установлено, что для достоверного анализа хромосомного полиморфизма по С-блокам длина недоконденсированных хромосом не должна более чем в три раза  превышать средний размер этих же хромосом, получаемых без использования интеркалятора. Методика существенно расширяет возможности анализа хромосом человека и растений, особенно мелкохромосомных видов, а также видов с неинформативным рисунком С-окраски хромосом.

Обнаружено, что окрашивание недоконденсированных хромосом растений ацетоорсеином позволяет выявлять высокоразрешающий G/R-подобный рисунок дифференциального окрашивания (OR-бэндинг), содержащий значительно большее число сегментов по сравнению с С-окраской. Установлено, что OR-бэндинг хромосомо- и видоспецифичен и хорошо воспроизводим. С помощью последовательного OR-С/DAPI-окрашивания хромосом льна и гороха впервые продемонстрировано, что ацетоорсеином не окрашиваются прицентромерные, крупные интеркалярные и теломерные гетерохроматические районы хромосом.

Показано, что локализация с помощью FISH на хромосомах генов рибосомных РНК позволяет использовать их в качестве эффективных дополнительных молекулярно-цитогенетических маркеров для идентификации мелких хромосом и хромосомных перестроек в геномах растений.

Продемонстрирована перспективность использования для растений подходов, разработанных с целью исследования генома человека. Показана принципиальная возможность получения NotI-библиотек из небольших геномов мелкохромосомных растений и их использования для изучения этих геномов и поиска молекулярных маркеров хромосом.

У мелкохромосомных растений использование собственной геномной ДНК в качестве зонда для FISH позволяет выявлять на хромосомах рисунки гибридизации, сходные с C-бэндингом.

Установлено, что применение двух новых АТ-специфичных флуоресцентных соединений - димерных бис-бензимидазолов - позволяет выявлять более контрастные рисунки дифференциального окрашивания по сравнению со стандартно используемыми флуорохромами DAPI и Hoechst 33258. Это не только расширяет возможности точной идентификации хромосом и хромосомных перестроек, но и FISH-картирования на них различных зондов.

По рисункам ранней репликации впервые идентифицированы хромосомы в диплоидном A1 геноме дикорастущего хлопчатника Gossipium herbaceum var. africanum и аллотетраплоидном (AD)2, геноме тонковолокнистого хлопчатника G. barbadense, а также проведено разделение хромосом (AD)2 генома на Ab и Db субгеномы. Обнаружено сходство рисунков ранней репликации хромосом в родственных геномах.

С применением 9-АМА впервые проведено морфометрическое исследование хромосом одноклеточных красных водорослей и показано, что число хромосом может быть использовано для уточнения таксономии класса Cyanidiophyceae (Rhodophyta).

       По рисунку С-бэндинга повышенного разрешения (после 9-АМА предобработки) проведена идентификация хромосом в кариотипах ромашки аптечной и двух родственных видов ромашек. Установлено, что Matricaria inodora является автотетраплоидом, субгеномы которого сходны с геномом M. maritima, а M. chamomilla имеет родственный геном.

       По рисункам С/DAPI-бэндинга идентифицированы все хромосомы гороха, включая морфологически неразличимые при равномерном окрашивании 1 и 2 пары гомологов. Это позволило провести исследование внутривидового полиморфизма гетерохроматических районов хромосом, а также обнаружить  двойную транслокацию с одновременной перицентрической инверсией у линии гороха с перестроенным кариотипом.

Сравнительное исследование геномов двухромосомных злаков из родов Zingeria и Colpodium по молекулярно-цитогенетическим маркерам хромосом и последовательностям внутренних транскрибируемых спейсеров генов 45S рРНК (ITS1 и ITS2) позволило установить, что эти два близких рода имеют монофилетическое происхождение.

Впервые с помощью комплекса высокоразрешающих модификаций методов С/DAPI-бэндинга и одновременного FISH-картирования на хромосомах генов 26S и 5S рРНК изучены геномы возделываемого вида льна (Linum usitatissimum L.) и 25 дикорастущих видов из 6 секций рода Linum L., произрастающих в Евразии и Африке. Установлены хромосомные числа у L. squamulosum Rudolphi (2n = 18), L. komarovii Juz. (2n = 18), L. thracicum Degen. и L. czernjajevii Klokov; уточнены хромосомные числа у L. decumbens  Desf ( 2n = 16), L. narbonense L. (2n = 28), L. stelleroides Planch (2n = 18), L. pallescens Bunge (2n = 18). Впервые в кариотипах видов секции Syllinum обнаружены В-хромосомы и изучена их структура и установлено, что число А-хромосом у этих видов равно 28.

По сходству кариотипов, все изученные виды льнов разделились на 8 групп, что совпало с распределением этих видов на кластеры по данным RAPD-анализа. Результаты молекулярно-цитогенетического анализа подтвердили обособленность секции Adenolinum от секции Linum, выявили геномное сходство видов секций Adenolinum и  Stellerolinum, а также показали обособленное положение видов L. narbonense L. и L. nodiflorum L. от других видов льна. Проведенный анализ позволил уточнить таксономический статус некоторых видов секций Linopsis, Syllinum, Linum и Adenolinum. Проведена реконструкция возможных филогенетических взаимосвязей культурного и дикорастущих видов льна.

Теоретическая и практическая ценность работы.

Впервые на основании использования цитологических маркеров проведена полная идентификация хромосом у двух видов хлопчатников. Предложенная нами классификация хромосом хлопчатников, остается единственной, и по сей день используется всеми авторами, изучающими геномы возделываемых видов хлопчатников и их дикорастущих сородичей.

Выявлены новые кариологические характеристики видов, входящих в состав родов Galdieria, Cianidium, Gossypium, Matricaria, Zingeria, Calpodium, Linum, позволяющие уточнить их таксономический статус и происхождение.

Полученные результаты могут быть применены для ускорения селекционного процесса, направленного на получение новых высокопродуктивных и устойчивых сортов льна, гороха  и ромашки аптечной. Результаты также могут быть использованы в геномных исследованиях льнов секции Syllinum, которые являются продуцентами биологически активных соединений, применяемых в фармакологии в качестве противоопухолевых препаратов.

Применение интеркалятора ДНК 9-АМА и новых флуоресцентных красителей (димерных бис-бензимидазолов) не только расширяет возможности исследования хромосомной организации геномов ценных сельскохозяйственных культур, но и может  существенно повысить точность цитогенетического анализа и картирования хромосом человека, что особенно важно для проведения сложной перинатальной цитогенетической диагностики плода.

Сведения, полученные о геномах видов рода Linum, заложили цитогенетические основы для объединения генетической и цитологической классификаций хромосом и тотального секвенирования генома L. usitatissimum L.

Результаты исследования могут быть также использованы в курсах лекций и лабораторных работах по цитогенетике в средних и высших учебных заведениях.

Апробация работы.

Результаты, полученные в данной работе, представлены на следующих научных конференциях: VI International Barley Genetic Symposium, 1991; 17 International Congress of Genetics, 1993; II Российский симпозиум "Новые методы биотехнологии растений", 1993; 26 Annual Meeting of American Society of Cell Biology, 1994; V (1996),VIII (1998) и XI (1999) Конференции "Геном человека"; V International Oat Conference & VII International Barley Symposium, 1997; XI(1997), XII(1999), XV(2005) Всероссийские совещания "Структура и функции клеточного ядра"; XIX(1998), XX(2000), XXIV (2008) International Congress ISAC, II (1997), III (1999), IV (2001) VII(2007) и VIII(2009) Международные симпозиумы "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования"; XIII International Genome Sequencing and Analysis Conference, 2001; Международный симпозиум "Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология", 2001; International Polyploidy Conference, 2003; III(2004) и V(2009) Съезды ВОГиС; IV International Conference BGRS, 2004; Международная конференция "Молекулярная и прикладная генетика", 2005; Международная научная конференция "Современные проблемы генетики", 2005; V Международное совещание по кариологии, кариосистематике и молекулярной систематике растений, 2005; Human Genome Meeting, 2001 и 2006; 11th World Congress on Advances in Oncology and 9th International Symposium on Molecular Medicine, 2006; Международная конференция "Генетика в России и мире", 2006; 16th International Chromosome Conference (ICC), 2007; Международная конференция "Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке: состояние, проблемы, перспективы", 2007; II Научно-практическая конференция "Современные тенденции в селекции и семеноводстве овощных культур. Традиции и перспективы", 2008; II съезд Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50-летию ЦИН РАН, 2007; Симпозиум памяти Г.А. Левитского "Хромосомы и эволюция", С-Петербург 2008; VI(2008), V(2009) Международной научной конференции "Факторы экспериментальной эволюции организмов"; International Conference "Chromosome, 2009".

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 52 статьи (среди которых три обзора) в международных и отечественных рецензируемых научных журналах, раздел в книге, 19 статей в сборниках и около 60 тезисов.

Материалы и методы.

       Семена ячменя для исследования получены из коллекции Лаборатории генетики растений ИОГен РАН, ромашек - из коллекции ВИЛАР РАСХН, гороха - из коллекции кафедры генетики МГУ и из коллекции ВНИИСХМ, цингерии, кальподиума и катабразеллы - из Лаборатории кариосистематики БИН РАН, хлопчатников - из коллекции Иолотанской опытной станции ВИР РАСХН, льнов - из коллекций ВНИИЛ РАСХН, ИГи - НАН Беларусии, Института ботаники НАН Украины и Генного банка Института генетики растений и исследования возделываемых растений г. Гетерслебена (Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research, Gatersleben, Germany).

       Для исследования хромосом растений были разработаны методы выявления рисунков ранней репликации хромосом и искусственной задержки конденсации митотических хромосом, а также модифицированы методики OR-, С-, DAPI-, CMA- и Ag-ЯОР-дифференциального окрашивания хромосом. G-подобное окрашивание хромосом после обработки трипсином проводилось согласно уже известной методике [Friebe et al., 1996]. Геномная ДНК выделялась стандартным СТАБ-методом [Murray, Tompson, 1980]. Клонирование фрагментов 26S и 5S рДНК, выделенных с помощью ПЦР из генома Linum austriacum L., проводилось в клетках Escherichia coli (XL 10-Gold Ultracompetent Cells, Stratagene) с использованием вектора pTZ57R (Fermentas, St.Leon-Rot, Germany) согласно протоколу производителя. Для получения геномных NotI библиотек и их анализа, определения количества ДНК в расчете на 1С, проведения высокоразрешающего RAPD-PCR-анализа в полиакриламидном геле, анализа последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 генов 45S рРНК применены методики, разработанные ранее [Бойко и др., 1985; Kashuba et al., 1999; Родионов и др., 2005; Зеленина и др., 2006]. Для поиска гомологий сиквенсов клонированных последовательностей с имеющимися в базах данных использованы NCBI Blast и Arabidopsis thaliana WU-BLAST2. Для гибридизации на хромосомах геномной ДНК, клонированных геномных фрагментов, генов рибосомных РНК и синтезированной меченной флуорохромом олигонуклеотидной теломерной последовательности арабидопсиса (CCCTAAA)3ЦС6-Cy3 (БиоЧип, ИМБ РАН) специально были разработаны различные модификации метода FISH. Исследование проводили с помощью систем цитогенетического анализа (микроскоп, ССD-камера), а также специализированных программ хромосомного анализа ImageJ 1.42 (National Institutes of Health, USA), ВидеоТестКарио 1.5 и 3.0 (ВидеоТест, Сантк-Петербург, РФ).

Основное содержание работы.

Глава 1. Подходы к идентификации мелких хромосом в геномах растений.

Знание любого генома неполно без исследования его хромосомной организации. У растений такая работа  обычно начинается с изучения числа и морфологии метафазных хромосом в митозе с последующей идентификацией гомологичных пар. Существует несколько возможностей решения задач идентификации и исследования хромосом в кариотипах растений. Как правило, для каждого конкретного кариотипа необходимо подбирать наиболее эффективные методы анализа и последовательность их применения. Кроме того, нужны способы, позволяющие быстро и с наименьшими потерями информации провести регистрацию изображений хромосом и их объективное исследование. Это легко разрешимо в век компьютерных технологий, которые позволяют быстро получить цифровое изображение хромосом, выявить максимальное число хромосомных маркеров и провести анализ хромосом в интерактивном режиме, т.е. создать объектспецифичный алгоритм изучения хромосом.

При исследовании мелких хромосом со сходной морфологией гарантированный результат можно получить только при комплексном применении всех вышеперечисленных подходов. Именно такой эффективный подход к изучению кариотипов растений с небольшими хромосомами представлен ниже. Подход включает комплекс высокоразрешающих молекулярно-цитогенетических методов исследования, позволяющих получать достаточное число маркеров для распознавания и сравнительного изучения мелких хромосом или хромосом с малоинформативным рисунком С-бэндинга.

1.1. Рисунок ранней репликации хромосом растений.

Поиск новых методов, позволяющих получать рисунок дифференциального окрашивания высокого разрешения, был начат нами с методики выявления репликативного бэндинга, основанной на асинхронности репликации ДНК хромосом в течение S-фазы. В основе этого метода лежит включение в процессе репликации ДНК аналогов оснований с последующей их детекцией. В результате, на хромосомах млекопитающих выявляется высокоразрешающий так назваемый "репликативный" бэндинг. У млекопитающих  процесс синтеза ДНК  имеет двухфазный характер, поэтому в хромосомах можно выявлять рисунки, соответственно, ранней и поздней репликации. У человека рисунок ранней репликации сходен с G-, а поздней - с R- и С-бэндингом при использовании так называемого FPG (Fluorochrom Plus Giemsa) метода выявления репликативного бэндинга [Захаров и др., 1982]. Применительно к хромосомам растений мы адаптировали вариант метода выявления рисунков ранней репликации хромосом - BrdU-Hoechst-Giemsa-бэндинг. Он основан на встраивании бромдезоксиуридина (BrdU) в ДНК в начале S-периода ее синтеза и последующим разрушением участков ДНК со встроенным аналогом с помощью облучения ультрафиолетовым светом [Захаров и др., 1982]. При этом участки хромосом, реплицирующиеся в середине и конце S-фазы,  выделяются как темно окрашенные (Giemsa-положительные) сегменты (бэнды). В этом варианте методики используется обработка BrdU в высокой концентрации, что блокирует большинство делящихся клеток корневой меристемы в начале S-фазы. После снятия BrdU-блока, в первом митотическом делении на хромосомах выявляется рисунок ранней репликации.

Для отработки методики в качестве модельного объекта было выбрано крупнохромосомное растение - ячмень (Hordeum vulgare L.), хромосомы которого имеют длину 6-12 мкм. У этого модельного объекта нам удалось получить рисунок ранней репликации, который был специфичен для каждой из 7 гомологичных групп хромосом (Рис. 1).

