На правах рукописи

Козлов Александр Павлович ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ГАММА-ИЗЛУЧЕНИЯ В ШИРОКОМ ДИАПАЗОНЕ ДОЗ И УСКОРЕННЫХ ИОНОВ БОРА НА МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТОВ 01.04.16 - физика атомного ядра и элементарных частиц

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва-2007

Работа выполнена на кафедре физики ускорителей высоких энергий Физического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный консультант:

доктор физико-математических наук, профессор Черняев Александр Петрович

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, Василенко Олег Иванович профессор доктор физико-математических наук, Рууге Энно Куставич профессор

Ведущая организация:

Международный Университет природы, общества и человека Дубна

Защита состоится 24 мая 2007 года в на заседании Диссертационного совета Д.501.001.65 на Биологическом факультете Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова по адресу:

119992, Москва, Ленинские горы, Биологический факультет, аудитория _.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан л апреля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Т. В. Веселова кандидат биологических наук 2

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Одной из актуальных задач современной прикладной ядерной физики является исследование особенностей воздействия различных видов излучения, в частности -излучения и пучков тяжелых заряженных частиц, на биологические структуры. При этом в качестве исследуемой биологической модели довольно часто используются безъядерные красные клетки крови человека. Эритроциты являются удобной биологической моделью, эти клетки рассматриваются в качестве эффективного естественного биодатчика состояний и изменений организма при воздействии различных внешних факторов (в частности, ионизирующего излучения) и экологического состояния окружающей среды.

Выявлено, что воздействие -излучения и пучков ускоренных альфа-частиц на эритроциты человека в диапазоне доз выше величины ~ 1 кГр приводит к гибели облученных клеток непосредственно сразу после облучения (Puchala, 2004). Другие авторы изучали действие ионов Li (6,4 МэВ) в летальных дозах на эритроциты кролика (Choudhary, 1998)Показано, что липофильная часть мембраны становится более текучей после действия -излучения (Benderitter, 2003); также действие тяжелых ионов приводило к изменению жесткости мембраны (Schon, 1994).

Известно, что под воздействием ионизирующих излучений в биологических мембранах появляются скрытые повреждения, которые могут не привести к гибели клеток даже в течение длительного времени после облучения. Скрытое повреждение может проявиться при дополнительных воздействиях.

Дополнительное воздействие определенного физического или химического фактора является как бы индикатором, с помощью которого можно установить и определить степень скрытых повреждений, возникающих в результате облучения, что особенно важно при облучении в малых дозах. Например, дополнительное воздействие ультрафиолетового излучения позволило выявить скрытые радиационные повреждения кристаллинов в хрусталике глаза (Островский, Красавин, 2003). Комбинированное действие -излучения в диапазоне сверхмалых доз (до 10 сГр) и импульсного электрического поля высокой напряженности также позволило проявить скрытые радиационные повреждения мембран эритроцитов (Черняев, 2004, 2005).

В ряде работ рассматриваются механизмы повреждения мембран под воздействием ионизирующих излучений (Бурлакова 2001; Эйдус, 2001).

Экспериментального материала накоплено недостаточно (особенно по облучению пучками тяжелых заряженных частиц) для установления всех закономерностей и особенностей изменений, происходящих в биомембранах при облучении. Также различны условия проводимых экспериментов и методы исследования, что вносит некоторую несогласованность в полученные результаты. Отсутствуют исследования, в которых используется один и тот же физический метод для установления характера биологических эффектов, возникающих при облучении биомембран в широком диапазоне доз.

Целью работы является экспериментальное исследование воздействия излучения в широком диапазоне доз и пучка ускоренных ионов бора на мембраны эритроцитов человека.

Задачи исследования:

1. Усовершенствовать метод калиброванной электропорации, используемый для регистрации скрытых повреждений мембран эритроцитов при облучении их гаммаизлучением 60Co и ускоренными ионами бора.

2. Измерить константу скорости гемолиза эритроцитов в зависимости от поглощенной дозы гамма-излучения.

3. Измерить константу скорости гемолиза эритроцитов в зависимости от флюенса пучка ускоренных ионов бора.

4. Рассчитать характеристики взаимодействия пучка ускоренных ионов бора с мембраной эритроцитов.

5. Разработать математическую модель, описывающую результаты экспериментов по воздействию гамма-излучения.

