На правах рукописи

КУЛУЕВ БУЛАТ РАЗЯПОВИЧ НОВЫЕ ПРОМОТОРЫ КАУЛИМОВИРУСОВ И КОНСТРУИРОВАНИЕ ИХ ХИМЕРНЫХ ФОРМ 03.00.04 - биохимия 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа - 2007

Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН и на кафедре биохимии и биотехнологии Башкирского государственного университета.

Научные руководители Доктор биологических наук, профессор Р.И. Ибрагимов Доктор биологических наук, профессор А.В. Чемерис Официальные оппоненты Доктор биологических наук, профессор А.Ф. Топунов Кандидат биологических наук, доцент Т.В. Маркушева

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

Защита диссертации состоится 14 ноября 2007 г. в 16 часов на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу:

450054, г. Уфа, проспект Октября, 71.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН.

Автореферат разослан л14 октября 2007 г.

Ученый секретарь Регионального диссертационного совета, к.б.н. Бикбулатова С.М.

2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. При создании трансгенных растений весьма важным является выбор промотора для обеспечения достаточного уровня экспрессии чужеродного гена. В настоящее время одним из наиболее широко используемых для этих целей служит УсильныйФ конститутивный 35S промотор, выделенный из вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК) из группы каулимовирусов (Odell et al., 1985). Этот промотор имеет в 110 раз большую эффективность (Sanders et al., 1987), чем широко применявшийся ранее, промотор нопалинсинтазы из Т-ДНК агробактерий. Однако для решения некоторых задач по созданию трансгенных растений и обеспечения достаточного уровня экспрессии белковых продуктов, экспрессионной эффективности 35S промотора оказалось недостаточно (Mitsuhara et al., 1996).

При этом во многих бинарных векторах для трансформации растений как селективный, так и маркерный (или целевой) гены находятся под контролем все того же классического 35S промотора, что может отрицательно сказываться на уровне экспрессии, а иногда приводит и к "молчанию" трансгена. В этой связи представляет значительный интерес как обнаружение новых, более эффективных промоторов, так и создание их химерных форм. И поскольку 35S промотор вируса мозаики цветной капусты оказался во многом универсальным, стали осуществляться поиски аналогичных промоторов других каулимовирусов.

Так, были выделены и исследованы промоторы каулимовирусов сои (Glycine max) (Hasegawa et al., 1989), норичника (Scrophularia californica) (Sanger et al., 1990), ночной красавицы (Mirabilis jalapa) (Dey, Maiti, 1999), земляники (F. x ananassa) (Pattanaik et al., 2004), маниока (Manihot sp.) (Samac et al., 2004). Все эти промоторы показали УсилуФ, сравнимую, а некоторые - превосходящую УсилуФ промотора вируса мозаики цветной капусты. Из известных ныне промоторов каулимовирусов оставались не исследованными таковые у вирусов мозаики георгина (ВМГ), кольцевой гравировки гвоздики (ВКГГ), желтых листовых завивок цеструма и некоторых других. Помимо поиска новых каулимовирусов, были проведены эксперименты по созданию эффективных промоторных кассет, в состав которых были включены модифицированные и гибридные с другими промоторами формы 35S промотора. Некоторые из полученных конструкций уже нашли применение в генной инженерии растений и показали высокий уровень экспрессии белковых продуктов. Например, 35S промотор с двумя энхансерными доменами показал увеличение экспрессионной активности почти в два раза (Omirulleh et al., 1993); его гибридная форма с промотором маннопинсинтазы продемонстрировала уровень экспрессии в 3-раз больший в листьях и в 10-15 раз больший в корнях различных трансгенных растений (Comai et al., 1990). Были созданы различные промоторные кассеты на основе промотора и терминатора 35S транскрипта, из которых одна форма показала увеличение уровня экспрессии в 50 раз, по сравнению с 35S промотором (Mitsuhara et al., 1996). Тем не менее, пока нет оснований считать, что самые лучшие промоторы для целей создания трансгенных растений уже найдены или сконструированы.

Одним из путей создания новых эффективных промоторов является метод направленной молекулярной эволюции in vitro. Представляет особый интерес создание химерных форм промоторов методом ДНК шаффлинга - высокоэффективного метода рекомбинации генетического материала последовательностей гомологичных белков или их доменов (Stemmer, 1994), а также промоторных последовательностей (Remans et al., 2005). В качестве родительских последовательностей ДНК здесь предпочтительно использовать эффективные природные промоторы, каковыми являются промоторы каулимовирусов, все исследованные формы которых показали весьма высокий уровень экспрессии белков в трансгенных растениях. При этом могут быть получены конструкции, более эффективные в трансгенных растениях, чем природные формы промоторов каулимовирусов.