Рис. 1. Кариограмма хромосом H. vulgare. В каждой гомологичной группе (номера 1-7) хромосомы расположены по типам окрашивания слева направо:

Ц рисунок поздней репликации хромосом (по данным Uozu et al., 1997);

Ц рисунок ранней репликации хромосом;

Ц рисунок G-подобной окраски (окрашивание раствором Giemsa после обработки трипсином);

Ц рисунок С-окраски хромосом.

Ранее считалось, что у растений асинхронность репликация ДНК в течение S-периода выражена в меньшей степени, чем у млекопитающих [Cortes et al., 1980; Kakeda, Yamagata, 1991]. Однако, как показали наши исследования, асинхронность репликации ДНК в течение S-периода у растений может проявляться достаточно отчетливо. При этом на хромосомах ячменя, как и на хромосомах человека [Захаров и др., 1982], рисунок поздней репликации хромосом в целом совпадает с рисунком С-окраски [Uozu et al., 1997], а рисунок ранней репликации хромосом - с рисунком G-подобного дифференциального окрашивания, выявляемого на хромосомах после обработки трипсином (Рис. 1). Этот факт еще раз подтверждает единство основных принципов хромосомной организации геномов высших эукариот.

Большое число сегментов, которые выявил на хромосомах ячменя метод репликативного бэндинга, побудило нас попытаться  использовать этот подход для изучения  мелких хромосом растений с целью идентификации этих хромосом по рисункам ранней репликации (См. раздел 2.1).

1.2. Исследование недоконденсированных хромосом.

Другой подход, который используют при изучении кариотипов растений с малыми размерами метафазных хромосом - это их анализ в прометафазе или профазе, когда отчетливо виден рисунок дифференциальной конденсации хромосом, который можно применять для их идентификации. Однако, этот метод не получил широкого распространения, поскольку получение большого количества прометафазных и профазных хромосом связано с рядом методических сложностей [Fukui, Mukai, 1988].

Более широкие перспективы имеет подход, основанный на искусственном торможении процесса конденсации  хромосом за счет встраивания молекул интеркаляторов между парами оснований молекулы ДНК. К числу ДНК-интеркаляторов, задерживающих конденсацию хромосом, относятся такие широко применяемые флуоресцентные красители, как этидий (ЭБ) или акридиновый оранжевый (АО) [Зеленин, 1967; Zelenin, 1999]. Введение интеркаляторов в делящиеся клетки приводит к увеличению продолжительности профазы и метафазы и накоплению в этой стадии большого числа клеток с недоконденсированными или искусственно "удлиненными" хромосомами. На таких хромосомах разрешающая способность любого дифференциального окрашивания повышается.

С целью замедления конденсации хромосом растений мы использовали предобработку делящихся клеток ДНК-интеркалятором 9-аминоакридином (9-АМА). При выборе этого агента мы  исходили из простоты его структуры (отсутствии множественных боковых групп), а также низкой константы связывания 9-АМА с ДНК. Эти особенности 9-АМА гарантируют его легкое удаление из хромосом при фиксации и последующих обработках, а, следовательно, использование 9-АМА не препятствует применению в дальнейшем различных методик дифференциального окрашивания хромосом.

1.2.1. Метод задержки конденсации митотических хромосом с помощью 9-АМА.

Отработку метода задержки конденсации хромосом с помощью 9-АМА проводили на хромосомах человека, поскольку степень их конденсации легко оценивать по числу G-бэндов на гаплоидный набор, и на хромосомах ромашки аптечной (Matricaria chamomilla L.), степень конденсации которых оценивали по числу OR-бэндов. Для сравнения использовали обработку этидием, которую часто применяют для задержки конденсации хромосом человека и животных и получения рисунка дифференциального окрашивания более высокого разрешения. Было исследовано влияние 9-АМА и этидия в различных концентрациях (от 0,1 до 10,0 мкг/мл) на задержку конденсации хромосом. Установлено, что для получения сходных эффектов задержки конденсации хромосом требуется существенно более низкая концентрация 9-АМА, чем этидия.

Добавление в культуру лимфоцитов крови человека 9-АМА до конечной концентрации 0,5-1,0 мкг/мл или этидия - до l,0-5,0 мкг/мл за час перед фиксацией давало возможность получать значительное число метафаз с длинными хромосомами и с небольшим числом хромосомных наложений на препаратах. В этих условиях средняя длина хромосом увеличивалась на 70-90% по сравнению с хромосомами, не обработанными 9-АМА. При одинаковой степени разрешения рисунков Gбэндинга их контрастность, после обработки 9-АМА, оказалась заметно выше, чем после обработки этидием. Этот факт позволяет полагать, что использование предобработки 9-АМА весьма перспективно для повышения степени разрешения различных типов дифференциального окрашивания хромосом человека при проведении высокоточного цитогенетического анализа.

Для ромашки аптечной оптимальные условия предобработок интеркаляторами, приводящих к достаточному удлинению хромосом и выявлению четкого OR-бэндинга на всех хромосомах, были определены как 4-10 мкг/мл для этидия и 0,5-2,0 мкг/мл для 9АМА за 12 часов до фиксации при температуре +26С. Уменьшение концентрации и времени обработки интеркаляторами приводило к снижению эффекта задержки конденсации хромосом. Увеличение концентраций 9-АМА и этидия и/или длительности обработки этими реагентами приводило к значительному увеличению длины хромосом и числа хромосомных наложений, а также к снижению числа метафазных пластинок на препаратах.

Таким образом был разработан протокол получения препаратов с большим числом "удлиненных" метафазных хромосом, основанный на использовании 9-АМА. Установлено, что обработка 0.5-1.0 мкг/мл 9-АМА в течение часа до фиксации клеток приводит к существенному возрастанию разрешающей способности G-окрашивания хромосом человека с 400 до 850 G-бэндов на гаплоидный набор. Для ромашки оптимальные условия обработки составляли 0.5-1.0 мкг/мл 9-АМА и в течение 12-24 часов до фиксации корневых меристем. При таких условиях 9-АМА не подавляет митотическую активность клеток меристемы, а длина хромосом достаточна для получения высокоразрешающего OR-бэндинга (250-260 бэндов на гаплоидный набор).

Обнаружено, что 9-АМА в качестве интеркалирующего агента имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с этидием:

• достижение более сильного деконденсирующего эффекта при более низких концентрациях агента;
• егко отмывается фиксатором и поэтому не флуоресцирует на хромосомных препаратах и не мешает последующему применению различных методов флуоресцентного дифференцильного окрашивания и FISH;
• на хромосомах выявляется более четкий и контрастный рисунок бэндинга.

С учетом всех достоинств в дальнейшей работе для задержки конденсации митотических хромосом с целью повышения разрешающей способности хромосомного анализа мы применяли только 9-АМА.

1.2.2. Повышение разрешающей способности дифференциального окрашивания хромосом.

Методика задержки конденсации митотических хромосом была апробирована для повышения разрешающей способности OR- и С-бэндинга хромосом разных размеров у высших растений (лен, ромашка, горох, цингерия). Кроме того, использование 9-АМА впервые дало возможность визуализировать и исследовать с помощью светового микроскопа хромосомы одного из самых примитивных низших растений - красных одноклеточных водорослей. Установлено, что для всех исследованных объектов оптимальной является одна и та же концентрация 9-АМА - 0,5-1 мкг/мл. Все изложенное позволяет рекомендовать использование этого интеркалятора для получения высокоразрешающего дифференциального окрашивания как хромосом растений, так и человека и животных.

1.2.2.1. Определение оптимальных для исследования интервалов длин недоконденсированных хромосом, полученных после предобработки 9-АМА.

Использование 9-АМА впервые позволило идентифицировать мелкие хромосомы льна посевного (Linum usitatissimum L.) по рисункам С-окраски повышенного разрешения. При проведении этой работы, мы столкнулись  с тем, что применение 9-АМА значительно увеличивает вариабельность метафаз по степени конденсации хромосом на препаратах, что особенно заметно для мелких хромосом (Рис. 2).

Рис. 2. С-дифференциальное окрашивание хромосом  льна (L. usitatissimum L.): а Ц метафазная  и б Ц прометафазная пластинки.

Это побудило нас осуществить исследование достоверности оценки размеров и положения С-бэндов на "удлиненных" хромосомах. Сравнение вариабельности рисунка С-окраски в зависимости от степени конденсации хромосом было проведено на примере хромосомы 4 льна крупноцветкового (Linum grandiflorum Desf.), содержащей относительно небольшое  число С-бэндов. Препараты хромосом льна были приготовлены в двух вариантах: по стандартной методике с использованием колхицина и по предложенной нами методике с использованием 9АМА (1мкг/мл на 12 часов перед фиксацией).

Рис. 3. Идиограмма С- дифференциально окрашенных хромосом: a Ц ячменя и б Ц льна.

Для сравнения была взята хромосома 4 ячменя (Hordeum vulgare L.) (Рис. 3). Ячмень был выбран потому, что для этого объекта был предварительно проведен качественный и количественный анализ полиморфизма С-блоков хромосом, и на основе полученных сведений были разработаны основные принципы хромосомной паспортизации по рисункам С-окраски.

Оказалось, что, несмотря на значительно больший разброс длин  хромосомы 4 льна (2,3-7,1 мкм), после обработки 9-АМА по сравнению с необработанными (1,5-2,8 мкм) (Рис. 4), основной рисунок С-окраски мало изменяется. При длине хромосомы от 2,3 до 5,5 мкм обнаружено постоянство размеров и вариабельности крупных гетерохроматических блоков; не меняется также положение на хромосомных плечах небольших интеркалярных С-бэндов. Это позволяет проводить оценку полиморфизма С-блоков в хромосоме 4 льна, подобно тому, как это делается и у ячменя.

Рис. 4. Функция распределения длин хромосом ячменя (1), льна после обработки 9-АМА (2), льна без обработки 9-АМА (3).

Таким образом, было установлено, что на препаратах, приготовленных с применением 9-АМА, необходимо выбирать для исследования определенный интервал длин хромосом, который не должен превышать трёх средних размеров тех же метафазных хромосом, полученных без применения интеркалятора. В этом интервале длин можно достоверно оценивать хромосомный полиморфизм как по наличию-отсутствию С-бэндов, так и по их размерам. В указанном интервале длин на мелкохромосомных объектах можно проводить сравнительные исследования рисунков С-окраски и составлять хромосомные паспорта, аналогично тому, как это делается на крупнохромосомных объектах. Рекомендации, приведенные в этом разделе, учитывались нами при изучении полиморфизма по С-блокам разных сортов посевного льна (долгунцовые, масличные и межеумки) и в последующих исследованиях хромосом растений с использованием 9-АМА.

1.2.2.2. Сравнительное исследование рисунков OR- и С-бэндинга.

Проведенное нами исследование рисунков OR-бэндинга хромосом ромашки, гороха и цингерии позволило определить некоторые общие особенности этого типа окрашивания. Установлено, что рисунок OR-окраски выявляется на недоконденсированных прометафазных хромосомах. Рисунок OR-окрашивания воспроизводим, хромосомо- и видоспецифичен, несмотря на то, что число выявляемых на хромосомах растений OR-бэндов зависит от степени конденсации хромосом, подобно тому как это имеет место при G- или R-окрашивании хромосом животных. [

При окрашивании хромосом растений ацетоорсеином было обнаружено, что, в отличие от окрашивания по С-методу, прицентромерные гетерохроматические районы хромосом обычно окрашиваются очень слабо. Для детального сравнения двух различных методов окрашивания была проведена последовательная обработка хромосом льна крупноцветкового (Linum grandiflorum Desf.) ацетоорсеином и АТ-специфичным флуоресцентным красителем DAPI. Как известно, на хромосомах растений, в том числе у льнов, DAPI-позитивные районы обычно совпадают с С-бэндами (Рис. 5).

Рис. 5. Хромосомы L. grandiflorum: а Ц OR-бэндинг, б Ц последующее окрашивание DAPI, в Ц компьютерное совмещение DAPI- и OR-бэндинга, г ЦС-бэндинг.

В результате последовательного OR- и DAPI-окрашивания хромосом льна и последующего компьютерного наложения изображений выявлено, что ацетоорсеин слабо окрашивает не только околоцентромерные, но и теломерные гетерохроматические районы. Кроме того, было обнаружено, что большинство крупных блоков интеркалярного гетерохроматина также не окрашивается ацетоорсеином (Рис. 5 и см. разделы 2.3 - 2.5).

Таким образом, было установлено, что рисунок OR-бэндинга, хотя и  зависит от степени компактизации хромосом, не является простым отражением рисунка дифференциальной конденсации. Вероятно, интенсивность окрашивания ацетоорсеином зависит не только от плотности упаковки отдельных районов хромосом, но и от особенностей структурной организации этих районов.

1.3. Молекулярно-цитогенетические маркеры для картирования хромосом и геномов с помощью флуоресцентной гибридизации in situ.

В период активной интеграции молекулярной биологии и цитогенетики значительно упростилась идентификация отдельных хромосом или геномов. Стало возможным проводить молекулярное кариотипирование с помощью метода FISH, позволяющего локализовать на хромосомах молекулярные маркерные зонды - хромосомоспецифичные или геномоспецифичные последовательности ДНК, т.е. осуществлять физическое картирование хромосом. У растений в качестве маркерных зондов обычно используются различные повторяющиеся последовательности.

1.3.1. Теломерные повторы.

Известно, что хромосомные слияния, имеющие место при реорганизации кариотипов растений в процессе видообразования, могут приводить к изменению числа и морфологии хромосом в родственных геномах. В некоторых случаях на месте слияния хромосом остаются теломерные повторы, обычно локализованные на концах хромосом. Наличие таких интерстициальных сайтов теломерных повторов может свидетельствовать о произошедших хромосомных перестройках и, в ряде случаев, дает возможность исследовать особенности реорганизации кариотипов в процессе видообразования. Кроме того, локализация таких дополнительных мест расположения теломерных повторов на хромосомах может служить в качестве дополнительных маркеров при распознавании трудно идентифицируемых хромосом (Рис. 6).

Рис. 6. FISH с зондом теломерного повтора (AAATGGG) (красный) на хромосомах: а ЦPisum sativum (интерстициальные сайты гибридизации отсутствуют);

б ЦLinum  hirsutum (в двух хромосомах выявлены интерстициальные сайты гибридизации). Хромосомы окрашены DAPI (синий).

Использование теломерного повтора в качестве дополнительного молекулярно-цитогенетического маркера достаточно перспективно для изучения мелких хромосом и уточнения точек хромосомных разрывов в генетических коллекциях растений с перестроенными кариотипами, а также при исследовании особенностей структурной организации В-хромосом (См. разделы 2.4 и 2.6).

1.3.2. Гены рибосомных РНК.