Научная новизна работы. 1. Впервые экспериментально показано, что гаммаизлучение Cо в диапазоне доз 1-600 Гр (мощность дозы 2,75 Гр/мин) вызывает скрытые повреждения мембран эритроцитов, выявляемые методом электропорации. 2. Показано, что гамма-излучение Cо в диапазоне доз 1-350 Гр вызывает малые скрытые повреждения мембран эритроцитов, практически не изменяющие порога электропорации мембран и не зависящие от величины поглощенной дозы.

3. Методом электропорации показано, что гамма-излучение Cо в диапазоне доз 350 - 600 Гр при взаимодействии с мембранами эритроцитов вызывает в них скрытые повреждения, которые пропорциональны величине дозы. 4. Экспериментально установлено, что через сутки после облучения границы диапазонов доз, вызывающих характерные повреждения мембран, сдвигаются в область более низких доз по сравнению с начальными (сразу после облучения). 5. Впервые проведены исследования по воздействию пучка ускоренных ионов бора на мембраны эритроцитов. Экспериментально методом электропорации показано, что ускоренные ионы бора с энергией 32 МэВ/нуклон в диапазоне доз 50 - 750 Гр (ЛПЭ в среднем - 70 КэВ/мкм; мощность облучения - 1,4 - 10,7 Гр/с) вызывали скрытые повреждения мембран эритроцитов сразу после облучения. 6. Взаимодей ствие ускоренных ионов бора с биологической мембраной приводило к непосредственному гемолизу эритроцитов только через несколько суток. При этом константа скорости гемолиза нелинейно зависела от величины дозы. 7. Предложена математическая модель, которая удовлетворительно описывает процессы взаимодействия гамма-излучения с мембраной эритроцита. Рассчитана кривая Брэгга ионизационных потерь ионов бора для условий поставленного эксперимента.

Достоверность научных результатов обеспечена использованием хорошо апробированных методик, хорошей воспроизводимостью опытных данных и строгим соблюдением условий эксперимента. Выводы научно обоснованы и убедительны.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Для гамма-излучения Co при взаимодействии с мембраной эритроцита существуют три диапазона доз, отличающиеся характером биологических эффектов: дозы от 1 до 350 Гр вызывают малые скрытые повреждения мембран эритроцитов, практически не зависимые от величины дозы; степень скрытых повреждений мембран для диапазона поглощенных доз от 350 до 600 Гр пропорциональна величине дозы; дозы гамма-излучения выше 600 Гр вызывают тотальное повреждение мембран эритроцитов сразу после облучения.

2. Ускоренные пучки ионов бора (энергия 32 МэВ/нуклон) в зоне плато кривой Брэгга вызывают скрытые повреждения мембран эритроцитов в диапазоне поглощенных доз от 50 до 750 Гр, слабо зависящие от величины дозы.

Практическая ценность работы. Выявленные три диапазона доз, отличающиеся характером биологических эффектов, могут быть приняты во внимание при выборе оптимальных условий облучения при лучевой терапии.

Результаты, полученные в диссертации, могут быть включены в программу обучения студентов ВУЗов, специализирующихся в области ядерной физики и радиобиологии.

Апробация работы. Основные результаты диссертации докладывались на следующих конференциях: 4th International Workshop on Space Radiation Research and 17th Annual NASA Space Radiation Health InvestigatorsТ Workshop (Москва, 2006); III Международный симпозиум под эгидой ЮНЕСКО, посвященного 100летию со дня рождения акад. Н.М. Сисакяна Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии (Дубна, 2006); Международная конференция, посвященная 70-летию НИИ общей реаниматологии РАМН (Москва, 2006); The investigation of erythrocyte membrane under the action of ionizing radiation, Meeting EARCR (Оксфорд, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ. Из них 5 в рецензируемых журналах, 5в сборниках трудов и тезисах конференций.

ичный вклад автора. Все эксперименты и методические исследования были проведены при непосредственном участии автора в Лаборатории радиационной биологии ОИЯИ г. Дубна, на физическом факультете МГУ и на кафедре медицинской и биологической физики ММА им. И.М. Сеченова.

Теоретические оценки и расчеты сделаны лично автором.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из оглавления, введения, пяти глав, выводов и списка литературы, всего на 92 страницах, включая 37 рисунков. Список цитируемой литературы включает 74 наименования.

Содержание работы Методика экспериментов Эксперименты по воздействию ионизирующего излучения на эритроциты проводились в ОИЯИ г. Дубна. В качестве источника -излучения использовали радиоактивный изотоп кобальта Co с периодом полураспада 5,2 года и активностью около 5000 Ки. Спектральные линии излучения 1,17 МэВ и 1,33 МэВ.

