На правах рукописи

Никишина Марина Владимировна

ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ

АРИЛАМИН N-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗ И АССОЦИАЦИИ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ С РАКОМ ЛЕГКОГО

У ЕВРОПЕОИДОВ г. НОВОСИБИРСКА

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск - 2007

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (Новосибирск, Россия)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор В.А.Вавилин

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор С.Х.Дегтярев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А.Р.Колпаков

кандидат медицинских наук В.Н.Максимов

Ведущая организация:

ГУ Научно-исследовательский институт цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск)

Защита состоится "___" _______ 2007 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 в ГУ Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН (630117, г. Новосибирск, ул. академика Тимакова, 2; тел.: 8-(383)333-54-81).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательского института биохимии СО РАМН

Автореферат разослан "___" ____________ 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Г.С.Русских

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В современных молекулярно-эпидемиологических исследованиях многофакторных заболеваний, к которым относятся и онкологические, широко используется подход, основанный на исследовании ассоциаций полиморфных вариантов генов, продукты которых потенциально вовлечены в развитие и регуляцию тех или иных звеньев патогенеза заболевания, так называемый подход кандидатных генов (Пузырев, Степанов, 1997). С этих позиций перспективным объектом исследования представляются ферменты биотрансформации ксенобиотиков (ФБК), которые ответственны за процессы токсификации и детоксификации чужеродных соединений, в том числе и канцерогенных веществ (Galton, Ferns, 1999). Соотношение процессов токсификации и детоксификации сильно варьирует между индивидуумами вследствие высокой популяционной вариабельности генов ФБК (Weber, 1999). Особое значение дисбаланс детоксификации/токсификации ксенобиотиков имеет для онкологической патологии, составляя важную часть процессов стадии инициации. Рак легкого - самое распространенное в мировой популяции злокачественное заболевание. Ежегодно в мире диагностируется около 1 млн новых случаев рака легкого (Трахтенберг, Чиссов, 2000). Острота проблемы обусловлена не только высокой распространенностью заболевания, но и поздней диагностикой, неудовлетворительными результатами лечения и, как следствие, высокой летальностью. Это делает актуальным изучение всех факторов, причастных к начальному этапу канцерогенеза, в том числе и ФБК.

К группе ферментов биотрансформации ксенобиотиков относятся ариламин N-ацетилтрансферазы (E.C. 2.3.1.5.): NAT1 и NAT2, осуществляющие N- и O-ацетилирование ароматических и гетероциклических аминов и гидразинов (Hein et al., 2000). Обширный скрининг субстратов показал, что NAT1 и NAT2 имеют перекрывающиеся, но четко отличающиеся профили специфических активностей (Kawamura et al., 2005). Давно известный полиморфизм NAT2 фенотипически проявляется наличием в популяции быстрых и медленных ацетиляторов, при этом у представителей европеоидной расы частота медленных ацетиляторов составляет 40-60% (Evans, 1989). Долгое время считалось, что для NAT1 не свойственен метаболический полиморфизм, но недавно показано, что около 8% европеоидов являются медленными ацетиляторами по специфическим субстратам NAT1 (Butcher et al., 1998). Причиной метаболического полиморфизма ацетилирования являются некоторые нуклеотидные замены в белок-кодирующем регионе гена NAT2 (Grant et al., 1990) и кодирующем и некодирующем регионе гена NAT1 (Weber, Vatsis, 1993). Молекулярные механизмы, ведущие к фенотипу медленного ацетилятора до сих пор не совсем понятны. Снижение активности ацетилирования в несколько сотен и даже тысяч раз происходит за счет снижения экспрессии белка (Leff et al., 1999), образования менее стабильного белка (Grant et al., 1997; Delomenie et al., 1997) или усиленной деградации белка (Butcher et al., 2004; Zang et al., 2004). Эти различия в механизмах реализации, а также характерная субстратная специфичность аллозимов (Hickman et al., 1995), свидетельствуют о гетерогенности группы медленных ацетиляторов.

