На правах рукописи

УДК: 575.1:577.27:578.828:636.4

Айтназаров Руслан Бейшеналиевич

Молекулярно-генетический анализ эндогенных ретровирусов у некоторых пород домашних свиней и диких кабанов

03.00.15 - генетика

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

НОВОСИБИРСК

2006

Работа выполнена в лабораториях разведения экспериментальных животных и молекулярных основ генетики животных Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научные руководители: доктор биологических наук

Виктор Иванович Ермолаев

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

кандидат биологических наук

Николай Серафимович Юдин

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Илья Кузьмич Захаров

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

доктор биологических наук,

Валентина Семеновна Деева

СибНИПТИЖ СО РАСХН,

г. Краснообск

Ведущая организация: Государственный научный центр вирусологии

и биотехнологии Вектор, Кольцово,

Новосибирская область

Защита диссертации состоится л___ _____________ 2006 года на _________

заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, Новосибирск-90, проспект акад. Лаврентьева, 10, тел/фак: (383) 331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институте цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан л___ _____________ 2006 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук А.Д. Груздев

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Одной из основных проблем медицины является недостаток органов для пересадки человеку, в связи с чем в практику вошла пересадка органов от животных к человеку (ксенотрансплантация) (Patience et al., 1997; Кристофер, 2001; Lee et al., 2002; Scobie et al., 2004; Niebert, Tonjes, 2005). Свинья является главным претендентом на роль донора органов при ксенотрансплантации, так как её органы более всего сходны с человеческими по размеру и физиологическим параметрам. Однако, присутствие в клетках свиньи эндогенных ретровирусов, которые являются составной частью генома, ставит серьезные проблемы перед медициной. Существует вероятность, что, находясь в латентной форме, эндогенные ретровирусы при пересадке органа от животного-донора, могут активизироваться и вызвать заболевания у человека, в том числе, онкологические (Шумаков, 1995). Эндогенные ретровирусы свиней, передающиеся при межвидовой трансплантации, могут стать причиной эпидемий, подобных эпидемии СПИДа. При ксенотрансплантации искусственно создаются условия для рекомбинаций патогенных близкородственных вирусов человека и животного, появления новых инфекций, адаптации к организму человека вирусов, репродуцирующихся в организме животных. Чтобы избежать, риска возникновения вирусной инфекции при проведении манипуляций с органами и тканями животных, необходимо тщательное обследование животного-донора.

Эндогенные ретровирусы у свиней (porcine endogenous retroviruses, PERV) впервые были выявлены путем электронной микроскопии культур клеток (Breese et al., 1970; Альтштейн и др., 1972). В последствие были выделены три типа ретровирусов PERV (А, В и С), которые различаются по последовательности нуклеотидов гена env и своим биологическим свойствам (Takeuchi et al., 1998). Обнаружены рекомбинантные вирусы PERV A/C, которые могут существовать как экзогенные вирусы, т.е. передаваться вертикально по наследству и/или горизонтально между животными (Oldmixon et al., 2002). Показано, что PERV способны инфицировать клетки человека in vitro (Martin et al., 1998). Известно, что геномы свиней, в зависимости от породы животного, содержат разные типы PERV (Jin et al., 2000).

В настоящее время за рубежом выведены многочисленные породы лабораторных мини-свиней специально для медико-биологических исследований и нужд ксенотрансплантации. Первое стадо отечественных лабораторных миниатюрных свиней Минисибс было создано в Институте цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск) при скрещивании свиней вьетнамский черной и пятнистой пород, шведского ландраса, а также кабанов европейского и среднеазиатского подвидов (Тихонов, 1990). Впервые сердечные клапаны мини-свиней для пересадки человеку были использованы в Кемеровском кардиологическом центре (Тихонов, 2000; Горелов и др., 2001). Несколько лет успешного использования клапанов свиных сердец в качестве биопротезов показали, что в отличие от зарубежных аналогов, они гораздо дешевле и более надежны. В Институте патологии кровообращения им. Мешалкина МЗ РФ проводятся исследования по трансплантации сердца, клапанов, кровеносных сосудов и других тканей у мини-свиней. В Новосибирском научно-исследовательском институте травматологии и ортопедии МЗ РФ на мини-свиньях ведутся исследования по коррекции сколиоза.