Наиболее часто в качестве эффективных хромосомных маркеров используют рисунки локализации последовательностей генов 45S и 5S рРНК. Как известно, ДНК-последовательности рибосомных генов высоко консервативны и обладают очень низкой видовой специфичностью. Это позволяет последовательности генов рибосомных РНК, выделенные из генома какого-либо одного вида, применять в качестве зондов для исследования их хромосомной локализации с помощью FISH как у близких, так и у филогенетически далеких видов. В нашей работе была продемонстрирована  возможность использования последовательности 18S-28S рДНК, выделенной из генома человека (клон 22F9 из библиотеки LA-13NCO1), для гибридизации с хромосомами ячменя (Рис.7а). Также, показана возможность использования зондов 18S-26S и 5S рДНК (клоны рТа71 и рТа794 соответственно), полученных из генома мягкой пшеницы [Gerlach, Bedbrook, 1979], для гибридизации с хромосомами человека и примитивных фотосинтезирующих эукариот - красных одноклеточных водорослей (Рис. 7в и 7б).

Рис. 7. FISH с зондами рибосомных генов на хромосомах:

а Ц H. vulgare

(22F9 - красный);

б Ц G. sulfuraria

(рТа71 - зеленый, рТа794-красный);

в Ц H. sapience (рТа71-красный).

Расположение локусов рибосомных генов на хромосомах считают синапоморфным  признаком, несмотря на редкие исключения из этого правила, связанные с особенностями геномов некоторых видов. Изучение хромосомной локализации генов 45S и 5S рРНК, наряду со сравнительными исследованиями последовательностей межгенных спейсеров (ITS), успешно используется для определения филогенетических взаимосвязей родственных видов растений (См. раздел 2.5).

1.3.3. Геномная гибридизация.

Высокое содержание различных классов повторяющихся последовательностей в геномах растений привело к разработке метода геномной гибридизации in situ (GISH), который открыл тайны  происхождения многих аллополиплоидных видов, в частности злаков [Paterson et al., 2000].

Метод продолжает совершенствоваться до сих пор и позволяет различать все более близкородственные геномы. Например, недавно нами был разработан высокочувствительный вариант метода GISH, позволивший нам разделить в метафазных пластинках мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) геномы А, В и D (Рис. 8). Кроме того, с его помощью стало возможным уточнить структуру перестроенных хромосом и определить точки разрывов на хромосомных плечах.

Рис. 8. A-, B-, и D- геномы гексаплоидной пшеницы, дифференцированные с помощью GISH.

Существуют разные варианты метода GISH, использующие геномную ДНК одного или нескольких видов для выявления сайтов локализации консервативных повторяющихся последовательностей на хромосомах как родственных, так и не родственных видов растений [Belyaev, Raskina, 1998; Zoller et al., 2001]. Для хромосом льна (L. usitatissimum) нами разработан вариант метода гибридизации геномной ДНК, выделенной из того же вида. Методика заключается в совместной денатурации на препарате ДНК хромосом и зонда (геномной ДНК) в гибридизационной смеси, содержащей 50% формамида, при температуре 73С, и последующей ренатурации в течение 15 минут при 40С. В этих условиях на хромосомах льна гибридизуется часть высокоповторяющихся последовательностей ДНК, что позволяет выявлять на мелких хромосомах льна рисунок локализации зонда, напоминающий С-бэндинг (Рис. 9).

Рис. 9. GISH с собственной геномной ДНК на хромосомах L. usitatissimum.

Развитие  этого подхода открывает широкие перспективы для выявления рисунков распределения высокоповторяющихся последовательностей ДНК на хромосомах небольших размеров, поскольку  разрешение этого  метода выше других способов дифференциальной окраски. Геномную ДНК легко выделить из любого растения, поэтому возможность ее использования при FISH-картировании в качестве зонда, позволяющего выявлять дополнительные хромосомные маркеры очень ценна, особенно для хромосом с трудновыявляемым и бедным рисунком С-бэндинга.

1.3.4. Геномные библиотеки Ц источник зондов для FISH.

Картирование уникальных генов и различных анонимных последовательностей ДНК на хромосомах человека было начато задолго до начала тотального секвенирования его генома и во многом послужило основой для его успешного проведения. С целью исследования генома человека были разработаны различные методики получения BAC-, YAC- библиотек геномных ДНК-последовательностей, позволившие секвенировать отдельные фрагменты генома и собирать из них фрагменты генома большего размера. Был разработан метод создания NotIЦбиблиотек, специфичных для одной хромосомы и для генома в целом. Поскольку NotI сайты ассоциированы с генами, то исследование последовательностей ДНК из этих библиотек позволило обнаружить и картировать множество генов на хромосомах человека. Можно привести пример гена Harakiri (Рис. 10), вовлеченного в процесс апоптоза клеток.

Рис. 10. Локализация на 12 хромосоме человека (12q13.1) гена Harakiri (красный). Хромосомы окрашены DAPI (синий).

Кроме того, использование клонов ДНК из NotIЦбиблиотек позволило уточнить последовательность расположения генов в некоторых районах хромосомы 3 человека и выявить новые предполагаемые гены-супрессоры опухолевого роста. Сконструированные на основе NotI клонов ДНК микрочипы позволили создать новую технологию сравнительного анализа геномной ДНК, выделенной из нормальных и опухолевых клеток, дающую возможность выявлять генетические и эпигенетические изменения в геномах клеток на разных стадиях канцерогенеза. Интенсивные исследования генома человека также положили начало развитию молекулярной цитогенетики растений. Методики, разработанные для изучения хромосом человека и животных, были модифицированы и широко применяются для исследования хромосомной организации геномов растений. Интенсивные исследования структуры геномов растений (в первую очередь арабидопсиса) обнаружили, что участки генов растений, также как и животных, обогащены CpG-последовательностями, содержат NotI сайты рестрикции, метилирование которых и у растений является одним из способов эпигенетической регуляции [Matsuyama et al., 2003]. Нами были проведены пилотные эксперименты по получению геномных NotI библиотек из Triticum aestivum L., L. usitatissimum и L. austriacum, используя методику создания NotI - связующих библиотек человека. Из генома пшеницы (около 7 млрд. п.н.) не было получено ни одного клона. В то же время с первой попытки из геномов льнов (около 650 млн. п.н. для L. usitstissimum) получен 41 клон геномных фрагментов. В результате сравнения сиквенсов этих последовательностей с имеющимися в базах данных (NCBI Blast и Arabidopsis thaliana WU-BLAST2) для 22 ДНК клонов не было обнаружено гомологий. Среди остальных выявлены гомологии с фрагментами хлоропластных и ядерных генов, а также с ДНК-последовательностью ретротранспозонного элемента, гомология с сиквенсом которого приведена на рис. 11.

Рис. 11. Гомология клона 32 из генома L. usitatissimum (сорт Оршанский 2) gypsy-подобному семейству  ретротранспозонов (Athila).

Таким образом, наши результаты показали перспективность использования NotIЦбиблиотек для исследования геномов небольшого размера у растений.

1.3.4. Дифференциальное окрашивание хромосом АТ-специфичными флуоресцентными красителями.

При проведении FISH для окраски хромосом обычно используют АТ-специфичный флуоресцентный краситель DAPI, выявляющий Q-подобный рисунок окрашивания на хромосомах животных. У растений после гибридизации in situ метафазные хромосомы обычно окрашиваются DAPI монохромно. Как правило, такое окрашивание характерно для растений с крупными геномами (пшеница, ячмень). У растений с небольшими геномами на метафазных хромосомах могут выявляться рисунки DAPI-дифференциального окрашивания. Как показали наши исследования, этот бэндинг становится виден на хромосомах особенно отчетливо после предобработки 9-АМА. Такая предобработка позволила выявить рисунок DAPI-бэндинга не только у льнов (геном льна посевного около 600 млн.п.н.) и цингерии (геном около 1,5 млрд п.н.), но и у гороха (геном около 4,3 млрд п.н.) (См. разделы 2.4 - 2.6).

Рисунок DAPI-дифференциального окрашивания хромосом растений, подобен рисунку С-бэндинга (Рис. 12-I а, б). При этом, чем длиннее хромосомы, тем выше разрешение DAPI-бэндинга (Рис. 12-II, III).

Рис. 12. Изменение рисунка DAPI-окрашивания хромосом L. grandiflorum в зависимости от степени компактизации хромосом:

I Ц метафаза (а Ц DAPI-окрашивание и

б Ц инвертированное изображение),

II Ц прометафаза,

III Ц поздняя профаза.

Особенно важно получение высокоразрешающих рисунков DAPI-бэндинга после FISH, поскольку это позволяет не только точно идентифицировать хромосомы, но и отдельные районы хромосом, что существенно повышает точность картирования различных зондов.

Поскольку рисунок DAPI-бэндинга на хромосомах растений не всегда бывает достаточно контрастным, с целью улучшения качества дифференциального окрашивания хромосом при FISH, была изучена возможность применения новых флуоресцентных красителей. Было протестировано 10 димерных бис-бензимидазолов (содержащих две модифицированных группы красителя Hoechst 33258), синтезированных в ИМБ РАН [Zhuze et al., 2007]. Из них были отобраны четыре соединения: DB(7), DB(8), DB(17) и DB(18), при окрашивании которыми хромосом модельного объекта - человека, выявлялся бэндинг, сходный с рисунками дифференциального окрашивания флуорохромами DAPI или Hoechst 33258. Контрастность флуорохромного бэндинга, полученного при использовании этих четырех соединений, и его устойчивость к выгоранию была несколько выше, чем в случае DAPI и Hoechst 33258 .

Рис. 13. Дифференциальное окрашивание хромосом L. grandiflorum флуоресцентными красителями: а Ц DB(8), б Ц DAPI, в Ц Hoechst 33258, г Ц красителем Giemsa (С-бэндинг).

При окрашивании этими флуорохромами хромосом льна (L. grandiflorum) выявляется С/DAPI-подобный рисунок дифференциального окрашивания. Бэндинг, полученный при использовании DB(8) и DB(17) имел высокую контрастность и пониженную выгораемость (Рис. 13). Таким образом, полученные результаты открывают перспективы использования новых АТ-специфичных флуорохромов в исследовании хромосом не только человека, но и растений.

1.3. Комплексный подход к анализу хромосомной организации геномов растений.

Результаты нашего исследования показали, что одновременное или последовательное использование нескольких методов выявления на хромосомах молекулярно-цитогенетических маркеров позволяет успешно идентифицировать мелкие хромосомы и более точно локализовать различные ДНК-зонды, а также получать дополнительную информацию о структурной организации митотических хромосом растений.

       Наиболее информативным является сочетание  различных видов дифференциального окрашивания хромосом и гибридизации in situ с одним или несколькими зондами, проводящиеся на одних и тех же хромосомных пластинках последовательно или одновременно. Такой подход не только позволяет наиболее глубоко исследовать хромосомную организацию генома изучаемого растения, но и легко решать многие конкретные задачи. В частности, именно таким образом была проведена полная идентификация трудно распознаваемых хромосом у Linum flavum L. (Рис. 14).

Рис. 14. Кариотип L. flafum после совмещения различных методов окрашивания хромосом: DAPI (синий) и CMA (зеленый), а также  FISH с зондами теломерного повтора (AAATGGG) (красный). 1-14 Ц хромосомные группы, В Ц добавочные или В-хромосомы.

Следует отметить, что любое исследование тонкой структуры мелких митотических хромосом с помощью светооптического микроскопа практически невозможно без современных компьютерных технологий. При анализе хромосом небольших размеров и/или малоинформативным рисунком бэндинга особое значение приобретает оптимизация методов получения оцифрованных изображений хромосом и их последующей компьютерной обработки. Новые возможности по улучшению разрешения самых мелких деталей рисунка дифференциального окрашивания хромосом открывают методы деконволюции изображений. Современные методы деконволюции позволяют эффективно устранять размытие изображения (вследствие оптических аберраций и шумов регистрирующей системы) с помощью применения сложного математического аппарата для моделирования процессов формирования изображения и оценки качества восстанавливаемого изображения. В конечном итоге существенно повышается разрешающая способность оптической системы (Рис.15).

Рис.15. Локализация теломерного повтора (AAATGGG) (красный) на хромосомах льна (L.usitatissimum) методом FISH. Хромосомы окрашены DAPI (синий).

а Ц метафазная пластинка до деконволюции;

б Ц та же метафазная пластинка после деконволюции;

в Ц улучшение качества изображения с помощью деконволюции позволило распознать гомологи и составить кариограмму.

Анализ кариотипов мелкохромосомных растений значительно облегчают специализированные программы хромосомного анализа, работающие в интерактивном режиме. Примером такой программы, созданной фирмой ВидеоТест совместно со специалистами по хромосомному анализу, и в том числе при нашем активном участии, могут служить программы ВидеоТестКарио 1.5 и 2.0 (ВидеоТест, Санкт-Петербург).

Разработка программы ВидеоТестКарио 1.5 была направлена на создание объективного помощника при разностороннем изучении структуры хромосом (Рис. 16). С помощью этой программы анализ изображений хромосом ведется в интерактивном режиме. Взаимодействие исследователя с различными модулями программы позволяет направленно улучшать изображения хромосом, проводить их измерения, определять центромерные индексы, а также положение и размеры бэндов, что особенно ценно при малом числе маркеров хромосом.

Рис. 16. Интерфейс программы хромосомного анализа

ВидеоТестКарио 1.5.

Идиограммы строятся в соответствии с интенсивностью окрашивания хромосомы по длине, что позволяет составлять объективные количественные идиограммы. По усредненным данным двух гомологов строится идиограмма хромосом генома изучаемого растения. Полученные результаты измерений хромосом в метафазной пластинке вносятся в таблицу, которая может быть преобразована в формат программы Microsoft Office Excel. Это позволяет накапливать результаты измерений по нужному числу хромосомных пластинок и далее использовать их для математической обработки, что очень важно при изучении полиморфизма хромосом, создании баз данных, а также при проведении сравнительных исследований. Коммерческие специализированные программы хромосомного анализа других производителей не предоставляют такой возможности, что существенно усложняет изучение хромосом разных видов растений.

       Особенно эффективно сочетание комплексного подхода к изучению хромосомной организации геномов растений с различными молекулярными методами их исследования. Примерами плодотворности одновременного использования цитогенетических и молекулярных технологий (RAPD, ITS, определение количества ДНК в расчете на 1С) для изучения геномов растений могут служить сравнительные исследования различных видов красных микроводорослей, двухромосомных злаков и льнов, а также сортов и линий гороха, подробно описанные в следующей главе.

Глава 2. Хромосомная организация геномов у низших и высших видов растений с хромосомами малых размеров или неинформативным рисунком дифференциального окрашивания.

2.1. Сравнительные исследование геномов A1 G. herbaceum и (AD)2  G. barbadense.

С помощью BrdU-Hoechst-Giemsa-метода выявления рисунков ранней репликации хромосом были изучены кариотипы дикорастущей разновидности диплоидного хлопчатника (гуза) Gossypium herbaceum L. var. africanum (Watt) Mauer (2n = 26) и возделываемого аллотетраплоидного вида тонковолокнистого хлопчатника G. barbadense L. (2n = 52).

Рис. 17. Кариограмма и идиограмма BrdU-Hoechst-Giemsa - окрашенных хромосом

(a-m Ц обозначения хромосомных групп) хлопчатников: A1 Ц геном G. herbaceum; Ab и Db Ц субгеномы в составе генома (AD)2  G. barbadense.