После того, как была показана роль ацетилирования в метаболической активации и детоксификации канцерогенов, присутствующих в табачном дыме, окружающей среде и потребляемой пище (Hein et al., 1993; 1994: Fretland et al., 2001; 2002), стали широко проводиться исследования ассоциаций между полиморфизмом NAT и онкологическими заболеваниями. К настоящему времени показано, что статус ацетилирования вносит изменения в риски возникновения рака мочевого пузыря (Inatomi et al., 1999; Hein, 2006) и толстой кишки (Hein et al., 2000; Tamer et al., 2006). Имеющиеся немногочисленные данные литературы о связи полиморфизма NAT и рака легкого противоречивы (Cascorbi et al., 1996; Bouchardy et al., 1998; Wikman et al., 2001). В этих исследованиях по результатам генотипирования делили аллели на две группы: ведущие к фенотипу медленного или быстрого ацетилятора. Однако в свете последних данных о разнообразии проявлений полиморфных вариантов генов NAT, изучение их ассоциации с заболеванием имеет самостоятельное значение.

Одним из наиболее востребованных методов обнаружения полиморфных вариантов генов является анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ). В связи с открытием все новых полиморфизмов в генах NAT, иногда в непосредственной близости от ранее известных, важна более точная локализация выявляемых полиморфизмов (Hein et al., 2000). Поэтому оптимизация метода ПДРФ является актуальной задачей.

Генетический полиморфизм NAT2 у европеоидов Западной Сибири, как и вообще России, остается малоизученным. Генетический полиморфизм NAT1 у европеоидов России не изучен вообще. В связи с этим, имеет большое значение изучение распределения частот встречаемости полиморфных вариантов генов NAT у европеоидов России, а также поиск возможных специфических полиморфизмов в нашей популяции.

Целью настоящей работы является исследование полиморфизма генов NAT1 и NAT2 методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и анализ ассоциации полиморфных вариантов с раком легкого у европеоидов

г. Новосибирска.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить возможность использования новых эндонуклеаз рестрикции для более надежного и точного обнаружения известных полиморфизмов генов NAT1 и NAT2 и поиска новых полиморфизмов.

2. Изучить частоту встречаемости полиморфных вариантов генов NAT1 и NAT2 у европеоидов г. Новосибирска.

3. Провести анализ ассоциаций аллелей, генотипов и комбинаций генотипов полиморфных вариантов генов NAT c раком легкого.

Научная новизна исследования

Впервые предложен способ обнаружения полиморфизма 1025 гена NAT1 методом ПДРФ-анализа и предложены способы однозначного определения полиморфизмов A752T гена NAT1 и С190Т, G857A гена NAT2 этим методом. Предложенные способы ПДРФ-анализа позволяют различать полиморфизмы С190Т и G191A; G857A и T859C, 859Del гена NAT2.

Впервые в России охарактеризована частота встречаемости полиморфных вариантов C97T, С190Т, 350,351G>C, T402C, A752T и 1025 гена NAT1 и С190Т, G191A, A434C, C759T, T859C, 859Del гена NAT2. Впервые у европеоидов Западной Сибири определены частоты встречаемости полиморфных вариантов C282T, A803G и G857A гена NAT2.

Установлено, что аллель 803G гена NAT2 у мужчин ассоциирован с устойчивостью к раку легкого. Генотип 803АА у мужчин, в том числе курящих, ассоциирован с предрасположенностью к раку легкого. Комбинация генотипов гена NAT2 282ТС/590АG/481CC/803GA/857GG ассоциирована с устойчивостью к раку легкого, а комбинация 282СС/590GG/481TC/803AA/857GG ассоциирована с предрасположенностью к раку легкого.

Практическая значимость работы

Предложены новые способы ПДРФ-анализа генов NAT, которые позволяют однозначно определить полиморфизмы A752T гена NAT1 и С190Т, G857A гена NAT2, а также различить полиморфизмы С190Т и G191A; G857A и T859C, 859Del гена NAT2. Эти способы применимы в исследованиях, направленных на изучение функциональных проявлений полиморфизмов генов NAT, кинетических характеристик аллозимов NAT и популяционно-генетических исследованиях.

Полученные данные о распределении аллелей и генотипов полиморфных вариантов NAT у жителей г. Новосибирска представляют интерес для геногеографических и генетико-эпидемиологических исследований широко распространенных заболеваний человека. Результаты настоящей работы могут быть использованы в учебно-методическом процессе на биологических и медицинских факультетах ВУЗов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Предложенные способы ПДРФ-анализа позволяют однозначно определять полиморфизмы C190T и G857A гена NAT2 и A752T гена NAT1, а также различать полиморфизмы С190Т и G191A; G857A и T859C, 859Del гена NAT2.

2. Распределение частот встречаемости полиморфных вариантов генов NAT1 и NAT2 у европеоидов г. Новосибирска соответствует таковому в других популяциях европеоидов.