Перечисленные проблемы обусловливают актуальность изучения эндогенных ретровирусов PERV типов А, В и С у лабораторных мини-свиней, созданных для медико-биологических исследований в ИЦиГ СО РАН, а также у некоторых родоначальных пород домашних свиней и диких кабанов.

Цель и задачи исследования. Целью исследования является выявление эндогенных ретровирусов типов А, В и С в геномах лабораторных мини-свиней и их некоторых родоначальных пород, а также изучение факторов, влияющих на частоту встречаемости PERV.

В задачи исследования входило:

1. Изучить частоту встречаемости эндогенных ретровирусов разных типов у нескольких пород домашних свиней и диких кабанов.

2. Оценить влияния средовых (условия содержания и обитания) и генетических факторов (породы и подвиды) на наличие разных типов ретровирусов в геноме домашних и диких свиней.

3. Провести анализ ассоциаций различных типов эндогенных ретровирусов между собой и традиционными генетическими маркерами, использовавшимися при селекции свиней.

Научная новизна и практическая ценность. Впервые изучена порода лабораторных сибирских мини-свиней на наличие эндогенных ретровирусов PERV типов А, В, С. Показано, что эндогенные ретровирусы типа А, В и С широко распространены у лабораторных миниатюрных свиней. Обогащенность геномов животных этой породы ретровирусами, вероятно, обусловлена внесением их от пород-основателей. В то же время среди пород-основателей (диких и домашних свиней) имеются животные, свободные от некоторых типов эндогенных ретровирусов. Поскольку существует опасность активации эндогенных ретровирусов свиней при ксенотрансплантации, необходимо учитывать, что частота встречаемости эндогенных ретровирусов в некоторых выборках домашних и диких свиней существенна. На наличие эндогенных ретровирусов разных типов в популяциях свиней оказывает влияние не только порода (подвид), но и условия содержания(обитания). При селекции и разведении свиней для медико-биологических исследований необходимо строгое соблюдение зоогигиенических норм. В ходе работы выявлены ассоциации эндогенных ретровирусов свиней с разными генетическими маркерами и полом животного, которые могут быть использованы в дальнейших научных исследованиях и при селекции.

Положения, выносимые на защиту.

1. Изучение влияния генотипа (породы и подвиды животных) на уровень встречаемости у свиней эндогенных ретровирусов PERV показало статистически значимые различия частот носителей различных типов ретровируса (A, B и C) как внутри популяций одной породы, так и между различными породами, а также у диких кабанов Южной Украины и Средней Азии.

2. Метод однофакторного дисперсионного анализа, кластеризация методом двух главных компонент и семейный анализ пометов свиньи крупной белой породы, показали достоверное влияние факторов среды (условия содержания и обитания) на частоту носителей PERV в популяциях домашних и диких свиней.

3. Выявлены ассоциации ретровируса PERV типа A c локусами эритроцитарных антигенов EAE, EAK, липопротеином LPB и полом животных, а также ассоциации ретровируса PERV типа В с локусами aM, EAE и LPB у разных подвидов диких кабанов и домашних пород свиней. Показана ассоциация между PERV типов А и В у некоторых пород свиней.

4. Высказана гипотеза о возможности, кроме вертикальной передачи эндогенных ретровирусов свиней всех трех типов по наследству от родителей потомкам, горизонтальной передачи от особи к особи, при которой PERV могут выступать в качестве инфекционного вируса.

Апробация работы. Материалы исследования были представлены на ХII Международной конференции Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии (Ялта-Гурзуф, 2004); на международном конгрессе УProgress in Fundamental and Applied Sciences for Human HealthФ (Ukraine, 2004); на международной научноЦпрактической конференции молодых ученых СО РАСХН Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых учёных (Новосибирск, 2004); на Сибирском международном ветеринарном конгрессе Актуальные вопросы ветеринарной медицины (Новосибирск, 2005); на отчетной конференции Динамика генофондов растений, животных и человека (Москва, 2005); на отчетной сессии ИЦиГ СО РАН (Новосибирск, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация содержит 158 страницы машинописного текста, иллюстрирована 23 таблицами и 17 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы. Указатель литературы содержит 256 работ, из которых 159 зарубежных авторов.