На прометафазных хромосомах хлопчатников длиной 1,8-5,5 мкм число выявленных Giemsa-позитивных бэндов на хромосому варьировало от 2 до 9. Полученные рисунки ранней репликации хромосом были воспроизводимы и хромосомоспецифичны, что позволило идентифицировать все хромосомы в геноме A1 диплоида G. herbaceum и в геноме (AD)2 аллотетраплоида G. barbadense. При этом геном (AD)2 был разделен на субгеномы Ab и Db по размеру хромосом и сходству BrdU-Hoechst-Giemsa-бэндинга (Рис. 17). Сравнительное изучение рисунков BrdU-Hoechst-Giemsa-бэндинга хромосом в геномах хлопчатников выявило сходство распределения рано реплицирующихся районов по длине хромосом в A1-геноме и  в Ab- и Db-субгеномах.

Проведенное исследование показало, что у растений, так же как и у животных, рисунок репликации хромосом достаточно консервативен и может применяться для решения задач цитогенетики. Однако, несмотря на хорошее разрешение этого метода для анализа мелких хромосом растений, он имеет существенные недостатки, ограничивающие его применение. Метод довольно сложен в исполнении, требует длительной предобработки прорастающих корней раствором бромдезоксиуридина в высокой концентрации. При этом высокая митотическая активность корневой меристемы сохраняется только в условиях хорошей аэрации корней. Кроме того, использованный вариант BrdU-Hoechst-Giemsa-бэндинга не совместим с другими методами дифференциального окрашивания хромосом, а также с FISH, что очень важно при исследовании хромосомной организации геномов разных растений.

2.2. Микроводоросли класса Cyanidiophyceae (Rhodophyta).

До нашего исследования митотические хромосомы в клетках автоспор одноклеточных красных водорослей с помощью микроскопического исследования обнаружить не удавалось. Использование 9-АМА позволило визуализировать митотические хромосомы одноклеточных красных водорослей Galdieria maxima, G. partita, G. sulphuraria и Cianidium caldarium в процессе формирования автоспор. Для этого была разработана методика, позволяющая одновременно обрабатывать культивируемые клетки водорослей 9-АМА и пепсином с целью размягчения белкового компонента клеточных стенок. Такой подход позволяет после фиксации клеток и окрашивания ацетоорсеином получить хорошие давленые препараты недоконденсированных митотических хромосом и провести их морфометрическое исследование.

В автоспорах всех трех видов Galdieria было обнаружено по две хромосомы длиной 0,8-2,3 мкм, причем одна из хромосом была на треть больше другой (Рис. 18).

Рис. 18. Хромосомные пластинки (а) и их контрастированное изображение (б): 1 Ц G. maxima, 2 Ц G. partita, 3 Ц G. sulphuraria, 4 Ц C. caldarium.

Масштабная линейка Ц 3 мкм.

Статистически значимые межвидовые различия размеров хромосом G. maxima, G. partita, G. sulphuraria могут быть использованы в качестве дополнительного признака при определении видовой принадлежности этих водорослей. Больше трудностей представлял подсчет числа хромосом в геноме C. сaldarium, поскольку размеры 5 видимых хромосом были от 0,4 до 0,7 мкм (Рис. 18). Иногда с трудом различались еще 2 точечных хромосомы, размеры которых были на грани разрешающей способности светового микроскопа.

На хромосомах всех изученных видов было трудно точно определить положение центромер. Возможно, что хромосомы этих водорослей относятся к голоцентрическому типу, характерному для некоторых зеленых водорослей. Полученные результаты позволяют использовать число хромосом в качестве таксономического признака для распознавания представителей родов Cianidium и Galdieria.

Определение содержания ядерной ДНК, проведенное на профазных ядрах, окрашенных по Фельгену, показало, что представители семейства Cyanidiасеае имеют самые маленькие из известных геномов у фотосинтезирующих эукариот - 1,5-2,25х10-2 пкг ДНК в расчете на 1С (Табл.1).

Таблица 1. Средние значения суммарной длины хромосом и

количества ДНК в геномах красных микроводорослей.

Вид микроводоросли	Суммарная длина хромосом, мкм±SE	Содержание ДНК на 1C, пкг 10-2±SE
G.maxima	4.14±0.44	2.25±0.09
G.partita	2.82±0.49	1.56±0.06
G.sulphuraria	2.07±0.18	1.35±0.05
C. caldarium	2.61±0.06	1.49±0.03

SE Ц стандартная ошибка среднего значения.

       Это хорошо объясняет как малые размеры хромосом, обнаружить которые при микроскопическом исследовании стало возможным только после применения 9-АМА, так и отсутствие дифференциального окрашивания хромосом у исследованных видов.

Таким образом, исследование хромосомной организации геномов четырех видов микроводорослей класса Cyanidiophyceae (Rhodophyta) позволило не только установить их хромосомные числа и уточнить их систематическое положение, но и подтвердить наличие зависимости хромосомной организации генома от его размера.

2.3. Ромашка аптечная и родственные виды.

Исследование рисунков OR- и С-бэндинга хромосом (Рис. 19, 20) у двух диплоидных (Азулена и Сибирская бизаболольная) и одного автотетраплоидного (Подмосковная) сортов ромашки аптечной Matricaria chamomilla L. показало, что четкий рисунок OR-бэндинга выявляется на хромосомах ромашки размером 5,3-10,2 мкм. Это почти в 1,5 раза превышает длину хромосом, необходимую для получения С-бэндинга высокого разрешения и в 2 раза - длину метафазных хромосом, получаемых без использования 9-АМА (2,8-5,9 мкм).

На каждой хромосоме ромашки аптечной выявляется от 12 до 22 OR-бэндов. При этом центромерные районы, а также области вторичных перетяжек не окрашиваются. Сравнительное изучение рисунков OR-окраски хромосом у разных сортов ромашки обнаружило межсортовую консервативность этого типа бэндинга.

Рис. 19. С- (а) и OR- (б) окрашенные хромосомы M. chamomilla сорта Сибирская бизаболольная.

При изучении рисунков С-бэндинга в кариотипах тех же трех сортов ромашки аптечной выявлено, что они отличались большей контрастностью и наличием ряда дополнительных мелких интеркалярных С-блоков по сравнению с необработанными 9АМА С-окрашенными хромосомами. По рисункам С-бэндинга проведена идентификация хромосом в кариотипах изученных сортов. Сорта различались в основном по размерам прицентромерных гетерохроматических районов, а также ряда небольших интеркалярных и теломерых С-бэндов на всех хромосомах, кроме 4 и 5. Хромосомы сорта Подмосковная  в целом были более гетерохроматичны по сравнению с диплоидными сортами. Изучение рисунков С-бэндинга хромосом у этого сорта позволило подтвердить его автополиплоидное происхождение. Тем не менее, выявлены небольшие различия в рисунках С-окраски 2, 6 и 7 хромосом из разных субгеномов в кариотипе сорта Подмосковная. Геном ромашки аптечной был обозначен нами Mch геном.

На основании оценки размеров хромосом, положения центромер и вторичных перетяжек было установлено соответствие результатов по идентификации хромосом, проведенной на основании рисунков OR- и С-окрашивания хромосом Mch генома ромашки аптечной, и построены идиограммы (Рис. 20).

Рис. 20. Идиограммы и кариограммы С- (слева) и  OR- (справа) окрашенных хромосом (1-7 Ц обозначения гомологичных групп) Mch-генома M. chamomilla L.

Исследование хромосом двух родственных видов ромашек: диплоидной M. maritima L. (2n = 18) и тетраплоидной M. inodora L. (2n = 36), позволило идентифицировать по рисункам С-окраски и морфологическим параметрам все пары гомологов в их кариотипах. Обнаружено, что геном M. inodora по морфологии хромосом и рисункам С-бэндинга можно разделить на два практически идентичных субгенома, что указывает на автополиплоидное происхождении этого вида. Сравнение хромосом M. maritima и M. inodora выявило, что они имеют очень близкие рисунки распределения гетерохроматических сегментов и сходную морфологию. Это позволило предположить, что геном M. inodora образовался в результате удвоения генома M. maritima , который был обозначен Mm. Это подтверждается и тем, что содержание ядерной ДНК в расчете на 1С у изученных видов имеет близкие значения: у диплоидного вида - 2.75 пкг, а у тетраплоидного вида - 2,31 пкг [Garcia et al., 2005]. Сравнение хромосом Mm- и Mch-геномов выявило сходство морфологии хромосом и рисунков распределения позиций гетерохроматических районов по длине хромосом, что говорит об общности происхождения этих геномов. Однако в Mch-геноме значительно большее количество гетерохроматина содержится в прицентромерных и интеркалярных районах хромосом, тогда как в Mm-геноме более четко были выражены теломерные С-бэнды. Вероятно, дифференцировка этих геномов сопровождалась перераспределением повторяющихся последовательностей и их амплификацией в проксимальных районах хромосом Mch-генома. Это соответствует и значительно большему содержанию ядерной ДНК у ромашки аптечной - 3,87 пкг в расчете на 1С [Garcia et al., 2005].

2.4. Горох посевной.

Применение 9-АМА позволило впервые изучить рисунки OR- и С-окраски хромосом 8 сортов гороха посевного (Pisum sativum L.), который имеет размеры хромосом, сходные с ромашкой. При С-окрашивании хромосом гороха выявляются небольшие прицентромерные и теломерные, а также мелкие интеркалярные С-бэнды. На основании оценки морфологии  хромосом и рисунков С-бэндинга была проведена идентификация хромосом в геноме гороха в соответствии со стандартной цитогенетической номенклатурой Бликста (Рис. 21а) [Blixt, 1959].

Рис. 21. Кариотипы P. sativum L.: C- (а) и OR- (б) дифференциальное окрашивание хромосом. Компьютерное совмещение последовательно окрашенных хромосом ацетоорсеином (красный) и DAPI (синий) (в). 1-7 Ц номера хромосом в соответствии со стандартной  номенклатурой Бликста.

Рисунки С-бэндинга хромосом у сортов овощного, сахарного, кормового и зернового гороха различались по размерам прицентромерных и приспутничных гетерохроматических блоков, а также интеркалярных С-бэндов в коротких плечах 2, 3, 4 и 7 хромосом и в длинных плечах хромосом 1 и 5.

Четкий OR-бэндинг c большим числом темноокрашенных районов был выявлен на хромосомах тех же сортов гороха. По рисункам OR-окраски идентифицированы все хромосомы (Рис. 21б). Также как и С-окрашенные хромосомы, они были  расположены по размерам и центромерному индексу в соответствии с номенклатурой Бликста. Было проведено последовательное (Рис. 21в) OR-, а затем С/DAPI-окрашивание (Рис. 21а и 22а) хромосом гороха, которое подтвердило правильность такого подхода при их идентификации. Межсортовых различий по рисункам OR-окраски не было выявлено.

При исследовании хромосом гороха было обнаружено, что на профазных и прометафазных хромосомах после предобработки 9-АМА и процедуры FISH выявляется Q-подобный DAPI-бэндинг. В зависимости от фазы митоза DAPI-бэндинг может быть различной степени разрешения. По мере компактизации хромосом Q-подобный DAPI-бэндинг переходит в С-подобный DAPI-бэндинг (C/DAPI-бэндинг) (Рис. 22а).

Рис. 22. Кариограммы и идиограммы DAPI-окрашенных (инвертированное изображение) хромосом гороха (1-7 Ц номера хромосом в соответствии со стандартной  номенклатурой Бликста): а  Ц разные степени разрешения DAPI-бэндинга (на профазных хромосомах суммарное число DAPI-полос на гаплоидный набор хромосом гороха равно 344); б Ц точная локализация точек разрывов хромосом в транслокационных линиях гороха L-108 и M-10 по рисункам высокоразрешающего DAPI-окрашивания.

Это обстоятельство позволяет подобрать степень конденсации хромосом, при которой по рисунку DAPI-бэндинга возможно идентифицировать хромосомы и при необходимости локализовать на них точки хромосомных перестроек или ДНК-зонды. С помощью такого подхода была изучена структура кариотипов транслокационных линий L-108 и M-10 гороха. DAPI-бэндинг высокого разрешения позволил точно установить на профазных-прометафазных хромосомах точки разрыва хромосом при транслокациях (Рис. 22б). Для линии L-108 выявлены точки разрывов в проксимальных районах коротких плеч хромосом 2 и 7. Для линии М-10 впервые установлено наличие двойной транслокации между длинными и короткими  плечами хромосом 2 и 4.

Сравнительное исследование рисунков DAPI-бэндинга хромосом у всех восьми сортов и 2 родственных линий (с высоким симбиотическим потенциалом) гороха, выявленных после FISH картирования рибосомных генов и теломерного повтора, обнаружило невысокий уровень внутри- и межсортового полиморфизма, подобно С-окраске (Рис. 23).

У всех изученных образцов гороха 26S рДНК находится в районах вторичных перетяжек и на спутнике 4 хромосомы и в приспутничном районе 7 хромосомы. Сайты 5S рДНК располагались на 1, 3 и 5 хромосомах, причем высокоразрешающее DAPI-окрашивание дало возможность уточнить районы локализации 5S рДНК. Теломерные повторы выявлялись на концах всех хромосом (см. раздел 1.3.1, рис. 6) как в нормальных, так и в транслокационных кариотипах. Дополнительных сайтов гибридизации с рДНК и теломерными последовательностями не выявлено (Рис. 23).

Ag-ЯОР-окрашивание показало, что в изученных образцах гороха оба локуса 26S рДНК, расположенные на хромосомах 4 и 7, функционально активны. В линиях гороха, несущих транслокации по ЯОР-образующим хромосомам 4 и 7, изменений функциональной активности ЯОР в этих хромосомах не обнаружено.

Рис. 23. Хромосомы гороха сорта Frisson: а - С-бэндинг, б - FISH-картирование 45S (зеленый) и 5S (красный) рДНК, в - идиограмма хромосом с указанием расположения С/DAPI-бэндов (черный), 45S (зеленый) и 5S (красный) рДНК 1-7 Ц номера хромосом в соответствии со стандартной  номенклатурой [Blixt, 1959; Fuchs et al., 1998].

Исследование геномного полиморфизма у изученных сортов и линий гороха методом RAPD-PCR-анализа в полиакриламидном геле с 3 информативными праймерами А06, А09 и А10 в выявило между ними различия по 45 полиморфным локусам. RAPD-спектры всех исследованных представителей сорта или линии делились на кластеры в четком соответствии с сортовой принадлежностью. В кластерах линии Sprint 2 и сорта Finale обнаружен геномный полиморфизм между изученными индивидуальными растениями. Полученные нами результаты подтверждают возможность применения RAPD-анализа для идентификации сортов гороха [Гостимский и др., 2005].