3. В европеоидной популяции г. Новосибирска аллель 803G гена NAT2 у мужчин ассоциирован с устойчивостью к раку легкого. Генотип 803АА у мужчин, в том числе курящих, ассоциирован с предрасположенностью к раку легкого.

4. Комбинация генотипов 282ТС/590АG/481CC/803GA/857GG гена NAT2 в исследованной популяции ассоциирована с устойчивостью к раку легкого, а комбинация 282СС/590GG/481TC/803AA/857GG ассоциирована с предрасположенностью к раку легкого.

Апробация работы. Материалы исследования были представлены на III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); 8-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых Биология - наука XXI века (Пущино, 2004); на Российской научно-практической конференции, посвященной 25-летию НИИ онкологии ТН - СО РАМН Современное состояние и перспективы развития клинической онкологии (Томск, 2004); на V молодежной научной конференции СО РАМН Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины (Новосибирск, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ (из них 4 в рецензируемой печати).

Структура работы. Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста с полуторным интервалом, содержит 20 таблиц и 14 рисунков и состоит из шести разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, а также списка цитируемой литературы, включающего 230 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена с использованием банка образцов периферической крови, собранного при выполнении программы Здоровье населения Сибири, проект Оценка генетически полиморфных форм ферментов биотрансформации чужеродных соединений как факторов риска развития рака у жителей г. Новосибирска (руководитель - академик РАМН Ляхович В.В.). Группа больных раком легкого состояла из 122 чел. (мужчин - 78, женщин - 44), средний возраст составил 60.4 10.4 лет. Постановка диагноза по совокупности рентгенологических, клинических и, в части случаев, на основании результатов гистологического исследования, сбор учетной информации и биологического материала проведен врачем-онкологом Наровым Ю.Э. на базе поликлинического отделения онкологического диспансера г. Новосибирска.

Контрольная группа людей без признаков онкологических заболеваний состояла из 167 чел. (мужчин - 119, женщин - 48), средний возраст составил 56.8 18.9 лет. Все обследованные индивиды являлись европеоидами и не состояли в родстве. Часть образцов ДНК контрольной группы предоставлена ГУ НИИ терапии СО РАМН, собранных при проведении эпидемиологического исследования по программе ВОЗ MONIKA.

К группе курящих в нашем исследовании относили лиц, курящих на момент исследования, и учитывали суточную дозу в пачках. В качестве объекта исследования были использованы образцы тотальной геномной ДНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови.

Методы. Выделение ДНК проводили из образцов цельной периферической крови стандартным методом фенол-хлороформной экстракции (Маниатис, 1984). Фрагменты генов NAT1 размером 1552 п.н. и NAT2 размером 1000 п.н., которые включали единственный транслируемый экзон размером 870 п.н., амплифицировали в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Hickman, Sim, 1991; Payton, Sim, 1998). Подбор эндонуклеаз рестрикции проводился с использованием программ Dnasis и Vector NTI в первичных последовательностях генов NAT1 (GenBank, Acc. Number X17059) и NAT2 (GenBank, Acc. Number AY331807.1). Полиморфные варианты генов NAT (табл. 1) выявляли методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов с помощью опубликованных (Hickman, Sim, 1991; Bell et al., 1993; Lin et al., 1994; Cascorbi et al., 1995; Woolhouse et al. 1997; Lin et al., 1998; Leff et al., 1999) и оригинальных способов. Все использованные в работе эндонуклеазы рестрикции произведены в НПО СибЭнзим (Россия). Продукты ферментативного гидролиза разделяли путем горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле в трис-ацетатном буфере и визуализировали в проходящем УФ-свете с помощью видеосистемы DNA Analyzer (Россия).

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов NAT1 (GenBank, Acc. Number X17059), NAT2 (GenBank, Acc. Number AY331807.1) и NATP (GenBank, Acc. Number X17060) проводили при помощи компьютерной программы для сравнения нуклеотидных последовательностей CLUSTAL W Multiple Sequence Alignment Program (

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета прикладных статистических программ SPSS 11.5 и программы EpiInfo 6. Об ассоциации аллелей, генотипов и комбинаций генотипов с раком легкого судили по величине отношения шансов (ОШ) (Флетчер и др., 1998). Достоверность различий в частотах встречаемости изучаемых признаков между группой больных и контрольной группой оценивалась по критерию 2 с коррекцией Йейтса или по двустороннему критерию Фишера, когда в группе сравнения было менее 5 наблюдений.

Таблица 1

Общая характеристика изученных полиморфных вариантов генов NAT