Цели и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в выделении и исследовании новых промоторов каулимовирусов и создании их химерных форм методом ДНК шаффлинга.

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Выявление филогенетического родства каулимовирусов на основе анализа нуклеотидных последовательностей их геномов, поиск промоторных последовательностей и подбор праймеров для их амплификации;

2. Поиск и отбор инфицированных каулимовирусами растений;

3. Амплификация и клонирование промоторов вируса мозаики георгина (ВМГ) и вируса кольцевой гравировки гвоздики (ВКГГ);

4. Определение нуклеотидной последовательности промоторов ВМГ и ВКГГ и проведение сравнительного анализа с промоторами других каулимовирусов;

5. Клонирование промоторов ВМГ и ВКГГ в бинарных векторах pCambia;

6. Получение химерных форм промоторов каулимовирусов методом ДНК шаффлинга;

7. Анализ экспрессионной активности генов GUS (-глюкуронидаза) и GFP (зеленый флюресцентный белок) под контролем природных форм промоторов каулимовирусов в протопластах N.tаbacum;

8. Количественный анализ экспрессионной активности промоторов ВМГ и ВКГГ в трансгенных растениях N. tаbacum.

Научная новизна. Впервые амплифицирован и секвенирован участок генома вируса мозаики георгина, содержащий часть межгенного спейсера (пн), промотор и 7-ю открытую рамку считывания. Проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей промоторов ВМГ и ВКГГ с промоторами других каулимовирусов. Показано распространение вируса мозаики георгина на территории г. Уфы и окрестностей. Впервые для получения одноцепочечной ДНК промоторов применена амплификация по типу катящегося кольца с использованием ДНК полимеразы фага рhi 29. Получены химерные последовательности промоторов каулимовирусов методом ДНК шаффлинга.

Впервые проведен анализ экспрессионной активности промоторов вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики в протопластах и трансгенных растениях табака. Показано, что для проявления экспрессионной активности промотора вируса кольцевой гравировки гвоздики достаточно последовательности размером 370 пн.

Практическая значимость работы. Промоторы вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики могут быть применены при создании трансгенных растений в качестве заменителя классического 35S промотора, так как большое количество его копий в геноме могут быть одной из причин так называемого УмолчанияФ трансгена. Химерные промоторы каулимовирусов могут оказаться более эффективными, чем их природные аналоги и найдут применение при создании трансгенных растений, продуцирующих различные лекарственные или другие физиологически активные вещества и используемых в промышленных масштабах, так как применяемые для тех же целей клетки бактерий не всегда обеспечивают правильное сворачивание рекомбинантных белков. Подобранные праймеры для амплификации промоторов каулимовирусов могут быть использованы для идентификации этих вирусов в инфицированных растениях.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XIII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов (Москва, 2006); на международной конференции УГенетика в России и миреФ (Москва, 2006); на Российской школе-конференции Генетика микроорганизмов и биотехнология (Москва - Пущино-на-Оке, 2006); на Четвертом съезде общества биотехнологов России (Пущино, 2006), на Школесеминаре молодых ученых Биомика - наука ХХI века (Уфа, 2007).

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 10 печатных работах, а также депонированы в международных банках данных EMBL, GenBank и DDBJ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах, содержит 3 таблицы и 42 рисунка. Состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка литературы, включающего 203 источников.

Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами РФФИ-Агидель 05-04-97914, грантами Программы поддержки ведущих научных школ РФ НШ-2217.2003.4 и НШ-1003.2006.4.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектами исследований были промоторы вируса мозаики цветной капусты, вируса кольцевой гравировки гвоздики и вируса мозаики георгина. В работе использованы следующие методы. ДНК из листьев, пораженных каулимовирусами, выделяли фенольно-детергентным методом (Graham, 1978).

Плазмидную ДНК выделяли методом мягкого лизиса (Clewel, Helinski, 1969) с некоторыми модификациями. При анализе рекомбинантных клонов для определения размера вставки применяли быстрый метод щелочного лизиса бактериальных колоний (Sambrook et al., 1989). Расщепление ДНК проводили в буферах, рекомендованных фирмами-поставщиками. Качество и количество выделенных препаратов определяли аналитическим электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Агарозный гель-электрофорез проводили в приборах модели Sub-Cell GT WIDI MINI (Bio-Rad, США). Элюцию фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы проводили по методу (Sealey, Southern, 1982). ПЦР проводили в амплификаторе производства компании УДНК-технологияФ с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus (McPherson et al., 1995).