Таким образом, значительных кариотипических различий исследованных сортов и линий гороха выявлено не было. Тем не менее, даже небольшие специфические особенности их геномов могут служить основой для создания кариогеномного паспорта. Такой подход может быть особенно важен для сертификации определенного генотипа гороха посевного при создании новых сортов и проверке чистоты суперэлитного и элитного семенного материала.

2.5. Исследование Zingeria biebersteiniana и родственных видов.

2.5.1. Цингерия Биберштейна.

Наряду с исследованием мелкохромосомных видов нами были изучены дикорастущие злаки, с числом хромосом кратным 2 - Z. biebersteiniana (Claus) P. Smirn. (2n = 4) и Z. pisidica (Boiss.) Tutin (2n = 8), Colpodium versicolor (Stev.) Schmalh. (2n = 4) с целью изучения формирования и происхождения их уникальных двухромосомных геномов. Сложность исследования хромосом этих растений была связана с тем, что, несмотря на довольно крупные размеры хромосом (8-11 мкм), две пары хромосом цингерии не всегда легко идентифицируются по размерам и морфологии, особенно в случае отсутствия выраженных вторичных перетяжек, а рисунок С-бэндинга у них беден и поэтому малоинформативен. При С-окрашивании хромосом Zingeria biebersteiniana четко выявляются только крупные С-бэнды в прицентромерных районах хромосом, а интеркалярные и прителомерные С-бэнды имеют очень маленькие размеры и выявляются нерегулярно (Рис. 23а). Следует отметить, что по рисункам С-бэндинга идентификация хромосом цингерии не составляет труда, но сравнение хромосом близкородственных видов значительно затруднено ввиду плохой выраженности интеркалярных С-бэндов. Это обстоятельство выдвинуло на первый план задачу поиска дополнительных хромосомных маркеров, позволяющих детально исследовать структуру хромосом двухромосомных злаков.

Применение 9-АМА позволило выявить на недоконденсированных хромосомах длиной 11-15 мкм чёткий рисунок OR-бэндинга (Рис. 23б).

Рис. 24. Кариограммы и идиограммы цингерии: а -C- бэндинг и б - OR- бэндинг. 1 и 2 Ц номера хромосом.

По сравнению с С-окраской рисунок OR-бэндинга в хромосомах цингериии представлен большим числом интеркалярных бэндов. При этом С-позитивные прицентромерные районы хромосом, а также области вторичных перетяжек ацеторсеином не прокрашиваются.

2.5.2. Происхождение двухромосомных злаков Zingeria и Colpodium.

Для установления путей происхождения уникальных двухромосомных геномов злаков проведено сравнительное исследование хромосом в кариотипах Z.biebersteiniana (2n = 4), Z. pisidica (2n = 2х = 8), Colpodium versicolor (2n = 4) и Catabrosella variegata (syn.= Colpodium variegatum) (2n = 10). Метод С-дифференциального окрашивания выявляет на хромосомах этих видов малоинформативные рисунки, тем не менее, в кариотипах двух образцов Z. bibersteiniana из разных мест произрастания обнаружен межпопуляционный полиморфизм С-блоков хромосом. В частности, хромосомы растений, собранных вблизи лимана Пришиб в Волгоградской области, содержат более крупные прителомерные и интеркалярные С-блоки по сравнению с хромосомами растений, выросших в окрестностях с. Рахинка той же области.

Рис. 25. Кариограммы, идиограммы, метафазные пластинки С-окрашенных хромосом и FISH с зондами 45S (зеленый) и 5S (красный) рДНК. Zb ЦZ.bibershteniana, Zp Ц Z.pisidica и C Ц C.versicolor. Масштабные линейки по 5 мкм.

Сравнительный анализ геномов C. versicolor и Z. biebersteiniana показал, что они сходны по морфологии и характеру распределения интеркалярных С-блоков по одной из хромосом, тогда как  по другой (ядрышкообразующей) хромосоме различаются по центромерному индексу, положению вторичных перетяжек и рисунку С-окрашивания.

Установлено, что две пары хромосом из четырех в кариотипе Z. pisidica  имеют значительное сходство с хромосомами Z. biebersteiniana. Однако, в отличие от Z. biebersteiniana, хромосомы Z. pisidica не содержат крупных прицентромерных С-блоков. Две другие хромосомы по рисункам С-окраски сходны с хромосомами C. versicolor. Однако размеры отдельных интеркалярных С-блоков у Z. pisidica значительно крупнее, чем таковые в хромосомах C. versicolor (Рис. 25). По-видимому, один из субгеномов Z. pisidica и геном Z. biebersteiniana имеют общее происхождение. Не исключено, что предковый геном C. versicolor принимал участие в формировании другого субгенома Z. pisidica.

У исследованных видов проведена хромосомная локализация генов 45S и 5S рРНК. Рисунки расположения генов 45S и 5S рРНК на хромосомах двух видов цингерий и у C. versicolor подтверждают предположение, что Z. pisidica является аллотетраплоидом, у которого один из субгеномов сходен с геномом Z. biebersteiniana (Рис. 24). Сравнение кариотипов Catabrosella  variegata и описанных выше видов злаков не выявило черт сходства между ними.

Проведено сравнение последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 генов 45S рРНК в геномах изученных видов. Обнаружено, что геномы уникальных двухромосомных злаков  (x = 2) - Z. biebersteiniana (2n = 4), Z. pisidica (2n = 2х = 8) и Colpodium versicolor (2n = 4), относимые ранее к разным трибам или подтрибам, представляют два близких рода, генетическое расстояние (p-distance) между ITS которых составляет всего 1,2Ц4.4%. На молекулярно-филогенетическом древе виды Zingeria и Colpodium versicolor  образуют единую кладу с Catabrosella araratica (2n = 42, x = 7).

Таким образом, установлено, что геномы Zingeria и Colpodium с наиболее низким из известных основным числом хромосом (x = 2) возникли не в разных филогенетических ветвях, а имеют монофилетическое происхождение.

2.6. Изучение геномов у видов рода Linum L.

Для определения родственных взаимоотношений и уточнения таксономического статуса, а также выявления филогенетических взаимосвязей видов рода Linum L. проведено изучение геномов возделываемого Linum usitatissimum L. и 25 дикорастущих видов из 6 секций  [Юзепчук, 1949; Егорова, 1996], в основном произрастающих в Евразии.

2.6.1. Идентификация хромосом, геномы и кариотипы видов льна.

Род Linum - лен включает около 200 видов, которые разделяют на 5-6 секций [Юзепчук, 1949; Ockendon, Walters, 1968; Егорова, 1996]. Кариологическое изучение видов льна начато более полувека назад, и почти у 30 видов Нового и 50 видов Старого Света были определены хромосомные числа. Показано, что в кариотипах льновых число хромосом варьирует от 12 до 84. Однако, у многих видов льна числа хромосом, определенные разными исследователями, различались. Даже в кариотипе наиболее хозяйственно важного возделываемого вида L. usitatissimum L. насчитывали два числа хромосом 2n = 30 и 2n = 32. Хромосомы у льнов имеют сходную морфологию (в основном это метацентрики), и их размеры колеблются от 1 мкм до 6 мкм [Ray, 1944; Болховских и др.,, 1969; Rogers и др.,  1972; Chennaveeraiah, Joshi, 1983].

При изучении кариотипов видов из 6 секций рода Linum L. нами впервые установлены хромосомные числа у L. squamulosum Rudolphi (2n = 18), L. komarovii Juz. (2n = 18), L. thracicum Degen. (2n = 28+1-6B) и L. czernjajevii Klokov (2n = 28+1-6B); уточнены хромосомные числа у L. decumbens  Desf. ( 2n = 16), L. narbonense L. (2n = 28), L. stelleroides Planch. (2n = 18), L. pallescens Bunge (2n = 18). На основании исследований кариотипов 22 долгунцовых и масличных сортов льна, а также межеумков было подтверждено, что число хромосом у L.  usitatissimum - 2n = 30.

До настоящего исследования ни у одного вида льна по результатам монохромного окрашивания в кариотипе не были идентифицированы пары гомологов. В результате дифференциального окрашивания в хромосомах всех изученных видов были выявлены С/DAPI-бэнды, самые крупные из которых располагались преимущественно в прицентромерных районах, а средние и небольшие - в теломерных и интеркалярных районах хромосом. На хромосомах всех изученных видов были локализованы пробы 26S и 5S рДНК. В геномах большинства видов льнов обнаружены 1-2 основных локуса 26S рДНК, ко-локализованные с 5S рДНК, а также 1-3 отдельных локуса 5S рДНК. Исключение составили два вида секции Linopsis (syn.= Linastrum), в геномах которых 5 из 9 пар хромосом несут сайт 26S рДНК и одна - 5S рДНК. На основании изучения морфологии хромосом, рисунков С/DAPI-окрашивания и результатов FISH-анализа удалось провести полную идентификацию хромосом в кариотипах всех исследованных видов. В кариотипах видов секции Syllinum впервые были выявлены и охарактеризованы В-хромосомы.

2.6.2. В-хромосомы.

В кариотипах видов секции Syllinum: L. flavum L., L. capitatum Kit. еx Schultes, L. campanulatum L., L. thracicum Degen, L. tauricum Willd, L. elegans Sprun. ex Boiss., L. czerniajevii Klokov нами были обнаружены добавочные хромосомы (В-хромосомы), число которых варьировало в клетках корневой меристемы от 1 до 6, а у некоторых растений эти хромосомы отсутствовали вовсе.

       Установлено, что В-хромосомы в кариотипах исследованных видов имеют сходную структуру. В подавляющем большинстве случаев они представляют собой субметацентрики длиной около 1 мкм, и являются самыми маленькими хромосомами в наборе. Они гетеропикнотичны, интенсивно окрашиваются DAPI и СМА (Рис. 26-III), содержат множественные сайты 5S и 26S рДНК (Рис. 26-IV), которые не проявляют функциональной активности (Рис. 26-II). В- хромосомы с такой морфологией мы назвали  "основным морфологическим типом" (Рис. 26-IV).

Рис 26. В-хромосомы видов секции Syllinum. I Ц С-окраска хромосом и ядра L.flavum; II Ц Ag-ЯОР-окрашивание профазных хромосом L.flavum (а) и его совмещение с последующим DAPI-окрашиванием (б); III Ц CMA-окрашивание В-хромосом в профазе (а), ядре (б) и сравнение рисунков окраски CMA и DAPI метафазных В-хромосом; IV Ц основной морфологический тип В-хромосом у разных видов, представлено инвертированное изображение DAPI-окрашивания и рядом та же хромосома с локализацией 26S рДНК (зеленый сигнал) и 5S рДНК (красный сигнал); V Ц иногда встречаемые атипичные В-хромосомы (а) и ассоциации В-хромосом (б).

Иногда встречаются другие морфологические типы В-хромосом - метацентрики и мелкие акроцентрики (Рис. 26-Vа). Возможно, что такие "атипичные" хромосомы образуются из В-хромосом основного типа в результате хромосомных перестроек. В некоторых метафазных пластинках обнаружены В-хромосомы, объединённые в кластеры, напоминающие по форме грозди винограда (Рис. 26-Vб). Следует отметить, что хотя по размеру и рисунку DAPI-бэндинга В-хромосомы иногда бывает трудно отличить от самых мелких хромосом постоянного набора (А-хромосом), наличие генов рибосомных РНК в В-хромосомах позволяет надежно их идентифицировать. Исследование В-хромосом у видов секции Syllinum позволило точно установить число А-хромосом в их кариотипах (2n = 28).

2.6.3. Сравнительные молекулярно-цитогенетические исследования видов льна.

Все исследованные виды льнов были разделены на 8 групп на основании сходства их кариотипов. Виды, объединенные в одну группу, имели сходную структуру кариотипов, а межвидовые различия, выявленные по рисунку С/DAPI-окраски хромосом и расположению рибосомных генов, были представлены небольшим числом реципрокных хромосомных транслокаций или перицентрических инверсий. В то же время, кариотипы видов, входящих в разные группы, значительно отличались друг от друга как по размерам, числу хромосом и рисункам их дифференциального окрашивания, так и по числу и расположению на хромосомах рДНК локусов. Кариограммы и идиограммы одного из видов, принадлежащих к каждой группе представлены на рисунке 27.

Первую группу составили виды с 2n = 18 из секций Adenolinum и Stellerolinum. Хромосомы вида L. stelleroides Planch., который систематики выделяют  в монотипную секцию Stellerolinum Juz. ex Probat. [Юзепчук, 1949], по рисунку С/DAPI-окраски и расположению рибосомных генов оказались схожими с видами из секции Adenolinum (L. austriacum subsp. austriacum L., L. austriacum subsp. еuxinum Juz. (=L. squamulosum Rudolphi), L. leonii F.W. Schultz, L. perenne L., L. lewisii Pursh., L. komarovii Juz., L. altaicum Ledeb., L. mesostylum Juz., L. pallescens Bunge.). По-видимому, морфологические и анатомические отличия видов этих секций обусловлены различиями их геномов на молекулярном уровне, не детектируемыми цитогенетическими методами.

Секция Linum  разделилась три группы с 2n = 30, 2n = 16 и 2n = 28. Следует отметить, что близкородственные 30-хромосомные виды L. usitatissimum L. и L. bienne Mill. отличаются  от  L. angustifolium Hunds. перицентрической инверсией хромосомы 3. Эти виды и виды L. grandiflorum Desf. и L. decumbence Desf. с 2n = 16 секции Linum, хотя и различаются плоидностью, но похожи по рисункам С/DAPI-окраски многих хромосом набора и расположению рибосомных генов. Высокое сходство рисунков С/DAPI-бэндинга наблюдается также между этими видами секции Linum и видами секций Adenolinum и Stellerolinum. При этом кариотипы последних, по нашим данным, отличаются от 16-хромосомных видов по наличию, по крайне мере, одной транслокации и дупликации по хромосоме 8. Таким образом, результаты хромосомного анализа подтверждают общность происхождения вышеуказанных видов секций Linum, Adenolinum и Stellerolinum.

Рис. 27. Кариограммы и идиограммы DAPI/С-окрашенных хромосом  с локализацией 26S и 5S рДНК представителей различных секций рода Linum L. * ЦЗнаком (?) помечены спорные таксоны.

Вид L. narbonense L. резко отличался как по числу и размерам хромосом, так и по рисунку их С/DAPI-окраски и расположению рибосомных генов от других видов секции Linum. Анализ хромосом по молекулярно-цитогенетическим маркерам выявил тетраплоидную природу генома этого вида. По морфологии и размерам хромосомы L. narbonense скорее схожи с таковыми у L. hirsutum L. секции Dasylinum и видами секции Syllinum (2n = 28+B), что согласуется с мнением ботаников, считающих L. narbonense переходным видом, систематическое положение которого нуждается в уточнении [Светлова, 2007; Оптасюк, 2007].

Как уже говорилось выше, обнаружение в кариотипах видов L. flavum, L. capitatum, L. campanulatum, L. thracicum, L. tauricum, L. elegans, L. czerniajevii секции Syllinum В-хромосом, позволило установить, что число хромосом в основном хромосомном наборе этих видов равно 28. Обнаружено, что основные А-хромосомные наборы всех этих видов сходны по размерам хромосом, рисунку C/DAPI бэндинга и локализации рДНК. У двух видов L. capitatum и L. czerniajevii выявлено по одной реципрокной транслокации хромосом.