60 В процессе радиоактивного распада Co превращается в Ni, и возбужденное ядро 60Ni переходит в стабильное состояние с последовательным испусканием двух квантов. Источником ускоренных ионов B служил циклотрон U400M. Значение энергии иона бора на входе в суспензию составляло 32 МэВ/нуклон. Диаметр коллиматора равнялся 14 мм. В проведенных облучениях дозе 1 Гр соответствовало 1,4107 ядер бора на см2.

В экспериментах использовали воздействие -излучения и пучков ускоренных ионов бора на мембраны эритроцитов как по отдельности, так и в сочетании с импульсным электрическим полем высокой напряженности для выявления скрытых повреждений мембран. Исследуемым явлением был гемолиз эритроцитов вызываемый воздействием выше указанных физических факторов.

Общая схема проведения опытов по комбинированному действию ионизирующего излучения и импульсного электрического поля (ИЭП) на суспензию эритроцитов представлена на рис. 1. В качестве исследуемой модели используются клетки крови человека - эритроциты. Приготавливались четыре образца суспензии эритроцитов в 0,9% растворе хлористого натрия (гематокрит 0,2%). Первый образец служил контролем (без облучения и без электрпорации);

второй подвергали действию ионизирующего излучения, третий - воздействию импульсного электрического поля. Четвертый образец подвергали комбинированному воздействию - сначала облучению, а затем - импульсному электрическому полю. Сравнивали кинетику гемолиза эритроцитов во всех случаях. Излучение, действуя на мембраны эритроцитов и разбавленную плазму крови, вызывало неявные, скрытые повреждения мембран либо гибель клеток после облучения. Действие импульсного электрического поля после облучения проявляет скрытые повреждения, изменяя кинетику гемолиза эритроцитов.

Степень воздействия оценивали по скорости уменьшения числа эритроцитов в суспензии в результате гемолиза.

Рис. 1. Общая схема проведения опытов по комбинированному действию ионизирующего излучения (ИИ) и импульсного электрического поля (ИЭП) на суспензию эритроцитов (СЭ) Для измерения числа эритроцитов в суспензии использовался спектрофотометрический метод. Ослабление света при прохождении его через суспензию эритроцитов обусловлено двумя процессами: истинным поглощением и рассеянием. Для разбавленной суспензии оптическая плотность D пропорциональна концентрации эритроцитов. Оптическая плотность суспензии на длине волны =760 нм определяется именно рассеянием на эритроцитах, вклад других компонент не более 2,5-3%. Поэтому, измеряя оптическую плотность раствора после воздействия различных физических факторов, можно получить информацию о изменении концентрации эритроцитов в суспензии со временем. Исходная суспензия с гематокритом 0,2% в опытах имела оптическую плотность 1,0 при толщине слоя 5 мм. Это был мутный, непрозрачный раствор. Кинетическая кривая (кривая изменения оптической плотности суспензии со временем) уменьшения числа эритроцитов после воздействия на суспензию импульсного электрического поля (электропорации), хорошо описывается экспоненциальной функцией:

D(t) = D1 exp(-t) + D2, где - константа скорости гемолиза; D1, D2 - параметры кинетической кривой.

Источником импульсного электрического поля служил клинический дефибриллятор УLifepakФ 7, с помощью которого получали однополярные электрические импульсы с энергией от 5 до 400 Дж. Длительность импульса ~ мс. Электрический импульс подводили к титановым электродам, которые помещались в кварцевую кювету. В неё наливали 1 - 5 мл суспензии. Расстояние между силовыми электродами 15мм. Для создания трансмембранного потенциала 0,3 - 0,5 В (пороговый потенциал электрического пробоя мембраны) необходимо формировать электрическое поле в растворе 1000 - 2000 В/см. Измерение характеристик импульса электрического поля в растворе и степени однородности их по объёму, особенно при таких высоких значениях напряженности, в биологическом эксперименте является важной и актуальной задачей. В серии методических экспериментов были установлены характеристики электрического импульса непосредственно в растворе. Для регистрации импульса в растворе, в него помещались две металлические иголки на расстоянии 1,3 мм друг от друга, разность потенциалов с которых подавалась через схему делителя напряжения на вход звуковой карты компьютера, который служил в качестве электронного осциллографа. С помощью специальной программы на экране компьютера наблюдался в реальном времени исследуемый импульс (рис. 2).