Для клонирования амплификатов промоторов каулимовирусов использовали вектор pKRX. Подготовку и трансформацию компетентных клеток E.coli осуществляли по методу Коэн (Cohen et al., 1972). Секвенирование проводили, на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Inc., США). Электрокомпетентные клетки E.coli и A.tumefaciens готовили по методу Ausubel et al. (1987) и Lin (1995). Протопласты трансформировали методом опосредованного полиэтиленгликолем (PEG 4000) эндоцитоза плазмидной ДНК, затем проводили анализ транзиентной экспрессии (Lyznik et al., 1989; Locatelli et al., 2003). Трансгенные формы табака получали методом агробактериальной трансформации листовых дисков (Horsch et al., 1985). Промоторы каулимовирусов в одноцепочечной форме были получены с помощью амплификации по типу катящегося кольца с использованием ДНК полимеразы фага phi 29. ДНК шаффлинг проводили по (Stemmer, 1994) с модификациями (Zhao, Arnold, 1997) и (Kikuchi et al., 2000).

Флюориметрическое определение активности GUS в клеточных экстрактах проводили по методу, описанному Jefferson (1987) с модификациями (Зверева, Романов 2000). Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ DNASIS (Hitachi Software Engineering Co, Япония) и Lasergene фирмы УDNASTAR, Inc.Ф (США).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 1. Выяснение филогенетических связей каулимовирусов, поиск промоторных последовательностей, подбор праймеров для их амплификации и поиск инфицированных каулимовирусами растений.

Для проведения экспериментов по направленной молекулярной эволюции in vitro необходимым условием является наличие гомологии между нуклеотидными последовательностями (Stemmer, 1994). Поэтому нами был предварительно осуществлен поиск каулимовирусов, близкородственных к вирусу мозаики цветной капусты. Для определения филогенетических связей каулимовирусов был осуществлен анализ 14-ти полностью секвенированных последовательностей геномов каулимовирусов и частично секвенированной последовательности генома скрытого вируса хрена. Для этого использовали данные из международного банка нуклеотидных последовательностей. Было выяснено, что по гомологии нуклеотидной последовательности геномов наиболее близко к вирусу мозаики цветной капусты стоят скрытый вирус хрена и вирус кольцевой гравировки гвоздики (рис. 1). Другую близкую группу образуют вирус мозаики норичника (ВМН) и вирус мозаики ночной красавицы (ВМНК). Несколько дальше отстоит вирус, окаймляющий жилки земляники (ВОЖЗ). Еще одну группу каулимовирусов, с меньшей гомологией нуклеотидной последовательности с вирусом мозаики цветной капусты образуют каулимовирусы черешни, цеструма, арахиса, маниока и сои (рис. 1).

Рис. 1. Филогенетическое древо сходства основных представителей каулимовирусов, построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей геномов. CaMV - ВМЦК; HRLV - скрытый вирус хрена;

CERV - ВКГГ; FMV - вирус мозаики норичника (ВМН); MMV - вирус мозаики ночной красавицы (ВМНК); SVBV - вирус, окаймляющий жилки земляники (ВОЖЗ); SbCMV - вирус бледной пятнистости сои; CesCauliVir - вирус желтых листовых завивок цеструма; PeanutCSV - вирус бледной полосатости арахиса;

BlueberryRRV - вирус красных кольцевых пятен черешни; CsVMV - вирус мозаики маниока.

Для проведения дальнейшего анализа и отбора промоторов для ДНК шаффлинга с 35S промотором, были взяты ВКГГ, ВМН и ВОЖЗ, поскольку эти вирусы оказались филогенетически близки к ВМЦК. Нуклеотидные последовательности геномов 4-х штаммов ВМЦК, 2-х штаммов ВКГГ и по одному штамму ВМН, ВОЖЗ, а также ВМНК были выровнены с помощью программы Megalign пакета Lasergene. Используя информацию о расположении промоторов ВМЦК, ВМН и ВМНК в геноме, было оценено примерное местоположение промоторов ВКГГ и ВОЖЗ, затем промоторные участки исследуемых каулимовирусов были выровнены для оценки их гомологии.