Особняком от остальных видов секции Syllinum стоит 26 хромосомный вид L. nodiflorum L. Хромосомы этого вида имеют значительно меньшие размеры по сравнению с хромосомами других видов этой секции, В-хромосом у этого вида не обнаружено. Кроме того, L. nodiflorum отличается от других видов секции по расположению и количеству  локусов генов рибосомных РНК. Следует, однако, отметить, что, несмотря на различия в размерах, хромосомы L. nodiflorum схожи с хромосомами других видов секции по рисунку С/DAPI-бэндинга. Последнее указывает на то, что L. nodiflorum имеет все же отдаленное родство с 28-хромосомными видами секции. Результаты молекулярно-цитогенетического анализа позволяют предположить, что в процессе формирования кариотипа L. nodiflorum имело место по крайней мере одно хромосомное слияние. Выявленные геномные отличия L. nodiflorum от других видов секции Syllinum хорошо согласуются с мнением некоторых систематиков о необходимости выделения этого вида в отдельную секцию Tubilinum [Светлова, 2006].

Две отдельные группы составляли виды секций Dasilinum и Linopsis. Кариотип L. hirsutum L. subsp hirsutum секции Dasylinum состоит из 16 хромосом, имеющих самые крупные размеры среди льновых. По рисункам С/DAPI-бэндинга и расположению рибосомных генов хромосомы этого вида схожи с отдельными хромосомами L. narbonense,  L. nodiflorum и видов из секции Linopsis. 

Кариотипы L. suffruticosum L. subsp. salsoloides (Lam.) Rouy. и L. tenuifolium L. секции Linopsis (syn. Linastrum) представлены 9 парами сходных по рисункам С/DAPI-бэндинга хромосом. Эти виды различаются по наличию транслокации между хромосомами, несущими гены рРНК. Поэтому у L. tenuifolium на одной из 5 спутничных хромосом в разных плечах расположены сайт ко-локализованных 26S и 5S рДНК и отдельный сайт 5S рДНК. Таким образом, у этих видов представлены практически все морфологические типы хромосом, несущих гены рРНК, которые имеются у видов из других секций.

Параллельно с комплексным хромосомным анализом для этих же видов льна был проведен анализ геномного полиморфизма с помощью высокоразрешающнго метода RAPD-PCR в полиакриламидном геле. В результате была построена UPGMA-дендрограмма геномной близости видов рода Linum (Рис. 28).

Рис. 28. Дендрограмма генетической близости видов различных секций рода Linum L., построенная по результатам RAPD-анализа.

Результаты RAPD-анализа хорошо согласуются с данными кариологического исследования. Обнаружено, что группы видов, имеющие сходную структуру кариотипа, имеют и низкий уровень межгеномной дивергенции и кластеризуются совместно. Так, виды секций Adenolinum и Stellerolinum попали в один кластер, а L nodiflorum кластеризуется отдельно от 28-хромосомных видов секции Syllinum. Отдельный кластер формирует вид секции Dasylinum. 30- и 16- хромосомные виды Linum и L. narbonense также формируют три отдельных кластера. Исключение составили виды секции Linopsis: L. suffruticosum subsp. salsoloides (Lam.) Rouy. и L. tenuifolium L. Для них выявлен высокий уровень межгеномной дивергенции, несмотря на то, что, по нашим данным, их кариотипы различаются по одной реципрокной транслокации. Систематика этих видов до сих пор не вполне ясна. У них была выявлена значительная межпопуляционная изменчивость по морфологическим признакам, и в то же время существует мнение, что L. suffruticosum и L. tenuifolium являются подвидами, а не самостоятельными видами [Nicholls, 1985].

2.6.4. Хромосомные числа видов рода Linum.

Предполагается, что предковая форма рода Linum (Protolinum) могла иметь основное число хромосом равное 8 или 9. Эти числа встречаются у диплоидных видов рода, отнесенных к разным филогенетическим ветвям. Виды секций Adenolinum, Stellerolinum и Linopsis имеют n = 9, а виды секции Linum, Dasylinum и Cathartolinum имеют n = 8.

Рис. 29. Гипотетическое эволюционное древо хромосомных чисел рода Linum L.

Ранее на основании анализа кариотипов при монохромном окрашивании хромосом было построено предполагаемое эволюционное древо рода Linum, в основание которого был помещен диплоидный вид c основным числом хромосом n = x = 9 [Chennaveeraiah and Joshi, 1983]. Если предположить, что исходным было число хромосом n = x = 8, то оказывается, что редукция хромосомных чисел имела место только у полиплоидных видов льна (n = 13, 14, 15), а диплоидные виды с n = 9, 10 могли возникнуть вследствие хромосомных дупликаций. На наш взгляд это наиболее простое объяснение изменчивости основного числа хромосом у льнов (Рис. 29).

Как показало проведенное нами кариологическое исследование, в процессе видообразования льновых происходила полиплоидизация, различные хромосомные перестройки, в частности, хромосомные слияния, а также могла иметь место полисомия и утрата хромосом полиплоидами, что и привело к существующему разнообразию хромосомных чисел у видов рода Linum. Поэтому в настоящий момент не представляется возможным достоверно установить, какое именно основное хромосомное число было исходным у льнов. Возможно, что это число было даже более низким, чем у ныне живущих диплоидных видов. В связи с этим следует упомянуть, что на основании недавно проведенного молекулярно-филогенетического исследования последовательностей внутренних нетранскибируемых спейсеров генов 45S рРНК и нескольких генов генома хлоропластов, было высказано мнение, что род Linum не является монофилетическим [McDill et al., 2009]. Если это действительно так, то единого для рода Linum исходного хромосомного числа может и вовсе не существовать.

Таким образом, сравнительное молекулярно-кариологическое исследование видов рода Linum L. позволило подтвердить их филогенетические связи. В то же время обнаружено, что систематика рода не вполне совершенна, и хочется надеяться, что полученные нами результаты помогут уточнить таксономию рода Linum L.

Заключение.

В работе представлен комплекс методов, позволяющих осуществлять детальное  изучение хромосомной организации геномов растений, включая надежную идентификацию малоинформативных (небольшие размеры и/или бедность рисунков С-окраски) индивидуальных хромосом. Использование метода выявления рисунков ранней репликации хромосом открывает широкие возможности не только для идентификации хромосом, но и для более глубокого исследования последовательности репликации ДНК у растений. Применение ДНК-интеркаляторов тормозит процесс конденсации митотических хромосом, что приводит к повышению разрешающей способности дифференциального окрашивания и FISH с различными маркерными последовательностями ДНК. Оптимизация программно-аппаратного комплекса регистрации и анализа изображений значительно облегчает, ускоряет и делает более объективными исследования хромосомной организации геномов растений даже с очень мелкими хромосомами. Четкая идентификация индивидуальных хромосом на препаратах, полученных с помощью щадящих структуру ДНК процедур, может служить в качестве кариологической основы при осуществлении проектов тотального секвенирования геномов хозяйственно-ценных мелкохромосомных растений, поскольку открывает возможность получать хромосомо- и локус-специфические клонотеки с помощью микродиссекции и способствовать созданию генных контигов различной протяженности.

Применение комплексного подхода для одновременного сравнительного исследования кариотипических особенностей и геномного полиморфизма видов льна показало, что на уровне секций результаты, полученные с помощью цитогенетических и молекулярных методов полностью совпадают. На видовом уровне крупные геномные реорганизации, такие как хромосомные перестройки, выявляются методами хромосомного анализа, а мелкие геномные реорганизации - методом RAPD-анализа. Таким образом, с помощью RAPD-анализа можно оценить степень генетической близости родственных геномов, а хромосомный анализ позволяет выявить различия в хромосомной организации геномов, и , следовательно, оба подхода хорошо дополняют, но не заменяют друг друга. Результаты исследования геномов видов секций Linum, Syllinum, Adenolinum, Stellerolinum, Dasylinum и Linopsis важны не только для решения разнообразных проблем эволюционной и сравнительной геномики льна, но и для развития генетических и молекулярных основ селекции льна посевного. Изучение геномов различных видов льновых продолжается, однако уже сейчас можно утверждать, что полученные нами сведения об их кариотипах заложили цитогенетические основы для проведения тотального секвенирования генома L. usitatissimum L. Осуществление этого проекта помогло бы разрешить многие проблемы селекции культурного льна, а также систематики и эволюции видов рода Linum L. на основе новых сведений, которые можно получить методами сравнительной геномики.

ВЫВОДЫ

1. Разработан комплекс цитогенетических методов (выявление рисунка ранней репликации хромосом растений, задержка конденсации митотических хромосом с помощью 9-АМА, OR-бэндинг, Q-подобный DAPI-бэндинг и применение новых флуоресцентных лигандов, созданных на базе красителя Hoecht, -  DB(8) и DB(17), для получения высококонтрастного флуорохромного бэндинга), и повышающий разрешающую способность анализа хромосомной организации геномов растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком дифференциального окрашивания.
2. Показано, что FISH-картирование универсальных молекулярных зондов (рДНК, теломерный повтор) не только облегчает идентификацию хромосом и выявление хромосомных перестроек в кариотипах растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком С-бэндинга, но и дает возможность более точно устанавливать взаимотношения родственных геномов. Для растений с небольшими геномами и мелкими хромосомами FISH-картирование геномной ДНК или ее фрагментов из геномных библиотек перспективно для получения дополнительных маркеров, позволяющих проводить успешную идентификацию их хромосом.
3. Применение последовательно или одновременно нескольких молекулярно-цитогенетических методов в сочетании с оптимизацией программно-аппаратного комплекса получения и анализа изображений значительно расширяет возможности исследования хромосомной организации геномов растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком дифференциального окрашивания.
4. По рисункам ранней репликации идентифицированы 13 пар гомологов в геноме A1 диплоидного хлопчатника G. herbaceum и 26 пар - в геноме (AD)2 аллотетраплоидного хлопчатника G. barbadense. Хромосомы генома (AD)2 были разделены на субгеномы Ab и Db. Сходство рисунков ранней репликации не только в A1 и Ab геномах, но и в Db геноме свидетельствует о консервативности последовательности репликации ДНК в родственных геномах.
5. С применением 9-АМА впервые проведено морфометрическое исследование хромосом одноклеточных красных водорослей. Показано, что число хромосом может быть использовано для уточнения таксономии класса Cyanidiophyceae (Rhodophyta). Обнаружено, что изученные виды, относящиеся к наиболее примитивным эукариотам, обладают и практически самыми малыми геномами, что демонстрирует зависимость хромосомной организации генома, от его размера.
6. Cравнительное исследование хромосом по рисункам С- и OR-бэндинга в кариотипах трех сортов ромашки аптечной ( M. chamomilla L.) показало, что они различались по полиморфизму С-блоков и не различались по рисункам OR-бэндинга. По сходству рисунков С-окраски хромосом обнаружено, что дикорастущий вид M. inodora является автотетраплоидом, субгеномы которого сходны с геномом M. maritima , который был обозначен Mm. Его сравнение с Mch-геномом ромашки аптечной выявило сходство морфологии хромосом и рисунков распределения позиций гетерохроматических районов по длине хромосом, что говорит об общности их происхождения.
7. По рисункам OR-бэндинга, С/DAPI-бэндинга, распределению на хромосомах рибосомных генов и теломерного повтора, а также их активности, проведено сравнительное исследование кариотипов 8 сортов и 4 линий гороха посевного. RAPD-анализ обнаружил деление их на кластеры в четком соответствии с сортовой принадлежностью. Продемонстрировано, что даже небольшие специфические особенности геномов сортов и линий гороха могут служить основой для их идентификации. C помощью высокоразрешающего DAPI-бэндинга проведено точное картирование разрывов в хромосомах транслокационных линий гороха M-10 и L-108.
8. Сравнительное исследование геномов двухромосомных видов злаков Zingeria и Colpodium по молекулярно-цитогенетическим маркерам хромосом и последовательностям внутренних транскрибируемых спейсеров генов 45S рРНК (ITS1 и ITS2) позволило установить, что эти два близких рода имеют монофилетическое происхождение.
9. По рисункам С/DAPI-бэндинга и расположения генов рРНК идентифицированы все хромосомы; составлены кариотипы и построены идиограммы хромосом в геномах рода линум L. У видов секции Syllinum впервые  охарактеризованы В-хромосомы, что позволило уточнить число А-хромосом (2n=28) в их кариотипах.
10. По результатам анализа кариотипов 26 видов льнов из секций Linum  Adenolinum, Stellerolinum, Dasylinum, Syllinum и Linopsis рода Linum разделились на 8 групп. Внутри этих групп виды различались по хромосомным перестройкам и плоидности. Результаты RAPD-анализа хорошо согласовались с данными кариологического исследования. Обнаружено, что группы видов льной, имеющие сходную структуру кариотипа, имеют и низкий уровень межгеномной дивергенции и кластеризуются совместно.
11. Подтверждена таксономическая обособленность секций Adenolinum, Dasylinum, Linopsis и Tubilinum. Не обнаружено различий видов секций Stellerolinum и Adenolinum. Виды секции Linum разделились на три геномных группы, что позволяет использовать кариотип как дополнительный таксономический признак при уточнении сложного систематического статуса этой секции.
12. Молекулярно-кариологическое исследование видов рода Linum L. позволило подтвердить их филогенетические связи. Обнаружено, что секции Linum, Adenolinum и Stellerolinum имеют общего предка. Изучение геномов различных видов льновых продолжается, однако уже сейчас можно утверждать, что полученные нами сведения об их кариотипах заложили цитогенетические основы для начала тотального секвенирования генома L. usitatissimum L.

Список публикаций.

