На правах рукописи

УДК 577.322.4 ФИЛАТОВ Иван Васильевич Расчет трехмерной структуры и физических характеристик фибриллярных коллагенов человека I, II, III, V и XI типов.

03.00.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 2006

Работа выполнена на кафедре молекулярной биофизики факультета молекулярной и биологической физики Московского физико-технического института (Государственного университета), в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Научные руководители: доктор физико-математических наук, профессор Туманян Владимир Гайевич;

кандидат физико-математических наук Мильчевский Юрий Викторович.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор Лобышев Валентин Иванович;

кандидат физико-математических наук Тиктопуло Елизавета Игнатьевна;

Ведущая организация: Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Защита диссертации состоится л18 октября 2006 года в 10.00 часов на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (Государственном университете), по адресу 141700, Московская область, г. Долгопрудный, Институтский переулок, 9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физикотехнического института (Государственного университета).

Автореферат разослан л16 сентября 2006 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физико-математических наук Брагин В.Е.

2

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы Выдающиеся успехи биологии второй половины двадцатого века обеспечили нас пониманием того, как устроены глобулярные белки и как их пространственная структура, в ряде случаев известная с атомным разрешением, связана с их ролью в генезе биологических структур и их функционированием. Подобных успехов в исследованиях строения фибриллярных белков нет (за исключением, быть может, коротких -спиральных белков, типа тропомиозина или фрагментов l-меромиозина, которые в клетке перемещаются во время своего функционирования и, соответственно, входят в различного типа полибелковые комплексы, а поэтому их кристаллизация имеет смысл). Фибриллярные белки, как ясно из их определения, функционируют в виде макроскопических, волокнистых образований. Не известны структуры промежуточных форм и, прежде всего, структуры одиночных молекул в том их виде, в котором они вступают в длительный (в связи с большим размером молекул) процесс своего фибриллогенеза. К настоящему времени уже хорошо известно, что при фибриллогенезе отдельных белков паутины, в частности спидроинов, конечная -структурная форма полипептидной цепи белков в волокне возникает на достаточно развитом этапе комплексообразования различных белков волокна в целом. Отдельные молекулы спидроинов в растворе образуют подобные глобулярным белкам структуры, причем характеристики вторичных структур, полученные по данным кругового дихроизма и других спектральных методов, включая метод ЯМР в растворе, показывают, что -структура находится в исходном одиночном белке в следовых количествах. Эти структуры демонстрируют, что рентгенография и другие экспериментальные исследования фибрилл могут вводить в заблуждение относительно того строения одиночной молекулы, в котором она пребывает в тех компартментах клетки, где протекают начальные стадии фибриллогенеза.

Еще менее, чем сложное строение паутины, изучены детали молекулярного строения важнейшего фибриллярного белка - коллагена, хотя, казалось бы, анализу отдельных макромолекул различных коллагеновых белков посвящены сотни работ.

Коллагены - основные белки предохранительных, опорных и соединительных тканей в организмах животных. Они встречаются так же во всем таксономическом ряду организмов от одноклеточных бактерий, до организмов беспозвоночных и позвоночных животных, аналоги коллагенов замечены в царстве растений. В структурном отношении это большой класс белков, включающих значительную фибриллярную часть, сформированную тройными спиралями, образованными специфическими периодическими последовательностями типа (Gly-X-Y)n, где Gly - глицин, а X и Y любой остаток амино- или иминокислоты, причем содержание последних достигает 15-20% процентов. В последнее время круг уровней организации, на которых фибриллярные структуры коллагенового типа оказываются функционально значимыми, резко расширился. Во-первых, стало ясным, что малые по размеру тройные спирали коллагенового типа имеются в ряде функционально значимых глобулярных белках, как, например, в ацетилхолинэстеразе, или Cq1 комплемента. Стало очевидным, что функциональная роль поверхностей тройных спиралей коллагенового типа разнообразна и простирается от уровня макромолекул, через уровень клеток на уровень тканей. Так же ясно, что не только надмолекулярный уровень организации тройной спирали коллагенового типа важен для функционирования, но поверхность одиночной тройной спирали оказалась активной в ряде функций. Поэтому представляется актуальным анализ возможных конформационных состояний пространственной структуры одиночной трехспиральной молекулы коллагена. Обратим внимание, что генезис самой тройной спирали и ее дальнейшее включение в фибриллу до сих пор не рассматривались в аспекте возможных изменений параметров тройной спирали в одиночных и надмолекулярных состояниях. Это означает, что совершенно не обязательно те усредненные структурные параметры спирали, которые мы знаем по рентгенограммам коллагеновых фибрилл, будут генерироваться в целой одиночной тройной спирали. Таким образом, анализ одиночных молекул фибриллярных элементов коллагена до сих пор представляет существенный интерес как для понимания структурных основ функционирования рецепторных элементов пространственной структуры, так и для построения моделей созревания коллагеновых фибрилл. Так как способов экспериментального анализа пространственной структуры одиночных молекул в растворе для случая коллагена, содержащего в фибриллярной форме на 100% спирали типа поли-Lпролин II, не существует, единственным способом исследования пространственных структур является их расчет. Облегчающим моментом является существование большого числа низкомолекулярных соединений коллагенового типа, конформации которых получены методом рентгеноструктурного анализа и могут, поэтому, быть критерием оценки качества расчетов.

Цели исследования Цель настоящего исследования заключалась в развитии методов молекулярной механики для расчетов структур одиночных фибриллярных макромолекул и их комплексов, а также адаптации известных методов и программ для минимизации конформаций боковых радикалов к расчетам структур макромолекул коллагенов I, II, III, V и XI типов.

В задачи данной работы входило:

установление пространственной структуры одиночных макромолекул коллагенов пяти разных типов на основании априорного расчета трехмерной структуры по последовательности аминокислот с использованием методов молекулярной механики и множественного статистического дискриминантного анализа;

анализ типов спиральных структур, определяемых различными мотивами аминокислотных последовательностей;

расчеты модуля Юнга и персистентной длины для сопоставления локальной и глобальной стабильности расчетных структур с целью установления их роли в процессах фибриллогенеза и дифференцировки.

Научная новизна работы Впервые развит метод расчета целых фибриллярных макромолекул коллагена на основе методов конформационного анализа объектов пептидной природы. Особенностью разработанного варианта является использование редуцированной библиотеки конформеров боковых радикалов аминокислот, что позволило провести полную оптимизацию конформаций не только остова полипептидной цепи белков, но и всего ансамбля фрагментов, описывающих макромолекулу в целом. Впервые получены хорошо оптимизированные данные об участках стыковки трипептидов с пролином во втором положении триплетов и аминокислотой во втором положении. Продемонстрировано, что изменения стереохимических характеристик структуры в областях таких стыковок не больше, чем изменения спиральных параметров при переходе от областей с последовательностью ГАА к областям с последовательностью ГАО.

Это позволило впервые рассчитать структуры одиночных молекул коллагенов пяти разных типов и сравнить их стереохимические характеристики, что позволяет сделать выводы не только о роли отдельных аминокислот в структуре белка, но и в некоторых случаях понять, как важна специфика последовательности аминокислот для его функции.

В ходе работы применен специальный метод расчета спиральных параметров для молекул, не обладающих строгой спиральной симметрией, что дает возможность рассчитывать дифракционные картины, а следовательно, сравнивать расчетные и рентгенографические данные, сколь бы усредненными они ни были.

Проведен полный стереохимический анализ полученной структуры. Показано, что при отсутствии дополнительных начальных условий в любой части коллагеновой молекулы генерируется трехспиральная структура с симметрией, соответствующей типу симметрии дифракционной картины коллагена. Таким образом, рассчитанная структура удовлетворяет всем требованиям, предъявляемым рентгенографическими экспериментами.

На примере пяти фибриллярных структур полностью обоснована двусвязная модель структуры коллагена. Показано, что во всех полных структурах коллагенов COгруппы остатка глицина и третьего по цепи остатка находятся на поверхности тройного комплекса макромолекулы коллагена и симметрически эквивалентны друг другу. Это определяет независимость гидратации макромолекулы коллагена от последовательности аминокислот, т.е. объясняет фундаментальный факт ткане-, а не видоспецифичности гидратации коллагенов разного типа и разного происхождения.

Впервые проведен аналитический расчет модуля Юнга для фибриллярных макромолекул. Создана программа расчетов применительно к фибриллярным системам различного типа. Развиты подходы к расчету персистентной длины фибриллярных макромолекул. Впервые установлена персистентная длина макромолекулы коллагена и показано, что она существенно превышает длину макромолекулы. Таким образом, структура одиночной макромолекулы коллагена определяет ход фибриллогенеза, а действующим фактором оказывается распределение параметров спирали вдоль макромолекулы.

Практическое значение работы.

Впервые рассчитаны структуры, содержащие последовательности аминокислот, приводящие к патологиям соединительной ткани и тяжелым клиническим последствиям.

Показано, что жесткость отдельных макромолекул определяет возможность их участия в процессах фибриллогенеза коллагена как структурообразующих факторов. Таким образом, патология соединительной ткани, возникающая вследствие мутагенеза коллагена, оказывается примером типичного молекулярного заболевания.

Установлены отличия возможных дефектов процессов фибриллогенеза при различных точечных мутациях в коллагенах человека. Разработанные подходы позволяют предсказывать типы возможных дефектов коллагеновых фибрилл при различных мутациях, в том числе и неточечных.

Апробация работы и публикации Основные результаты диссертации были представлены на Международной конференции по биоинформатике регуляции и структуры генома (BGRS`04), на III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), Московской конференции по компьютерной молекулярной биологии (MCCMB`05).

По материалам диссертации опубликовано семь печатных работ.

Структура и диссертации Диссертация изложена на 103-х страницах, содержит 38 рисунков, 21 таблицу, список литературы включает 91 библиографическую ссылку. Диссертация содержит введение, пять глав, выводы, список цитированной литературы и приложение.

Краткое содержание работы Введение Во Введении обоснована актуальность темы диссертации, ее научная новизна и практическая значимость, приведены положения, выносимые на защиту.

Первая глава. Обзор литературы.

В обзоре литературы детально рассматриваются данные о структуре и физикохимических свойствах коллагенов разных типов и из разных источников. Подробно описываются представления о структуре коллагеновой макромолекулы и факторов ее стабилизации, сложившиеся на основе рентгенографических и косвенных физикохимических данных. Особое внимание уделено критическому рассмотрению данных о структуре низкомолекулярных моделей трехспиральных макромолекул коллагенов, данных о модельных расчетах структур полимеров, изоморфных коллагену. Детально описываются методы и подходы к расчетам молекулярных структур. При этом особое внимание уделяется оценке и критериям выбора силового поля при том или ином из подходов. Рассматриваются литературные данные о физических свойствах коллагенов и их проявлениях в различных структурах. Рассматриваются сведения о роли одиночных макромолекул в генезе соединительно-тканных фибрилл.

Рассмотрение литературных данных позволяет констатировать существенный прогресс, произошедший в развитии исследований структур коллагенового типа. Прежде всего - это осознание исследователями в области молекулярной биологии клетки важной функциональной роли коллагеновых структур в биологии клеточных процессов и процессов морфогенеза. Во-вторых - это осознание того факта, что нам до сих пор не известна пространственная структура коллагеновых макромолекул, не говоря уже о микрофибриллах, а это знание необходимо не только в фундаментальных областях, но и в медицине и промышленности. Прекрасные работы по структуре фрагментов коллагеновых молекул, проведенные методами рентгеноструктурного анализа кристаллов и рентгенографии волокон, позволили сравнивать расчетные и экспериментальные данные. Проделанные расчеты и экспериментальные данные позволили объяснить ряд физико-химических и структурных свойств и найти области существования нативных конформаций коллагена. Тем не менее до сих пор не удалось провести уточнения конформаций боковых радикалов аминокислот, а это, в свою очередь, не позволяет получить количественного объяснения зависимости термостабильности коллагенов от состава и последовательности аминокислот. Не удается также отличить параметры гидратации коллагена, связанные с остовом полипептидной цепи и отдельными аминокислотными остатками.