Материалы и методы исследования

Материалом исследования послужили образцы крови из девяти выборок диких и домашних свиней (всего 471 особь), представляющих контрастные по происхождению и морфологическим признакам формы. Во-первых, это лабораторные мини-свиньи Минисибс, разводимые в Экспериментальном хозяйстве (ЭХ) СО РАН. Во-вторых, это четыре заводские породы: ландрас ЭХ СО РАН и племфермы ОАО "Кудряшовское", дюрок ОАО "Кудряшовское", два внутрипородных типа крупной белой породы - новосибирский и ачинский тип из ЗАО АПК Иня, свиньи скороспелой мясной породы СМ-1 из учхоза Тулинское.

Дикие кабаны представлены двумя популяциями: среднеазиатской (Чуйская долина и Сары-Челекский заповедник, Киргизия) и южно-украинской (окрестности г. Мелитополь).

Методы исследования. Взятие крови для исследований у свиней осуществляли из сердца или же прижизненно из передней полой вены. Для выделения ДНК кровь собирали в стерильные пробирки без консерванта и хранили при температуре -200С. Выделение ДНК из образцов крови проводили методом фенол-хлороформной экстракции по модифицированной методике (Смит и др., 1990). Генотипирование выполняли типо-специфичными праймерами для эндогенных ретровирусов свиней PERV методом ПЦР (Le Tissier et al., 1997; Akiyoshi et al. 1998; Takeuchi et al., 1998). Продукты амплификации оценивали электрофорезом в 4% ПААГ, окрашивание проводили бромистым этидием, длину фрагмента определяли сравнением с ДНК маркерами (СибЭнзим, г. Новосибирск) (рис. 1).

Рис. 1. Электрофореграммы амплицированных фрагментов ДНК, env-A, env-B и env-C эндогенных ретровирусов свиней в 4% полиакриламидном геле.

Примечание: М-ДНК маркер, длина в п.н. показана стрелками; PERV с положительным env-A, env-B и env-C; К- контроль ПЦР.

Для проведение аллотипирования кровь собирали в пробирки с консервантом. Сыворотку отделяли центрифугированием при 4 тыс. об/мин, консервировали азидом натрия (0,01%) и хранили при -200С (Баранов, Савина, 1988). Аллотипы сывороточных белков исследуемых животных определяли стандартными методами, описанными в литературе (Беляев и др., 1974; Баранов, 1981; Князев и др., 1982). Для установления электрофоретической подвижности белков, маркированных аллотипами, проводили иммуноэлектрофорез в агаровом геле. В популяции свиней крупной белой породы новосибирского типа был определен иммуногенетический статус и по группам крови 8 генетических систем. Данные типирования по группам крови были любезно предоставлены Лабораторией биотехнологии СибНИПТИЖ СО РАСХН (зав. лабораторией Г. М. Гончаренко).

Статистическую обработку экспериментального материала проводили стандартными методами (Плохинский, 1960; Лакин, 1990). Анализ влияния породной принадлежности и условий среды на частоту носителей PERV проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа. По компонентам факториальной девиаты рассчитывали дисперсию (s2) и силу влияния (2) каждой из компонент и оценивали статистическую значимость фактора.

Для определения взаимоотношений изучаемых популяций строили карту в пространстве двух главных компонент. Генетические дистанции для построения карты в системе двух главных компонент определяли по формуле:, (евклидова дистанция) где m - число фенотипов, pi и qi - частоты фенотипов в сравниваемых группах (Вейр, 1995). Для вычислений использовали компьютерную программу MGA-dist. ( Наличие и силу ассоциации различных типов ретровирусов с генетическими маркерами определяли с помощью коэффициента ассоциации rA (Лакин, 1990) по формуле. Достоверность коэффициента ассоциации оценивали критерием 2 (Животовский, 1991) по формуле, где N - объём выборки.

Результаты и обсуждение

1. Наличие эндогенных ретровирусов разных типов в популяциях домашних свиней и диких кабанов.