а. статьи в рецензируемых журналах:

1. Муравенко О.В., Бадаев Н.С., Руденко М.И., Пухальский В.А., Зеленин А.В. Закономерности становления и организации генома злаков. Сообщение II. Хромосомный полиморфизм межсортовых гибридов ячменя. Генетика. 1990. Т. 26. N 6. С. 1070-1078.
2. Муравенко О.В., Бадаев Н.С., Каррыева Г.В., Зеленин А.В. Использование "хромосомного паспорта" как цитогенетической характеристики ячменя. Доклады ВАСХНИЛ. 1990. N 3. С. 4-8.
3. Badaeva E.D., Sozinova L.F., Badaev N.S., Muravenko O.V., Zelenin A.V. "Chromosomal passport" of Triticum aestivum L.em Thell cv. Chinese spring and standardization of chromosomal analysis of cereals. Cereal Res. Commun. 1990. V.18. N 4. P. 273-281.
4. Саматадзе Т.Е., Муравенко О.В., Климахин Г.И., Зеленин А.В. Изучение внутривидового полиморфизма по рисунку С-окрашивания хромосом Matricaria chamomilla L. (syn.= M.recutita L.). Генетика. 1997. T. 33. C. 130-132.
5. Муравенко О.В., Саматадзе Т.Е., Зеленин А.В. Компьютерный и визуальный анализ G-подобного бэндинга хромосом ромашки аптечной. Биологические мембраны. 1998. Т.15. С. 670-678.
6. Саматадзе Т.Е., Муравенко О.В., Зеленин А.В. Сравнение С-окрашенных хромосом в кариотипах трех видов рода Matricaria L. Генетика. 1998. T. 34. C. 1720-1724.
7. Muravenko O.V., Fedotov A.R., Punina E.O., Fedorova L.I., Grif V.G., Zelenin A.V. Comparison of chromosome BrdU-Hoechst-Giemsa banding patterns of the A1 and (AD)2 genomes of cotton. Genome. 1998. V. 41. P. 616- 625.
8. Kashuba V.I., Gizatullin R.Z., Protopopov A.I., Li J., Vorobieva N.V., Fedorova L.I., Zabarovska V.I., Muravenko O.V., Kost-Alimova M.V., Domninsky D.A., Kiss C., Allikmets R., Zakharyev V.M., Braga E.A., Sumegi J., Lerman M., Wahlestedt C., Zelenin A.V., Sheer D., Winberg G., Grafodatsky A., Kisselev L.L., Klein G., Zabarovsky E.R. Analysis of NotI linking clones isolated from human chromosome 3 specific libraries. Gene. 1999. V.239. N. 2. P. 259-271.
9. Zabarovska V.I., Li J., Muravenko O.V., Fedorova L.I., Braga E.A., Ernberg I., Wahlestedt C., Klein G.,. Zabarovsky E.R. CIS - cloning of identical sequences between two complex genomes. Chrom.Res. 2000. V.8. N 1. P. 77-84.
10. Zabarovsky E.R., Gizatullin R.Z., Podowski R.M., Zabarovska V.I., Xie L., Muravenko O.V., Kozyrev S., Petrenko L., Skobeleva N., Li J., Protopopov A.I., Kashuba V.I., Wasserman W., Ernberg I., Winberg G., Wahlestedt C. Not-I clones in the analysis of the human genome. Nucl. Acids Res. 2000. V.28. N 7. P. 1635-1639.
11. Muravenko O.V., Gizatullin R.Z., Protopopov A.I., Kashuba V.I., Zabarovsky E.R., Zelenin A.V. Assignment of CDK5R2 coding for the cyclin-dependent kinase 5, regulatory subunit 2 (NCK5AI protein) to human chromosome band 2q35 by fluorescent in situ hybridization. Cytogenet. Cell Genet. 2000. V.89. N 3-4. P.160-161.
12. Gizatullin R.Z., Muravenko O.V., Al-Amin A.N., Wang F., Protopopov A.I., Kashuba V.I., Zelenin A.V., Zabarovsky E.R. Human COP9 homolog gene. Map position 2q37. Chrom.Res. 2000.V. 8. N 6. P. 559.
13. Gizatullin R.Z., Muravenko O.V., Al-Amin A.N., Wang F., Protopopov A.I., Kashuba V.I., Zelenin A.V., Zabarovsky E.R. Human NRG-3 gene maps to position 10q22-q23. Chrom.Res., 2000. V. 8. N 6. P. 560.
14. Muravenko O.V., Gizatullin R.Z., Al-Amin A.N., Protopopov A.I., Kashuba V.I., Zelenin A.V., Zabarovsky E.R. Human SS13 gene. Map position 17q25.3. Chromosome Res. 2000. V. 8. N 6. P. 561.
15. Muravenko O.V., Gizatullin R.Z., Al-Amin A.N., Protopopov A.I., Kashuba V.I., Zelenin A.V., Zabarovsky E.R. Human ALY/BEF gene maps to position 17q25.3. Chrom. res. 2000. V. 8. N 6. P. 562.
16. Muravenko O.V., Kashuba V.I., Kutsenko A.S., Gizatullin R.Z., Protopopov A.I., Kvasha S.M., Al-Amin A.N., Zelenin A.V., Zabarovsky E.R. Human Harakiri (HRK) gene maps to position 12q13.1. Chrom. Res. 2000. V. 8. N 7. P.656.
17. Муравенко О.В., Саматадзе Т.Е., Попов К.В., Амосова А.В., Зеленин А.В. Полиморфизм гетерохроматических районов хромосом льна. Биологические мембраны. 2000. T. 17. N 6. C. 599-603.
18. Samatadze T.E., Muravenko O.V., Popov K.V., Zelenin A.V. Genome comparison of the Matricaria chamomilla L. varieties by the chromosome C- and OR-banding patterns. Caryologia. 2001. V. 54. N 4. P. 299-306.
19. Муравенко О.В., Саматадзе Т.Е., Попов К.В., Амосова А.В., Зеленин А.В. Сравнительное исследование геномов двух видов льна по рисункам С-окраски хромосом. Генетика. 2001.T. 37. N 3. C. 332-335.
20. Попов К.В., Муравенко О.В., Саматадзе Т.Е., Амосова А.В., Зеленин А.В. Особенности изучения гетерохроматических районов в мелких хромосомах растений. Доклады Академии Наук. 2001. Т. 381. N 4. С. 562 - 565.
21. Муравенко О.В., Бадаева Е.Д., Амосова А.В., Шостак Н.Г., Попов К.В., Зеленин А.В. Локализация на хромосомах ячменя ДНК-проб рибосомных генов человека. Генетика. 2001. T. 37. N 12. C. 1721-1724.
22. Зеленин А.В., Бадаева Е.Д., Муравенко О.В. Введение в геномику растений. Молекулярная биология. 2001. Т. 35. N 3. С. 339-348.
23. Muravenko O.V., Selyakh I.O., Kononenko N.V., Stadnichuk I.N. Chromosome numbers and nuclear DNA contents in the red microalgae Cyanidium caldarium and three Galdieria species. Eur. J. Phycol. 2001. V. 36. P. 227-232.
24. Badaeva E.D., Amosova A.V., Muravenko O.V., Samatadze T.E., Chikida N.N., Zelenin A.V., Friebe B., Gill B.S. Genome differentiation in Aegilops. 3. Evolution of the D-genome cluster. Plant Systematics and Evolution. 2002. V. 231. P. 163 - 190.
25. Саматадзе Т.Е., Муравенко О.В., Зеленин А.В., Гостимский С.А. Идентификация хромосом генома гороха (Pisum sativum L.) по рисунку С-окраски. Доклады Академии Наук. 2002. T. 387. C. 714 - 717.
26. Sulimova G.E., Kutsenko A.S., Rakhmanaliev E.R., Udina I.G., Kompaniytsev A.A., Protopopov A.I., Moisjak E.V., Klimov E.A., Muravenko O.V., Zelenin A.V., Braga E.A., Kashuba V.I., Zabarovsky E.R., Kisselev L.L. Human chromosome 3: integration of 60 NotI clones into a physical and gene map. Cytogenet Genome Res. 2002. V. 98. N 2-3. P. 177-183.
27. Li J., Protopopov A.I., Wang F., Senchenko V., Petushkov V., Vorontsova O., Petrenko L., Zabarovska V.I., Muravenko O.V., Braga E.A., Kisselev L.L., Lerman M.I., Kashuba V.I., Klein G., Ernberg I., Wahlestedt C., Zabarovsky E.R. NotI-specific microarrays to detect copy number and methylation changes in whole genomes. Proc Natl Acad Sci.  2002. V. 99. N 16. P. 10724-10729.
28. Kutsenko A.S., Gizatullin R.Z., Al-Amin A.N., Wang F., Kvasha S.M., Podowski R.M., Matushkin Y.G., Gyanchandani A., Muravenko O.V., Levitsky V.G., Kolchanov N.A., Protopopov A.I., Kashuba V.I., Kisselev L.L., Wasserman W., Wahlestedt C., Zabarovsky E.R. NotI flanking sequences: a tool for gene discovery and verification of the human genome. Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. N 14. P. 3163 - 3170.
29. Муравенко О.В., Лемеш В.А., Саматадзе Т.Е., Амосова А.В, Грушецкая З.Е., Попов К.В.,. Семенова О.Ю., Хотылева Л.В., Зеленин А.В. Сравнение геномов трех близкородственных видов льна и их гибридов с использованием хромосомных и молекулярных маркеров. Генетика. 2003. T. 39. N 4. C. 510-518.
30. Muravenko O.V., Amosova A.V., Samatadze T.E., Popov K.V., Poletaev A.I., Zelenin A.V. 9-aminoacridin - an efficient reagent to improve human and plant chromosome banding patterns and to standardize chromosome image analysis. Cytometry. 2003. V. 51. P.52-57.
31. Protopopov A.I., Kashuba V.I., Zabarovska V.I., Muravenko O.V., Lerman M.I., Klein G., Zabarovsky E.R. An integrated physical and gene map of the 3.5-Mb chromosome 3p21.3 (AP20) region implicated in major human epithelial malignancies. Cancer Res. 2003. V. 63. N 2. P. 404-412.
32. Cremonini R., Ruffini Castiglione M., Grif V.G., Kotseruba V.V., Punina E.O., Rodionov A.V., Muravenko O.V., Popov K.V., Samatadze T.E, Zelenin A.V. Chromosome banding and DNA methylation patterns, chromatin organisation and nuclear DNA content in Zingeria biebersteiniana. Biologia plantarum. 2003. V. 4. N 46. P. 543-550.
33. Cтадничук И.Н., Селях И.О., Муравенко О.В. Хромосомные числа видов микроводорослей класса Cyanidiophyceae (Rhodophyta) Ботанический журнал. 2003. Т.88. № 4. C. 175-176.
34. Куприянова Н.С., Шибалев Д.В., Воронов А.С., Муравенко О.В., Зеленин А.В., Рысков А.П. Сегментные дупликации прителомерных участков хромосомы 13 человека. Молекулярная биология. 2003. T. 37. N 2. C.221-227.
35. Муравенко О.В., Амосова А.В, Cаматадзе Т.Е., Семенова О.Ю., Носова И.В., Попов К.В., Шостак Н.Г., Зощук С.А., Зеленин А.В. Хромосомная локализация 5S и 45S рибосомной ДНК у видов рода Linum L. секции Linum (syn.= Protolinum и Adenolinum). Генетика. 2004. T. 40. N 2. C. 256-260.
36. Kashuba VI, Li J, Wang F, Senchenko VN, Protopopov A, Malyukova A, Kutsenko AS, Kadyrova E, Zabarovska VI, Muravenko OV, Zelenin AV, Kisselev LL, Kuzmin I, Minna JD, Winberg G, Ernberg I, Braga E, Lerman MI, Klein G, Zabarovsky ER.RBSP3 (HYA22) is a tumor suppressor gene implicated in major epithelial malignancies. Proc Natl Acad Sci. 2004. V.101. N 14. P.4906-4911.
37. Саматадзе Т.Е., Муравенко О.В., Большева Н.Л., Амосова А.В., Гостимский С.А., Зеленин А.В. Изучение хромосом сортов и транслокационных линий гороха посевного (Pisum sativum L.) с использованием FISH, Ag-ЯОР и DAPI- дифференциального окрашивания. Генетика. 2005. T. 41. N 12. C. 1665 - 1673.
38. Носова И.В., Семенова О.Ю., Саматадзе Т. Е., Амосова А.В., Большева Н.Л., Зеленин А.В., Муравенко О.В. Исследование структуры кариотипа и картирование рибосомных генов на хромосомах дикорастущих видов рода Linum с помощью флуоресцентной гибридизации in situ. Биологические мембраны. 2005. T. 22. C. 227Ц231.
39. Зощук Н.В., Бадаева Е.Д., Муравенко О.В., Зеленин А.В.  Хромосомный анализ в геномную эру.  Биологические мембраны. 2005. Т.22. N 3. C. 166 - 177.
40. Большева Н.Л., Семенова О.Ю., Муравенко О.В., Носова И.В., Зеленин А.В. Локализация теломерных последовательностей в хромосомах двух видов льна. Биологические мембраны. 2005. Т. 22. N 3. C. 244-248.
41. Семенова О.Ю., Саматадзе Т.Е., Зеленин А.В., Муравенко О.В. Сравнительное изучение геномов видов льна секций Adenolinum и Stellerolinum с использованием флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Биологические мембраны. 2006. Т. 23. N 6. С. 453-460.
42. Муравенко О.В., Саматадзе Т.Е., Попов К.В., Юркевич О.Ю., Носова И.В., Большева Н.Л., Зеленин А.В.. Площадь гетерохроматических районов в ядрах и хромосомах как показатель изменчивости генома культурного льна. Биологические мембраны. 2007. T. 24. N 6. C. 435-441.
43. Носова И.В., Светлова А.А., Большева Н.Л., Муравенко О.В. Хромосомные числа видов секции SYLLINUM рода LINUM (LINACEAE). Ботанический журнал. 2008. T. 91. N 9. C. 138-143.
44. Саматадзе Т.Е., Зеленина Д.А., Шостак Н.Г., Волков А.В., Попов К.В., Рачинская О.А., Борисов А.Ю., Тихонович И.А., Зеленин А.В., Муравенко О.В. Сравнительный анализ геномов сортов и линий гороха посевного (Pisum sativum L.) с помощью хромосомных и молекулярных маркеров. Генетика. 2008. T. 44. N 12. С. 1644-1651.
45. Зеленин А.В., Муравенко О.В. 16-я Международная хромосомная конференция Амстердам, Нидерланды, 25-29 августа 2007. Биологические мембраны. 2008. T. 25. N 2. C. 164-169.
46. Попов К.В., Егорова Е.И., Иванов А.А., Громыко А.В., Жузе А.Л., Большева Н.Л., Юркевич О.Ю., Муравенко О.В., Зеленин А.В. Димерные бисбензимидазольные красители на основе Hoechst 33258 Цновые ДНК-специфическые флуорохромы для цитогенетики человека и растений. Биологические мембраны. 2008. T. 25. N 3. C. 163-170.
47. Muravenko O.V., Yurkevich Yu.O., Bolsheva N.L., Samatadze T.E., Nosova I.V., Zelenina D.A., Volkov A.A., Popov K.V., Zelenin A.V. Comparison of genomes of eight species of sections Linum and Adenolinum from the genus Linum based on chromosome banding, molecular markers and RAPD analysis. Genetica. 2009. V. 135. P. 245-255.
48. Амосова А.В., Бадаева Е.Д., Муравенко О.В., Зеленин А.В. Усовершенствование метода геномной гибридизации in situ (GISH) для разделения близкородственных геномов тетраплоидных и гексаплоидных видов пшеницы. Онтогенез. 2009. T. 40. N 2. С. 120-125.
49. Павлова Т.В., Кашуба В.И., Муравенко О.В., Иенамантра П.С., Иванова Т.А., Забаровская В.И., Рахманалиев Э.Р., Петренко Л.А., Пронина И.В., Логинова В.И., Юркевич О.Ю., Киселев Л.Л., Зеленин А.В., Забаровский Е.Р. Технология анализа эпигенетических и структурных изменений хромосомы 3 человека. Молекулярная биология. 2009. Т.43. N 2. С.339-347.
50. Юркевич О.Ю., Светлова А.А., Муравенко О.В. Числа хромосом некоторых видов секций Linum, Adenolinum и Stellerolinum рода Linum (Linaceae) Ботанический журнал. 2009. T. 94. N 4. C. 588-596.
51. Муравенко О.В., Зеленин А.В. Исследование хромосомной организации геномов мелкохромосомных растений Генетика. 2009. Т.45. N 11. С.1457-1471.
52. Ким Е.С., Большева Н.Л., Саматадзе Т.Е., Носов Н.Н., Носова И.В., Зеленин А. В., Пунина Е.О., Муравенко О.В., Родионов А.В. Уникальный геном двухромосомных злаков Zingeria и Colpodium, его происхождение и эволюция. Генетика. 2009. Т.45. N 11. С.1472-1482.

б. Избранные статьи в тематических сборниках

1. Зеленин А.В., Бадаева Е. Д., Муравенко О. В., Зощук Н.В. Структура генома и биотехнология растений. В кн. "Изучение генома и генетическая трансформация растений". М: Наука, 2001. С. 13-26.
2. Muravenko O.V., Badaev N.S., Badaeva E.D., Kost M.V., Pukhalskiy V.A., Zelenin A.V. Standardization of chromosome analysis of barley. Proc. VI International barley genetics symposium. L. Munck. Munksgaard Int. Publ. Ltd., Copenhagen, 1991. V. 1. P.293-296.
3. Muravenko O.V., Badaev N.S., Pukhalskiy V.A., Zelenin A.V. C-banding polymorphism of barley heterosis hybrids. Proc. VI International barley genetics symposium. L. Munck. Munksgaard Int. Publ. Ltd., Copenhagen, 1991. V. 1. P 290-292.
4. Муравенко О.В., Бадаев Н.С. Полиморфизм С-блоков хромосом в кариотипе ячменя. Tруды ТОГИС "Генетико-селекционные исследования в Туркменистане". Ашхабад: Ылым, 1991. С. 120-131.
5. Muravenko O.V., Fedotov A.R., Bolsheva N.L., Fedorova L.I., Zelenin A.V. Comparison of different high resolution patterns in barley chromosomes. Proc. V International oat conference & VII International barley genetics symposium. 1997. V. 1. P. 360-362.
6. Муравенко О.В., Амосова А.В., Кост М.В., Саматадзе Т.Е., Федорова Л.И. Исследование молекулярной организации хромосом растений. В сб. "Информационный бюллетень РФФИ". 1997. Т. 5. N4. С. 213.
7. Попов К.В, Муравенко О.В., Саматадзе Т.Е., Зеленин А.В. Компьютерный и визуальный анализ С- и G- дифференциально окрашенных хромосом Zingeria biebersteiniana. Труды III Международного симпозиума "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования". РАСХН, М.-Пущино, 1999. Ч.4. С. 36-38.
8. Саматадзе Т.Е., Муравенко О.В., Зеленин А.В. Сравнение С-окрашенных хромосом в трех видов рода Matricaria L. Труды III Международного симпозиума "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования". РАСХН, М.-Пущино, 1999. Ч.4. С. 42-44.
9. Муравенко О.В., Назарова М.А., Бадаева Е.Д., Померанцева Г.В., Зеленин А.В. Внутривидовой полиморфизм С-блоков хромосом дикорастущего ячменя (Hordeum spontaneum C.Koch) из разных мест произрастания. Труды IV Международного симпозиума "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования". М. 2001. Т. 2. С. 225-227.
10. Селях И.О., Муравенко О.В., Кононенко Н.В., Стадничук И.Н. Хромосомные числа и содержание ядерной ДНК у красных микроводорослей Cyanidium и Galdieria. Труды IV Международного симпозиума "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования". М., 2001. Т. 2. С. 302-304.
11. Муравенко О.В., Саматадзе Т.Е., Попов К.В., Амосова А.В., Лемеш В.А., Хотылева Л.В., Зеленин А.В. Сравнительное исследование двух видов льна. Труды IV Международного симпозиума "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования". М., 2001. Т. 2. С. 228-230.
12. Zabarovsky E.R., Kashuba V.I., Li J., Kutsenko A.S., Protopopov A.I., Petrenko L., Wang F., Senchenko V.N., Kadyrova E., Zabarovska V.I., Muravenko O.V., Zelenin A.V., Kisselev L.L., Winberg G., Ernberg I., Braga E.A., Lerman M.I., Klein G. Restriction site tagged passports and microarrays for analysis of complex biological systems. Proc. IV International conference on bioinformatics of genome regulation and structure. IC&G, Novosibirsk, 2004. V. 2. P.163-166.
13. Муравенко О.В. Особенности анализа мелких хромосом растений. Труды VII Международного симпозиума "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования". РУДН, М., 2007. T. 3. C. 251 - 254.
14. Гузенко Е.В., Лемеш В.А., Хотылева Л.В., Муравенко О.В., Зеленин А.В. ДНК полиморфизм современных сортов льна масличного. В сб. Досягнення I проблеми генетики, селекцi та биотехнологi Голов. ред. В.А.Кунах. Кив: Логос, 2007. Т.2. С.256-260.
15. Муравенко О.В., Большева Н.Л., Носова И.В., Юркевич О.Ю., Рачинская О.А., Попов К.В., Саматадзе Т.Е., Зеленин А.В. Молекулярно-цитогенетический анализ геномов видов рода Linum L. Труды VIII Международного симпозиума "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования". РУДН, М., 2009. T. 2. C. 224-227.
16. Муравенко О.В. Сравнительное изучение геномов у видов пяти секций рода Linum L. с использование хромосомных и молекулярных маркеров. В сб. "Фактори експериментально еволюцi органiзмiв." Голов. ред. В.А.Кунах. Кив: Логос, 2008. Т. 4. С. 181- 185.
17. Муравенко О.В., Большева Н.Л., Юркевич О.Ю., Носова И.В., Саматадзе Т.Е., Зеленин А.В. Изучение геномов видов шести секций рода Linum L. с помощью хромосомных и молекулярных маркеров. Труды симпозиума "Хромосомы и эволюция". Санкт-Петербург, 2008. С. 75-77.
18. Саматадзе Т.Е. Эеленина Д.А., Шостак Н.Г., Волков А.В., Попов К.В., Рачинская О.А., Борисов А.Ю., Тихонович И.А. О.Ю., Зеленин А.В., Муравенко О.В. Хромосомно-молекулярные маркеры в изучении гороха посевного В сб. "Фактори експериментально еволюцi органiзмiв." Голов. ред. В.А.Кунах. Кив: Логос, 2009. Т. 7. С. 65-68.
19. Большева Н.Л., Носова И.В., Саматадзе Т.Е., Юркевич О.Ю., Зеленин А.В., Муравенко О.В. В-хромосомы в кариотипах видов секции Syllinum рода Linum. В сб. "Фактори експериментально еволюцi органiзмiв." Голов. ред. В.А.Кунах. Кив: Логос, 2009. Т. 6. С. 39-43.
20. Муравенко О.В. Повышение разрешающей способности хромосомного анализа кариотипов мелкохромосомных растений. В сб. "Фактори експериментально еволюцi органiзмiв." Голов. ред. В.А.Кунах. Кив: Логос, 2009. Т. 6. С. 192- 197.

в. Избранные тезисы конференций.

1. Muravenko O.V., Fedorova L.I., Zelenin A.V.BrdU-Hoechst-Giemsa banding of cotton chromosomes. Vol.Abstracts 17 International Congress of Genetics.  Int. Convention Centre. Birmingham. UK. 15-21 August 1993. P.139.
2. Muravenko O.V., Bolsheva N.L., Fedorova L.I., Zelenin A.V. Comparison of different high resolution banding patterns of plant chromosomes. Abstracts 26 Annual Meeting of American Society of Cell Biology. San-Francisko, 10-14 Dec. 1994. J. Cell Biol. 1994. V. 5, suppl. P.1239.
3. Федотов А.Р., Муравенко О.В., Большева Н.Л., Саматадзе Т.Е., Зеленин А.В. Сходство организации хромосом растений с хромосомами млекопетающих, выявляемое при сравнении FPG- и G-бэндинга хромосом. XI Всероссийское совещание Структура и функции клеточного ядра. Санкт-Петербург, 1997. Цитология. 1997. Т.39: С.114.
4. Muravenko O.V., Samatadze T.E.,Fedotov A.R., Zelenin A.V. New approaches to plant chromosome study and identification: high resolution banding and image analysis. XIX International Congress ISAC.  Cytometry. 1998,. suppl. 9. P. 56.
5. Муравенко О.В., Саматадзе Т.Е., Федотов А.Р., Попов К. В., Зеленин А.В. Высокоразрешающие методы дифференциального окрашивания для исследования мелкохромосомных видов растений. XII Всероссийское совещание Структура и функции клеточного ядра. Санкт-Петербург, 1999. Цитология. 1999.Т. 41. N 12. С. 1071
6. Muravenko O., Amosova A., Popov K., Samatadze T., Poletaev A., Zelenin A. Improvement of human and plant chromosome high resolution banding patterns using 9-aminoacridine for the standardization of chromosome image analisys. XX International Congress ISAC. Cytometry. 2000. Suppl.10. P. 163-164.
7. J. Li, V. Zabarovska, O.Muravenko, E. Braga, F.Wang, V.Kashuba, E. Zabarovsky Development of new approaches for cloning different and identical sequences from two complex genomes. Abstract Jornal. XIII International Genome Sequencing and Analysis Conference, San-Diego, CA, 25-28 October, 2001. P. 86-87
8. Muravenko O.V., Samatadze T.E., Amosova A.V., K. V. Popov, O. Yu. Semenova, I.V.Nosova, A.V. Zelenin. The comparison of five related flax species genomes by different chromosome markers. International Polyploidy Conference. 27-30 April 2003, Linnean Society and Royal Botanic Gardens, Kew, p.28.
9. Муравенко О.В., Саматадзе Т.Е., Амосова А.В., Попов. К.В., Зеленин А.В. Изучение эволюции рода Linum L. с использованием различных хромосомных маркеров. Международный Симпозиум "Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология". Москва, 18-21 ноября, 2001, Труды с.115 - 116.
10. Муравенко О.В. Исследование кариотипов мелкохромосомных растений Сборник трудов V Международного совещания по кариологии, кариосистематике и молекулярной систематике растений. Санкт- Петербург, 2005 С.65-66
11. Zabarovsky E.R., Pavlova T., Ivanova T., Petrenko L., Rakhmanaliev E., Muravenko O., Pronina I., Loginov W., Saraev D., Yenamandra P.S., Senchenko V., Zabarovska V., Braga E., Skrypkina I., Rynditch A., Grigorieva E., Kiseljova N., Kiseljov F.L., Kisselev L.L., Klein G., Kashuba V., Zelenin A.V. Epigenetic analysis of cancer cells using NotI microarrays. Abstracts of Human Genome Meeting. Helsinky, 2006. P. 215.
12. Большева Н.Л., Носова И.А., Семенова О.Ю., Саматадзе Т.Е., Амосова А.В., Зеленин А.В., Муравенко О.В. Теломеры как ценный дополнительный маркер при исследовании кариотипов мелкохромосомных видов растений. XV Всероссийское совещание Структура и функции клеточного ядра. Цитология, 2005, т. 47, №9, с. 795 - 796.
13. Муравенко О.В., Т.Е. Саматадзе, Большева Н.Л., О.Ю. Юркевич, А.В. Зеленин. Особенности идентификации мелких хромосом растений. XVI Всероссийское совещание Структура и функции клеточного ядра. Санкт-Петербург, 2007. Цитология, 2007, т. 49, с. 779-780.
14. Zelenin A.V., Popov K.V., Egorova E.I., Bolsheva N.L., Ivanov A.A., Gromyko A.A., Zhuze A.L., Yurkevich O.U., Muravanko O.V. Novel AT-specific DNA-binding dimeric bis-benzimidazoles as efficient fluorochromes for cytogenetics and chromosome analysis. XXIV International Congress ISAC. 2008, p. 188.
15. Muravenko Olga, Yurkevich Olga, Samatadze Tatiana, Bolsheva Nadezhda, Zelenina Daria, Popov Konstantin, Zelenin Alexander. Chromosome evolution of flax and related species from sec. Linum and Adenolinum studied by molecular-cytogenetic analysis. Abstracts 16th International Chromosome Conference. Amsterdam, 2007. Chrom. Res., 2007, v.15, suppl. 2, p. 44.
16. Муравенко О.В., О.Ю. Юркевич, И.В. Носова, Н.Л. Большева, Т.Е. Саматадзе, О.Ю. Рачинская, К.В. Попов, Н.Г. Шостак, А.В. Зеленин Молекулярно-цитогенетическй анализ видов рода Linum L. Труды V Съезда ВОГИС. Москва, 2009. Ч.2. С.402.
17. Муравенко О.В., Большева Н.Л., Юркевич О.Ю., Носова И.В., Рачинская О.В., Саматадзе Т.Е., Зеленин А.В. Кариогеномное исследование видов рода Linum L. Международная конференция Хромосома 2009. Новосибирск, 2009. Тезисы. Т.2. С.66-67.

Список сокращений:

9-AMA - 9 аминоакридин

EB - этидий бромистый

DAPI - 4Т-6Т- Diamino-2-phenilindole

CMA - Chromomycin A3

АО - акридиновый оранжевый

OR-бэндинг - дифференциальное окрашивание хромосом ацетоорсеином

FPG (Fluorochrom Plus Giemsa)- метод детекции инкорпорированного в ДНК аналога основания (бромдезоксиуридина, фтордезоксиуридина и т.п.) с помощью последовательной обработки флуорохромом, ультрафиолетовым облучением и окрашиванием красителем Giemsa

BrdU-Hoechst-Giemsa-бэндинг - вариант FPG - метода

RAPD - Random Amplified Polimorfic DNA - полиморфизм случайно амплифицированных фрагментов ДНК

ITS - Internal Transcribed Spacer - межгенный транскрибируемый спейсер

FISH - флуоресцентная гибридизация in situ

GISH - геномная гибридизация in situ

PCR (ПЦР) - полимеразная цепная реакция

рДНК (РНК) - рибосомная ДНК (РНК)

ЯОР - ядрышкоорганизующий район

Ag-ЯОР - район ядрышкового организатора, окрашиваемый серебром

п.н. - пар нуклеатидов

БЛАГОДАРНОСТИ.

Выражаю глубокую благодарность моим коллегам  и соавторам за  плодотворное совместное сотрудничество и дружескую поддержку. Особую  признательность выражаю моему Учителю профессору А.В.Зеленину. Низкий поклон родным и близким, терпеливо перенесшим муки моего творчества.

   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии